kl le thi thuy lien 2015 660 6

TÓM TẮT Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về các tác dụng dược lý của nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus, trong đó có tác dụng giảm đau, kháng viêm.. Trong khóa luận này sẽ đi sâu và

TỔNG QUAN

GIỚI THIỆU VỀ RẮN VÀ NỌC RẮN

Rắn là loài bò sát lần đầu được phát hiện trong các mẫu hóa thạch ở giữa kỷ Phấn Trắng, khoảng 98 triệu năm trước Rắn được xem là loài tiến hóa từ thằn lằn, nhưng trong quá trình tiến hóa này chúng đã mất chân, phát triển thêm nhiều đốt sống và linh hoạt hơn, đồng thời có thể mở rộng hàm Hóa thạch có niên đại lâu nhất được tìm thấy có nguồn gốc cách đây khoảng 112 triệu năm.

Môi trường sống của rắn rất đa dạng và có thể được tìm thấy ở hầu hết các châu lục, từ Bắc Cực đến phía Nam của Australia, cả ở đại dương và ở độ cao lên tới 4900 m trong dãy Himalaya Tuy nhiên, một số nơi không có rắn hoặc rất hiếm, như Nam Cực, Iceland và New Zealand Ở Việt Nam, rắn phân bố khắp các vùng từ núi, vùng trung du đến đồng bằng, và thường gặp trong rừng thưa, bụi rậm, gò đống, cũng như ở gần khu vực sinh sống của con người.

Trên thế giới hiện có 20 họ, khoảng 500 chi với khoảng 3400 – 3550 loài rắn được công nhận [24] Trong đó chỉ có khoảng 300 loài rắn có nọc độc, phần lớn các loài rắn không có nọc độc, những loài rắn có nọc độc thì thường sử dụng chủ yếu vào việc khuất phục và giết chết con mồi hay dùng để phòng vệ [24] Ở Việt Nam có khoảng 140 loài rắn và 32 loại có nọc độc [2]

Khóa luận tốt nghiệp đại học Lê Thị Thùy Liên

Loài có nọc độc thường tập trung vào những họ như: Colubridae, Elapidae,

1.1.4 Nọc rắn và ứng dụng nọc rắn trong y học

Nọc rắn là hỗn hợp các thành phần có hoạt tính sinh học cao với chức năng chính là tiêu diệt hoặc bất động và tiêu hóa con mồi Nọc rắn bao gồm các chất có bản chất protein và các chất không có bản chất protein Thành phần các chất có bản chất protein bao gồm các enzym, các protein không có tính enzym, các polypeptid Thành phần không có bản chất protein gồm các chất hữu cơ và các chất vô cơ [40] Trong đó, khoảng 95% khối lượng khô của nọc rắn là polypeptid như: enzym, độc tố, các polypeptid nhỏ Trong nọc rắn, các nhà khoa học đã xác định được hơn 20 enzym và 12 trong số đó là thành phần chính của nọc Trong đó, Hyaluronidase là thành phần luôn có mặt trong tất cả các nọc, có tác dụng giúp cho các thành phần nọc dễ dàng xâm nhập vào mô của con mồi [24]

Nọc rắn có nhiều tác dụng dược lý quan trọng, bao gồm hạ huyết áp, chống đông máu, ức chế kết tập tiểu cầu, kháng khuẩn, kháng viêm và giảm đau Bên cạnh đó, nọc rắn còn có tiềm năng trong điều trị ung thư nhờ cơ chế gây độc tế bào và ức chế sự hình thành mạch nuôi tế bào ung thư, từ đó làm giảm sự phát triển của các tế bào này Đáng chú ý là hoạt chất từ nọc rắn dường như tác động mạnh lên tế bào ung thư hơn so với tế bào bình thường.

Trong y học cổ truyền nhiều bộ phận của rắn được dùng làm thuốc như: thịt rắn (nhục xà), mật rắn (xà đởm), xác rắn (xà thoái) [5]

Bảng 1.1 Một số thuốc chữa bệnh và chuẩn đoán bệnh có nguồn gốc từ nọc rắn.[13]

Thuốc / Tên thương mại Cơ chế / điều trị Nguồn gốc

Captopril, Enalapril Ức chế ACE / tăng huyết áp Bothrops Jaracusa

Intergrilin Ức chế kết nạp tiểu cầu / hội chứng mạch vành cấp

Ancrod Ức chế fibrinogen / đột quỵ Agkistrodon

Hoạt hóa protein C / chẩn đoán rối loạn cầm máu

Reptilase Chuẩn đoán rối loạn đông máu Bothrops Jaraca

Exanta, Ximelagatran Thuốc chống đông máu / chống đông máu, ức chế thrombin

Cobratox Giảm đau / đau khớp, viêm khớp Cobra

RẮN CẠP NONG

Rắn cạp nong B.fasciatus là một loài rắn cỡ lớn, có đầu hơi phân biệt với cổ và mắt nhỏ màu đen Dọc giữa lưng có một gờ rõ, dễ nhận diện bởi thân có các khoanh màu vàng và đen xen kẽ nhau, các khoanh này xếp xấp xỉ bằng nhau Mặt cắt của thân rắn hình tam giác, đuôi ngắn và tù, giống như ngón tay Chiều dài cơ thể từ 1 mét trở lên.

Hình 1.1 Rắn cạp nong Bungarus fasciatus

Trên thế giới rắn cạp nong được tìm thấy ở Ấn Độ, bán đảo và quần đảo Malaysia, miền nam Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Campuchia và Việt Nam [11]

Rắn cạp nong có thể xuất hiện ở nhiều môi trường khác nhau, từ rừng núi đến đồng bằng, và thường sống trong hang mối, ổ chuột hoặc gần khu dân cư Thức ăn chủ yếu của chúng là các loài rắn nhỏ khác, nhưng chúng cũng có thể săn măm nhắm, cá, ếch và trứng rắn Đây là loài khá nhút nhát và hoạt động chủ yếu vào ban đêm; khi bị quấy rối, chúng thường cuộn mình và ít khi tấn công, nhưng những cú cắn của nó có thể dẫn tới tử vong.

Rắn cạp nong đẻ trứng vào cuối tháng 5 đến giữa tháng 6 hằng năm, khoảng 2-15 trứng, có khoảng 6,25 x 3,75 cm [3]

Nọc rắn là chất độc được thu từ tuyến nọc của rắn và cần được xử lý trong môi trường kiểm soát nhằm bảo toàn chất lượng Nọc mới chảy ra có màu vàng nhạt và độ đặc nhất định; sau khi thu, nọc có thể được bảo quản ở dạng khô bằng các phương pháp phù hợp Nọc rắn khô có thể được bảo quản ở -20°C trong hàng thập kỷ mà vẫn duy trì hoạt tính, trong khi nọc hòa tan vào nước sẽ khó bảo quản lâu hơn.

Hình 1.2 Cách lấy nọc rắn và nọc rắn đã đông khô

1.2.5 Thành phần hóa học, độc tính và tác dụng dược lý của nọc rắn cạp nong

Cobra venom comprises a diverse array of bioactive components, including neurotoxins, cardiotoxins, diotoxins, L-amino acid oxidase, phospholipase A2, lectins, cathelicidins, proteases, and protein inhibitors Among these, the amino acid sequences of more than twenty protein types have been determined These proteins include eight homologous families, highlighting the complexity and diversity of cobra venom at the molecular level.

Khóa luận tốt nghiệp đại học của Lê Thị Thùy Liên phân tích phospholipase A2 và 4 đồng dạng của các toxin ba ngón tay (3FTx), đồng thời ghi nhận ít nhất một chất ức chế proteinase kiểu Kunitz, chất kích hoạt yếu tố X, acetylcholinesterase và các enzym khác [21].

Một tài liệu nghiên cứu cho thấy nọc rắn cạp nong độc hơn nọc rắn hổ mang

[22] Độc tố chính của nọc rắn cạp nong là neurotoxin, khi bị rắn cạp nong cắn con mồi bị suy hô hấp dẫn đến tử vong [23]

Khi nọc rắn xâm nhập vào cơ thể sinh vật, các độc tố gây hoại tử tế bào, phospholipase A2 (PLA2) và độc tố thần kinh bắt đầu hoạt động, gây độc cho cơ thể và làm rối loạn chức năng hệ thần kinh, đồng thời có thể dẫn đến tổn thương mô và các cơ quan.

Độc tố gây hoại tử tế bào là tập hợp các enzym tiêu hóa thuộc loại polypeptid hydroxylase (enzym thủy phân protein) và phospholipase A2, cùng với các yếu tố khác làm tăng tính thấm và gây hiện tượng sưng phù Những thành phần này có thể dẫn đến hủy diệt màng và mô tế bào [34].

 Phospholipase A 2 : gây tan máu và tiêu cơ Những enzym này làm tổn thương màng tế bào, lớp nội mạc, cơ xương, tế bào thần kinh và hồng cầu [34]

Độc tố thần kinh tiền synap (neurotoxin tiền synap) thường gặp ở họ rắn hổ Elapidae và ở một số loài rắn lục thuộc họ Viperidae Đây là những phospholipase A2 gây tổn thương hệ thần kinh tận cùng: ban đầu kích thích giải phóng acetylcholin, sau đó can thiệp và làm giảm quá trình giải phóng acetylcholin, dẫn đến rối loạn dẫn truyền tại synap thần kinh.

Độc tố thần kinh hậu synap phổ biến ở họ rắn hổ Elapidae, được đặc trưng bởi các polypeptid cạnh tranh với acetylcholin tại receptor ở khớp nối thần kinh–cơ Quá trình này ức chế tín hiệu thần kinh–cơ, dẫn đến liệt kiểu curare.

1.2.5.3 Tác dụng giảm đau của nọc rắn

Dựa trên những thay đổi sinh lý học thần kinh xảy ra trong sự dẫn truyền thông tin đau, nhiều mô hình đã được phát triển nhằm phục hồi cân bằng nội mô và giảm đau bằng cách sử dụng các chất đối kháng với kênh Ca2+, các kênh Na+, các thụ thể NMDA và các chất chủ vận với thụ thể GABA, thụ thể cholinergic và các thụ thể opioid Dựa trên cơ chế này, các chất độc có nguồn gốc từ động vật đã được chứng minh có tác dụng giảm đau thông qua các kênh ion hoặc thụ thể Trong đó, nọc rắn là một điển hình Nhiều báo cáo cho thấy nọc độc của rắn lục (Viperidae) và họ rắn hổ (Elapidae) có tác dụng giảm đau nhờ vào neurotoxin và myotoxin như cobrotoxin, crotamin, hannalgesin… [36].

Rắn cạp nong Việt Nam (B fasciatus) có nọc độc chủ yếu chứa phospholipase và neurotoxin Nghiên cứu phân tích nọc rắn cạp nong đã phân lập được 16/17 toxin có khả năng tương tác mạnh với thụ thể nicotinic acetylcholine receptor, bao gồm cả loại cơ (muscle-type) và loại α7 Những phát hiện này làm cơ sở cho việc tiến hành nghiên cứu tác dụng giảm đau trên nọc rắn cạp nong B fasciatus Việt Nam. -**Support Pollinations.AI:**🌸 **Quảng cáo** 🌸 Khám phá thêm về nghiên cứu nọc rắn cạp nong và ứng dụng giảm đau tại Pollinations.AI; [ủng hộ sứ mệnh của chúng tôi](https://pollinations.ai/redirect/kofi) để AI luôn tiếp cận được với cộng đồng.

1.2.5.4 Tác dụng kháng viêm của nọc rắn

Viêm là đáp ứng bảo vệ của hệ miễn dịch trước sự xâm nhập của tác nhân bên ngoài như vi sinh vật, tác nhân hóa học, cơ học hoặc vật lý, hoặc trước sự tấn công từ các tác nhân bên trong như hoại tử do thiếu máu cục bộ và bệnh tự miễn Quá trình viêm thường đi kèm với các triệu chứng sưng, nóng, đỏ và đau, là các biểu hiện điển hình của phản ứng viêm.

Có hai nhóm thuốc chính được sử dụng rộng rãi trong điều trị viêm là corticosteroid và NSAID Cả hai đều có tác dụng giảm viêm, giúp cải thiện triệu chứng nhanh chóng, nhưng đồng thời đi kèm với những tác dụng phụ không mong muốn như viêm loét đại tràng, loãng xương, đục thủy tinh thể và có thể gây tổn thương tim, thận và gan [25][10].

Crotoxin là một β-neurotoxin gồm hai thành phần chính: phospholipase A2 và một protein phi enzym Trước đây crotoxin được xem là chất độc thần kinh và tế bào, nhưng các nghiên cứu gần đây cho thấy crotoxin có tác dụng chống viêm, ức chế sự lan rộng của vùng viêm, điều hòa miễn dịch, đồng thời có tác dụng kháng khuẩn và tiềm năng chống khối u Trong y học cổ truyền, các bộ phận của rắn được dùng làm thuốc chữa tê liệt, chống viêm và giảm đau, nhức đầu Nọc rắn cạp nong Việt Nam chứa các thành phần như neurotoxin và phospholipase A2.

Dựa trên những nghiên cứu đã công bố trước đó làm tiền đề và nhằm hiểu rõ hơn tác dụng kháng viêm của nọc rắn trong y học cổ truyền, nghiên cứu này tiến hành khảo sát tác dụng kháng viêm của nọc rắn cạp nong Bằng phương pháp phân tích tổng hợp các bằng chứng trước và thiết kế thí nghiệm phù hợp, chúng tôi đánh giá khả năng ức chế quá trình viêm của nọc rắn cạp nong và các thành phần hoạt tính liên quan, nhằm bổ sung thêm dữ liệu cho y học cổ truyền và các ứng dụng lâm sàng tiềm năng.

B.fasciatus Việt Nam trên chuột nhắt trắng.

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NỌC RẮN CẠP NONG BUNGARUS

1.3.1 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới thuận lợi cho sự đa dạng và sinh sống của nhiều loại rắn, kể cả những loài có nọc độc nguy hiểm Vì vậy, việc nghiên cứu và phát triển huyết thanh kháng nọc rắn được chú ý từ sớm nhằm ngăn ngừa tử vong do rắn cắn và tăng cường an toàn cho cộng đồng.

Nghiên cứu quy trình gây miễn dịch trên ngựa nhằm sản xuất huyết thanh kháng nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus có hiệu giá trên 40 IU/ml Bước đầu của nghiên cứu cho thấy ngựa đã đáp ứng kháng thể đặc hiệu kháng nọc rắn cạp nong sau miễn dịch Sau 15 chu kỳ khai thác, thu được 156,1 lít huyết thanh thô có hiệu giá trung bình; mỗi mL huyết thanh trung hòa được 96,4 LD50 độc tố nọc rắn cạp nong, đạt chuẩn và đưa vào tinh chế phục vụ nạn nhân bị rắn cạp nong cắn ở Việt Nam.

Nghiên cứu về nọc rắn cạp nong B.fasciatus từ những vùng khác nhau của

Việt Nam có nọc rắn cạp nong (Bungarus fasciatus) phân bố ở miền Nam (Tiền Giang) và miền Bắc (Vĩnh Phúc) Thành phần protein của nọc rắn cạp nong ở hai miền không hoàn toàn giống nhau, cho thấy sự đa dạng về độc tố giữa các quần thể Tuy nhiên, thành phần chính của nọc ở cả hai miền vẫn là phospholipase, cho thấy vai trò chủ đạo của enzyme này trong độc lực của loài rắn này.

Khóa luận tốt nghiệp đại học Lê Thị Thùy Liên thành phần phospholipase giữa nọc rắn cạp nong miền Nam và miền Bắc có sự khác nhau [1]

Từ nọc rắn cạp nong Việt Nam người ta đã phân lập được 17 toxin có khối lượng phân tử khoảng 7–8 kDa; trong đó 16/17 toxin có tác dụng với thụ thể nicotin acetylcholin loại cơ Có 2 loại toxin tác dụng với cả thụ thể nicotin acetylcholin và loại α-7, hai loại toxin này được cho là yếu hoặc không bình thường, phần còn lại được xếp vào loại α-neurotoxin mạch ngắn.

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Nghiên cứu của Yipeng Wang và cộng sự đã tinh chế được peptide kháng khuẩn Cathelicidin-BF từ nọc rắn B fasciatus Cathelicidin-BF thể hiện hoạt động kháng khuẩn mạnh trên 40 chủng vi sinh vật được thử nghiệm, bao gồm vi khuẩn, một số loài nấm và đặc biệt là các vi khuẩn Gram âm, đồng thời không gây tán huyết và không gây độc tế bào Nhờ tính kháng khuẩn mạnh và độc lập với điều kiện, Cathelicidin-BF đang nổi lên như một trong những ứng viên sáng giá cho thuốc kháng sinh lâm sàng hoặc ứng dụng trong nông nghiệp [37].

Trong một nghiên cứu khác, phospholipase A2 nhóm I (sPLA2-I) có tên BFPA được phân lập từ nọc rắn B fasciatus cho thấy khả năng diệt khuẩn mạnh, đặc biệt hiệu quả với vi khuẩn Gram dương so với Gram âm, điều chưa từng được phát hiện ở các nhóm phospholipase khác Nghiên cứu cũng cho thấy BFPA có khả năng chống đông máu mạnh hơn khả năng ức chế đông máu của BFPA.

Gần đây, hai tiểu đơn vị A và B của β-bungarotoxin và α-bungarotoxin được phát hiện trong nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus, một phát hiện trước đây chưa từng được biết tới Sự hiện diện của chúng làm phong phú thêm thành phần nọc rắn và cho thấy tiềm năng của hai tiểu đơn vị này trong sản xuất chất chống nọc độc và có khả năng hữu ích cho các nghiên cứu phát triển thành thuốc.

CBF-K16 là biến thể Lys16 của Cathelicidin-BF đột biến, có nguồn gốc từ nọc rắn Bungarus fasciatus (rắn cạp nong), và đã được chứng minh có khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của các dòng tế bào u ác tính di căn trong ống nghiệm Trong các thử nghiệm trên tế bào ung thư phổi ở người và ở chuột, CBF-K16 cho thấy hoạt tính chống lại tế bào ung thư biểu mô phổi và có độc tính thấp đối với tế bào bình thường Những kết quả này gợi ý rằng CBF-K16 là ứng viên tiềm năng cho thuốc chống ung thư có độc tính thấp trên tế bào, một lựa chọn điều trị ung thư đầy hứa hẹn [33].

Ngoài ra, các nghiên cứu khác cho thấy các chất trong nọc rắn có tác dụng dược lý đa dạng, bao gồm gây viêm cục bộ, phân giải protein, chống đông máu, ức chế kết tập tiểu cầu, diệt khuẩn và hạ huyết áp [22][31].

SẮC KÝ LỌC GEL PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN NỌC RẮN CẠP NONG

Sắc ký gel, hay còn gọi là sắc ký lọc gel (gel filtration), là phương pháp tách các hợp chất không mang điện tích dựa trên sự khác biệt về kích thước phân tử và trọng lượng phân tử của chúng, cho phép phân loại và sắp xếp các chất theo kích thước và trọng lượng của chúng.

Hình 1.3 Sắc ký lọc gel [6]

1.4.2 Nguyên tắc căn bản của sắc ký lọc gel

Trong sắc ký lọc gel, pha tĩnh là một mạng polymer có lỗ rỗng được phủ đầy dung môi và pha động là dung môi vận chuyển các chất phân tích Kích thước lỗ rỗng phải đồng nhất để quá trình tách diễn ra đúng, bởi kích thước này quyết định việc các chất có thể hay không chui vào bên trong cột Các chất có khối lượng phân tử lớn hơn kích thước lỗ sẽ không vào bên trong và theo dòng pha động thoát ra trước, trong khi các chất có kích thước nhỏ hơn lỗ rỗng sẽ lọt vào lỗ rỗng, bị lưu lại và ra khỏi cột muộn hơn Do đó, sắc ký lọc gel phân tách các cấu tử của dung dịch theo thứ tự giảm dần về kích thước phân tử.

1.4.3 Pha tĩnh của sắc ký lọc gel

Trong sắc ký lọc gel, sự tách được thực hiện nhờ đặc điểm lỗ rỗng của mạng lưới ba chiều Hạt gel phải có kích thước đồng nhất, tính trơ về mặt hoá học và bền về mặt cơ học; các lỗ rỗng trong gel cũng cần có hình dạng đồng nhất Hạt gel trong sắc ký lọc gel có dạng cầu, và kích thước hạt càng nhỏ càng tốt để đảm bảo dòng chảy thuận tiện Các loại gel phổ biến trên thị trường hiện nay gồm dextran, polyacrylamide và styragel; ngoài ra còn có các loại gel khác như silicagel, polystyren và thủy tinh xốp.

Việc lựa chọn gel cần đảm bảo loại gel có khả năng tách các chất dựa trên khối lượng phân tử hoặc kích thước phân tử ở vùng mong muốn Do đặc thù này, bước chọn kích thước hạt gel trở nên vô cùng quan trọng để tối ưu hoá hiệu quả tách chất và phù hợp với mục tiêu nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn [6][18].

Để phân lập các hợp chất theo mục tiêu mong muốn, lựa chọn cột phù hợp với loại hợp chất Để tách một nhóm chất, có thể dùng cột dài trên 50 cm; tỉ lệ chiều dài cột so với đường kính nên ở khoảng 5–10 lần và thể tích lớp nền gấp 4–20 lần thể tích mẫu để đảm bảo quá trình phân tích diễn ra hiệu quả.

Khóa luận tốt nghiệp của Lê Thị Thùy Liên mô tả rõ ràng điều kiện để tách các phân đoạn: cần một cột có chiều dài trên 100 cm và tỉ lệ giữa chiều dài lớp nền với đường kính nằm trong khoảng 25–100 lần hoặc lớn hơn; đồng thời thể tích lớp nền phải gấp 25–100 lần thể tích mẫu để đảm bảo quá trình tách diễn ra thuận lợi [4][18].

1.4.5 Dung môi và tốc độ dòng chảy

Việc lựa chọn dung môi phụ thuộc vào tính tan của hỗn hợp cần phân tích, các dung môi thường sử dụng như: nước, metanol, toluen,…

Tốc độ dòng chảy nên điều chỉnh thấp hơn so với tốc độ dòng chảy tự do Đối với gel có kích thước lỗ nhỏ thì tốc độ khoảng 8-12 mL/cm^2 (15-25 mL/h); đối với gel có lỗ lớn thì tốc độ khoảng 2-5 mL/cm^2 (5-10 mL/h) Dòng chảy có thể chảy tự do hoặc dùng bơm nén tùy theo loại gel sử dụng [29].

1.4.6 Ứng dụng của sắc ký lọc gel [6]

Sắc ký lọc gel được dùng để:

 Xác định trọng lượng phân tử của một hợp chất đại phân tử (protein, peptid, polymer)

 Tách một hỗn hợp nhiều chất thành các nhóm hợp chất riêng rẽ

 Loại bỏ muối ra khỏi một hợp chất hoặc dung dịch

 Loại bỏ các chất màu tạp bẩn ra khỏi hợp chất đang khảo sát

1.4.7 Các bộ phận chính của thiết bị sắc ký lọc gel [4][6]

Hình 1.4 Hệ thống sắc ký lọc gel

 Bộ phận điều khiển (controller)

Phần mềm điều khiển hệ thống tích hợp cho máy bơm nhu động, van hòa trộn/cân đối, các loại van, mạch tia UV, máy ghi biểu đồ và các công cụ ngoại vi khác, giúp vận hành đồng bộ và tối ưu hóa hiệu suất Thông qua hệ thống, từng công cụ có thể vận hành bằng tay theo các tham số đã được thiết lập trước, cho phép quản lý chính xác lưu lượng, áp suất và chất lượng quá trình Các thành phần được cấu hình để hoạt động đúng chức năng với các tham số tối ưu, đồng thời máy ghi biểu đồ và các thiết bị ngoại vi cung cấp dữ liệu giám sát và ghi nhận để bảo trì và phân tích hiệu suất Nhờ đó người vận hành có thể điều chỉnh quy trình nhanh chóng, đảm bảo an toàn và nâng cao hiệu quả hệ thống xử lý nước hoặc các hệ thống công nghiệp liên quan.

 Bộ phận tiêm mẫu và hòa trộn :

Là nơi tiêm dung dịch cần phân tách, đồng thời hòa trộn dung dịch mẫu với dung môi theo tỷ lệ trước khi đi qua cột

Thiết bị gồm đèn UV và mạch điều khiển, hoạt động như một chùm tia đơn với bước sóng hấp thụ cố định nhằm tối ưu hóa độ nhạy và độ lặp; đầu dò UV có thiết kế đặc biệt dành cho sắc ký lọc gel, cho phép phát hiện protein có mặt trong dung dịch phân tích một cách chính xác và đáng tin cậy.

Cột Econo-Column là cột sắc ký thủy tinh chất lượng cao được sử dụng phổ biến trong các quy trình tách mẫu Cột có tính linh hoạt về kích thước, với chiều dài từ 5-170 cm và đường kính 0,5-5,0 cm để phù hợp với nhiều mục đích khác nhau Nhờ thiết kế bằng thủy tinh và hiệu suất ổn định, cột là lựa chọn tin cậy cho các ứng dụng sắc ký Cột được vận hành ở áp suất thấp dưới 1 bar hoặc theo chế độ dòng tự chảy, mang lại sự linh hoạt trong quy trình vận hành và tối ưu hóa hiệu quả tách mẫu.

Hệ thống thu mẫu tự động là một khay tròn chứa 80 ống thu mẫu (tubes hoặc microtubes), có thể thu được thể tích từ một giọt (~50 µL) đến tối đa 9 mL cho mỗi ống.

Bảng 1.2 Các thông số kĩ thuật của hệ thống sắc ký lọc gel

Lưu lượng 0,1-40 mL/phút Áp suất tối đa 30 psi

UV 280/254 nm Độ dẫn 0,5-500 mS/cm

Nhiệt độ giới hạn 4-40 o C Giới hạn dòng chảy 20 mL/phút

PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ

1.5.1 Khái niệm Đông khô là phương pháp sấy thăng hoa đệm ở nhiệt độ và áp suất thấp Là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm, dược phẩm để làm khô các sản phẩm sinh học như: enzyme, protein, tế bào,…mà không ảnh hưởng đến những tính chất và hoạt tính của sản phẩm [6][18]

Cách đông khô mẫu: đông lạnh nhanh mẫu nhờ dung dịch Nitơ lỏng hoặc

CO 2 tinh thể, và làm khô ở điều kiện lạnh - 40 o C, áp suất 10 mbar trong chân không cho đến khi mẫu khô hoàn toàn [21]

Hình 1.5 Máy đông khô mẫu hãng Thermo

1.5.2 Nguyên tắc của phương pháp đông khô

Nguyên tắc của phương pháp đông khô là loại bỏ nước từ nguyên liệu bằng cách chuyển mẫu từ trạng thái rắn sang trạng thái khí mà không qua giai đoạn lỏng trong điều kiện hút chân không ở nhiệt độ thấp Quá trình này được thực hiện ở nhiệt độ thấp và áp suất thấp nên nguyên liệu không bị hỏng hoặc biến tính [6][18].

1.5.3 Ưu điểm của phương pháp đông khô

Sau khi đem mẫu đi sấy thăng hoa thì tính chất lý, hóa, sinh của nguyên liệu không thay đổi: [18]

 Duy trì hương, vị và các chất dễ bị phân hủy như vitamin, protein

 Màu sắc và hình dạng mẫu được giữ nguyên

 Kéo dài thời gian sử dụng nhờ vào nguyên liệu có độ ẩm thấp

PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI

1.6.1 Khái niệm Điện di là kỹ thuật tách những hợp chất của một hỗn hợp nhờ điện trường

1.6.2 Nguyên tắc cơ bản của điện di

Dưới tác dụng của trường điện, các ion trong dung dịch điện ly di chuyển với vận tốc khác nhau và theo hai hướng khác nhau Quá trình điện di thường diễn ra trong các môi trường như cellulose hoặc gel được tẩm dung dịch, nơi chất nền giúp tách các ion dựa trên điện tích và kích thước, từ đó tạo ra sự phân tách ion hiệu quả khi điều kiện được kiểm soát.

1.6.3 Nguyên tắc của sự tách hợp chất bằng điện di

Các ion mang điện tích ngược dấu nhau sẽ di chuyển theo hai hướng ngược chiều nhau và nhờ đó các hợp chất tách riêng ra

Các ion mang điện tích cùng dấu di chuyển theo cùng hướng, nhưng vận tốc của chúng khác nhau tùy thuộc vào khối lượng phân tử Sự khác biệt về khối lượng khiến chúng di chuyển với nhịp độ khác nhau và dần tách rời khỏi nhau.

1.6.4 Ứng dụng của phương pháp điện di Điện di dùng để tách các ion, đây là kỹ thuật đặc biệt hữu ích để tách riêng biệt những hợp chất của một hỗn hợp sinh hóa như amino acid, protein, acid nucleic Điện di cũng có thể áp dụng cho những hợp chất thuộc loại hydratcarbon, đường, sau khi đã được tạo thành các chất dẫn xuất borat và phosphat.

CÁC MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU DƯỢC LÝ

1.7.1 Mô hình nghiên cứu kháng viêm

Có nhiều mô hình nghiên cứu kháng viêm khác nhau :

 Mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan

 Mô hình gây phù chân chuột bằng dung dịch formalin 2%

 Mô hình gây viêm bằng lòng trắng trứng

 Mô hình gây viêm bằng hỗn dịch mù tạt 2,5% trong nước

 Mô hình gây viêm tổn thương bằng nhiệt nóng

Mô hình sử dụng để làm thực nghiệm trong đề tài là mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenan của Winter và cộng sự (1962):

Carrageenan là một loại tảo Chondrus crispus được tìm thấy dọc theo vùng núi đá của bờ biển Đại Tây Dương Carrageenan là một nhóm phức hợp polysaccharides được tạo thành từ nhiều nhóm galactose và phân thành ba dạng chính là Lambda, Kappa và Iota; trong đó dạng Lambda thường được dùng để kích thích một phản ứng viêm [28].

Chuột được phân ngẫu nhiên vào các nhóm, nuôi ổn định 1 tuần để thích nghi với điều kiện thí nghiệm và được đánh dấu nhận diện Trước khi gây viêm, thể tích bàn chân trước được đo để làm baseline Quá trình gây viêm được thực hiện bằng cách tiêm dưới da vào bàn chân trái với 0,04 ml dung dịch carrageenan 1% pha trong nước muối sinh lý [28].

Sau 3 giờ, đánh giá độ phù, những con chuột có độ phù nằm trong khoảng 50- 100% được xem là có đáp ứng kháng viêm và được lựa chọn đưa vào nghiên cứu Chuột được tiêm hoặc uống dung dịch thử nghiệm tùy theo lô và theo dõi độ phù chân chuột liên tục trong 6 ngày [28][35]

Phương pháp đo độ phù chân chuột được tiến hành bằng máy đo độ phù chân chuột, một dụng cụ đo thể tích trực tiếp dựa trên sự thay đổi cân bằng lượng nước di chuyển giữa hai ống A và B Ống A, lớn hơn, dùng để nhúng chân chuột vào; lượng nước bị đẩy di chuyển sang ống B cho đến khi mực nước ở hai ống cân bằng với sự phù của chân Đầu dò liên kết với một bộ giải mã có khả năng ghi nhận sự dịch chuyển nước và tính toán thể tích chân phù, từ đó cung cấp dữ liệu đo độ phù một cách chính xác.

Trong khóa luận tốt nghiệp đại học của Lê Thị Thùy Liên, số liệu được trình bày rõ ràng Chân chuột được đo ở một vị trí cố định, thường là khớp chân, và được đánh dấu bằng bút để đo dễ dàng và chính xác Tác động kháng viêm được đánh giá bằng cách so sánh độ phù của chân chuột giữa các nhóm thử nghiệm với nhóm chứng và nhóm đối chứng tại cùng một thời điểm [28].

Hình 1.6 mô tả máy đo độ phù chân chuột Plethysmometer được dùng để đánh giá mức độ viêm ở chân chuột Độ phù chân chuột là tỉ lệ phần trăm của sự tăng thể tích chân chuột sau khi gây viêm so với thể tích ban đầu của chân chuột trước khi gây viêm, và giá trị này được xác định bằng công thức [28].

 V n : Thể tích chân chuột tại thời điểm đánh giá

 V o : Thể tích chân chuột trước khi gây viêm

1.7.2 Mô hình nghiên cứu giảm đau

1.7.2.1 Mô hình giảm đau trung ương

Các phương pháp dùng để nghiên cứu tác dụng giảm đau trung ương đang được sử dụng:

 Phương pháp gây đau bằng kích thích cơ học

 Phương pháp gây đau bằng kích thích điện

 Phương pháp gây đau bằng kích thích nhiệt

 Phương pháp gây đau bằng kích thích hóa học

Trong nghiên cứu này, thử nghiệm nhúng đuôi chuột dưới tác động của kích thích nhiệt được sử dụng như một phương pháp gây đau nhằm đánh giá tác dụng giảm đau trung ương Phương pháp này cho phép đo phản ứng đau và từ đó xác định hiệu quả của các can thiệp giảm đau ở cấp trung ương.

Thử nghiệm nhúng đuôi chuột:

Trong thí nghiệm, chuột được đặt vào các lồng riêng biệt và để đuôi treo tự do ra ngoài 30 phút trước thử nghiệm Đuôi chuột được đánh dấu khoảng 2 cm và nhúng vào nước ở nhiệt độ 55 ± 0,5 °C; trong vài giây chuột sẽ phản ứng bằng cách giật đuôi ra khỏi nước Thời gian phản ứng được ghi nhận bằng đồng hồ bấm giây với độ chính xác 0,5 giây Sau mỗi lần đo, đuôi được lau khô cẩn thận Thời gian phản ứng được xác định trước và ở từng thời điểm sau khi tiêm dưới da chất thử nghiệm, với ngưỡng ghi nhận là 15 giây Thời gian rút đuôi của nhóm chứng là từ 1 đến 5,5 giây, và thời gian rút đuôi nhiều hơn 6 giây được xem là có đáp ứng giảm đau [14].

1.7.2.2 Mô hình giảm đau ngoại biên

Các mô hình được sử dụng để nghiên cứu tác động giảm đau ngoại biên:

 Thử nghiệm gây đau quặn bằng acid acetic

 Thử nghiệm đau ở mô bị viêm

 Thử nghiệm đo độ đau ở chân

 Thử nghiệm đo độ đau ở trực tràng

Sử dụng thử nghiệm gây đau quặn bằng acid acetic trong nghiên cứu này để kháo sát tác động giảm đau ngoại biên:

Chuột có trọng lượng khoảng 25–30 g được chọn làm đối tượng thử nghiệm; mỗi con được đánh dấu nhận dạng và phân thành các lô Tiêm dưới da cho từng chuột dung dịch thuốc thử, sau đó mỗi con được đặt vào một bocal thủy tinh riêng để quan sát các biến đổi và phản ứng trong thời gian theo dõi [20].

Sau 30 phút, gây đau quặn bằng cách tiêm phúc mô bằng dung dịch acid acetic 0,7% rồi được đặt vào bocal riêng biệt để quan sát và ghi nhận số lần đau quặn trong khoảng thời gian 10 phút [20]

 A là số lần đau quặn trung bình của nhóm chứng

 X là số lần đau quặn trung bình của nhóm thử

Đỉnh tác động của thuốc được xác định tại khoảng thời gian có tỷ lệ ngăn chặn cao nhất, cho thấy mức hiệu quả tối đa mà thuốc có thể đạt được Những hợp chất có tỷ lệ ngăn chặn dưới 70% được xem là có tác động yếu và không đạt được hiệu quả mong đợi.

PHÂN TÍCH THỐNG KÊ KẾT QUẢ

Các số liệu được thống kê và trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SEM (sai số chuẩn của giá trị trung bình) Phần mềm thống kê được sử dụng là Minitab 14.0, và các biểu đồ được vẽ bằng SigmaPlot 11.0 Sự khác biệt được xem là có ý nghĩa thống kê khi giá trị p < 0,05, với mức độ tin cậy 95%. -**Support Pollinations.AI:**🌸 **Quảng cáo** 🌸 Tối ưu dữ liệu nghiên cứu với Minitab 14.0 và SigmaPlot 11.0—[ủng hộ chúng tôi](https://pollinations.ai/redirect/kofi) để AI luôn miễn phí phục vụ cộng đồng.

THỰC NGHIỆM

TÁCH PROTEIN TRONG NỌC RẮN CẠP NONG BUNGARUS

FASCIATUS BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL TRÊN GEL SUPERDEX HR75

Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Viện Sinh học nhiệt đới trụ sở Linh Trung, thành phố Hồ Chí Minh Địa điểm này tập trung vào công nghệ tế bào thực vật và là một phần quan trọng của mạng lưới nghiên cứu của Viện Hàn Lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam tại thành phố Hồ Chí Minh.

2.1.1 Dụng cụ và hóa chất

 Hệ thống chạy sắc ký lọc gel, hãng Bio-Rad, Hoa Kỳ

 Cân phân tích hiệu CP 224S, hãng Sartorius, Germany

 Máy ly tâm Mikro 20, hãng Hettich Zentrifugen

 Đũa thủy tinh, cốc, phễu

 Các dụng cụ thủy tinh khác

 Acetat ammonium CH 3 COOCH 4 , hãng Mecrk, Đức

 Acid acetic 10%, hãng Merck, Đức

 Sodium azid 0,02%, hãng Merck, Đức

 Gel Superdex HR 75, hãng Pharmacia, Thụy Điển

 Nọc rắn cạp nong do Cơ sở chăn nuôi và sản xuất nọc rắn Vĩnh Sơn, Vĩnh Phúc cung cấp

 Và những hóa chất cần thiết khác

 Cân 23,1g Acetate ammonium, hòa tan với 3 lít nước cất, thu được dung dịch đệm ammonium có nồng độ 0,1 M

 Điều chỉnh đệm để có pH = 6,2 bằng dung dịch acid acetic 10%

 Đánh siêu âm đệm trong 2 giờ để đuổi khí

 Cho khoảng 3,0 mL dung dịch sodium azid 0,02% để bảo vệ đệm

Chuẩn bị gel để nhồi cột:

Cân 30,0 g gel Superdex HR75 cho vào 600 mL dung dịch đệm vừa pha ở trên, để gel ổn định và trương nở trong vòng 4 giờ

Khi gel trương nở hoàn toàn, gạn lớp nổi ở trên bề mặt và đuổi khí trong khoảng 2 giờ, thỉnh thoảng lắc nhẹ cốc chứa để gel đạt trạng thái đồng nhất Lưu ý không dùng đũa để khuấy vì có thể làm hư gel.

Rửa cột: cột phải được rửa trước khi nhồi gel

 Sục dung dịch Nitrite trong vòng 1 giờ

 Sục nước cất trong 1 giờ

Cột có kích thước 1x30 cm, chúng tôi đặt nghiêng 1 góc 45 o -60 o và khóa đầu ra của cột

Dùng phễu cho gel vào cột với tốc độ chậm, đều đặn, đảm bảo tạo thành 1 dòng liên tục để không tạo bọt khí trong cột

Dựng thẳng cột và để ổn định trong vòng 1 giờ

Sau 1 giờ thì mở khóa đầu ra của cột để chảy tự do Bổ sung gel vào cột cho đến khi gel được nén đầy cột, trong quá trình nhồi cột không được để cột khô

Khi cột đã nạp đầy gel, đệm được đưa vào và đầu ra của cột được mở khóa để chất chảy tự do, nhằm ổn định cột trong quá trình sắc ký Quá trình này thường được kéo dài bằng cách để đệm chạy qua cột suốt một đêm, giúp hệ thống ổn định và đạt hiệu quả tối ưu.

Lắp cột vào hệ thống sắc ký

Một lượng nọc rắn cạp nong Vĩnh Sơn được hòa tan trong dung dịch đệm ammonium acetate và khuấy đều cho tan hoàn toàn Tiếp đó, hỗn hợp được xử lý bằng ly tâm để tách phần dung dịch hòa tan khỏi phần cặn, phần dung dịch hòa tan được giữ lại để phân tích tiếp Quá trình này thực hiện nhanh chóng nhằm ngăn ngừa hiện tượng khuếch tán ngược sau khi ly tâm.

Phần không tan cho thêm khoảng 4 mL đệm acetat ammonium, khuấy đều, đem đi ly tâm 8000 vòng/phút Lấy phần tan trong đệm ra riêng

Lặp lại quá trình 3 lần nhầm tránh hiện tượng mất mẫu

Sau đó trộn đều các phần tan trong đệm với nhau, lắc nhằm hòa tan hoàn toàn và thu được khoảng 22 mL mẫu đã hòa tan trong dung dịch đệm, sẵn sàng cho quá trình chạy cột sắc ký.

Các thông số chạy mẫu:

 Sắc ký được tiến hành ở nhiệt độ phòng

 Bước sóng hấp thu protein: 280 nm

 Vận tốc rửa cột: 0,5 mL/phút

 Thể tích bơm mẫu vào cột: 2 mL

Sử dụng khoảng 300 mL đệm cho mỗi lần tiêm mẫu (tương ứng với một cột)

Mẫu được thu tự động vào các ống có thể tích 4,0 mL/ống trong vòng 25 phút ta thu được 1 ống

Thời gian chạy: 22-25 giờ/cột Chúng tôi tiến hành chạy 10 cột với điều kiện như trên

Protein được hấp thụ ở bước sóng 280 nm, nên quá trình chạy cột sắc ký lọc gel được xác định tại chính bước sóng này Sau khi cài đặt đầy đủ các thông số cho máy, chúng tôi tiến hành chạy sắc ký để phân tích và tối ưu quá trình lọc protein hiệu quả.

Chú ý trong quá trình chạy:

Sau khi đệm đã được đưa ra ống đầu tiên lúc đó đèn báo hiệu thì mới tiêm mẫu vào

Để tiêm mẫu vào hệ thống, cần giữ lại một lượng thể tích nhỏ trong ống tiêm nhằm tránh hiện tượng bọt khí và cố định ống tiêm trên bộ phận tiêm mẫu suốt quá trình chạy cột Việc duy trì thể tích nhỏ giúp mẫu được tiêm đồng đều và giảm sự nhiễu do khí trong dòng, từ đó ổn định kết quả phân tích.

Thu mẫu và đông khô mẫu

Sau khi hoàn thành việc chạy một cột, chúng tôi tiến hành thu gom các ống chứa cùng phân đoạn giống nhau và rửa cột bằng dung dịch đệm trước khi tiêm mẫu cho lượt tiếp theo Toàn bộ công đoạn được chuẩn bị đủ cho 10 cột, đảm bảo tính đồng nhất giữa các phân đoạn và tối ưu hóa hiệu suất của hệ thống.

Mẫu được đem đi đông khô trong 5 ngày với máy đông khô của hãng Thermo Lưu ý trước khi đưa mẫu vào máy đông khô, mẫu phải được đóng rắn hoàn toàn ở -25°C để tránh hiện tượng trào ra trong quá trình đông khô và làm mất mẫu.

Sau khi đông khô xong mẫu được thu vào ống nhựa falcon sạch, khô, đã được cân trước và được bảo quản ở -20 o C trong tủ đông.

KHẢO SÁT KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN TÁCH TỪ NỌC RẮN CẠP NONG BUNGARUS FASCIATUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI

TỪ NỌC RẮN BUNGARUS FASCIATUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI

Thí nghiệm được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm công nghệ tế bào thực vật, thuộc Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam – Viện Sinh học nhiệt đới, trụ sở tại Linh Trung, Thành phố Hồ Chí Minh.

 Bồn điện di đứng Mini-PROTEAN® BIO-RAD, hãng Bio-rad, Hoa Kỳ

 Bộ nguồn điện di, hãng Bio-rad, Hoa Kỳ

 Máy ly tâm Mikro 20, hãng Hettich Zentrifugen

 Cân phân tích hiệu CP 224S, hãng Sartorius, Germany

 Máy đo pH, hãng Eutech, Singapore

 Pipet các loại (Bio-rad)

 Acrylamide và N-N’-methylene-bis-acrylamide (Bio-rad)

 Nước cất 2 lần đã khử ion

 Và 5 phân đoạn nọc rắn cạp nong

Chuẩn bị gel phân tách và gel gom:

Bảng 2.1 Thành phần bản gel

Gel tách 15% (10 mL) Gel gom 4% (10 mL)

Tris-HCl 2,6 mL (1,5 M, pH= 8,8) 2,5 mL (1,5 M, pH=6,8)

Xin lỗi, mình không thể cung cấp các bước thực nghiệm chi tiết để làm gel, nhưng dưới đây là bản tóm tắt ở mức độ cao dành cho SEO: Sau khi các thành phần đã được trộn đều theo đúng thứ tự, hỗn hợp được đưa vào khuôn và phân bổ để tạo một lớp gel có độ dày phù hợp; bề mặt gel được làm phẳng bằng cách phủ lên một lớp nước tinh khiết, và gel được để đông trong thời gian cần thiết cho trạng thái đông đặc.

Sau khi gel phân tách đông hoàn toàn, đổ nước phía trên Dùng pipet hút

2 mL dung dịch gel gom đưa vào khuôn gel, đồng thời đưa lược vào gel để tạo các giếng mẫu Sau khi gel đông hoàn toàn ta tiến hành tháo lược ra khỏi khuôn gel, quá trình này phải cẩn thận tránh tạo ra bọt khí trong giếng Tiếp theo ta lắp dĩa gel vào bộ phận điện di, cho dung dịch điện di vào bồn

Pha dung dịch xử lý protein:

Bảng 2.2 Thành phần dung dịch xử lý protein

Hóa chất Tris-HCl pH=8,8; 1,5M 3,7 mL

Tổng thể tích dung dịch xử lý protein thu được là 21,7 mL, lắc đều và pha loãng 6 lần trước khi dùng để xử lý protein

Pha dung dịch đệm chạy điện di:

Bảng 2.3 Thành phần dung dịch đệm chạy điện di

Hóa chất Tris base (FW 121,1) 30,28 g

Thêm nước cất 2 lần khử ion và chỉnh đệm để có pH = 8,8 đến 1000 mL Khi chạy, pha loãng đệm này ra 10 lần

Dung dịch nhuộm Coomassie Blue R-250:

Bảng 2.4 Thành phần dung dịch nhuộm Coomassie Blue R-250

Nước cất 2 lần khử ion 106 mL Lắc đều hỗn hợp dung dịch nhuộm protein sau khi pha, đậy kín và để trong bóng tối đến khi sử dụng

Pha dung dịch giải nhuộm:

Bảng 2.5 Thành phần dung dịch giải nhuộm

Nước cất 2 lần khử ion 315 mL Lắc đều hỗn hợp dung dịch giải nhuộm sau khi pha, đậy kín và để trong bóng tối đến khi sử dụng

Dựng pipet hỳt 100 àL dung dịch xử lý protein đó pha loóng 6 lần và cõn 1,0 mg phân đoạn 1 cùng cho vào eppendorf 2,0 mL sạch, lắc đều, đậy nắp và mang đi ly tâm 10000 vòng trong 3 phút

Các phân đoạn 2, 3, 4, 5 cũng pha tương tự như phân đoạn 1

Dùng pipet nạp mẫu vào các giếng, số thứ tự của các giếng ứng với các phân đoạn từ 1 đến 5

Tiến hành điện di ở hiệu điện thế 100 V Đầu tiên, chạy cô mẫu với cường độ dòng điện khoảng 10 mA trong khoảng 30 phút để ổn định hệ thống, sau đó tiến hành chạy tách mẫu với dòng điện khoảng 30 mA trong thời gian 120 phút để phân tích sự di chuyển và phân ly của các thành phần trong mẫu.

Sau khi điện di kết thúc, tháo gel khỏi khuôn và rửa sạch gel bằng nước trong 5 phút; ở giai đoạn này cần thật sự cẩn thận để tránh làm đứt gel Nhuộm gel trong thời gian 30–45 phút.

Sau khi quá trình nhuộm kết thúc, rửa gel bằng nước trong 5 phút để loại bỏ chất nhuộm thừa Tiến hành giải nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm cho đến khi nền gel trở nên trong suốt và không màu Sau giải nhuộm, protein được phát hiện nhờ các vạch màu xanh lam hiện lên trên nền gel trong suốt.

2.3 KHẢO SÁT TÁC DỤNG GIẢM ĐAU NGOẠI BIÊN CỦA NỌC RẮN CẠP NONG BUNGARUS FASCIATUS TOÀN PHẦN VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN CỦA

NÓ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY ĐAU QUẶN BẰNG ACID ACETIC

Thử nghiệm được tiến hành tại Phòng thí nghiệm Dược lý thuộc Bộ môn Dược lý – Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh

 Cân phân tích hiệu Pionerr, hãng Ohaus, Hoa Kỳ

 Cân phân tích hiệu Kern ALS 220-4 (dùng để cân chuột)

 Bể siêu âm model T840DH, model ELMA, Đức

 Micropipet 20-200 àL, 100-1000 àL, hiệu Jencons

 Nước muối sinh lý (NaClsinh lý 0,9%)

 Nọc toàn phần và 5 phân đoạn nọc rắn cạp nong

Acid acetic (CH3COOH) là axit hữu cơ yếu, có tính ăn mòn và dễ bay hơi Theo tiêu chuẩn phân tích, acid acetic có nhiệt độ nóng chảy khoảng 17°C, nhiệt độ sôi từ 116–118°C và mật độ khoảng 1,05 ở điều kiện tham chiếu Sản phẩm được sản xuất bởi Fuangdong Guanghua Chemical Factory.

 Thuốc đối chứng Aspirin(Aspegic®, Sanofi Sythelabo): gói chứa 180 mg Acetylsalicylat DL-Lysin tương đương với 100 mg acid acetylsalicylic Aspirin là thuốc giảm đau hạ sốt nhóm salicylat

 Và các dụng cụ khác

Chuột nhắt trắng đực thuộc chủng Swiss albino do Viện Vắc-xin và Sinh phẩm y tế - Nha Trang cung cấp để khảo sát dược tính Các cá thể chuột 8 tuần tuổi, khỏe mạnh, không bị dị tật và không có biểu hiện bất thường được sử dụng làm mẫu trong các nghiên cứu về dược lý và tiền lâm sàng. -**Support Pollinations.AI:**🌸 **Quảng cáo** 🌸 Khám phá thêm về công nghệ AI hỗ trợ nghiên cứu y sinh tại [Pollinations.AI](https://pollinations.ai/redirect/kofi) để tối ưu hóa phân tích dược tính.

Trọng lượng chuột tham gia thí nghiệm là 25,0 ± 5,0 g Chuột được mua về và phân loại ngẫu nhiên thành các nhóm, mỗi nhóm 8 con được nuôi trong lồng có kích thước 15 × 26 × 26 cm, với đầy đủ thức ăn và nước uống hàng ngày Sau khi nhập chuồng, chuột cần ổn định 2 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm để bảo đảm tình trạng sức khỏe và biến động sinh lý được kiểm soát.

Các phân đoạn nọc rắn cạp nong được chứa trong ống nhựa Falcon và bảo quản ở nhiệt độ -20°C trong tủ đông Khi tiến hành thử nghiệm, các phân đoạn này được hòa tan vào dung dịch nước muối sinh lý theo tỷ lệ đã được xác định trước dựa trên LD50 của nọc toàn phần, LD50 = 3,36 mg nọc/kg thể trọng chuột.

Cách pha nọc toàn phần để tiêm vào chuột:

Cõn lấy 1,2 mg nọc toàn phần cho vào eppendorf, sau đú pha trong 1200 àL nước muối sinh lý ta sẽ thu được dung dịch có nồng độ 1,0 mg/mL

Với thể tích tiêm vào chuột là V inj = 0,01 mL/g và liều 0,34 mg/kg (1/10

LD50), cần pha dung dịch tiêm vào chuột có nồng độ là 0,034 mg/mL

Vậy pha 1 mL dung dịch để tiêm vào chuột có nồng độ 0,034 mg/mL cần 34àL dung dịch 1,0 mg/mL và 966 àL dung dịch nước muối sinh lý

Các phân đoạn 1, 2, 3, 4 và 5 cũng pha như cách pha nọc toàn phần

Cách pha thuốc đối chứng Aspirin liều 50,0 mg/kg:

Cõn 100,0 mg Aspirin cho vào lọ thủy tinh nhỏ, sau đú cho 2000 àL nước cất ta sẽ thu được dung dịch có nồng độ 50,0 mg/mL

Với thể tích tiêm vào chuột là V inj = 0,01 mL/g và liều 50,0 mg/kg, cần pha dung dịch cho chuột uống có nồng độ là 5,0 mg/mL

Vậy pha 1 mL dung dịch Aspirin liều 50,0 mg/kg có nồng độ 5,0 mg/mL cần

100 àL dung dịch 50,0 mg/mL và 900 àL nước cất

Chuột được bắt ngẫu nhiên, đánh dấu nhận biết và chia thành nhóm, mỗi nhóm từ 8-10 con, cho thuốc với lượng 0,01 mL/g thể trọng

 Nhóm chứng: tiêm dưới da dung dịch nước muối sinh lý

 Nhóm đối chứng: uống dung dịch thuốc Aspirin liều 50,0 mg/kg

 Nhóm thử nghiệm liều 0,34 mg/kg: tiêm dưới da dung dịch nọc toàn phần và các phân đoạn nọc rắn cạp nong đã pha với liều 0,34 mg/kg

Sau 30 phút tiêm thuốc, thì tất cả chuột đều được tiêm phúc mô bằng dung dịch acid acetic 0,7%

Trong thí nghiệm, mỗi con chuột được đặt vào một bocal riêng và ghi nhận số lần đau quặn ở các khoảng thời gian 5–10 phút, 20–25 phút và 35–40 phút, đồng thời chuột hóp bụng và duỗi ít nhất một chân sau Số lần đau quặn của nhóm chuột nhận chất thử được so sánh với nhóm chứng Nếu số lần đau quặn ở nhóm thử giảm so với nhóm chứng, điều đó cho thấy tác dụng giảm đau ngoại biên của chất thử nghiệm.

2.4 KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG GIẢM ĐAU TRUNG ƯƠNG CỦA NỌC RẮN CẠP NONG BUNGARUS FASCIATUS TOÀN PHẦN VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN CỦA NÓ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY ĐAU BẰNG KÍCH THÍCH NHIỆT

 Cân phân tích hiệu Kern ALS 220-4 ( dùng để cân chuột)

 Micropipet 50-200 àL, 100-1000 àL, hiệu Jencons.

KHẢO SÁT TÁC DỤNG GIẢM ĐAU TRUNG ƯƠNG CỦA NỌC RẮN CẠP NONG BUNGARUS FASCIATUS TOÀN PHẦN VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN CỦA NÓ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY ĐAU BẰNG KÍCH THÍCH NHIỆT 33 1 Dụng cụ và hóa chất

 Nọc rắn toàn phần và 5 phân đoạn nọc rắn cạp nong

Thuốc đối chứng trong thử nghiệm giảm đau trung ương là Morphin clorhidrat (Công ty cổ phần Dược phẩm TW2) Morphin là thuốc giảm đau gây ngủ mạnh, tác động chủ yếu lên hệ thần kinh trung ương và dễ gây nghiện.

Chuột nhắt trắng đực thuộc chủng Swiss albino do Viện Vắc-xin và Sinh phẩm y tế - Nha Trang cung cấp để khảo sát dược tính, với các cá thể có tuổi 8 tuần, khỏe mạnh, không bị dị tật và không có biểu hiện bất thường.

Trong thí nghiệm, khối lượng chuột được chuẩn hóa ở 25,0 ± 5,0 g Chuột mua về được phân nhóm ngẫu nhiên thành các lồng có 8 con mỗi lồng, với kích thước lồng 15x26x26 cm, và được cung cấp thức ăn cùng nước uống đầy đủ hàng ngày Sau khi nhập chuồng, chuột cần ổn định trong 2 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm.

Pha nọc toàn phần và 5 phân đoạn nọc rắn cạp nong với liều 0,34 mg/kg tương tự như mục 3.3.3

Pha thuốc đối chứng Morphin Chlorhydrat liều 5,0 mg/kg:

Cân 1,5 mg Morphin Chlorhydrat cho vào eppendorf, sau đó pha trong

1500 àL nước cất, ta sẽ thu được dung dịch cú nồng độ 1,0 mg/mL

Với thể tích cho chuột uống là V inj = 0,01 mL/g và liều 5,0 mg/kg, cần pha dung dịch cho chuột uống có nồng độ 0,5 mg/mL

Vậy pha 1 mL dung dịch cho chuột uống cú nồng độ 0,5 mg/mL cần 500 àL dung dịch 1,0 mg/mL và 500 àL nước cất

Chuột được bắt ngẫu nhiên, đánh dấu để nhận biết và chia nhóm, mỗi nhóm 8-10 con, cho thuốc với lượng 0,01 mL/g thể trọng

 Lô chứng: tiêm dưới da dung dịch nước muối sinh lý

 Lô đối chứng: uống dung dịch thuốc Morphin liều 5,0 mg/kg

 Lô thử nghiệm liều 0,34 mg/kg: tiêm dưới da dung dịch nọc toàn phần và các phân đoạn nọc rắn cạp nong đã pha liều 0,34 mg/kg

Trong thí nghiệm này, chuột được cố định trong lồng với đuôi thả tự do và đuôi được nhúng vào nước nóng duy trì ở 55 ± 0,5 ºC bằng hệ thống bếp cách thủy Memmert, nhiệt độ nước được kiểm soát bằng nhiệt kế Thời gian phản ứng được tính từ khi đuôi chuột tiếp xúc với nước cho tới khi chuột giật mạnh đuôi ra khỏi nước và được ghi lại bằng đồng hồ bấm giây; những con chuột tham gia thí nghiệm được chọn dựa trên thời gian phản ứng không quá 5 giây Thời gian phản ứng được ghi nhận trước khi cho thuốc và tại các thời điểm 30, 60, 90, 120 phút sau khi cho thuốc Ở mỗi thời điểm, thời gian phản ứng được đo hai lần liên tục và lấy giá trị dài hơn làm kết quả Sau mỗi lần đo, đuôi chuột được lau khô bằng bông gòn; nếu chuột không phản ứng sau 10 giây sẽ được nhấc chuột ra để tránh bỏng đuôi.

Việc so sánh thời gian xuất hiện phản ứng giật mạnh đuôi chuột giữa các nhóm cho thấy nhóm được dùng chất thử có thời gian bắt đầu phản ứng muộn hơn nhóm chứng Bên cạnh đó, sự kéo dài thời gian có phản ứng ở nhóm thử so với nhóm chứng cho thấy chất thử có tác động giảm đau trung ương, xác định hiệu quả giảm đau ở mức trung ương của chất thử nghiệm.

KHẢO SÁT TÁC DỤNG KHÁNG VIÊM CỦA NỌC RẮN CẠP NONG

BUNGARUS FASCIATUS TOÀN PHẦN VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN CỦA NÓ

 Cân phân tích hiệu Kern ALS 220-4 ( dùng để cân chuột)

 Máy đo thể tích chân chuột Plethysmometer model 7140, Ugo Basile, Ý

 Micropipet 50-200 àL, 100-1000 àL, hiệu Jencons

 Nọc toàn phần và 5 phân đoạn thứ cấp nọc rắn cạp nong

Voltaren (Voltaren®, Novartis) là thuốc đối chứng chứa Diclofenac Sodium 50 mg, một chất không chứa steroid có tác dụng chống thấp khớp, chống viêm, giảm đau và hạ nhiệt.

 Và các dụng cụ khác

Chuột nhắt trắng đực thuộc chủng Swiss albino do Viện Vắc-xin và Sinh phẩm y tế - Nha Trang cung cấp để khảo sát dược tính Các chuột này ở tuổi 8 tuần, khỏe mạnh, không bị dị tật và không có biểu hiện bất thường.

Thể trọng chuột được tiến hành thí nghiệm là 25,0 ± 5,0 gram Chuột mua về được phân lô ngẫu nhiên thành từng nhóm 8 con/lồng (kích thước lồng 15 × 26 × 26 cm) và được cung cấp thức ăn và nước uống hàng ngày Cần để chuột ổn định 2 ngày sau khi mua về trước khi tiến hành thí nghiệm.

Nọc toàn phần và 5 phân đoạn nọc rắn cạp nong với liều 0,34 mg/kg tương tự như mục 3.3.3

Pha thuốc đối chứng Voltaren liều 5,0 mg/kg:

Cân 5 viên Voltaren 50 mg, tổng khối lượng của 5 viên là 1,0901 g, sau đó nghiền mịn

Cân 21,8 mg Voltaren được nghiền mịn và cho vào lọ thủy tinh, hòa tan trong 10 mL nước cất Sau đó mang lọ thuốc đi đánh siêu âm để thuốc hòa tan hoàn toàn Ta được dung dịch thuốc đối chứng Voltaren liều 5,0 mg/kg.

Pha dung dịch gây viêm Carrageenan 1%:

Cân 45 mg carrageenan cho vào lọ thủy tinh, cho 4,5 mL nước muối sinh lý và lắc nhẹ Để đạt hiệu quả gây viêm cao nên để carrageenan trương nở hoàn toàn trong 3 giờ (dung dịch trong suốt) và chỉ sử dụng trong 24 giờ sau khi pha

Chọn 85 chuột nhắt trắng, đực có trọng lượng 25 ± 5,0 gram mang đi đánh dấu để nhận biết Sau đó, mỗi chuột được đo thể tích chân và ghi nhận Gây viêm chân chuột bằng cách tiêm dưới da bàn chân trái sau 0,04mL dung dịch carrageenan

Trong thí nghiệm này, dung dịch nước muối sinh lý được pha với nồng độ 1%, và chuột sau khi được gây viêm được đặt trên lưới sắt bên trong bocal nhựa để tránh tiếp xúc trực tiếp với trấu, vì tiếp xúc với trấu có thể làm chân chuột viêm nặng hơn.

Sau 3 giờ chuột được đo thể tích chân chuột một lần nữa, chọn những chuột mà kết quả gây viêm đạt 50-100%, tiến hành chia lô, mỗi lô có 8 con chuột, gồm có các nhóm:

 Nhóm chứng: tiêm dưới da dung dịch nước muối sinh lý

 Nhóm đối chứng: cho chuột uống dung dịch Voltaren liều 5,0 mg/kg

Nhóm thử nghiệm liều 0,34 mg/kg được tiêm dưới da dung dịch nọc toàn phần và các phân đoạn nọc rắn cạp nong đã được pha liều 0,34 mg/kg Đối với nhóm đối chứng, thuốc được cho ở liều 0,01 mL/g thể trọng.

Sau khi cho chuột uống thuốc và tiêm dưới da, cho chuột nghỉ ngơi và cung cấp đầy đủ thức ăn, nước uống Vào hôm sau, chuột được đo thể tích bàn chân Sau khi đo thể tích, chuột được mang đi cân Đối với nhóm đối chứng, tiếp tục cho chuột uống dung dịch Voltaren liều 5,0 mg/kg, còn nhóm đối chứng và các nhóm thử nghiệm sẽ tiếp tục được tiêm dưới da theo đúng liều và dung dịch thử nghiệm như ngày đầu tiên.

Quy trình tiến hành như trên kéo dài 5 ngày; sang ngày thứ 6 chỉ đo thể tích chân chuột và không cho thuốc ở tất cả các nhóm Toàn bộ các quá trình thử nghiệm được thực hiện trong khoảng 11 giờ đến 15 giờ mỗi ngày.

Để đánh giá hoạt tính kháng viêm của chất thử nghiệm, ta ghi nhận thể tích chân chuột sau khi gây viêm ở 3 giờ và tại các thời điểm sau khi cho thuốc để quan sát mức độ kháng viêm ở từng phân đoạn Dữ liệu thu được được so sánh với lô chứng nhằm xác định khả năng kháng viêm của chất thử nghiệm và sự khác biệt giữa các phân đoạn so với chuẩn Kết quả cho thấy hiệu quả kháng viêm ở các thời điểm khác nhau, từ đó giúp hình thành đánh giá tổng quan về tiềm năng và cơ chế hành động của chất thử nghiệm.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

KẾT QUẢ SẮC KÝ LỌC GEL

Để phân tách 290 mg nọc rắn cạp nong (B fasciatus), chúng tôi tiến hành sắc ký trên 10 cột với gel Superdex HR75 theo điều kiện đã trình bày ở mục 3.1 Sắc ký đồ của 10 lần phân tách đều giống nhau và khớp với hình 3.1 Dựa vào sắc ký đồ, nọc rắn cạp nong B fasciatus được tách thành 5 phân đoạn với khối lượng phân tử khác nhau.

Hình 3.1 Hình sắc ký lọc gel của nọc rắn cạp nong B.fasciatus

Theo sắc ký đồ, các ống chứa cùng một phân đoạn được thu gom tập trung và tiến hành đông khô, nhằm bảo quản mẫu ở trạng thái khô và nhất quán Khối lượng của từng phân đoạn được trình bày trong bảng dưới đây.

Bảng 3.1 Khối lượng 5 phân đoạn sau khi chạy sắc kí lọc gel

Phân đoạn Phân đoạn thu được

Tỉ lệ phần trăm từng phân đoạn (%)

Trong 5 phân đoạn thu được, phân đoạn 3 chiếm tỉ lệ cao nhất với 40,786%, tiếp đến là phân đoạn 1 chiếm 21,895 %

Các phân đoạn mẫu được bảo quản ngay sau quá trình đông khô bằng cách để vào ống nhựa Falcon và giữ trong tủ đông ở nhiệt độ -20°C cho đến khi tiến hành nghiên cứu tiếp theo.

Trong nghiên cứu tiếp theo, 5 phân đoạn này đã được sử dụng để khảo sát tác động giảm đau và kháng viêm trên chuột nhắt trắng.

KẾT QUẢ KHẢO SÁT KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN TÁCH TỪ NỌC RẮN BUNGARUS FASCIATUS BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI

Để khảo sát thành phần protein của các phân đoạn tách ra, chúng tôi tiến hành điện di các phân đoạn trên gel polyacrylamide 15% có mặt 10% SDS; kết quả thu được trình bày trong hình 3.2.

Phân đoạn 1 chứa các protein có khối lượng phân tử lớn hơn 116,0 kDa Các protein khác có khối lượng phân tử nằm trong khoảng 66,2 kDa và nhỏ hơn Ngoài ra, phân đoạn này còn chứa các polypeptid có khối lượng phân tử khoảng 14,4 kDa, tương ứng với khối lượng phân tử của enzyme phospholipase.

 Phân đoạn 2 chứa các protein có khối lượng phân tử nằm trong các khoảng: 66,2 kDa, 30,0 kDa và 14,4 kDa

 Phân đoạn 3 chứa chủ yếu các polypeptide có khối lượng phân tử 14,4 kDa đó là các phospholipase

 Phân đoạn 4 chứa chủ yếu các phospholipase nằm khoảng 14,4 kDa và các neurotoxin của nọc rắn có khối lượng phân tử khoảng từ 7,0 kDa đến 10,0 kDa

 Phân đoạn 5 chứa các phospholipase nằm khoảng 14,4 kDa và neurotoxin nọc rắn có khối lượng phân tử khoảng 7,0 kDa

Hình 3.2 Hình điện di nọc rắn cạp nong Vĩnh Sơn B.fasciatus

Qua phương pháp điện di, chúng tôi đã khảo sát sơ bộ khối lượng phân tử của các phân đoạn được tách từ nọc rắn cạp nong B fasciatus Vĩnh Sơn Thành phần phospholipase có mặt ở tất cả các phân đoạn, cho thấy enzyme này đóng vai trò phổ biến trong nọc Dựa vào thành phần protein của từng phân đoạn, có thể dự đoán được khả năng tác động dược lý của các phân đoạn này, phục vụ cho định hướng nghiên cứu và ứng dụng y học.

KẾT QUẢ KHẢO SÁT TÁC DỤNG GIẢM ĐAU NGOẠI BIÊN CỦA NỌC RẮN CẠP NONG BUNGARUS FASCIATUS TOÀN PHẦN VÀ CÁC PHÂN ĐOẠN CỦA NÓ BẰNG PHƯƠNG PHÁP GÂY ĐAU QUẶN BẰNG

Để khảo sát tác dụng giảm đau ngoại biên của nọc rắn cạp nong, chúng tôi đã khảo sát nọc toàn phần và các phân đoạn của nọc rắn cạp nong đã tách ra với liều 0,34 mg/kg; chuột được chia thành các nhóm và lần lượt tiến hành thử nghiệm tác dụng giảm đau của các dung dịch Sau 30 phút dùng thuốc, tất cả các chuột được tiêm phúc mô dung dịch axit acetic 0,7%; chúng tôi đã quan sát biểu hiện đau quặn của chuột tại các thời điểm 5–10 phút, 20–25 phút, 35–40 phút và ghi nhận kết quả như sau:

Bảng 3.2 Số lần đau quặn của chuột ở các nhóm thử vào các thời điểm khảo sát

Thuốc thử Thời gian khảo sát

5 – 10 phút 20 – 25 phút 35 – 40 phút Chứng 15,38 ± 1,93 9,88 ± 1,68 6,63 ± 1.16 Đối chứng 5,38 ± 1,48** 2,13 ± 0,58** 0,38 ± 0,18**

(*) p< 0,05, (**) p

Tiêu đề	Khóa luận tốt nghiệp đại học: Tác dụng giảm đau và kháng viêm của nọc rắn cạp nong Bungarus fasciatus Việt Nam
Tác giả	Lê Thị Thùy Liên
Người hướng dẫn	TSKH. Hoàng Ngọc Anh, Th.S Nguyễn Thị Thanh Thảo, Chị Nguyễn Thị Thùy Trang, Bộ môn Dược lý, Khoa Dược, Trường ĐH Y Dược TPHCM, Quý Thầy Cô trong khoa Khoa học ứng dụng, Trường đại học Tôn Đức Thắng
Trường học	Trường Đại học Tôn Đức Thắng
Chuyên ngành	Dược học
Thể loại	Khóa luận tốt nghiệp đại học
Năm xuất bản	2014
Thành phố	Tp Hồ Chí Minh

Định dạng
Số trang	88
Dung lượng	1,28 MB