Đề tài : Nghiên Cứu Công Nghệ Sản Xuất Thực Phẩm Chức Năng Bổ Sung Từ Vi Sinh Vật

chúng tôi thực hiện đề tài khoa học công nghệ cấp nhà nước “Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung từ vi sinh vật“ với mong muốn có thể nghiên cứu đưa ra được công nghệ và sản xuất được một số sản phẩm thực phẩm chức năng bổ sung từ các nguồn tự nhiên để hỗ trợ phòng chống và điều trị một số bệnh như cao huyết áp, tiểu đường, thoái hóa khớp. Mục tiêu đề tài: Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất một số protein, peptit chức năng, glucosamine từ vi sinh vật để tạo các sản phẩm thực phẩm chức năng có tác dụng phòng chống bệnh tim mạch, cao huyết áp, tiểu đường và viêm xương khớp. Nội dung đề tài: bao gồm 3 nhiệm vụ sau: 1. Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung chứa pepit có hoạt tính kìm hãm enzim chuyển angiotensin (Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptides) từ vi sinh vật có tác dụng hỗ trợ phòng chống bệnh cao huyết áp, tim mạch. 2. Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung chứa protein giàu crom hữu cơ từ nấm men Saccharomyces cerevisiae (GTF) có tác dụng hỗ trợ phòng chống bệnh tiểu đường typ 2. 3. Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung chứa glucozamin từ vi sinh vật có tác dụng hỗ trợ phòng chống bệnh viêm xương khớp.

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ CÔNG THƯƠNG

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.04/06-10

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

“NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THỰC PHẨM

CHỨC NĂNG BỔ SUNG TỪ VI SINH VẬT"

MÃ SỐ ĐỀ TÀI: KC04.05/06-10

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghiệp thực phẩm

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Nguyễn Thị Hoài Trâm

8570

Hà Nội – 2010

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ CÔNG THƯƠNG

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC.04/06-10

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

“NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THỰC PHẨM

CHỨC NĂNG BỔ SUNG TỪ VI SINH VẬT"

MÃ SỐ ĐỀ TÀI: KC.04.05/06-10 Chủ nhiệm đề tài Cơ quan chủ trì đề tài

PGS.TS Nguyễn Thị Hoài Trâm PGS.TS Lê Đức Mạnh

Ban Chủ nhiệm Chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ

Hà Nội – 2010

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ACE Angiotensin Converting Enzyme – Enzim chuyển angiotensin ACEI Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory – Chất kìm hãm enzim

chuyển angiotensin ACEIPs Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory peptides – Các peptit

kìm hãm enzim chuyển angiotensin ALT Alanin aminotransferase

AST Aspartate aminotransferase

BC Bạch cầu

CT Cholesterol

DOM Các chất hữu cơ hoà tan

EMEA Cơ quan đánh giá các sản phẩm y học châu Âu

FDA Food and Drug Administration – Cơ quan quản lý thực phẩm và

thuốc Hoa Kỳ

GFA1, GlmS Glucosamine-6-phosphate synthase

GFAT Glutamine: fructose-6-phosphate amidotransferase

HAHS Huyết áp hiệu số

HATT Huyết áp tâm thu

HATTr Huyết áp tâm trương

HATB Huyết áp trung bình

JNC Joint National Committee - Liên Ủy ban Quốc gia Hoa Kỳ LDL - C: Cholesterol của lipoprotein có tỷ trọng thấp (cholesterol xấu)

NagA N-acetylglucosamine-6-phosphate deacetylas

NIH Viện sức khoẻ quốc gia Mỹ

NSAIDs Non-steroidal anti-inflammatory drugs

OA Bệnh viêm xương khớp (osteoarthritis)

RAAS Hệ thống Renin – Angiotensin - Aldosterol

UDP-GlcNAc N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase

TC Tiểu cầu

TG Triglycerid

THA Tăng huyết áp

WHO World Health Organization - Tổ chức Y tế thế giới

YHCT Y học cổ truyền

YHHĐ Y học hiện đại

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số chất kìm hãm enzim chuyển angiotensin tổng hợp 7

Bảng 1.2 Một số peptit kìm hãm ACE thu nhận bằng phương pháp enzim từ

Bảng 1.3 Hoạt tính kìm hãm ACE của dịch thủy phân casein bằng một số

loại protease

11

Bảng 1.4 Một số peptit kìm hãm ACE được tổng hợp từ protein sữa bằng

phương pháp lên men

12

Bảng 1.5 Tác dụng hạ huyết áp trên người của một số ACEIPs thương mại 14

Bảng 1.6 Kết quả nghiên cứu tác dụng của crom đối với người mắc bệnh

tiểu đường typ 2

21

Bảng 2.1 Các enzim sử dụng trong nghiên cứu 40

Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu 41

Bảng 2.3 Các thí nghiệm theo ma trận Doehlert 45

Bảng 3.1.1 Khả năng sử dụng các nguồn đường của chủng vi khuẩn DC2 67

Bảng 3.1.2 Hàm lượng peptit và hoạt tính kìm hãm ACE của sản phẩm bột

sấy phun dịch lên men prtein đậu tương 71 Bảng 3.1.3 Khảo sát khả năng lên men tổng hợp ACEIPs từ protein sữa bò của

Bảng 3.1.4 Hoạt tính kìm hãm ACE của dịch sữa bò lên men sử dụng kết hợp

các chủng vi khuẩn lactic

72

Bảng 3.1.5 Hoạt tính kìm hãm ACE của dịch sữa bò lên men sử dụng kết hợp

Lactobacillus bulgaricus Lac 9 với các chủng nấm men Saccharomyces

73

Bảng 3.1.6 Thành phần môi trường, điều kiện lên men thích hợp để tổng hợp

ACEIPs từ sữa bò bằng L bulgaricus Lac 9 và S cerevisae TBS

74

Bảng 3.1.7 So sánh kết quả lên men protein sữa bò để thu nhận các peptit kìm

hãm ACE trên các thiết bị phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm

77

Bảng 3.1.8 So sánh kết quả lên men protein sữa bò để thu nhận các peptit kìm

hãm ACE trên các thiết bị phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm

77

Bảng 3.1.9 Hoạt tính kìm hãm ACE của các peptit thu nhận từ protein sữa bò

theo phương pháp lên men qua từng công đoạn thu hồi, làm sạch

78

Bảng 3.1.10 Kết quả sau tinh sạch dịch lên men protein sữa bò bằng phương

pháp sắc ký lọc gel trên cột Sephadex G-25 78 Bảng 3.1.11 Điều kiện cô dịch chứa ACEIPs từ dịch lên men protein sữa bò 81 Bảng 3.1.12 Danh mục thiết bị trong mô hình sản xuất thực phẩm chức năng bổ

sung Angiofemin chứa các peptit kìm hãm ACE từ protein sữa bò lên men

84

Bảng 3.1.13 Ước tính giá thành sản phẩm thực phẩm chức năng bổ sung

Angiofemin chứa các peptit kìm hãm ACE từ protein sữa bò lên men

85

Bảng 3.1.14 Các chỉ tiêu hoá, lý của sản phẩm Angiofemin chứa ACEIP từ

Bảng 3.1.15 Ảnh hưởng của enzim tiêu hoá pepsin và trypsin đến hoạt tính kìm

hãm ACE sản phẩm bột sấy phun dịch lên men protein sữa bò 86 Bảng 3.1.16 Độ giảm huyết áp trung bình trên chó tại các thời điểm sau khi

Bảng 3.1.19 Kết quả lựa chọn enzim thủy phân casein để thu nhận dịch thủy

Bảng 3.1.20 Hoạt tính kìm hãm ACE của các phân đoạn dịch thủy phân casein

Bảng 3.1.23 Hoạt tính kìm hãm ACE của sản phẩm casein thủy phân thu nhận theo

Bảng 3.1.25 Lựa chọn nguyên liệu để thu nhận ACEIPs từ đậu xanh theo

Bảng 3.1.26 Lựa chọn enzim protease để thủy phân và thu nhận ACEIPs từ

protein đậu xanh tách vỏ

95

Bảng 3.1.27 Lựa chọn điều kiện thủy phân protein đậu xanh bằng Papain 96

Bảng 3.1.28 Hoạt tính kìm hãm ACE của các mẫu sản phẩm chứa ACEIPs thu

nhận từ protein đậu xanh thủy phân bằng Papain

96

Bảng 3.1.29 Lựa chọn điều kiện sấy thu nhận sản phẩm bột chứa ACEIPs từ

protein đậu xanh trên thiết bị sấy phun công suất bốc hơi 5 kg/h

98

Bảng 3.1.30 Lựa chọn điều kiện sấy thu nhận sản phẩm bột chứa ACEIPs từ

protein đậu xanh trên thiết bị sấy phun công suất bốc hơi 5 -25 kg/h

99

Bảng 3.1.31 Ước tính giá thành cho 100 kg sản phẩm thực phẩm chức năng bổ

sung Angiohibin chứa ACEIPs từ protein đậu xanh thủy phân theo phương pháp enzim

101

Bảng 3.1.32 Danh mục thiết bị trong mô hình sản xuất sản phẩm thực phẩm

Bảng 3.1.33 Các chỉ tiêu hoá, lý, vệ sinh an toàn thực phẩm của sản phẩm thực

phẩm chức năng Angiohibin chứa ACEIP từ protein đậu xanh thủy phân theo phương pháp enzim

102

Bảng 3.1.34 Các chỉ tiêu vi sinh vật của sản phẩm Angiohibin chứa ACEIPs từ

protein đậu xanh thủy phân theo phương pháp enzim 103 Bảng 3.1.35 Hàm lượng các axit amin của sản phẩm Angiohibin 103

Bảng 3.1.36 Ảnh hưởng của pepsin và trypsin đến hoạt tính kìm hãm ACE của

sản phẩm bột protein đậu xanh thủy phân bằng phương pháp enzim

104

Bảng 3.1.37 Độ giảm huyết áp trung bình của chó tại các thời điểm sau khi

uống Angiohibin

105

Bảng 3.1.38 Thay đổi nhịp tim chó tại các thời điểm sau khi uống Angiohibin 105

Bảng 3.1.39 Sự thay đổi huyết áp của bệnh nhân sau các đợt điều trị 107

Bảng 3.1.40 Thay đổi huyết áp trung bình của bệnh nhân sau điều trị 107 Bảng 3.1.41 Kết quả nghiên cứu theo độ tăng huyết áp trước và sau điều trị 107

Bảng 3.1.42 Sự biến đổi nhịp tim và mạch của bệnh nhân trước và sau điều trị 108

Bảng 3.2.1 Khả năng phát triển trên môi trường đĩa thạch chứa CrCl3 của các

chủng nấm men Saccharomyces

109 Bảng 3.2.2 Xác định khả năng lên men của các chủng nấm men khi bổ sung

CrCl3 trong môi trường nuôi cấy 111

Bảng 3.2.3 Khả năng tích lũy crom trong sinh khối tế bào nấm men 111

Bảng 3.2.4 Ảnh hưởng của nồng độ CrCl3 trong môi trường nuôi cấy đến sự

phát triển và hấp thụ ion Cr3+của các chủng nấm men

112

Bảng 3.2.5 Ảnh hưởng của nồng độ glucose trong môi trường nuôi cấy đến

khả năng hấp thụ ion Cr3+ của các chủng nấm men 113 Bảng 3.2.6 Nghiên cứu lựa chọn phương thức nuôi cấy và thời điểm bổ sung

muối crom vào môi trường lên men 113 Bảng 3.2.7 Hàm lượng crom hấp thụ trong sinh khối tế bào nấm men nuôi cấy

trong môi trường có bổ sung CrCl3

114

Bảng 3.2.8 So sánh khả năng tích lũy crom khi nuôi cấy nấm men

Bảng 3.2.9 Kết quả làm giàu crom trong sinh khối nấm men sau sản xuất bia 117

Bảng 3.2.10 Hàm lượng protein và crom hữu cơ trong dịch trích ly sinh khối

nấm men giàu crom bằng các phương pháp tách chiết khác nhau 118 Bảng 3.2.11 Nghiên cứu thu nhận sinh khối nấm men giàu crom và sản phẩm

chứa protein nấm men giàu crom bằng phương pháp sấy phun 119

Bảng 3.2.12 Dự kiến giá thành sản phẩm Chromen từ S cerevisiae TBS khi

sản xuất quy mô pilot trên thiết bị lên men 500 lít

122

Bảng 3.2.13 Dự kiến giá thành sản phẩm Chromin từ nấm men giàu crom 123

Bảng 3.2.14 Danh mục các thiết bị trong mô hình sản xuất thực phẩm chức

Bảng 3.2.15 Các chỉ tiêu hóa lý, kim loại nặng của sản phẩm Chromen 124

Bảng 3.2.16 Các chỉ tiêu vi sinh vật của sản phẩm Chromen 124

Bảng 3.2.17 Chỉ tiêu hóa lý, an toàn vệ sinh thực phẩm của sản phẩm Chromin 124

Bảng 3.2:18 Hàm lượng các axit amin của sản phẩm Chromen 125

Bảng 3.2.19 Ảnh hưởng của bột sinh khối nấm men giàu crom Chromen lên

nồng độ glucose máu chuột nhắt trắng bị gây đái đường bằng Streptozocin

126

Bảng 3.2.20 Ảnh hưởng của Chromin lên nồng độ glucose máu chuột nhắt

trắng bị gây đái đường bằng Streptozocin

126

Bảng 3.3.3 Thành phần phản ứng cắt AND plasmit 133

Bảng 3.3.4 Sản phẩm tạo thành được xác định bằng phương pháp Elson và Morgan 135 Bảng 3.3.5 Sự phát triển hệ sợi và bào tử các chủng nấm sợi trên môi trường

thạch và môi trường nuôi cấy lên men chìm 145

Bảng 3.3.6 Hiệu suất tổng hợp sinh khối hệ sợi của các chủng nấm sợi trên

môi trường lên men chứa glucose, cao nấm men và peptone 145

Bảng 3.3.7 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng tổng hợp sinh

khối chứa chitin, chitosan của các chủng nấm sợi

146

Bảng 3.3.8 Hàm lượng glucosamine tách chiết từ sinh khối các chủng nấm sợi

chứa chitin và chitosan trên một số môi trường nuôi cấy khác nhau 146

Bảng 3.3.9 Hàm lượng sinh khối các chủng Aspergillus niger sau các khoảng

Bảng 3.3.10 Hàm lượng glucosamine và N-acetyl-glucosamine trong sinh khối

Bảng 3.3.11 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hiệu suất tổng hợp sinh

khối, các hợp chất chitin và chitosan của R microsporus var

chinensis BG

148

Bảng 3.3.12 Ảnh hưởng của thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy đến

sự tích lũy sinh khối của chủng A niger AN6 149

Bảng 3.3.13 Ảnh hưởng của phương thức nuôi cấy đến sự tổng hợp sinh khối,

chitin, chitosan, glucosamine của

R microsporus var chinensis BG

151

Bảng 3.3.14 Kết quả nuôi cấy thu nhận sinh khối nấm sợi Rhizopus

microsporus var chinensis BG trên thiết bị lên men 500 lít 152 Bảng 3.3.15 Bảng tổng hợp các thông số công nghệ lên men chủng A niger

AN6 quy mô xưởng thực nghiệm trên thiết bị dung tích 100 lít 152 Bảng 3.3.16 Ảnh hưởng của các phương pháp xử lý sinh khối nấm sợi đến hiệu suất

thủy phân thu nhận glucosamine

153

Bảng 3.3.17 Ảnh hưởng của các loại axit khác nhau đến hiệu suất thuỷ phân thu nhận

glucosamine từ sinh khối nấm sợi

153

Bảng 3.3.18 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thủy phân thu nhận glucosamine 154 Bảng 3.3.19 Lựa chọn nhiệt độ kết tủa glucosamine bằng ethanol 95% 155 Bảng 3.3.20 Lựa chọn thời gian kết tủa glucosamine 155 Bảng 3.3.21 Lựa chọn số lần làm sạch glucosamine bằng ethanol 95% 156

Bảng 3.3.22 Ảnh hưởng của phương pháp sấy và thời gian bảo quản đến chất

lượng cảm quan của glucosamine

157

Bảng 3.3.23 Lựa chọn chất bổ sung tạo sản phẩm Glusamin dạng viên nang

Bảng 3.3.24 Ước tính giá thành sản phẩm Glusamin từ sinh khối nấm sợi sản

xuất trên thiết bị lên men dung tích 500 lít 160 Bảng 3.3.25 Danh mục các thiết bị trong mô hình sản xuất thực phẩm chức

Bảng 3.3.26 Một số chỉ số phân tích sản phẩm Glusamin trước khi đóng viên 162

Bảng 3.3.27 Một số chỉ số phân tích sản phẩm Glusamin 162

Bảng 3.3.28 Ảnh hưởng của Glusamin lên số cơn quặn đau của chuột gây đau

bằng acid acetic

163

Bảng 3.3.29 Ảnh hưởng của Glusamin lên thời gian phản ứng với nhiệt độ của

chuột nhắt trắng gây đau bằng phương pháp mâm nóng

163 Bảng 3.3.30 Ảnh hưởng của Glusamin lên trọng lượng u hạt 164

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hệ thống Renin-Angiotensin-Aldosterol (RAAS) 4 Hình 1.2 Enzim chuyển angiotensin phân cắt angiotensin I thành angiotensin

Hình 1.3 Cơ chế gắn vào trung tâm hoạt động của ACE của Angiotensin I và

Hình 3.1.1 Đồ thị khảo sát khả năng lên men tạo ACEIPs của các chủng vi

khuẩn lactic trên môi trường chứa protein đậu tương

67

Hình 3.1.2 So sánh hoạt tính kìm hãm ACE của dịch lên men protein đậu tương

từ các chủng Lactobacillus DC2 và Bacillus subtilis 67

Hình 3.1.3 Hoạt tính kìm hãm ACE của dịch lên men protein đậu tương khi kết

hợp B subtilis TH2 với các chủng nấm men S cerevisiae 68

Hình 3.1.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường (a), protein đậu tương (b), nhiệt

độ (c), và pH (d) đến khả năng tạo peptit trong dịch lên men

69

Hình 3.1.5 Hoạt tính kìm hãm ACE của dịch lên men protein đậu tương trước

và sau khi tối ưu theo thuật toán ma trận Doehlert

70

Hình 3.1.6 So sánh hoạt lực kìm hãm ACE của dịch lên men protein đậu tương

trước và sau khi lọc màng

70

Hình 3.1.7 Động học quá trình lên men protein sữa bò để thu nhận ACEIPs trên

bình lên men 10 lít nuôi cấy tĩnh 75

Hình 3.1.8 Động học quá trình lên men protein sữa bò để thu nhận ACEIPs khi nuôi

Hình 3.1.9 Động học quá trình lên men protein sữa bò để thu nhận ACEIPs khi nuôi

Hình 3.1.10 Sắc ký đồ sản phẩm tinh sạch dịch lên men protein sữa bò từ

L bulgaricus Lac 9 và S cerevisae TBS bằng sắc ký lọc gel

78

Hình 3.1.11 Hình ảnh điện di trên gel polyacrylamide của các mẫu chứa peptit

Hình 3.1.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và thời gian bảo quản đến hoạt tính

kìm hãm ACE của dịch lên men protein sữa bò

80

Hình 3.1.13 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hoạt tính kìm hãm ACE của

sản phẩm thực phẩm chức năng Angiofemin 86 Hình 3.1.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ (a), pH (b), tỷ lệ enzim: cơ chất và thời gian

(c) đến khả năng thủy phân casein của Protease Asp 89 Hình 3.1.15 Ảnh hưởng của tỷ lệ enzim: cơ chất và thời gian phản ứng tới mức

độ thủy phân casein của Nattokinase 90 Hình 3.1.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ (A), tỷ lệ enzim: cơ chất và thời gian phản

ứng (B) tới khả năng thủy phân casein của Flavourzyme 90 Hình 3.1.17 Kết quả chạy sắc ký lọc gel mẫu dịch thủy phân casein 92

Hình 3.1.18 Ảnh hưởng của nhiệt độ, pH và thời gian bảo quản đến hoạt tính

kìm hãm ACE của dịch protein đậu xanh thủy phân bằng enzim

Hình 3.1.20 Kết quả giảm huyết áp theo xếp loại sau điều trị 107

Hình 3.2.1 Sự phát triển của các chủng nấm men Saccharomyces trên môi

trường thạch có chứa CrCl3

110

Hình 3.2.2 Sự phát triển và tích lũy crom trong sinh khối S cerevisiae TBS khi

nuôi cấy theo mẻ (A) và theo mẻ có bổ sung dinh dưỡng (B) trên thiết bị lên men 14 lít

115

Hình 3.2.3 Sự phát triển và tích lũy crom trong sinh khỗi S cerevisiae TBS khi

nuôi cấy theo mẻ có bổ sung dinh dưỡng trên thiết bị lên men 500 lít 115

Hình 3.3.3 Điện di đồ plasmids tái tổ hợp được cắt bằng EcoRI 129

Hình 3.3.4 So sánh trình tự gen GFA1 phân lập với trình tự gen GFA1của S

cerevi siae

130

Hình 3.3.5 Điện di đồ ADN tổng số 131

Hình 3.3.7 Điện di đồ sp cắt bằng enzyme EcoR1 và HindIII 131

Hình 3.3.8 Sản phẩm cắt của vector pESC-His và gen GFA1 132

Hình 3.3.9 Điện di đồ sản phẩm cắt vector tái tổ hợp pESC-His/GFA 1 134

Hình 3.3.10 Kiểm tra kết quả biến nạp vào KY 117 134

Hình 3.3.11 Kết quả biểu hiện GFA1 trong KY117 136

Hình 3.3.12 Điện di đồ sản phẩm cắt pET21a(+)/GFA1 137

Hình 3.3.13 Điện di đồ sản phẩm biểu hiện gen GFA1 trong E.coli 137

Hình 3.3.14 Điện di đồ sản phẩm cắt bằng enzymes XhoI và BamHI 139

Hình 3.3.15 Điện di đồ kiểm tra sự có mặt của gen NagA trong pESC-His 139

Hình 3.3.16 Điện di đồ cắt kiểm tra vector biểu hiện bằng enzyme EcoR1 140

Hình 3.3.17 Kết quả biểu hiện gen NagA trong E.coli 18 142

Hình 3.3.18 Qui trình thu hồi glucosamine từ vi sinh vật tái tổ hợp 144

Hình 3.3.19 Sự thay đổi pH, nồng độ glucose, protein khi nuôi cấy theo mẻ (A),

theo mẻ có bổ sung glucose (B), bổ sung glucose và cao nấm men (C)

150

Hình 3.3.20 Sự thay đổi pH, nồng độ glucose, protein khi nuôi cấy Rhizopus

microsporus var chinensis BG theo mẻ có bổ sung glucose (A) và

bổ sung thêm glucose và cao nấm men (B) trên thiết bị lên men 500 lít

151

Hình 3.3.21 Phổ LC-MSD của glucosamine từ thành tế bào A niger AN6 156

Hình 3.3.22 Sắc ký đồ phân tích glucosamine từ sinh khối nấm sợi R microsporus

var chinensis BG

156

M ỤC L ỤC

Trang

1.1 CÁC PEPTIT KÌM HÃM ENZIM CHUYỂN ANGIOTENSIN

(ACEIPs) TỪ NGUỒN PROTEIN THỰC PHẨM

3

1.1.1 Enzim chuyển angiotensin (ACE) và sự tăng huyết áp 3

1.1.2 Peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin (ACEIPs) 6

1.1.2.3 Tính chất và ứng dụng của ACEIPs 8 1.1.3 Công nghệ sản xuất các peptit kìm hãm enzim chuyển

angiotensin từ protein thực phẩm

9

1.1.3.1 Sản xuất ACEIPs bằng phương pháp enzim 10 1.1.3.2 Sản xuất ACEIPs bằng phương pháp lên men 11 1.1.4 Thử nghiệm và ứng dụng ACEIPs từ protein thực phẩm 13

1.2 PROTEIN CHỨC NĂNG TỪ SINH KHỐI NẤM MEN CÓ CHỨA

CROM HỮU CƠ

1.3.2 Công nghệ sản xuất glucosamine 29 1.3.2.1 Sản xuất glucosamine từ vỏ các loài giáp xác 30 1.3.2.2 Nghiên cứu, sản xuất glucosamine từ sinh khối nấm sợi 31 1.3.2.3 Nghiên cứu tổng hợp glucosamine bằng các chủng vi sinh vật

tái tổ hợp tạo chủng vi sinh vật biến đổi gen tổng hợp glucosamine cao

2.1.2 Vi sinh vật và phương pháp nuôi cấy 40

2.1.2.2 Môi trường và điều kiện nuôi cấy nấm men 41 2.1.2.3 Môi trường và điều kiện nuôi cấy vi khuẩn 42 2.1.2.4 Môi trường và điều kiện nuôi cấy nấm sợi 42 2.1.3 Hoá chất, thuốc thử, động vật, thiết bị dụng cụ sử dụng trong

nghiên cứu độc tính bán trường diễn và tác dụng dược lý trên động vật thực nghiệm

43

2.2.1 Phương pháp phân lập các chủng vi khuẩn lactic 44

2.2.2 Định tên các chủng nấm men, nấm mốc bằng phương pháp

giải trình tự rADN đoạn gen ITS-D1D2

44

2.2.3 Phương pháp sàng lọc các chủng nấm men có khả năng chống

chịu ion kim loại bằng test thử khuếch tán trên đĩa thạch

45

2.2.4 Phương pháp thu nhận protein đậu xanh 45 2.2.5 Thu nhận các peptit kìm hãm ACE từ protein thực phẩm 46 2.2.6 Phương pháp quy hoạch thực nghiệm sử dụng ma trận

Doehlert

46

2.2.7 Phương pháp tách và tinh sạch ACEIPs2.2.8 Thu nhận, xử lý

sinh khối nấm men chứa crom

2.3.1 Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm ACE 48

2.3.2 Phương pháp xác định hàm lượng peptit, protein 48 2.3.3 Phương pháp xác định độ bền của các peptit kìm hãm ACE

với nhiệt độ, pH, enzim tiêu hóa pepsin, trypsin và thời gian bảo quản

49

2.3.4 Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ 49 2.3.5 Phương pháp phân tích hàm lượng crom 49 2.3.6 Phân tích hàm lượng glucosamine bằng phương pháp đo

thực nghiệm theo đường uống

Chương 3: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC 66

3.1 NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THƯC PHẨM CHỨC

NĂNG BỔ SUNG CHỨA PEPTIT CÓ HOẠT TÍNH KÌM HÃM

ENZIM CHUYỂN ANGIOTENSIN TỪ VI SINH VẬT CÓ TÁC

DỤNG HỖ TRỢ PHÒNG CHỐNG BỆNH CAO HUYẾT ÁP, TIM

MẠCH

66

3.1.1 Nghiên cứu sản xuất các peptit kìm hãm enzim chuyển

angiotensin (ACEIPs) từ protein đậu tương bằng phương pháp lên men

66

3.1.1.1 Khảo sát và lựa chọn các chủng vi sinh vật có khả năng lên

men tổng hợp ACEIPs trên môi trường có chứa protein đậu tương

66

3.1.1.3 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu 68 3.1.1.3 Tinh sạch ACEIPs từ dịch lên men có chứa protein đậu tương 70 3.1.1.4 Tạo sản phẩm dạng bột chứa ACEIPs từ protein đậu tương

theo phương pháp lên men

71

3.1.2 Nghiên cứu công nghệ sản xuất các peptit kìm hãm enzim

chuyển angioten sin (ACEIPs) từ protein sữa bò bằng phương pháp lên men

71

3.1.2.1 Nghiên cứu lựa chọn các chủng vi sinh vật có khả năng lên

men tổng hợp ACEIPs từ protein sữa bò

71

3.1.2.2 Nghiên cứu nâng cao hiệu suất lên men tổng hợp ACEIPs từ

protein sữa bò bằng Lb bulgaricus Lac9 và S cerevisae TBS

73

3.1.2.3 Nghiên cứu thu nhận, làm sạch và phân tích các peptit kìm

hãm ACE từ protein sữa bò theo phương pháp lên men

77

3.1.2.4 Nghiên cứu tạo sản phẩm thực phẩm chức năng giàu peptit ức

chế enzim chuyển angiotensin từ nguồn protein sữa bò

81

3.1.2.5 Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ, xây dựng mô

hình pilot, sản xuất thực nghiệm thực phẩm chức năng bổ sung từ vi sinh vật có tác dụng hỗ trợ phòng chống bệnh cao huyết áp

81

3.1.2.6 Phân tích thành phần, chỉ tiêu vệ sinh an toàn thực phẩm, độc

tính và tác dụng dược lý của sản phẩm chứa ACEIPs từ protein sữa bò lên men

85

3.1.3 Nghiên cứu sản xuất (ACEIPs) từ casein bằng phương

pháp enzim

89

3.1.3.1 Nghiên cứu lựa chọn enzim thủy phân casein 89

3.1.3.2 Xác định hoạt tính kìm hãm ACE của các phân đoạn peptit từ

dịch thủy phân casein

91

3.1.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt tính

kìm hãm ACE của dịch thủy phân casein

92

3.1.3.4 Thu nhận sản phẩm dạng bột chứa ACEIPs từ casein thủy

phân

93

3.1.4 Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ

sung chứa các peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin

từ protein đậu xanh theo phương pháp enzim

94

3.1.4.1 Lựa chọn nguyên liệu protein đậu xanh cho nghiên cứu, sản

xuất

94

3.1.4.2 Nghiên cứu lựa chọn enzim protease và điều kiện thủy phân

protein đậu xanh tách vỏ để thu nhận ACEIPs

95

3.1.4.3 Nghiên cứu xác định một số tính chất của ACEIPs từ protein

đậu xanh thủy phân bằng Papain

97

3.1.4.4 Nghiên cứu lựa chọn công nghệ và thiết bị sản xuất thực

phẩm chức năng chứa ACEIPs từ protein đậu xanh bằng phương pháp enzim quy mô xưởng thực nghiệm

98

3.1.4.5 Nghiên cứu hoàn thiện quy trình công nghệ, xây dựng mô

hình pilot, sản xuất thực nghiệm thực phẩm chức năng bổ sung chứa peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin từ protein đậu xanh thủy phân theo phương pháp enzim

99

3.1.4.6 Kiểm tra, phân tích chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, độc

tính cấp, độc tính bán trường diễn, tác dụng dược lý của sản phẩm chứa ACEIPs từ protein đậu xanh thủy phân theo phương pháp enzim

102

3.1.4.7 Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng tác dụng của thực phẩm

chức năng bổ sung Angiohibin trên người bệnh cao huyết áp

106

3.2 NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC

NĂNG CHỨA PROTEIN GIÀU CROM HỮU CƠ TỪ NẤM MEN

SACCHAROMYCES CEREVISIAE CÓ TÁC DỤNG HỖ TRỢ

PHÒNG CHỐNG BỆNH TIỂU ĐƯỜNG TYP 2

109

3.2.1 Khảo sát và lựa chọn các chủng nấm men có khả năng tích

lũy crom cao

109

3.2.1.1 Khảo sát và lựa chọn các chủng nấm men chống chịu cao với

nồng độ ion crom hóa trị 3 (Cr3+) trên đĩa thạch

109

3.2.1.2 Nghiên cứu lựa chọn các chủng nấm men có khả năng tích lũy

Cr3+ từ môi trường lên men chìm

110

3.1.2 Nghiên cứu lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp để nâng

cao khả năng hấp thụ crom của hai chủng S carlsbergensis BQN và S cerevisiae TBS

112

3.2.2 Nghiên cứu công nghệ lên men, thu nhận protein chức năng

giàu crom từ nấm men quy mô phòng thí nghiệm và xưởng thực nghiệm

114

3.2.2.1 Nghiên cứu động học quá trình lên men, tích lũy crom trong

sinh khối tế bào nấm men trên thiết bị 14 lít

114

3.2.2.2 Kết quả lên men, thu nhận nấm men giàu crom trên thiết bị

500 lít

114

3.2.2.3 Nghiên cứu thu nhận nấm men giàu crom từ sinh khối nấm

men sau sản xuất bia

116

3.2.3. Nghiên cứu lựa chọn công nghệ và thiết bị tách chiết, làm

sạch hợp chất chứa crom hữu cơ từ sinh khối nấm men giàu crom

117

3.2.4 Nghiên cứu lựa chọn công nghệ, thiết bị để thu nhận sản

phẩm thực phẩm chức năng bổ sung chứa protein chức năng giàu crom

119

3.2.5 Hoàn thiện quy trình công nghệ, xây dựng mô hình pilot, sản

xuất thực nghiệm thực phẩm chức năng bổ sung có chứa crom hữu cơ từ nấm men

119

3.2.6 Kiểm tra, phân tích chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm của

sản phẩm thực phẩm chức năng có tác dụng hỗ trợ phòng chống bệnh tiểu đường typ 2 Phân tích độc tính cấp, độc tính bán trường diễn và tác dụng dược lý trên động vật thử nghiệm

3.3 NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THỰC PHẨM CHỨC

NĂNG BỔ SUNG CHỨA GLUCOSAMINE TỪ VI SINH VẬT CÓ

chứa glucosamine từ sinh khối nấm sợi

145

3.3.2.1 Nghiên cứu khảo sát, lựa chọn các chủng nấm sợi có khả năng

tổng hợp sinh khối hệ sợi chứa các hợp chất chitin, chitosan cao để thu nhận glucosamine

145

3.3.2.2 Nghiên cứu các điều kiện công nghệ lên men thu nhận sinh

khối hệ sợi để tách chiết glucosamine từ các chủng nấm sợi

Rhizopus microsporus var chinensis BG và A niger AN6 quy

mô PTN, XTN

148

3.3.2.3 Nghiên cứu lựa chọn công nghệ và thiết bị tách chiết, làm

sạch và thu glucosamine từ sinh khối nấm sợi

152

3.3.2.4 Nghiên cứu lựa chọn công nghệ và thiết bị tạo sản phẩm thực

phẩm chức năng bổ sung chứa glucosamine từ sinh khối nấm sợi

156

3.3.2.5 Hoàn thiện quy trình công nghệ, xây dựng mô hình pilot và

sản xuất thực nghiệm

158

3.3.2.6 Kiểm tra, phân tích chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, độc

tính cấp, độc tính bán trường diễn của sản phẩm thực phẩm chức năng Glusamin chứa glucosamine sinh khối nấm sợi

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

BỘ CÔNG THƯƠNG

VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

Hà Nội, ngày 31 tháng 12 năm 2010

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên đề tài: Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung từ vi sinh vật

Mã số đề tài: KC.04.05/06-10

Thuộc: Chương trình KH&CN trọng điểm cấp nhà nước KC.04/06-10

“Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học”

2 Chủ nhiệm đề tài:

Họ và tên: Nguyễn Thị Hoài Trâm

Ngày, tháng, năm sinh: 19/05/1957 Nam/ Nữ: Nữ

Học hàm, học vị: PGS.TS

Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên chính Chức vụ: Phó Viện trưởng

Điện thoại: 04 3858 3097; Tổ chức: 04 38584318;

Nhà riêng: 04 6269 1584; Mobile: 0904310544

Fax: 04 3858 4554; E-mail: tramnh@firi.ac.vn; tramfiri@yahoo.com

Tên tổ chức đang công tác: Viện Công nghiệp thực phẩm

Địa chỉ tổ chức: 301, Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: P309, Nhà E3B, Khu Đô thị Yên Hòa, Đường Trung Yên 1, Phường

Yên Hòa, Quận Cầu Giấy, Hà Nội

3 Tổ chức chủ trì đề tài:

Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Công nghiệp thực phẩm

Điện thoại: 04 3858 4318; Fax: 04 3858 4554;

E-mail: manh@firi.ac.vn ; Website: www firi.ac.vn

Địa chỉ: 301, Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Lê Đức Mạnh

Số tài khoản: 931.01.016

Ngân hàng: tại Kho bạc Nhà nước Thanh Xuân Hà Nội

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Công Thương

a) Tổng số kinh phí thực hiện: 3.400 triệu đồng, trong đó: Kinh phí hỗ trợ từ SNKH: 3.300

triệu đồng Kinh phí từ các nguồn khác: 100 triệu đồng

b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH: Đơn vị: đồng

Theo kế hoạch Thực tế đạt được

- Lý do thay đổi (nếu có):

3 Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài: (Liệt kê các quyết định, văn bản

của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều

chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện nếu có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn,

kiến nghị điều chỉnh nếu có)

Số

Quyết định, văn bản của cơ quan quản lý

1 Quyết định số 263/QĐ-BKHCN

ngày 21 tháng 02 năm 2006 về việc thành lập Hội đồng khoa học công nghệ cấp Nhà nước tư vấn tuyển chọn, xét chọn tổ chức và cá

nhân chủ trì thực hiện đề tài cấp Nhà nước để thực hiện trong kế hoạch năm 2006 thuộc Lĩnh vực Công nghệ sinh học

2 Quyết định số 769/QĐ-BKHCN

ngày 19 tháng 4 năm 2006 về việc phê duyệt các tổ chức và cá nhân trúng tuyển chủ trì thực hiện đề tài, dự án SXTN năm 2006 thuộc

Lĩnh vực Công nghệ sinh học

3 Quyết định số 2092/QĐ-BKHCN

ngày 22 tháng 9 năm 2006 về việc phê duyệt chủ nhiệm, cơ quan chủ trì và kinh phí các đề tài, dự án bắt đầu thực hiện năm 2006 thuộc

Chương trình khoa học và công nghệ trọng điểm cấp nhà nước giai đoạn 2006-2010 “Nghiên cứu, phát triển

ngày 15 tháng 10 năm 2007 về việc phê duyệt kế hoạch đấu thầu mua sắm hàng hóa cho đề tài thuộc Chương trình “Nghiên cứu, phát

triển và ứng dụng công nghệ sinh học”, mã số KC.04.05/06-10

6 Quyết định số 0871/QĐ-BCT ngày

01 tháng 10 năm 2007 của Bộ

trưởng Bộ Công Thương

về việc cử cán bộ đi công tác tại Đài Loan

7 Quyết định số 1120/QĐ-BCT ngày

17 tháng 10 năm 2007 của Bộ

trưởng Bộ Công Thương

về việc cử đoàn cán bộ đi công tác tại Canada

8 Quyết định số 2166/QĐ-BKHCN

ngày 29 tháng 9 năm 2009

về việc điều chỉnh thời gian thực hiện của đề tài KC.04.05/06-10 thuộc chương trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nước giai đoạn 2006-2010 “Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học”, Mã

số KC.04/06-10

9 Quyết định số 1499/QĐ - BKHCN

ngày 05 tháng 8 năm 2009 Về việc phê duyệt kế hoạch đấu thuầ mua sắm vật tư, hóa chất của đề tài KC.04.05 thuộc chương trình

“Nghiên cứu phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học” mã số KC.04/06-10

ngày 08 tháng 10 năm 2009 Về việc điều chỉnh nội dung và kinh phí của đề tài KC.04.05/06-10

Văn bản của Tổ chức chủ trì đề tài

1 Công văn số 26/CV-VTP ngày 1

tháng 4 năm 2008 của Viện trưởng

Viện Công nghiệp thực phẩm

Gửi Bộ Khoa học và Công nghê, Văn phòng các chương trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nước về việc xin mua bổ sung thiết bị trong đề tài nhà nước KC.04.05/06-10

2 Công văn số 105/CV-VTP ngày 13

tháng 8 năm 2009 của Viện trưởng

Viện Công nghiệp thực phẩm

Gửi Ban chủ nhiệm Chương trình KC.04/06-10, Văn phòng các chương trình KH&CN trọng điểm cấp Nhà nước giai đoạn 2006-2010 về việc xin điều chỉnh nội dung và gia hạn thực hiện đề tài KC.04.05/06-10

4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án:

Nội dung

Nghiên cứu tổng hợp, thu nhận peptit

có hoạt tính kìm hãm enzim chuyển angiotensin từ protein đậu tương quy mô PTN

- 01 chủng vi khuẩn B subtilis; 01 công bố; 01 Thạc sĩ

- Báo cáo kết quả nghiên cứu công nghệ sản xuất TPCN chứa ACEIPs

từ protein đậu tương lên men (sử

Hà Nội

Nghiên cứu tổng hợp, thu nhận peptit

có hoạt tính kìm hãm enzim chuyển angiotensin từ casein quy mô PTN

- 01 bài công bố; 01 Thạc sĩ

- 01 Báo cáo kết quả nghiên cứu công nghệ sản xuất TPCN chứa ACEIPs từ casein thủy phân theo phương pháp enzim quy mô PTN

Nghiên cứu tổng hợp glucosamine từ

vi sinh vật tái tổ hợp quy mô PTN

- 03 chủng vsv tái tổ hợp; 01 phương pháp tạo chủng vsv tái tổ hợp; Glucosamine từ vsv tái tổ hợp; 02 bài công bố; 01 Thạc sĩ;

- 01 Báo cáo kết quả nghiên cứu tổng hợp glucosamine từ vi sinh vật tái tổ hợp quy mô PTN

3 Liên hiệp Khoa

học sản xuất CN

sinh học và Môi

trường

Liên hiệp Khoa học sản xuất CN sinh học và Môi trường

Nghiên cứu tổng hợp glucosamine từ vsv quy mô PTN, XTN

- 01 chủng Aspergillus niger AN6;

Glucosamine từ sinh khối nấm sợi;

01 bài công bố

- 01 Báo cáo kết quả nghiên cứu sản xuât glucosamine từ sinh khối

nấm sợi A niger quy mô XTN

trên thiết bị lên men 100 lít

4 Đại học Y Hà

Nội: Bộ môn

Dược lý

Đại học Y Hà Nội: Bộ môn Dược lý

Phân tích độc tính bán trường diễn, tác dụng dược lý của các sản phẩm

Báo cáo chuyên để nghiên cứu xác định độc tính bán trường diễn, tác dụng dược lý của các sản phẩm

Báo cáo chuyên để nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trên người bệnh cao huyết áp, thoái hóa khớp (*)

- Lý do thay đổi: (*): Được điều chỉnh giảm thử nghiệm lâm sàng trên bệnh nhân tiểu đường typ 2

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:

Nội dung tham gia

1 Nguyễn Thị

Hoài Trâm Nguyễn Thị Hoài Trâm

2 Đỗ Thị Thanh

Huyền Đỗ Thị Thanh Huyền

3 Đỗ Thị Thuỷ Lê Đỗ Thị Thuỷ

Toàn

Nghiên cứu, sản xuất peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin, protein chức năng chứa crom và glucosamine từ vsv quy mô PTN, XTN

- 03 Sản phẩm thực phẩm chức

năng bổ sung Angiohibin (cho người cao huyết áp), Chromen (cho người tiểu đường typ 2),

Glusamin (cho người bệnh

thoái hóa khớp); 04 Quy trình công nghệ, 01 Mô hình pilot;

06 bài công bố; 06 Thạc sĩ

- 01 Báo cáo tổng hợp kết quả KHCN của đề tài

7 Quản Lê Hà Quản Lê Hà Nghiên cứu tổng hợp,

thu nhận peptit có hoạt tính kìm hãm enzim chuyển angiotensin từ casein quy mô PTN

- 01 bài công bố; 01 Thạc sĩ

- 01 Báo cáo tổng kết đề tài nhánh

8 Trần Liên Hà Trần Liên Hà Nghiên cứu tổng hợp,

thu nhận peptit có hoạt tính kìm hãm enzim chuyển angiotensin từ protein đậu tương quy

Nghiên cứu tổng hợp glucosamine từ vsv quy

Kim Cúc Nguyễn Thị Kim Cúc Nghiên cứu tổng hợp glucosamine từ vi sinh

vật tái tổ hợp quy mô PTN

- 03 chủng vsv tái tổ hợp; 01 phương pháp tạo chủng vsv tái

Báo cáo chuyên để nghiên cứu xác định độc tính bán trường diễn, tác dụng dược lý của các sản phẩm

12 Lê Thị Hiền Lê Thị Hiền Thử nghiệm lâm sàng

trên các bệnh nhân cao huyết áp

Báo cáo chuyên để nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trên người bệnh cao huyết áp

Phương

Thử nghiệm lâm sàng trên các bệnh nhân thoái hóa khớp

Báo cáo chuyên để nghiên cứu

hử nghiệm lâm sàng trên người bệnh thoái hóa khớp

Lý do thay đổi (nếu có): ThS Lê Thị Mai Hương chuyển công tác tháng 5 năm 2008

ThS Phạm Đức Toàn, PGS.TS.BS Đỗ Thị Phương là phụ trách thực hiện các nhánh/đề mục

quan trọng của đề tài

6 Tình hình hợp tác quốc tế:

Số

Đoàn đi Canada:

Số lượng người: 3 người Thời

gian: 9 ngày Địa điểm: Viện

Khoa học Công nghệ quốc gia,

ĐH TH Quebec, Canada

Kinh phí: 126 triệu đồng

Đoàn đi Đài Loan :

Số lượng người: 2 người Thời

gian: 14 ngày Địa điểm: Trường

Đại học Công nghệ Mingchi; Viện

Nghiên cứu và phát triển thực

phẩm, Đài Loan, Trung Quốc

Kinh phí: 74 triệu đồng

Đoàn ra: 02

Đoàn đi Canada:

Số lượng người: 3 người Thời gian: 9 ngày, từ 11-20/11/2007 Địa điểm: Viện Khoa học Công nghệ quốc gia, ĐH

TH Quebec, Canada

Kinh phí: 126 triệu đồng

Đoàn đi Đài Loan :

Số lượng người: 2 người Thời gian: 45 ngày, từ 15/9

đến 30/11/2007 (Phía bạn đã hỗ trợ thêm tiền ăn ở để

có thể kéo dài thời gian thực tập 6 tuần) Địa điểm: Trường Đại học Công nghệ Mingchi; Viện

Nghiên cứu và phát triển thực phẩm, Đài Loan, Trung

Quốc Kinh phí: 74 triệu đồng

Số lượng người: 1 người Thời

gian: 7 ngày Từ nước: CHLB

Đức, (Công ty Công nghệ sinh học

- Lý do thay đổi (nếu có):

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

Số

cứu, sản xuất và ứng dụng peptit chức năng

từ vi sinh vật Thời gian: 2008 Kinh phí: 5

triệu đồng Địa điểm: Viện Công nghiệp

thực phẩm

Hội thảo chuyên đề 1: Nội dung: Nghiên

cứu, sản xuất và ứng dụng peptit chức năng từ

vi sinh vật Thời gian: 2008 Kinh phí: 5 triệu đồng Địa điểm: Viện Công nghiệp thực phẩm

cứu, sản xuất và ứng dụng protein chức

năng chứa crom hữu cơ từ vi sinh vật

Thời gian: 2008 Kinh phí: 5 triệu đồng

Địa điểm: Viện Công nghiệp thực phẩm

Hội thảo chuyên đề 2: Nội dung: Nghiên

cứu, sản xuất và ứng dụng protein chức năng

chứa crom hữu cơ từ vi sinh vật

Thời gian: 2008 Kinh phí: 5 triệu đồng Địa điểm: Viện Công nghiệp thực phẩm

cứu, sản xuất và ứng dụng glucozamin từ

vi sinh vật Thời gian: 2008 Kinh phí: 5

triệu đồng Địa điểm: Viện Công nghiệp

thực phẩm

Hội thảo chuyên đề 3: Nội dung: Nghiên

cứu, sản xuất và ứng dụng glucozamin từ vi

sinh vật Thời gian: 2008 Kinh phí: 5 triệu đồng Địa điểm: Viện Công nghiệp thực phẩm

- Lý do thay đổi (nếu có):

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

1 Nghiên cứu khảo sát, lựa chọn và nâng cao

hoạt tính của các chủng vi khuẩn

Lactobacillus tổng hợp peptit chức năng có

hoạt tính kìm hãm enzim chuyển angiotensin;

nấm men Saccharomyces có khả năng tích luỹ

crom hữu cơ; nấm sợi Aspergillus/Mucor và

tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp có khả năng

tổng hợp glucozamin

1/2007 6/2008 1/2007 6/2008 N.T.H Trâm, Viện CNTP; Quản Lê Hà,

Trần Liên Hà, Viện CNSH &CNTP, ĐHBK HN; Phạm Việt Cường, Liên hiệp KHSX CNSH

và MT; Nguyễn Thị Kim Cúc, Viện CNSH,

và các cộng sự

2 Nghiên cứu các điều kiện công nghệ lên men

thu nhận các protein, peptit chức năng và

glucozamin có tác dụng hỗ trợ phòng chống

bệnh cao huyết áp, tim mạch, tiểu đường typ

2, viêm xương khớp quy mô PTN, XTN

7/2007 9/2008

7/2007 9/2008

N.T.H Trâm,

Q L Hà, T.L Hà, P.V Cường N.T.K Cúc

và các cộng sự

3 Nghiên cứu lựa chọn công nghệ và thiết bị

tách chiết, làm sạch, phân tích các protein,

peptit chức năng và glucozamin từ vi sinh vật

có tác dụng hỗ trợ phòng chống bệnh cao

huyết áp, tim mạch, tiểu đường typ 2, viêm

xương khớp quy mô PTN, XTN

10/2007 12/2008 10/2007 12/2008 N.T.H Trâm, Q L Hà, T L Hà,

P.V Cường, N.T.K Cúc

và các cộng sự

4 Nghiên cứu lựa chọn công nghệ và thiết bị tạo

chế phẩm thực phẩm chức năng bổ sung chứa

các protein, peptit chức năng và glucozamin

từ vi sinh vật có tác dụng hỗ trợ phòng chống

bệnh cao huyết áp, tim mạch, tiểu đường typ

2, viêm xương khớp quy mô PTN, XTN

1/2008 12/2008 12/2008 1/2008 N.T.H Trâm, Q L Hà, TS T.L.Hà,

P.V Cường, N.T.K Cúc

và các cộng sự

5 Hoàn thiện quy trình công nghệ, xây dựng mô

hình pilot, sản xuất thực nghiệm thực phẩm

chức năng bổ sung từ vi sinh vật có tác dụng

hỗ trợ phòng chống bệnh cao huyết áp, tim

mạch, tiểu đường typ 2, viêm xương khớp

1/2008 6/2009

1/2008 6/2009

N.T.H Trâm , P.V Cường,

và các cộng sự

6 Kiểm tra, phân tích thành phần, hoạt chất

chức năng và chất lượng vệ sinh an toàn thực

phẩm; Phân tích độc tính cấp, độc tính bán

trường diễn, tác dụng dược lý của các sản

phẩm thực phẩm chức năng bổ sung từ vi sinh

vật trên động vật thử nghiệm

10/2008 9/2009 10/2008 5/2010 N.T.H Trâm; Nguyễn Trọng Thông,

ĐH Y Hà Nội

và các cộng sự

7 Thử nghiệm lâm sàng tác dụng của các thực

phẩm chức năng bổ sung từ vi sinh vật trên

các bệnh nhân cao huyết áp, tim mạch, tiểu

đường typ 2, viêm xương khớp

4/2009 9/2009 10/2009 6/2010 Lê Thị Hiền, Đỗ Thị Phương, ĐH Y

Hà Nội

và các cộng sự

8 Hoàn thiện sản phẩm, xây dựng và công bố

tiêu chuẩn sản phẩm, giới thiệu, quảng cáo

- Lý do thay đổi (nếu có):

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được

1 Thực phẩm chức năng bổ sung chứa peptit

kìm hãm enzim chuyển angiotensin từ vi sinh vật

có tác dụng hỗ trợ phòng chống bệnh cao huyết

áp, tim mạch

2 Thực phẩm chức năng bổ sung chứa protein

giàu crom hữu cơ từ nấm men có tác dụng phòng

chống bệnh tiểu đường typ 2

3 Thực phẩm chức năng bổ sung chứa

1,5

3,0 3,0

50,0

7,0 7,0

2 Mô hình sản xuất quy mô pilot:

Mô hình pilot với hệ thống thiết bị lên men và các

thiết bị thu hồi, tạo sản phẩm như sấy phun, đông

khô,…

Mô hình

3 Bộ giống vi sinh vật: 08

- Giống vi khuẩn Lactobacillus tổng hợp peptit

kìm hãm ACE: Hoạt lực kìm hãm ACE (IC 50 ) đạt

- Vi sinh vật tái tổ hợp mang gen mã hoá tổng hợp

glucozamin: E coli mang gen nagA; S.c mang

gen GFA1

Chủng Chủng Chủng Chủng

1 phương pháp tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp mang

gen mã hoá tổng hợp glucosamine

cho sản phẩm: Thực phẩm chức năng Glusamin

- Chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm số CNTC ngày 31 tháng 12 năm 2010

cho sản phẩm: Thực phẩm chức năng: Angiohibin

3 Quy

trình 3 Quy trình công nghệ sản xuất 4 Quy trình công nghệ: - Quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ

công

nghệ protein, peptit chức năng và

glucozamin từ vi sinh vật

sung chứa các peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin

từ protein sữa bò theo phương pháp lên men quy mô xưởng thực nghiệm;

- Quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung chứa các peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin

từ protein đậu xanh theo phương pháp thủy phân enzim quy mô xưởng thực nghiệm;

- Quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ

sung chứa sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisae

giàu crom hữu cơ quy mô xưởng thực nghiệm;

- Quy trình công nghệ sản xuất thực phẩm bổ sung chứa glucosamine từ sinh khối nấm sợi quy mô xưởng thực nghiệm

c) Sản phẩm Dạng III:

Yêu cầu khoa học cần đạt

Số

1 Công bố kết quả nghiên cứu, sản xuất thực

nghiệm và ứng dụng các protein, peptit

chức năng, glucozamin từ vi sinh vật 9 11 2009-2010

d) Kết quả đào tạo:

sinh vật (hoặc peptit chức

năng, hoặc glucozamin) có

tác dụng hỗ trợ phòng chống

bệnh tiểu đường typ 2 (hoặc

bệnh cao huyết áp, tim mạch, hoặc bệnh về xương khớp)

- 01 Đơn đăng ký Bằng độc quyền giải pháp

hữu ích “Công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung “Angiohibin” chứa các peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin từ protein đậu xanh thủy phân theo phương pháp enzim”

Bệnh viện Y học cổ truyền

Hà Đông, Hà

- Angiohibin kết hợp với Natrilix có tác dụng hỗ trợ điều trị đối với bệnh nhân tăng huyết áp nguyên phát độ I và bước đầu tỏ ra có xu hướng cải thiện

trên bệnh nhân cao

huyết áp nguyên

phát độ 1

29/6/ 2010 Nội tốt hơn nhóm chứng, được thể hiện qua

các chỉ số huyết áp tâm thu, huyết áp tâm trương, huyết áp trung bình đều giảm sau các thời điểm điều trị Hiệu quả điều trị chung loại tốt 80%, loại khá 16,7%, loại trung bình 3,3%, không có loại kém Cải thiện tốt một số triệu chứng cơ năng trên lâm sàng như: đau đầu, bốc hỏa, hoa mắt, chóng mặt, mất ngủ, ù tai Không làm ảnh hưởng đến nhịp tim và mạch

- Các chỉ số về huyết học, sinh hóa máu trước và sau đợt điều trị không thay đổi

- Sản phẩm Angiohibin không gây các biểu hiện mẫn ngứa, đau đầu, rối loạn tiêu hóa khi sử dụng

2 Thử nghiệm lâm

sàng tác dụng của

thực phẩm chức

năng Glusamin trên

bệnh nhân thoái hóa

khớp gối

Từ 1/11/2009 đến 15/5/2010

Bệnh viện Đông Y Hà Nội

- Sản phẩm Glusamin có tác dụng hỗ trợ giảm đau khớp gối; có tác dụng phục hồi chức năng vận động khớp gối

- Khi dùng sản phẩm Glusamin không

có biểu hiện tác dụng không mong muốn nào trên lâm sàng và không làm ảnh hưởng tới chức năng tạo máu, chức năng gan, thận của bệnh nhân

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực và thế giới…)

- Công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng chứa các peptit có hoạt tính kìm hãm

enzim chuyển angiotensin (Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptides – ACEIPs) từ protein thực phẩm bằng phương pháp lên men và thủy phân enzim có tác dụng hỗ trợ phòng chống và điều trị bệnh cao huyết áp, tim mạch; Công nghệ sản xuất glucosamine từ sinh khối nấm sợi và từ vi sinh vật tái tổ hợp tạo thực phẩm chức năng

có tác dụng hỗ trợ phòng chống và điều trị bệnh thoái hóa khớp của đề tài đã tiếp cận với trình độ khoa học tiên tiến, tương đương với các nghiên cứu hiện nay ở các nước

phát triển như Trung Quốc, Hàn Quốc…

- Trong đề tài sử dụng kết hợp các công nghệ hiện đại như công nghệ gen, vi sinh,

enzim, các phương pháp tách chiết, tinh sạch, phân tích hiện đại vì vậy kết quả nghiên cứu, các sản phẩm của đề tài có giá trị khoa học và thực tiễn cao

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm

cùng loại trên thị trường…)

- Các sản phẩm của đề tài góp phần tạo ra sản phẩm mới, an toàn và có tác dụng hỗ trợ nâng cao sức khỏe cộng đồng

- Năng lực của đội ngũ cán bộ nghiên cứu tham gia thực hiện đề tài được nâng cao Góp phần củng cố, phát triển mối liên kết trong nghiên cứu, sản xuất thực nghiệm, trao đổi kinh nghiệm phát triển và ứng dụng công nghệ, sản phẩm công nghệ sinh học giữa các Viện nghiên cứu, trường đại học và các doanh nghiệp sản xuất

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

Số

Thời gian thực hiện

Ghi chú

(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ trì…)

1 Lần 1 9/2009 Đề tài thực hiện đúng nội dung và tiến độ Đã có các sản

phẩm như chủng giống vi sinh vật, bài báo công bố, đào tạo đại học và sau đại học

2 Lần 2 3/2008 Đề tài thực hiện đúng nội dung và tiến độ Đã có các sản

phẩm như chủng giống vi sinh vật, bài báo công bố, đào tạo đại học và sau đại học

3 Lần 3 3/2009 Đề tài thực hiện đúng nội dung và tiến độ năm 2007 và

2008 Do tình hình biến động giá cả, đề tài đề nghị xin được giảm bớt khối lượng thực hiện của nội dung xác định tác dụng dược lý của sản phẩm trên động vật thực nghiệm và thử nghiệm tác dụng của sản phẩm trên lâm sàng

4 Lần 4 1/2010 Đề tài thực hiện đúng nội dung và tiến độ năm 2007 và

2008 Hiện đang triển khai các nội dung, nhiệm vụ năm

2009 và cố gắng hoàn thành, báo cáo tổng kết nghiệm thu trong thời gian đề tài đã được gia hạn

5 Lần 4

(Bổ sung)

6/2010 Đề tài nộp nốt 12 chuyên đề còn lại để xin xác nhận đã

hoàn thành khối lượng công việc và các sản phẩm

1 Lần 1 09/11/2007 Đề tài đã triển khai được 3/5 nội dung đã đăng ký trong

TM và HĐ Đề tài thực hiện đúng tiến độ Đề tài không

có kiến nghị

2 Lần 2 05/6/2008 Đề tài đã thực hiện đúng các nội dung đã đăng ký trong

TM Đề tài thực hiện đúng tiến độ Đề tài không có kiến nghị

3 Lần 3 15/4/2009 Đề tài đã thực hiện bám sát vào các nội dung trong TM

và HĐ Đề tài thực hiện đúng tiến độ Đề nghị chủ nhiệm

đề tài làm công văn đề nghị điều chỉnh gửi tới Ban chủ nhiệm và VPCCT

4 Lần 4 26/1/2010 Đề tài đã hoàn thành 6/9 nội dung đã đăng ký Đề tài

thực hiện đúng tiến độ cả nội dung và kinh phí Ban Chủ nhiệm sẵn sàng xác nhận các chuyên đề tiếp theo để có thể hoàn thành thanh quyết toán và nghiệm thu đúng thời hạn

MỞ ĐẦU

Bệnh cao huyết áp được biết đến là một trong những nguyên nhân gây nên các bệnh tim mạch nguy hiểm như đột quị, nhồi máu cơ tim, tai biến mạch máu não Theo con số thống kê trên thế giới hiện nay có hơn một tỷ người mắc bệnh cao huyết áp (chiếm khoảng 15 %) và ở Việt Nam con số này là 16 % Một trong những loại thuốc chữa bệnh cao huyết áp thường được sử dụng hiện nay là chất kìm hãm enzim chuyển angiotensin (Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory - ACEI) như Captopril, Enalapril, Benazepril, Lisinopril,…Tuy nhiên, các loại thuốc tổng hợp thường gây những tác dụng phụ nên việc nghiên cứu, sản xuất các peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin (Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptides – ACEIPs) từ nguồn protein thực phẩm như sữa, thịt gà, cá, đậu, ngô,…có độ an toàn cao, dễ dàng sử dụng hàng ngày như thực phẩm, đồ uống chức năng bổ sung đang được quan tâm trên thế giới

Bệnh tiểu đường là một bệnh mãn tính do rối loạn chuyển hoá glucose vì thiếu insulin ở các mức độ khác nhau đang có xu hướng ngày càng gia tăng trên toàn thế giới Bệnh tiểu đường typ 2 hiện chiếm 80-90 % người bị bệnh có thể được hỗ trợ phòng chống và điều trị bằng các loại thực phẩm chức năng có tác dụng điều hoà hàm

từ nấm men Crom là một nguyên tố vi lượng cần thiết cho quá trình trao đổi chất glucoza và chất béo, đặc biệt có tác động đến hoạt động của hocmon insulin của người

và động vật

Thoái hoá khớp là một bệnh rất phổ biến, thường khởi phát từ lứa tuổi 40 trở đi

Có nhiều nguyên nhân gây ra tình trạng thoái hoá khớp nhưng nguyên nhân chủ yếu là hiện tượng lão hoá của cơ thể Bệnh có thể tiến triển theo hướng nặng, dẫn đến viêm khớp, cứng khớp, thoát vị đĩa đệm cột sống hoặc thậm chí gây tàn phế Trước kia, để điều trị thoái hoá khớp, chủ yếu dùng nhóm thuốc chống viêm giảm đau không steroit (NSAIDs) như aspirin, indomethacin, diclofencac…, tuy nhiên các thuốc này đều có tác dụng phụ như gây loét dạ dày, tá tràng và xuất huyết dạ dày Hiện nay, chế phẩm glucosamine chủ yếu được sản xuất từ chitin của vỏ loài giáp xác như vỏ sò, tôm, cua, ghẹ, mai mực đang được sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh thoái hóa khớp Tuy nhiên, một lượng lớn người bệnh có cơ địa mẫn cảm với các sản phẩm thuỷ hải sản dễ bị dị ứng dù với một lượng chất cực nhỏ chất gây dị ứng trong sản phẩm và có thể gây ra những phản ứng phụ đáng tiếc, thậm chí tử vong Vì vậy, đã có các nghiên cứu, sản

xuất và ứng dụng glucosamine từ sinh khối nấm sợi như Mucor, Aspergillus do các ưu

điểm của chúng như độ an toàn cao, không gây dị ứng Ngoài ra, hiện nay còn có nhiều nghiên cứu tạo chủng vi sinh vật tái tổ hợp mang gen mã hóa tổng hợp

glucosamine như GFA1 và NagA để có thể nâng cao hiệu suất tổng hợp glucosamine

từ vi sinh vật

Việt Nam là một nước có dân số trên 80 triệu, cùng với sự phát triển của đất nước, mức sống của nhân dân ta cũng ngày càng được cải thiện và nâng cao Tuy nhiên, với sức ép của nhịp sống công nghiệp, ô nhiễm môi trường… hàng loạt các vấn đề về sức khoẻ và bệnh tật cũng xuất hiện và gia tăng như các bệnh cao huyết áp, tim mạch, tiểu đường, béo phì, suy nhược thần kinh, giảm trí nhớ, thoái hoá cơ, khớp, rối loạn chức năng gan, mật… Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài khoa học công nghệ cấp nhà nước

“Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung từ vi sinh vật“ với

mong muốn có thể nghiên cứu đưa ra được công nghệ và sản xuất được một số sản phẩm thực phẩm chức năng bổ sung từ các nguồn tự nhiên để hỗ trợ phòng chống và điều trị một số bệnh như cao huyết áp, tiểu đường, thoái hóa khớp

Mục tiêu đề tài: Xây dựng được quy trình công nghệ sản xuất một số protein,

peptit chức năng, glucosamine từ vi sinh vật để tạo các sản phẩm thực phẩm chức năng có tác dụng phòng chống bệnh tim mạch, cao huyết áp, tiểu đường và viêm xương khớp

Nội dung đề tài: bao gồm 3 nhiệm vụ sau:

1 Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung chứa pepit có hoạt tính kìm hãm enzim chuyển angiotensin (Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptides) từ vi sinh vật có tác dụng hỗ trợ phòng chống bệnh cao huyết áp, tim mạch

2 Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung chứa protein

giàu crom hữu cơ từ nấm men Saccharomyces cerevisiae (GTF) có tác dụng hỗ

trợ phòng chống bệnh tiểu đường typ 2

3 Nghiên cứu công nghệ sản xuất thực phẩm chức năng bổ sung chứa glucozamin từ vi sinh vật có tác dụng hỗ trợ phòng chống bệnh viêm xương khớp

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CÁC PEPTIT KÌM HÃM ENZIM CHUYỂN ANGIOTENSIN (ACEIPs) TỪ NGUỒN PROTEIN THỰC PHẨM

1.1.1 Enzim chuyển angiotensin (ACE) và sự tăng huyết áp

Huyết áp trong cơ thể được kiểm soát bằng một số con đường sinh hóa khác nhau nhưng có các quan hệ tương tác với nhau Tuy không phải là hệ thống điều hòa huyết

áp độc quyền, nhưng hệ thống Rennin – Angiotensin - Aldosterol (RAAS) và Kalikrein - Kinin đóng vai trò quan trọng then chốt trong việc kiểm soát huyết áp, cân bằng chất điện phân, bài tiết, thận, nội tiết, thần kinh chức năng liên quan tới việc kiểm soát hoạt động tim mạch trong cơ thể người và các động vật có vú khác Trong hai hệ thống này, hoạt động của enzim chuyển angiotensin (Angiotensin Converting Enzyme – ACE) đóng vai trò rất quan trọng [Inagami, 1992], [Unger, 2002]

Hoạt động của ACE trong hệ thống Renin-Angiotensin-Aldosterol

Hệ thống Renin – Angiotensin – Aldosterol là một hệ thống phức tạp đóng vai trò then chốt trong việc duy trì và điều chỉnh huyết áp Khi áp suất trong máu giảm (áp suất trong tâm thu ≤ 100 mm Hg), thận sẽ tiết enzim renin vào máu Renin sẽ xúc tác phân cắt angiotensinogen, một protein phân tử lớn tiết ra từ gan và tuần hoàn trong máu, thành angiotensin I là một peptit trơ có 10 gốc axít amin có hoạt tính sinh học yếu Lúc này tại bề mặt của phổi và màng trong của thận sẽ tiết ra enzim ACE xúc tác phân cắt angiotensin I thành angiotensin II có 8 gốc axít amin Angiotensin II gây tăng huyết áp do (i) Kích thích hệ thần kinh giao cảm hoạt động mạnh tăng tổng hợp catecholamin làm co mạch, (ii) Kích thích vùng dưới đồi yên tiết ra hocmon chống lợi tiểu vasopressin, làm cho ứ nước và ion natri, (iii) Kích thích vỏ thượng thận tăng tiết aldosteron làm tăng tái hấp thụ ion natri, tiết kali, làm tăng quá trình giữ nước Sự gia tăng này làm cho thể tích chất lỏng trong cơ thể tăng lên gây gia tăng áp suất máu [Ondetti và Cushman, 1982] (Hình 1.1)

Hoạt động của ACE trong hệ thống Kallikrein - Kinin

Khi áp suất máu trong cơ thể tăng lên hệ thống Kallikrein - Kinin sẽ được hoạt hóa Lúc này trong cơ thể sẽ tiết ra enzim kallikrein làm cho kininogen có chủ yếu trong gan bị thủy phân tạo ra bradykinin là chất có khả năng gây giãn mạch mạnh làm

hạ huyết áp Dưới tác dụng của ACE, bradykinin sẽ bị vô hoạt, kết quả làm áp suất máu tăng lên và gây cao huyết áp [Dores và cộng sự , 1974] (Hình 1.2)

Ngoài việc gây co mạch và tăng áp suất máu, angiotensin II còn gây nhiều tác hại lên hệ thống tim mạch Nồng độ angiotensin II tăng làm dày lên cấu trúc cơ tim, các

thành mạch máu dày lên, cứng hơn, dẫn tới làm lắng đọng cholesterol gây tắc mạch máu, đây là cơ chế dẫn tới nhồi máu cơ tim và tai biến mạch máu não

Hình 1.1: Hệ thống Renin-Angiotensin-Aldosterol (RAAS)

Hình 1.2: Enzim chuyển angiotensin (ACE) phân cắt angiotensin I thành

angiotensin II và làm vô hoạt bradykinin

Kích thích đồi yên tăng tiết vasopressin chống lợi tiểu

1.1.1.1 Cấu trúc của ACE

Enzim chuyển angiotensin (ACE) hay còn gọi là enzim kininase (peptidyldipeptide hydrolase/metallocarboxylpeptidase, EC 3.4.15.1) tồn tại trên bề mặt tế bào thành mạch máu trong các cơ quan cơ thể như não, tim, phổi, gan, ruột non, tuỵ, tuyến thượng thận,…[Erdos and Skidgel, 1987] ACE là một

phân gốc carboxyl cuối mạch, yêu cầu cơ chất mang điện tích âm Các peptit với vị trí cacboxyl tự do cuối cùng sẽ là các cơ chất thích hợp của ACE vì vị trí này phải giữ

cs, 1983], [FitzGerald và cs, 2004], [Fuchs và cs, 2008]

Trong cơ thể người ACE tồn tại ở 2 dạng chủ yếu là ACE soma (somatic ACE) và

ACE sinh dục (Germinal/testicular ACE) Cả 2 dạng này đều được mã hóa bởi cùng một vùng gen trên nhiễm sắc thể 17 tại q23; chứa 26 exon và 25 intron Đoạn dài hơn

là ACE soma với 1302 amino axit, được phiên mã từ exon 1-12 và 14-26 Đoạn ngắn hơn là ACE sinh dục có kích thước là 732 amino axit và được phiên mã từ exon 13-

26 Promoter của ACE soma nằm trong vùng 5’ của exon đầu tiên, còn ACE sinh dục

nằm bên trong vùng intron 12 [Turner, 2002]

ACE soma có trọng lượng phân tử 170 kDa được tìm thấy trên bề mặt trong của phổi, thận, ruột, nhau thai, đám rối của tràng mạch và có vai trò điều khiển áp suất máu và chức năng của thận ACE soma chứa 2 vị trí hoạt động do được cộng hợp bởi

2 vùng N và vùng C Mỗi vùng đều có một kiểu gắn kẽm đặc thù, có tâm hoạt động là His-Glu-X-X-His Trong đó, hai histidin sẽ cung cấp 2 trong số 3 ligand kết hợp kẽm

và nhóm cacboxyl của glutamat là một nguồn cho điện tử cho phản ứng xúc tác [Wei

và cs, 1991], [Tzakos và cs, 2003];

ACE sinh dục có trọng lượng phân tử 100 kDa chỉ có duy nhất trong bộ phận sinh dục, nó tương ứng với vùng C của ACE soma, có một tâm hoạt động và chỉ có một kiểu gắn kẽm ACE sinh dục có vai trò chủ yếu trong sinh sản [Turner, 2002]

1.1.1.2 Cơ chế xúc tác của ACE

Enzim chuyển angiotensin có khả năng giải phóng dipeptit đầu C từ các cơ chất có một nhóm cacboxyl tự do cuối cùng [Cheung và cs, 1980], [FitzGerald và cs, 2004; Carretero, 2005] Theo cơ chế này, nó sẽ xúc tác việc phân cắt 2 axít amin ở cuối mạch chuỗi peptit angiotensin I (His – Leu) tạo ra angiotensin II là chất gây co mạch máu rất mạnh, đồng thời ACE làm vô hoạt các peptit làm giãn mạch bradykinin [Li và

cs, 2004], [Corvol và cs, 1995], [Georgiadis và cs, 2003] Mặc dù ACE thủy phân His

- Leu từ mạch peptit của nhiều cơ chất khác nhau nhưng bradykinin là cơ chất thuận

lợi nhất với hằng số Michaelis Menten K m thấp hơn ít nhất 10 lần so với angiotensin I [Bunning và cs, 1983], [Corvol và cs, 1995], [Alan và cs, 2008]

Như vậy, tác động của ACE làm tăng huyết áp, nguyên nhân chính gây nhiều bệnh tim mạch Bằng sự ức chế tác động của ACE, các peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin (Angiotensin Converting Enzyme Inhibitory Peptides – ACEIPs) sẽ có tác dụng làm giảm huyết áp [Cheung và cs, 1980]

1.1.2 Peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin (ACEIPs)

1.1.2.1 Lịch sử nghiên cứu ACEIPs

Các peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin (ACEIPs) bắt đầu được nghiên cứu

từ nǎm 1954 Báo cáo đầu tiên về chất kìm hãm ACE có tác dụng chống cao huyết

áp trong thí nghiệm trên tế bào sống (in vivo) là các peptit từ nọc rắn hổ mang Brazil Bothrops jararaca năm 1970 [Ferrei và cs, 1981; Cushman và cs, 1981] Những

peptit này có chứa từ 3 đến 15 gốc axit amin và hầu hết chúng đều có một trình tự có đầu cacbon của Ala-Pro hoặc Pro-Pro, trong đó nonapeptide SQ 20,881 với trình tự các axit amin Ala-Trp-Pro-Arg-Pro-Glu-Ile-Pro-Pro có tác dụng làm giảm huyết áp cao nhất Do không thể sử dụng bằng đường uống nên từ các cấu trúc peptit này, người ta đã nghiên cứu tổng hợp được chất kìm hãm enzim chuyển angiotensin (Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor – ACEI) thế hệ đầu tiên Captopril

thuốc Hoa Kỳ (Food and Drug Administration – FDA) phê chuẩn sử dụng làm thuốc

hạ huyết áp Sau đó, một loạt thuốc kìm hãm ACE thế hệ thứ 2 như Enalapril và thứ 3 (Fosinopril) đã được nghiên cứu và thương mại hóa (Bảng 1.1) [Cushman và Ondetti, 1991], [Nancy và cs, 1998]

Tuy nhiên nhược điểm của các chất kìm hãm ACE tổng hợp theo con đường hóa học là chúng đã gây ra những tác dụng như ho khan (xuất hiện trong 10 – 30 % số bệnh nhân điều trị), tăng mức kali huyết, giảm chức năng thận, mẩn đỏ da, rối loạn tiêu hoá, gây quái thai (khi mang thai sử dụng chất kìm hãm ACE), viêm da… [Abubakar và cộng sự, 1998; Seseko và Kaneko, 1985]

Vì vậy, từ những năm 1980 xu hướng tạo ra các peptit kìm hãm ACE có nguồn gốc tự nhiên đã diễn ra mạnh mẽ Đi đầu trong nghiên cứu là các nhà khoa học Nhật Bản, Mỹ và sau đó ở nhiều nước khác như Phần Lan, Trung Quốc, Đài Loan,… Các protein thực phẩm được sử dụng rất đa dạng như protein sữa, cá, sò, thịt lợn, thịt gà, trứng, đậu tương, đậu xanh, ngô, tảo,…Một số các sản phẩm chứa ACEIPs có nguồn gốc tự nhiên này đã được thử nghiệm trên chuột cao huyết áp tự phát, thử lâm sàng trên người và thương mại hóa trên thị trường Nhật Bản, Mỹ, Châu Âu

Bảng 1.1: Một số chất kìm hãm ACE tổng hợp

ACEI thế hệ 1: Chứa nhóm sulfhydryl

Có tác dụng phụ được coi là liên quan đến

dùng kết hợp với nhóm thuốc lợi tiểu Được bài thải qua thận

ACEI thế hệ 2: Chứa nhóm carboxyl

Được bài thải qua thận

ACEI thế hệ 3: Chứa phosphinic axit

mỡ nước, cuối cùng chuyển hoá thành axit

Thuốc được thải qua hai đường thận và gan

1.1.2.2 Cơ chế tác dụng của ACEIPs

Nghiên cứu về cấu trúc của những peptit có tác dụng kìm hãm ACE cho thấy tripeptit đầu cacbon đã góp phần lớn nhất vào việc gắn các peptit này vào tâm hoạt động của ACE và chuỗi tripeptit đầu cacbon tốt nhất để gắn vào tâm hoạt động đó là Phe-Ala-Pro Những axit amin này tạo ra một sự tác động qua lại lớn nhất với các vị trí thứ cấp s1, s’1, s’2 tại tâm hoạt động của ACE (Hình 1.3) [Cushman và cs, 1981] Đặc tính kỵ nước và ưa nước của peptit cũng là một nhân tố quan trọng tác động đến hoạt tính kìm hãm Tính ưa nước của peptit cao thường làm cho khả năng kìm hãm thấp hoặc không có khả năng kìm hãm ACE do nó làm cho peptit không thể tiến đến trung tâm hoạt động của ACE được

Các chất kìm hãm ACE có tác dụng như chất nền cho enzim chuyển angiotensin, cản trở sự chuyển angiotensin I thành angiotensin II ACEI tác động lên hệ thống Renin - Angiotensin - Aldosterol đặc hiệu tại từng bộ phận của các mô, tim, thận, thượng thận,… Điều đó giúp ACEI phát huy tác dụng tốt, vẫn còn tác dụng ức chế ACE khi không còn thấy nồng độ trong huyết thanh [Cheung và cs, 1980; FitzGerald

và cộng sự, 2004]

Hình 1.3: Cơ chế gắn vào trung tâm hoạt động của ACE của Angiotensin I và

Captopril

1.1.2.3 Tính chất và ứng dụng của ACEIPs

Tính chất dược lực học của ACEIPs

ACEIPs kìm hãm ACE, ngăn chặn quá trình chuyển hoá angiotensin I thành angiotensin II và quá trình phân huỷ bradykinin có tác dụng làm giảm huyết áp ACEIPs làm giảm tác động lên động mạch vành và ổn định tim mạch Không thay đổi tốc độ lọc cầu thận và máu chảy trong thận Tác dụng hạ áp suất máu của ACEIPs dựa trên sự ức chế hệ thống renin – angiotensin nhưng nó vẫn sử dụng được cho cả những bệnh nhân bị cao huyết áp có nồng độ renin thấp [Sarro và cs, 1994; Brown và Vaughan, 1998]:

Tính chất dược động học của ACEIPs

ACEIPs không bị ảnh hưởng bởi thức ăn trong ống tiêu hoá ACEIPs không gắn kết với những protein khác trong huyết thanh [Sarro và cộng sự, 1994]

Tuy nhiên, các ACEIPs tự nhiên từ nguồn protein thực phẩm có một số tính chất

sinh lý khác biệt với các peptit tổng hợp như sau:

- Peptit có hoạt lực kìm hãm ACE mạnh không luôn luôn tương đồng với tác dụng chữa bệnh cao huyết áp do: có thể peptit đã bị enzim tiêu hoá thuỷ phân hoặc bị ACE phân cắt những axit amin ở đầu C dẫn đến không còn tác dụng hạ huyết áp Ví dụ như

chống được bệnh cao huyết áp, kể cả khi uống ở cả liều lượng cao 100 mg/kg thể trọng [Ma và cs, 2006; Pihlanto và cs, 1998]

- Những peptit được hấp thu nguyên vẹn, không bị phân huỷ trước khi vào vòng tuần hoàn máu sẽ phát huy được tác dụng chống bệnh cao huyết áp, đó là các peptit có kích thước nhỏ có thể đi thẳng tới ruột mà không bị enzim tiêu hoá phân huỷ Những dipeptit, tripeptit thường có hoạt lực chống bệnh cao huyết áp mạnh, và cả những peptit có triptophan, phenylalanin, tyrozin, prolin ở đầu C cuối [Yamamoto và cs, 1999], [Pihlanto và cs, 1998] [Ma và cs, 2006; Draaisma và cs, 2005], [Muruyama và cộng sự, 1987; Ondetti và Cushman, 1982];

chống bệnh cao huyết áp rất cao Lý do vì những peptit này bị ACE hoặc những enzim protease trong dạ dày phân tách thành dạng tiền biệt dược (prodrug) có tác dụng ức chế ACE mạnh, sau đó được hấp thu nguyên vẹn và thể hiện hoạt tính chống bệnh cao

huyết áp [Roberta và cs, 1999; Saito và cs, 2000]

Ứng dụng của ACEIPs

ACEIPs được ứng dụng chủ yếu trong điều trị bệnh cao huyết áp, đặc biệt với những bệnh nhân cao huyết áp kèm bệnh tiểu đường hoặc hen xuyễn ACEIPs hữu hiệu trong khoảng 60% trong trường hợp dùng riêng biệt, khi kết hợp với các loại thuốc chữa cao huyết áp khác, hiệu quả có thể tăng tới 90% Vì angiotensin II can dự vào quá trình hình thành xơ vữa động mạch nên dùng ACEIPs để ức chế tạo angiotensin II tạo lợi thế cho chức năng nội mô và tăng sinh tế bào cơ trơn hệ mạch Ngoài ra, ACEIPs giúp giảm tỷ lệ tử vong những bệnh nhân suy tim, nhồi máu cơ tim, bệnh nhân có nguy cơ cao bị nhồi máu cơ tim hoặc suy tim, làm chậm lại tiến trình suy thận mãn, nhất là trong các bệnh cầu thận nhờ hiệu năng kháng protein niệu, giảm

áp suất ở cầu thận và trong di chuyển protein trong ống thận [Phan Quốc Đống, 2003; Bùi Quang Kinh, 1998; Trần Thy Nhân, 2004]

1.1.3 Công nghệ sản xuất các peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin từ

protein thực phẩm

Các peptit kìm hãm enzim chuyển angiotensin nằm trong nhóm các peptit có hoạt tính sinh học (Biopeptides) Các peptit này thường không có hoạt tính sinh học khi nằm trong chuỗi trình tự các axit amin của protein gốc nhưng khi được tách ra bằng các con đường sinh học như (a) thuỷ phân bởi các enzim trong hệ tiêu hoá, (b) thuỷ phân bởi các enzim proteaza từ vi sinh vật trong quá trình lên men, và (c) thuỷ phân bởi các enzim proteaza có nguồn gốc từ động, thực vật và vi sinh vật, trong nhiều