kl le thi phuong loan 072485s

23 4.1 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ Acetosyringone đến khả năng chuyển gen vào PLB thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .... Mặc dù phương pháp chuyển gen gi

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM

ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

GVHD : THS NGUYỄN XUÂN DŨNG SVTH : LÊ THỊ PHƯƠNG LOAN MSSV : 072485S

TP.HỒ CHÍ MINH - 2011

LỜI CẢM ƠN

Sau một thời gian thực hiện đề tài đến nay em đã hoàn thành bài báo cáo luận văn tốt nghiệp, để có được cơ hội thực hành và học hỏi thêm nhiều kiến thức trong suốt quá trình vừa qua, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:

Ban Giám hiệu trường Đại học Tôn Đức Thắng

Ban Giám đốc Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh

Qúy thầy, cô trong khoa Khoa Học Ứng Dụng trường Đại học Tôn Đức Thắng

đã tạo điều kiện để em hoàn tất bài luận văn

Cùng các anh chị thuộc phòng Công Nghệ Sinh học thực vật Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh

Đặc biệt, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến thầy Nguyễn Xuân Dũng là người hết lòng dạy dỗ và hướng dẫn em thực hiện đề tài trong suốt thời gian qua

Em cũng xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và động viên

em trong suốt thời gian thực hiện đề tài này

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

Lê Thị Phương Loan, Đại học Tôn Đức Thắng Tp HCM Tháng 12/2011

“BƯỚC ĐẦU THIẾT LẬP QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀO LAN DENDROBIUM SONIA BẰNG VI KHUẨN Agrobacterium ”

Giáo viên hướng dẫn: ThS Nguyễn Xuân Dũng

Đề tài nghiên cứu “Bước đầu thiết lập quy trình chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia bằng vi khuẩn Agrobacterium” được tiến hành tại Phòng Công nghệ sinh học

Thực vật – Trung tâm Công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh, thời gian thực hiện

từ 20/8 đến 20/12 năm 2011.Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên Kết quả nghiên cứu của đề tài nhằm mục đích cung cấp dữ liệu khoa học cần thiết cho

việc chuyển được gen vào cây lan Dendrobium Sonia cũng như lan Dendrobium nói chung bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Các thông số kỹ thuật của đề tài sẽ

là cơ sở để tiếp tục tiến hành chuyển gen tạo ra cây lan Dendrobium Sonia có khả năng

kháng virus

Kết quả nghiên cứu:

- Acetosyringone 100  và thời gian đồng nuôi cấy 4 ngày tạo ra hiệu quả

chuyển gen cao nhất trong sự chuyển gen vào PLB của lan Dendrobium Sonia

- Hygromycin 10 mg/l có khả năng giết chết toàn bộ PLB sau 20 ngày nuôi cấy, thích hợp cho sự sàn lọc PLB chuyển gen

- Cefotaxime 300 mg/l có khả năng diệt hoàn toàn vi khuẩn cộng sinh với PLB sau 9 ngày, thích hợp cho sự loại vi khuẩn từ PLB sau khi đồng nuôi cấy

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH SÁCH CÁC HÌNH vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỀU ĐỒ vii

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và phạm vi đề tài 1

1.3 Ý nghĩa của đề tài 2

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3

2.1 Giới thiệu chung về lan Dendrobium Sonia 3

2.1.1 Nguồn gốc 3

2.1.2 Phân loại 3

2.1.3 Đặc điểm về hình thái 4

2.2 Sơ lược về vi khuẩn Agrobacterium 6

2.2.1 Phân loại 6

2.2.2 Đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium 7

2.2.3 Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium 8

2.2.4 Sơ lược các phương pháp chuyển gen vào nhân tế bào thực vật thông dụng: 11

2.2.5 Cơ chế chuyển gen thông qua Agrobacterium 13

2.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen trên hoa lan 15

2

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài 17

3.1.1 Thời gian 17

3.1.2 Địa điểm 17

3.2 Nội dung nghiên cứu 17

3.3 Vật liệu nghiên cứu 17

3.3.1 Vật liệu 17

3.3.2 Trang thiết bị và dụng cụ 19

3.3.3 Hóa chất 19

3.3.4 Điều kiện thí nghiệm 20

3.4 Phương pháp nghiên cứu 20

3.4.1 Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn 20

3.4.2 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng Acetosyringone và thời gian đồng nuôi cấy thích hợp giữa vi khuẩn Agrobacterium và PLB 20

3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh Cefotaxime lên khả năng loại vi khuẩn từ mô cấy 21

3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh Hygromycin lên khả năng sống của protocorm 22

3.4.5 Xử lý thống kê 22

3

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ Acetosyringone đến khả năng chuyển gen vào PLB thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 23

4.2 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh Cefotaxime lên khả năng diệt vi khuẩn Agrobacterium từ mô cấy 28

4.3 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh Hygromycin lên khả năng sống của PLB 31

CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

5.1 Kết luận 35

5.2 Đề nghị 35

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

PHỤ LỤC 39

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A.tumefacciens Agrobacterium tumefaciens

DNA Deoxyribonucleic acid

GFP Green Fluorescent Protein

GUS β-glucuronidase

LB Left Border

PCR Polymerase Chain Reaction

PEG Polyethylene glycol

PLB Protocorm like body

RB Right Border

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1: Lan Dendrobium Sonia 4

Hình 2.2: Vi khuẩn Agrobacterium dưới kính hiển vi 7

Hình 2.3: Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium 8

Hình 2.4: Vị trí Ti-plasmid trong tế bào vi khuẩn 9

Hình 2.5: Cấu trúc của Ti-Plasmid 10

Hình 3.1: Chuẩn bị protocorm cho quá trình chuyển gen 17

Hình 3.2: Vi khuẩn Agrobacterium cấy trên đĩa môi trường LB 18

Hình 3.3: Cấu trúc vector pCambia 1301 18

Hình 4.1: Các mức độ biểu hiện màu khác nhau ở các mẫu PLB dương tính GUS 27

Hình 4.2: PLB nuôi cấy trên môi trường MS không bổ sung Hygromycin (A) và có bổ sung Hygromycin ở nồng độ 10 mg/l (B) sau 20 ngày 31

DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ

Bảng 4.1: Tỷ lệ mẫu PLB dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ

Acetosyringone sau 1 ngày đồng nuôi cấy 23 Bảng 4.2: Tỷ lệ mẫu PLB dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ

Acetosyringone sau 2 ngày đồng nuôi cấy 24 Bảng 4.3: Tỷ lệ mẫu PLB dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ

Acetosyringone sau 3 ngày đồng nuôi cấy 25 Bảng 4.4: Tỷ lệ mẫu PLB dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ

Acetosyringone sau 4 ngày đồng nuôi cấy 26 Bảng 4.5: Tỷ lệ mẫu sống và sạch khuẩn trên môi trường MS bổ sung kháng sinh

Cefotaxime ở các nồng độ khác nhau theo thời gian nuôi cấy 30 Bảng 4.6: Tỷ lệ mẫu PLB sống trên các môi trường chứa Hygromycin ở các nồng độ khác nhau theo thời gian nuôi cấy 32

Biểu đồ 4.1: Tỷ lệ mẫu PLB dương tính GUS ở nồng độ Acetosyringone 100 µM theo thời gian đồng nuôi cấy 26 Biểu đồ 4.2: Tỷ lệ mẫu sống và sạch khuẩn trên môi trường MS bổ sung kháng sinh Cefotaxime ở các nồng độ khác nhau sau 3 ngày nuôi cấy 28 Biểu đồ 4.3: Tỷ lệ mẫu sống và sạch khuẩn trên môi trường MS bổ sung kháng sinh Cefotaxime ở các nồng độ khác nhau sau 9 ngày nuôi cấy 29 Biểu đồ 4.4: Tỷ lệ mẫu sống và sạch khuẩn trên môi trường MS bổ sung kháng sinh Cefotaxime ở các nồng độ khác nhau sau 15 ngày nuôi cấy 30 Biểu đồ 4.5: Tỷ lệ mẫu PLB sống trên các môi trường chứa Hygromycin ở các nồng

độ khác nhau sau 10 ngày nuôi cấy 32 Biểu đồ 4.6: Tỷ lệ mẫu PLB sống trên các môi trường chứa Hygromycin ở các nồng

độ khác nhau sau 15 ngày nuôi cấy 33 Biểu đồ 4.7: Tỷ lệ mẫu PLB sống trên các môi trường chứa Hygromycin ở các nồng

độ khác nhau sau 20 ngày nuôi cấy 33

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU

3.1 Đặt vấn đề

Dendrobium là giống lớn thứ hai trong họ lan (Orchidaceae), có phân bố rộng từ

các vùng nhiệt đới đến cận nhiệt đới, rất thích hợp trong điều kiện khí hậu Việt Nam

Trong đó, Dendrobium Sonia là loài lan lai có hoa đẹp, màu tím, rất được ưa chuộng

và là loại lan cắt cành chủ lực hiện nay ở Việt Nam nói chung và Thành phố Hồ Chí

Minh nói riêng Tuy nhiên, lan Dendrobium Sonia cũng như hoa lan nói chung rất dễ

mắc các loại bệnh gây hại, đặc biệt là bệnh virus

Bệnh do virus gây ra ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây lan và hiện vẫn chưa có thuốc đặc trị Do đó, việc tạo ra giống lan có khả năng kháng virus là một trong những vấn đề cấp thiết hiện nay và một trong những phương pháp đang được quan tâm nhất để tạo cây lan kháng virus là chuyển gen

Mặc dù phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens thường được sử dụng để chuyển gen trên các cây thuộc lớp hai lá mầm

Tuy nhiên, gần đây đã có nhiều nghiên cứu cho thấy có thể sử dụng vi khuẩn này để chuyển gen trên các cây một lá mầm, tuy nhiên đòi hỏi phải tối ưu hóa nhiều yếu tố liên quan trong quy trình chuyển gen

Với mục tiêu tạo ra một quy trình phù hợp để chuyển gen vào lan Dendrobium Sonia bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens, góp phần vào mục tiêu tạo cây lan

chuyển gen kháng virus trong tương lai, đề tài: “Bước đầu thiết lập quy trình chuyển

gen vào lan Dendrobium Sonia bằng vi khuẩn Agrobacterium” được triển khai thực

3.3 Ý nghĩa của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dữ liệu khoa học cần thiết cho việc

chuyển được gen vào cây lan Dendrobium Sonia cũng như lan Dendrobium nói chung bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Các thông số kỹ thuật của đề tài sẽ là cơ sở

để tiếp tục tiến hành chuyển gen tạo ra cây lan Dendrobium Sonia có khả năng kháng

virus

Dendrobium đều là phụ sinh sống bám trên cây gỗ

Dendrobium rất phong phú về chủng loại, là giống lớn thứ hai của họ lan với

khoảng 1.600 loài phân bố trên các vùng thuộc châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều nhất

ở Đông Nam Á và Châu Úc

Điều kiện sinh thái của Dendrobium rất đa dạng, có loài chỉ mọc và ra hoa ở

vùng lạnh, có loài ở vùng nóng, có loài ở vùng trung gian, và cũng có loài có thể thích nghi với bất cứ điều kiện khí hậu nào

Hình 2.1: Lan Dendrobium Sonia

4.1.3 Đặc điểm về hình thái

a Rễ

Sự đa dạng về hình thái và cấu trúc rễ làm cho Dendrobium phù hợp với nhiều

điều kiện sống Ở một số loài có lối sống bám lơ lửng trên vỏ thân cây gỗ khác, nên thân rễ dài hay ngắn, mập hay mảnh mai giúp đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày Hệ rễ vừa làm nhiệm vụ lấy nước, hấp thu chất dinh dưỡng vừa làm nhiệm vụ bám chặt vào giá thể để giữ cho cây khỏi bị gió cuốn đi Hệ rễ phát triển nhiều hay ít phụ thuộc vào hình dạng chung của cả cây lan Ở một số loài sống hoại sinh thì rễ có dạng búi nhỏ dày đặt các vòi hút ngắn hút chất dinh dưỡng từ xác thực vật [5, 9]

b Thân

Thuộc nhóm đa thân, đây là nhóm gồm những cây tăng trưởng liên tục mà có

những chu kì nghỉ sau những mùa tăng trưởng Dendrobium vừa có thân thật vừa có

giả hành Giả hành tuy là thân nhưng có diệp lục, dự trữ nước và nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển giả hành mới Cấu tạo giả hành gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch nhầy, phía ngoài có lớp biểu bì với vách tế bào dày, nhẵn bóng bảo vệ

để tránh sự mất nước Đa số củ giả hành có màu xanh bóng, nên cùn với lá, nó cũng

làm nhiệm vụ quang hợp Thường các loài thuộc giống Dendrobium dùng cho mục

đích kinh doanh là lan đa thân với nhiều giả hành [5]

tinh bột, sáp hay chất sừng Vì thế giống Dendrobium khi ra hoa nó cho một số lượng

cành hoa nhiều hơn bất kì loài lan nào khác [5, 9]

e Quả:

Quả phong lan thuộc loại quả nang, nở ra theo 3 – 6 đường nứt dọc Khi chín quả

mở ra và mảnh vỏ còn dính lại với nhau ở phía đỉnh và phía gốc [5]

Protocorm là một cơ quan dự trữ nhỏ được hình thành từ phôi đang nẩy mầm Phôi này bao gồm một đỉnh sinh trưởng và một lá mầm

Protocorm like body là một thuật ngữ thích hợp để chỉ những cấu trúc giống với protocorm và có nguồn gốc từ nuôi cấy in vitro đỉnh sinh trưởng hay mô phân sinh của chồi bất định Thuật ngữ này được Morel sử dụng trong bài báo tiếng Anh của ông

về nuôi cấy chồi đỉnh

Trong nuôi cấy mô ở cây lan, PLB là một thể thường gặp và là cấu trúc tái sinh

cơ quan của lan PLB là một cụm nhỏ vô tổ chức, có khả năng sinh ra nhiều điểm tăng trưởng bất định Các điểm này có thể tạo ra nhiều PLB mới hay phát triển thành chồi non có lá Cùng với đặc điểm dễ dàng trong nuôi cấy nên PLB thường được dùng làm nguồn nguyên liệu nhân nhanh [6]

4.2 Sơ lược về vi khuẩn Agrobacterium

Giới: Prokaryotae ( monera )

Danh pháp của các loài Agrobacterium được đặt tên dựa trên các đặc điểm gây

bệnh của plasmid:

- Agrobacterium tumefaciens: gây bệnh gẻ khối u trên cây phong lữ, cà chua,

thuốc lá…

- Agrobacterium rhizogenes: gây bệnh rễ tơ trên cây đậu nành, cà chua…

- Agrobacterium rubi: gây bệnh mụn ở mía

- Agrobacterium vitis: gây bệnh ghẻ khối u ở nho

- Agrobacterium radiobacter: bao gồm tất cả các loài không gây bệnh

Nhóm Agrobacterium tumefaciens được sử dụng nhiều nhất trong chuyển gen Vi khuẩn gram âm Agrobacterium tumefaciens là một vi khuẩn gây bệnh, trong vòng đời

của mình vi khuẩn thực hiện việc biến nạp di truyền vào trong tế bào thực vật Việc biến nạp di truyền này tạo thành các u sần trên cây chủ làm ảnh hưởng đến sự sinh

trưởng bình thường của cây Bệnh do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens gây ra tác

động quan trọng đến nông nghiệp tuy nhiên nó chỉ tác động trên cây hai lá mầm [26]

Hình 2.2: Vi khuẩn Agrobacterium dưới kính hiển vi

4.2.2 Đặc điểm của vi khuẩn Agrobacterium

A tumefaciens là loài vi khuẩn đất, có dạng hình gậy, kích thước 2,5 – 3,0 x 0.7

-0.8mm, dạng đơn bào, không tạo ra bào tử, có vỏ và lông roi, là vi khuẩn háo khí, nhuộm gram (-), khuẩn lạc tròn và rìa nhẵn Khuẩn lạc màu trắng kem, nhẵn, bóng, tròn, nhỏ, rìa đều đặn và có màu xanh da trời nhạt sau đó đậm dần trên môi trường chỉ thị

Vi khuẩn A tumefaciens không có khả năng khử arginine, không phân giải

gelatin, có thể phân giải các loại đường, tinh bột, tryptophan, tạo NH3 và H2S, khử

oxydase Agrobacterium không thể tạo gây khối u (chuyển T-DNA) ở nhiệt độ trên

290C và khoảng pH bazơ Lý do là hệ thống protein vir đặc biệt là virA rất nhạy cảm

với nhiệt độ, chúng bất hoạt ở 290C và biến tính ở 320C Hiệu suất chuyển gen cao nhất ở 220C và khoảng pH từ 5.2 - 5.7, điều này được giải thích do thụ thể nhận biết ký

chủ của Agrobacterium (ChvE-VirA) được hoạt hóa bằng proton của hợp chất phenolic

và nó bị bất hoạt trong môi trường baz Một khi protein vir A bị bất hoạt thì tế bào vi khuẩn sẽ mất khả năng hoạt hóa toàn bộ hệ thống protein vir dẫn đến mất khả năng

chuyển gen [9]

A tumefaciens có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển một

đoạn ADN của nó vào tế bào thực vật Khi ADN vi khuẩn được hợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách có hiệu quả

và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sôi của quần thể vi khuẩn

Để khai thác và sử dụng A tumefaciens như là một vector chuyển gen các nhà

khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của T-ADN và thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T-

ADN và các gen vir Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-ADN Nó sẽ

được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật [7, 21, 26]

4.2.3 Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium

Agrobacterium tumefaciens có chứa nhiễm sắc thể và một plasmid lớn kích thước

khoảng 200 kb gọi là Ti-plasmid chính là tác nhân truyền bệnh cho cây Khi cây bị

nhiễm A.tumefaciens qua các vết thương, biểu hiện rõ nhất là các khối u được hình

thành ở ngay vị trí lây nhiễm Sự hình thành khối u sau đó có thể được tiếp tục mà không cần thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn Khả năng này có được do

A.tumefaciens đã chuyển một đoạn DNA của Ti-plasmid xâm nhập vào hệ gen của cây

bị bệnh [8, 16]

Hình 2.3: Cấu trúc tế bào vi khuẩn Agrobacterium

+ Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid

Trong thế giới động-thực vật đều tồn tại các thể plasmid Đó là các vòng DNA tự

do sinh sản độc lập Ở vi khuẩn và động-thực vật, plasmid liên quan tới yếu tố giới tính của tế bào, đến khả năng chống chịu các loại kháng sinh,… Đặc điểm quan trọng của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể nhưng cũng có thể tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể một cách độc lập (Hình 2.4)

Hình 2.4: Vị trí Ti-plasmid trong tế bào vi khuẩn

Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A.tumefaciens gây độc, có kích thước khoảng 200-250 kb Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở nhiệt độ

dưới 300C Bằng phương pháp lai ADN-ADN và lập bản đồ chuỗi kép di hợp (heteroduplex mapping), người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương đồng Kết quả phân tích di truyền cho thấy vùng T-ADN (transferred DNA) và vùng gây độc (virulence) liên quan đến sự hình thành khối u trong khi hai vùng khác liên quan đến

sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong Agrobacterium [10]

Hình 2.5: Cấu trúc của Ti-Plasmid Trong khi hình thành khối u, T-ADN được chuyển vào tế bào thực vật và hợp nhất với genome nhân T-ADN ổn định trong genome nhân Lai Ti-plasmid với ADN của khối u đã cho thấy T-ADN trong tế bào thực vật là tương ứng song song với T-

ADN trong Ti-plasmid của Agrobacterium Kết quả này chứng tỏ không có sự sắp xếp

lại vị trí của ADN trong lúc khối u được tạo thành Một hoặc nhiều bản sao của ADN có thể có mặt ở các đoạn lặp nối tiếp Chúng cũng có thể tách ra và liên kết với các vùng khác nhau của ADN thực vật Vị trí hợp nhất của T-ADN vào ADN thực vật

T-là hoàn toàn ngẫu nhiên [1, 10]

+ Cấu trúc và chức năng của T-ADN

T-ADN là một đoạn ADN có kích thước 25 kb, trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u Trong Ti-plasmid, vị trí của T-ADN được giới hạn bằng bờ phải (RB- Right Border) và bờ trái (LB-Left Border) Ngoài T-ADN, trên Ti-plasmid còn có các vùng ADN mã hóa cho việc tái

sinh plasmid, cho khả năng lây nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine

[1]

Ở Ti-plasmid dạng nopalin, T-ADN xâm nhập vào genom thực vật ở dạng một đoạn liên tục dài 22 kb Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopine, T-ADN là một đoạn gen liên tục dài 13 kb T-ADN mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mã hoá những

enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine; (2) Các gen gây khối u như tms1, tms2, tmsr mã hoá cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và cytokinine [10]

Trong các vùng ADN của Ti-plasmid, ngoài T-ADN được nghiên cứu nhiều hơn

cả là vùng ADN phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu như virE2, virB, virD, virD2,…

Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-ADN, bao bọc che chở các đoạn ADN này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn [1, 16]

4.2.4 Sơ lược các phương pháp chuyển gen vào nhân tế bào thực vật thông dụng:

 Phương pháp trực tiếp ( một số phương pháp chính )

Nguyên tắc phương pháp này là đưa gen trực tiếp vào tế bào

a) Phương pháp bắn gen (biolistic):

Nguyên tắc của phương pháp này là dùng một lực vật lý để bắn các loại hạt kim loại (vàng, tung sen) được bao bởi các phân tử DNA vào bên trong tế bào Các hạt kim loại được bắn với tốc độ lớn để có thể xuyên qua màng và vào bên trong tế bào Hệ thống tạo lực đẩy dùng khí Helium (khí trơ)… Phương pháp này dùng để chuyển gen vào nhân và lục lạp tế bào Màng tế bào có tính đàn hồi hoàn hảo nên có thể tái tạo sau khi bắn Các giai đoạn tiếp theo sự bắn DNA cho tới khi DNA tích hợp được vào bộ gen của cây thì chưa được hiểu đầy đủ Một phần lớn DNA bị hủy bởi enzyme nuclease của tế bào

Phương pháp này có ưu điểm là không dùng chuyên biệt cho một loại cây trồng nào, có thể sử dụng để chuyển gen với hiệu quả cao cho các đối tượng cây trồng một

và hai lá mầm

b) Phương pháp điện xung (electroporation):

Nguyên tắc của phương pháp là cảm ứng một trạng thái thấm cao tạm thời của

màng tế bào do xử lý một điện thế cao, nhờ vậy DNA có thể đi vào bên trong đến nhân

tế bào và tạo sự chuyển gen Cơ chế cảm ứng trạng thái thấm cao của màng chưa được hiểu đầy đủ Phương pháp này tương đối đơn giản nhưng hiệu quả chuyển gen không cao

c) Phương pháp dùng Polyethylene glycol (PEG):

Dùng PEG để tạo ra các lỗ tạm thời – giúp DNA thấm vào bên trong tế bào Khá nhiều dòng cây chuyển gen như thuốc lá bắp cải, khoai tây, bắp, … đã được tạo ra nhờ phương pháp này

Nói chung, tần số chuyển gen bằng phương pháp này cũng không cao, ngoài ra PEG gây kết dính tế bào trần và có ảnh hưởng đến tỉ lệ sống của tế bào [3, 4, 8, 11]

 Phương pháp gián tiếp nhờ Agrobacterium:

Nguyên tắc của phương pháp này là đưa gen chuyển vào tế bào qua trung gian

của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn sống lân cận và hoặc ngay trên

bộ rễ của nhiều cây Chúng chui vào và sống ở các tế bào rễ bằng cách xuyên qua các vết trầy lở trên mặt rễ Với sự có mặt của chúng, tổ chức tế bào thực vật phát sinh bướu thường thấy trên cây hai lá mầm và ở vị trí cổ rể và như vậy chúng đã gây hại cho cây trồng

Gen tạo bướu nằm trên đoạn DNA ở trong vi khuẩn và sự di chuyển của

T-DNA vào tế bào thực vật chịu sự quy định của gen vir cũng ở trong vi khuẩn Các gen

nói trên nằm trên plasmid Ti Hiện nay, trong lĩnh vực nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng, gen tạo bướu được loại bỏ và thay vào đó là các gen hữu ích để tạo cho cây trồng mang các đặc tính tốt như kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏ, …

Để chuyển gen vào cây hai lá mầm, phương pháp dùng vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens là phương pháp được dùng phổ biến nhất Phương pháp này tỏ ra khá hiệu

quả trong việc tạo cây chuyển gen Trước đây, phương pháp này ít hiệu quả với cây một lá mầm nhưng chỉ những năm gần đây đã có những tiến bộ [3, 4, 8, 11]

4.2.5 Cơ chế chuyển gen thông qua Agrobacterium

Chuyển nạp gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào bộ gen của sinh vật đang nghiên cứu Những thành tựu của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã mở ra triển vọng đối với chuyển nạp gen ở thực vật bậc cao, tạo ra những tính trạng di truyền mới như kháng sâu bệnh hại, thuốc diệt cỏ…

Hiện nay, có rất nhiều các phương pháp chuyển gen vào thực vật khác nhau như

sử dụng súng bắn gen, dùng xung điện tế bào và mô thực vật, dùng vi tiêm, chuyển gen thông qua con đường ống phấn,… Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen gián tiếp

nhờ vi khuẩn A tumefaciens là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay Phương pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển gen còn được gọi là

phương pháp chuyển gen gián tiếp [8, 23]

Sau khi xâm nhiễm, Agrobacterium gắn đoạn T-DNA vào bộ máy di truyền của

tế bào thực vật, dẫn đến sự rối loạn các chất sinh trưởng nội sinh, tạo ra khối u Khả năng này đã được khai thác để chuyển gen ngoại lai vào bộ máy di truyền của tế bào thực vật [8, 23]

Để gắn T-DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn A.tumefaciens phải tiếp

xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương Quá trình này được thực hiện nhờ các gen chvA và chvB Gen chvB mã hóa một protein liên quan đến hình thành β-1,2 glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận chuyển, định vị ở màng trong của tế bào vi khuẩn Protein vận chuyển giúp vận chuyển β-1,2 glucan vào khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất β-1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi

khuẩn Agrobacterium tiếp xúc với thành tế bào thực vật Nếu không có sự tiếp xúc

này, sẽ không có sự dẫn truyền T-DNA [1, 23]

Các sản phẩm protein của vùng vir có tác dụng cho việc dẫn truyền T-DNA từ vi

khuẩn vào tế bào thực vật Các loại protein đó rất cần thiết cho quá trình cắt T-DNA khỏi Ti-plasmid, cảm ứng thay đổi màng tế bào thực vật mà chúng tiếp xúc, tham gia

di chuyển phần T-DNA qua màng vi khuẩn tới tế bào chất của tế bào thực vật, vận chuyển tới nhân rồi cuối cùng xâm nhập vào gen của cây chủ Thực chất chỉ riêng T-DNA của Ti-plasmid được chuyển vào gen tế bào thực vật, mà không còn phần nào

khác Quá trình dẫn truyền chỉ do sản phẩm của các gen vir (vùng vir) và gen chv

quyết định mà không liên quan đến các gen khác trên T-DNA Tuy nhiên, chuỗi DNA

25 bp (RB và LB của T-DNA) có vai trò là vị trí cảm ứng cho các sản phẩm của tổ hợp

các gen vùng vir, đặc biệt là protein từ gen virE mang chúng dẫn truyền vào tế bào

thực vật Chúng hoạt động như các tín hiệu nhận biết và khởi động quá trình dẫn

truyền Trước hết gen virA trong tổ hợp gen vùng vir được phosphoryl hóa nhờ tác

động của các hợp chất phenol như acetosyringone giải phóng ra từ các tế bào thực vật

tổn thương Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG Sản phẩm của gen virG liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa là gen virB và virE Trước đó, khi gen virD được hoạt hóa, sản

phẩm của nó cảm ứng nhận biết RB và LB của T-DNA và làm đứt phần T-DNA ra khỏi DNA của Ti-plasmid thành các sợi đơn Đồng thời quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi áp xuất thẩm thấu của màng tế bào thực vật, màng tế bào bị mềm ra

và bị thủng Các sợi đơn T-DNA được gắn vào protein do gen virE tổng hợp và dịch

chuyển về phía màng tế bào vi khuẩn Ngay sau đó, sợi T-DNA được trượt từ vi khuẩn vào tế bào thực vật Cầu nối chính là sự tiếp hợp giữa hai tế bào do cảm ứng sản phẩm

gen virB mà thành Khi T-DNA đã được chuyển giao vào tế bào thực vật, chúng nhanh

chóng hợp nhất trong gen tế bào thực vật được ổn định và di truyền như các gen bình thường khác

Ðể khai thác và sử dụng A.tumefaciens như là một vector chuyển gen các nhà

khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hoá opine của T - DNA và thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái của T-

DNA và các gen vir Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-DNA Nó sẽ

được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm sắc thể tế bào thực vật Phương

pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium đã được kiểm tra đối với sự xâm nhập

bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển đặc biệt Một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô,

mức độ khởi đầu của vi khuẩn A tumefaciens sử dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau

khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật [1, 8, 23]

2.3 Tình hình nghiên cứu chuyển gen trên hoa lan

Đã có một số công trình công bố dùng phương pháp chuyển gen gián tiếp thông

qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen

để chuyển gen vào một số loại lan Các gen được chuyển bao gồm gen kháng thuốc trừ

cỏ (bar), gen chỉ thị gus A, gen kháng kanamycin nptII, gen kháng hygromycin hph, gen knox, gen CymMV-CSCP, gen mã hóa vỏ virus, gen phát sáng gfp từ sứa biển,

gen phát sáng luc từ đom đóm, Có thể tóm tắt một số kết quả nghiên cứu tiêu biểu

như sau:

+ Đối với các nghiên cứu trong nước

Năm 2007 Võ Phan Mi Sa và cộng sự nghiên cứu chuyển gen phát sáng gfp vào

của PLB lan Dendrobium Burana White thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens, sử dụng chủng LBA 4404 chứa plasmid pCAMBIA 1303 mang gen gfp5,

gen gusA và gen hph, đã nhận được một số dòng cây chuyển gen Kết quả cho thấy các dòng lan chuyển gen sinh trưởng bình thường trên môi trường có hygromycin 30mg/l, nhuộm xanh với thuốc thử GUS và có sự phát sáng màu xanh lục khi được xử

lý bằng tia UV sóng dài (của đèn cực tím) hoặc sóng lam của hệ thống kính hiển vi huỳnh quang

Năm 2008, Trần Lê Lưu Ly và cộng sự nghiên cứu chuyển gen trên lan hồ điệp

(Phalaenopsis amabilis L.) bằng phương pháp bắn gen, sử dụng hệ thống máy bắn gen

BiolisticTM PDS-1000/He để biến nạp plasmid pBAR-GUS (chứa gen uidA và bar) và

Agrobacterium tumefaciens, sử dụng chủng A tumefaciens C58pGV2260 mang

plasmid p35SGUS-INT chứa gen uidA và nptII Kết quả cho thấy biểu hiện GUS tối

ưu ở nồng độ acetosyringone 50 µM sau 4 ngày đồng nuôi cấy với thí nghiệm chuyển gen gián tiếp Tỷ lệ biểu hiện GUS cao nhất được ghi nhận ở khoảng cách bắn 6 cm, nồng độ tungsten/DNA plasmid là 500 μg/0,5 μg đối với phương pháp chuyển gen trực tiếp

+ Đối với các nghiên cứu ở nước ngoài

Năm 2002, Men và cộng sự nghiên cứu chuyển gen trên 2 loài lan

Dendrobium Phalaenopsis và Dendrobium nobile bằng phương pháp chuyển gen trực

tiếp, sử dụng hệ thống máy bắn gen BiolisticTM PDS-1000/He để biến nạp plasmid

(pCAMBIA1301 ) Kết quả cho thấy tỷ lệ biểu hiện GUS cao nhất được ghi nhận ở nồng độ tungsten/DNA plasmid là 500 μg/0,5 μg

Năm 2003, Men và cộng sự nghiên cứu chuyển gen trên lan Dendrobium bằng

vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Kết quả cho thấy biểu hiện GUS tối ưu khi PLB được đồng nuôi cấy với A tumefaciens, ở nồng độ 100 acetosyringone (AS), thời

gian đồng nuôi cấy 2-3 ngày PLB được nuôi cấy trên môi trường chọn lọc có chứa 30 mg/l hygromycin và 250 mg/l cefotaxime

Năm 2005, Sjahril và cộng sự nghiên cứu chuyển gen wasabi vào lan

Phalaenopsis bằng vi khuẩn Agrobacterium để kháng lại bệnh thối mềm do vi khuẩn Erwinia carotovora gây ra Kết quả cho thấy hầu hết các cây chuyển gen đều có khả

năng kháng mạnh với Erwinia carotovora

Năm 2006, Chin và cộng sự nghiên cứu chuyển gen gián tiếp vào PLB

Cymbidium Kết quả cho thấy biểu hiện GUS tối ưu ở nồng độ acetosyringone 100

µM Và cũng trong nghiên cứu này, sự hiện diện của mục tiêu đã được kiểm tra bằng phương pháp PCR

Năm 2010, Shrestha và cộng sự nghiên cứu chuyển gen gián tiếp thông qua vi

khuẩn Agrobacterium vào PLB của lan Vanda Kết quả cho thấy cây lan Vanda

chuyển gen tái sinh thành công sau khi đồng nuôi cấy PLB với vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens chủng EHA101

Cũng trong năm 2010, Advina và cộng sự nghiên cứu tối ưu hóa protein phát

quang sinh học (GFP) bằng cách chuyển gen gián tiếp thông qua Agrobacterium

tumefaciens vào lan Phalaenopsis violacea Kết quả đã tối ưu hóa được các yếu tố

quan trọng ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen vào lan Phalaenopsis violacea bằng Agrobacterium chủng EHA 105 và EHA 101, và ghi nhận chủng EHA 105 cho khả

năng biểu hiện gen GFP cao hơn so với chủng EHA 101

5 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

5.2 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát nồng độ chất cảm ứng acetosyringone và thời gian đồng nuôi cấy thích

hợp cho việc chuyển gen vào PLB lan Dendrobium Sonia bằng vi khuẩn

- PLB có nguồn gốc từ lát thân cắt mỏng của cây Lan Dendrobium Sonia in-vitro

Cụm protocorm Protocorm được tách nhỏ

Hình 3.1: Chuẩn bị protocorm cho quá trình chuyển gen

- Chủng vi khuẩn Agrobacterium LBA4404 (Hình 3.2) mang vector pCambia

1301 chứa gen GUS và gen kháng Hygromycin (Hình 3.3)

Hình 3.2: Vi khuẩn Agrobacterium cấy trên đĩa môi trường LB

Hình 3.3: Cấu trúc vector pCambia 1301

- Máy điều hòa

- Máy đo mật độ quang

- Máy ly tâm

- Máy lắc

- Tủ ổn nhiệt

- Pippetman

- Dao, kẹp cấy mô

- Đĩa petri, ống fancol, erlen, ống đong,…

5.3.3 Hóa chất

- Chất cảm ứng vi khuẩn Acetosyringone

- Các loại kháng sinh Kanamycine, Rifampicine 50mg/ml dùng trong tăng sinh

vi khuẩn, Cefotaxime, Hygromycin

- Môi trường MS (Murashige và Skoog,1962)

- Đường, Agar

- Môi trường LB (Luria – Bertani) (Sambrook và cs., 1989)

5.3.4 Điều kiện thí nghiệm

Tất cả các thao tác trên mẫu cấy được thực hiện trong tủ cấy vô trùng đặt tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực Vật – Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành Phố Hồ Chí Minh

- Nhiệt độ phòng nuôi nuôi: 250C20C

- Thời gian chiếu sáng: 16 giờ

- Cường độ chiếu sáng: 2500 500 lux

- Độ ẩm phòng nuôi cấy: 555%

5.4 Phương pháp nghiên cứu

5.4.1 Nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn

Vi khuẩn được tăng sinh qua đêm trong môi trường LB (3ml) có bổ sung kháng sinh kanamycine (50mg/l) và rifampicine (50mg/l), ở 28°C, tốc độ lắc lắc 200 vòng/phút Sau đó hút 1ml dịch tăng sinh chuyển vào 29ml môi trường LB có bổ sung kháng sinh như trên và tiếp tục tăng sinh qua đêm ở cùng điều kiện và tốc độ lắc Các mẫu vi khuẩn sau khi tăng sinh được sử dụng cho các thí nghiệm chuyển gen

5.4.2 Khảo sát nồng độ chất cảm ứng Acetosyringone và thời gian đồng

nuôi cấy thích hợp giữa vi khuẩn Agrobacterium và PLB

+ Chuẩn bị vi khuẩn cho chuyển gen

Mẫu vi khuẩn sau khi tăng sinh, sẽ được kiểm tra OD để đảm bảo giá trị OD nằm trong khoảng từ 0,6-1, sau đó tiến hành ly tâm thu sinh khối vi khuẩn ở 7000 vòng/phút trong 10 phút Sinh khối vi khuẩn thu được sau khi ly tâm được pha loảng trong với môi trường MS lỏng (cùng thể tích tăng sinh) có bổ sung chất cảm ứng Acetosyringone ở các nồng độ 0, 50, 100, 200 và 300 M

+ Chuẩn bị PLB và thực hiện đồng nuôi cấy

Tiến hành tách riêng từng từ các cụm PLB có nguồn gốc từ lát thân cắt mỏng

của cây lan Dendrobium Sonia in vitro Việc tách các PLB được thực hiện trong môi

trường MS lỏng PLB sau khi tách được ngâm trong môi trường MS có bổ sung chất

cảm ứng Acetosyringone ở các nồng độ 0, 50, 100, 200 và 300 M trong 15 phút ở

250C Sau đó, PLB được chuyển sang ủ tiếp tục trong môi trường MS có bổ sung Acetosyringone ở các nồng độ tương tự nhưng có bổ sung thêm vi khuẩn (đã thực hiện trong phần chuẩn bị vi khuẩn) trong 30 phút ở cùng nhiệt độ Sau khi ủ, PLB được làm khô nhẹ bằng cách đặt trên giấy thấm và chuyển sang đồng nuôi cấy trên môi trường

MS rắn có bổ sung Acetosyringone ở các nồng độ tương tự như môi trường ủ trong 1,

2, 3 hay 4 ngày Các đĩa Petri đồng nuôi cấy được đặt nuôi trong tối ở nhiệt độ 25  2

0

C, ẩm độ 55  5 0C

+ Đánh giá hiệu quả chuyển gen thông qua nhuộm GUS

Sau khi đồng nuôi cấy, PLB được nhuộm GUS với quy trình được cải tiến theo Jeffeson và cộng sự, 1978 Theo đó, PLB được chuyển vào các ependort có chứa thuốc nhuộm GUS, ủ ở nhiệt độ 370C trong 24h Sau đó, loại bỏ thuốc nhộm ngâm mẫu với ethanol 70% cho đến khi diệp lục mất hoàn toàn (ít nhất sau 4 giờ) Cuối cùng, đánh giá sự biểu hiện màu của PLB và chụp ảnh dưới kính hiển vi soi ngược Xác định nồng độ chất cảm ứng và thời gian đồng nuôi cấy thích hợp cho việc chuyển gen vào PLB

5.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh Cefotaxime lên khả năng loại vi khuẩn từ mô cấy

Sau 3 ngày đồng nuôi cấy với vi khuẩn, PLB được rửa 3 lần với nước cất vô trùng và rửa tiếp 1 lần với môi trường MS lỏng có bổ sung kháng sinh Cefotaxime nồng độ 0, 300, 500 và 700 mg/l Sau khi rửa, làm khô nhẹ bề mặt PLB bằng giấy thấm và đặt nuôi cấy trên môi trường MS rắn có bổ sung Cefotaxime ở các nồng độ tương tự như môi trường lỏng Theo dõi và ghi nhận tỷ lệ mẫu sống và sạch khuẩn ở các môi trường theo thời gian Xác định nồng độ Cefotaxime thích hợp cho việc loại vi khuẩn sau khi thực hiện đồng nuôi cấy Các đĩa Petri đồng nuôi cấy được đặt nuôi tối ở trong điều kiện ánh sáng 2500  500 lux, nhiệt độ 25  2 0C, ẩm độ 55  5 0C

5.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh Hygromycin lên khả năng sống của protocorm

Các PLB được được nuôi cấy trên môi trường MS rắn có bổ sung kháng sinh Hygromycin ở các nồng độ 0, 5, 7, và 10 mg/l Các đĩa Petri nuôi cấy được đặt nuôi trong điều kiện ánh sáng 2500  500 lux, nhiệt độ 25  2 0C, ẩm độ 55  5 0C Theo dõi và ghi nhận tỷ lệ PLB chết/ sống theo thời gian Xác định nồng độ kháng sinh Hygromycin thích hợp để giết chết PLB

5.4.5 Xử lý thống kê

Các số liệu nghiên cứu được xử lý, so sánh mức độ khác biệt (Ducan test) với phần mềm SPSS phiên bản 16

6 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

6.1 Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ Acetosyringone đến khả

năng chuyển gen vào PLB thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ chất cảm ứng Acetosyringone có ảnh hưởng

rõ rệt đến khả năng chuyển gen vào PLB thông qua vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens LBA 4404 Trong 4 nồng độ Acetosyringone được khảo sát (ở cả 4 thời

gian đồng nuôi cấy), tỉ lệ PLB dương tính GUS đều cao hơn so với đối chứng Ở thời điểm 1 ngày đồng nuôi cấy tỉ lệ PLB dương tính GUS tăng dần theo nồng độ Acetosyringone, đạt cao nhất ở nồng độ 100 µM và sau đó giảm dần xuống đến nồng

độ 300 µM (Bảng 4.1)

Bảng 4.1: Tỷ lệ mẫu PLB dương tính sau khi nhuộm GUS ở các nồng độ

Acetosyringone sau 1 ngày đồng nuôi cấy Nồng độ

Acetosyringone

(µM)

Tỷ lệ mẫu sống sau đồng nuôi cấy

Biểu hiện sau nhuộm GUS