Để ghóp phần hoàn thiện thêm qui trình lên men tổng hợp chế phẩm biopolymer sinh học cũng như ứng dụng biopolymer rộng rãi hơn trong vấn đề bảo vệ môi trường, chúng tôi tiến hành các thí
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
Phòng Công Nghệ Sinh Học - Khoa Khoa Học Ứng Dụng, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Tôn Đức Thắng TP Hồ Chí Minh
3.1.2 Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 03/2012 đến tháng 06/2012.
Nội dung nghiên cứu
- Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus từ bùn ao
Để hiểu và tối ưu khả năng tổng hợp biopolymer của Bacillus đã phân lập được, nghiên cứu đã khảo sát các yếu tố nhiệt độ, pH, tỉ lệ giống và thời gian nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy Kết quả cho thấy nhiệt độ và pH tối ưu cùng với tỉ lệ giống phù hợp và thời gian nuôi cấy hợp lý có ảnh hưởng đáng kể đến sinh tổng hợp biopolymer, từ đó nâng cao sản lượng và chất lượng biopolymer do Bacillus tạo ra.
- Ứng dụng biopolymer vào xử lý nước thải trong ngành dệt nhuộm.
Vật liệu thí nghiệm
Vi khuẩn Bacillus phân lập từ bùn ao có khả năng tạo ra biopolymer phân hủy sinh học
3.3.2 Trang thiết bị thí nghiệm
Trong một phòng thí nghiệm hiện đại, danh sách thiết bị phổ biến bao gồm máy đo pH, cân điện tử, tủ cấy, nồi hấp, tủ lạnh, tủ sấy, máy lắc, tủ ủ và bể điều nhiệt—những thiết bị cơ bản cho quá trình chuẩn đo, ủ mẫu và kiểm soát nhiệt độ Không thể thiếu kính hiển vi và máy đo màu OD để quan sát chi tiết và đo độ hấp thụ của mẫu, bên cạnh các chai lọ, cốc và bình Erlen làm dụng cụ lưu trữ và xử lý mẫu Các phụ kiện lọc như giấy lọc và phễu lọc, bình định mức và ống đong hỗ trợ đo lường chính xác, kết hợp đũa khuấy với micropipet và pipet cho thao tác mẫu chuẩn xác Cuối cùng, ống nghiệm và đĩa Petri đóng vai trò thiết yếu cho nuôi cấy và quan sát sinh học.
3.3.3 Hóa chất và môi trường thí nghiệm
Hóa chất nhuộm gram: Lugol, tím kết tinh, Fushin
3.3.3.2 Môi trường a) Môi trường thạch chọn lọc : môi trường Nutrient Agar (NA)
Môi trường được hấp khử trùng ở 121 o C áp suất 1atm, trong 15 phút
Hình 3.1 Chế phẩm CMC b) Môi trường tăng sinh : môi trường Nutrient Broth (NB)
Môi trường được hấp khử trùng ở 121 o C áp suất 1atm, trong 15 phút c) Môi trường tạo biololymer
K 2 HPO 4 14g d) Các môi trường cho phản ứng sinh hóa
Môi trường lòng đỏ trứng
Đoạn mô tả quy trình chuẩn bị môi trường nuôi cấy vô trùng bắt đầu từ nước cất có pH gần trung tính, sau đó phần môi trường được cho vào bình tam giác và trải qua quá trình khử trùng để loại bỏ nhiễm khuẩn Khi môi trường đã được làm mát ở mức phù hợp, dung dịch lòng đỏ trứng gà được bổ sung, trộn đều và phân phối vào đĩa Petri vô trùng để nuôi cấy Quy trình tuân thủ nguyên tắc vô trùng và kiểm soát nhiệt độ nhằm đảm bảo chất lượng và an toàn của môi trường nuôi cấy.
Cách pha dung dịch lòng đỏ trứng gồm các bước sau: rửa sạch trứng và sát trùng phần ngoài bằng cồn để đảm bảo vệ sinh; dùng kẹp giữ trứng và đập vỡ, loại bỏ lòng trắng, chuyển lòng đỏ vào bình beaker (bình thí nghiệm) để tiến hành pha.
Môi trường Simmons Citrate Agar
Methyl Red Vosger – Proskauer (MR – VP)
Đây là một môi trường lỏng được thiết kế để thử hai phản ứng sinh hóa quan trọng là Methyl Red và Voges-Proskauer (MR‑VP) Mục đích của môi trường là hỗ trợ quá trình lên men đường và cho phép phân biệt các loại vi khuẩn dựa trên sự thay đổi của sản phẩm lên men và tín hiệu nhận diện pH, từ đó cung cấp kết quả nhận diện dễ quan sát cho từng mẫu Môi trường được chuẩn bị và phân phối đều vào các ống nghiệm để đảm bảo tính lặp lại và độ chính xác của phép đo MR và VP Thành phần của môi trường được tối ưu hóa nhằm hỗ trợ sự phát triển vi khuẩn và tăng nhạy của hai phản ứng, giúp người dùng dễ dàng diễn giải kết quả thử nghiệm.
Thuốc thử: Methyl red, Kovac’s - napthol 5%, dung dịch KOH 40%
Môi trường thủy phân CMC
Môi trường Nutrient Agar (NA)
Phương pháp thí nghiệm
3.4.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus từ đất
Mục đích: Phân lập đƣợc chủng vi khuẩn Bacillus tổng hợp biopolymer
Phương pháp thu mẫu chính xác góp phần tăng tính tin cậy của kết quả phân tích mẫu đất và bùn đáy Đối với mẫu bùn đáy, nên thu nhẹ nhàng để tránh việc chất dinh dưỡng trong bùn bị thối rữa Dùng muỗng gạt nhẹ, bỏ lớp đất mặt khoảng 2–3 cm và lấy lớp đất ở phía dưới Sau khi thu mẫu, loại bỏ rác, sỏi và đá để mẫu sạch Cân 1 g mẫu đất bùn cho vào bình tam giác chứa 9 ml nước cất vô trùng và khuấy đều bằng đũa thủy tinh cho tan hết mẫu.
Chuẩn bị 4 ống nghiệm chứa nước muối sinh lý vô trùng, đánh số từ 1 đến 4 Dùng micropipette hút 1 ml từ mẫu đất phân lập vào ống nghiệm 1 để tạo nồng độ pha loãng 10^-1 và lắc đều, tiếp tục làm như vậy cho các ống cho đến ống cuối cùng Tiếp theo chọn các ống có nồng độ pha loãng 10^-2, 10^-3 và 10^-4, dùng micropipette hút từ mỗi nồng độ và phủ lên 3 đĩa môi trường thạch NA, trải đều bằng que trải vô trùng Ủ các đĩa và quan sát sự phát triển, được cho là của Bacillus subtilis; dùng que cấy vòng bắt và cấy giữ giống lại trên môi trường thạch nghiêng.
Dựa vào khả năng bắt màu khác nhau của vi khuẩn gram (+) và gram (-) đƣợc qui định bởi vách tế bào để tiến hành nhuộm gram
- Dàn đều dịch vi khuẩn và hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn tạo vết bôi
- Nhuộm tiêu bản bằng tím tinh thể trong 1 phút
- Tẩy bằng cồn 96 0 cho sạch
- Nhuộm bổ sung thuốc thử Fushin trong 30 giây
- Làm khô và quan sát dưới vật kính nhúng dầu
Khảo sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn phân lập đƣợc
Quan sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi là bước cơ bản để nhận diện đặc điểm của tế bào Mẫu sinh khối được chuẩn bị lên tiêu bản Gram và quan sát ở độ phóng đại 1000 lần để ghi nhận sự bắt màu, hình dạng và cách sắp xếp của vi khuẩn Các tiêu chí quan sát giúp phân loại sơ bộ dựa trên đặc điểm bắt màu Gram, hình dạng và cách sắp xếp tế bào, từ đó hỗ trợ nhận diện nhóm vi khuẩn Sau đó, tiếp tục thực hiện các phản ứng sinh hóa để khẳng định danh tính của vi khuẩn.
Kiểm tra đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn phân lập đƣợc
Phương pháp này mô tả cách nuôi cấy vi khuẩn bằng kỹ thuật vô trùng để lấy mẫu và cấy một lượng sinh khối lên môi trường lòng đỏ trứng, nhằm khởi động quá trình phát triển và sau đó ủ mẫu ở điều kiện thích hợp để đánh giá kết quả.
Kết quả : Phản ứng dương tính: có vòng trong xung quanh khuẩn lạc
Phản ứng âm tính : không có vòng trong xung quanh khuẩn lạc
Khả năng sử dụng citrate
Tiến hành: Cấy vi khuẩn vào môi trường citrate, nuôi ở 37 0 C trong 24 giờ
Kết quả: Phản ứng (–) : môi trường có màu xanh lá mạ
Tiến hành: Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn vào môi trường Clark Lubs, nuôi ở
37 0 C trong 24 giờ Sau đó nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Methyl-Red vào canh khuẩn và đọc kết quả
Kết quả: Phản ứng (–) : môi trường có màu vàng
Phản ứng (+) : môi trường có màu đỏ
Phản ứng VP (Voges Proskauer)
Tiến hành: Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn vào môi trường Clark Lubs, nuôi ở
37 0 C trong 24 giờ Sau đó nhỏ 3-5 giọt NaOH 40% và 3-5 giọt alpha-naphtol 10% Sau 15 phút đọc kết quả
Kết quả: Phản ứng VP (–) : môi trường có màu vàng
Phản ứng VP (+) : môi trường có màu đỏ
Kiểm tra khả năng thủy phân CMC của chủng vi khuẩn
Sử dụng phương pháp cấy điểm trên môi trường hoạt hóa có bổ sung CMC 0.5 % trải trên môi trường NA với các đĩa có độ pha loãng 10 -1 ,10 -2 , 10 -3 , 10 -4 , ủ ở nhiệt độ
30 0 C trong 24h Để kiểm tra khả năng phân hủy cellulose bằng cách quan sát có vòng phân giải khi nhỏ dung dịch Lugol
3.4.2 Tăng sinh vi khuẩn Bacillus subtilis
Môi trường lỏng NB chứa bình erlen được hấp khử trùng ở 121 0 C trong 15 phút và để nguội khoảng 40 – 50 0 C
Dùng que cấy vòng chạm lấy một ít sinh khối của vi khuẩn phân lập đƣợc sau đó cấy vào 250ml môi trường lỏng NB
Tiến hành nuôi cấy lắc ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ
Xác định mật độ vi khuẩn trong dịch tăng sinh bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường NA
3.4.3 Xác định mật độ tế bào vi khuẩn trong dịch tăng sinh
Quy trình nuôi cấy vi khuẩn B subtilis được mô tả ở mức khái quát, bắt đầu bằng việc chuyển vòng vi khuẩn từ mẫu sang môi trường tăng sinh đã tiệt trùng, nuôi cấy ở điều kiện phù hợp và sau 24 giờ đánh giá số lượng tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đếm khuẩn lạc.
Sau thời gian ủ, chọn những đĩa có từ 25 – 250 khuẩn lạc để đếm Tổng số vi khuẩn hiếu khí đƣợc tính theo công thức sau:
A: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1 g hay 1 ml mẫu
N: tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa đã chọn ni: số lƣợng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
Vi: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa
Fi: độ pha loãng tương ứng
3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên men đến khả năng tổng hợp biopolymer
3.4.4.1 Khảo sát môi trường A tổng hợp biopolymer có bổ sung CMC
Mục đích: Xác định nồng độ CMC bổ sung để tạo biopolymer thích hợp nhất Phương pháp thí nghiệm
Trong thí nghiệm này, có 4 nghiệm thức tương ứng và 1 nghiệm thức đối chứng; năm nghiệm thức được thử với 5 tỉ lệ CMC bổ sung khác nhau và được bố trí ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần.
- Năm nghiệm thức đƣợc đặt tên là : NS1, NS2, NS3, NS4, NS5
- Thể tích mỗi nghiệm thức là 100ml Trong đó, 50% thể tích môi trường tổng hợp biopolymer + 50% thể tích NB
- Năm nồng độ CMC bổ sung: 0 – 0.2 – 0.5 – 0.8 – 1.0%
- Nhiệt độ: nhiệt độ phòng
Sau khi thu nhận biopolymer từ từng nghiệm thức, tiến hành so sánh để xác định nghiệm thức cho ra lượng biopolymer nhiều nhất; nghiệm thức tối ưu được chọn và sau đó so sánh với môi trường B để đánh giá sự khác biệt về hiệu suất giữa hai điều kiện.
Bảng 3.1 Khảo sát các nghiệm thức của môi trường A có bổ sung CMC
Nghiệm thức Môi trường tổng hợp biopolymer (ml)
Môi trường NB (ml) CMC (%)
3.4.4.2 Khảo sát môi trường B tổng hợp biopolymer có bổ sung bùn
Mục đích: Xác định tỉ lệ bùn nào kết hợp với 0.4% CMC là thích hợp nhất để tổng hợp biopolymer
Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức xử lý và 1 nghiệm thức đối chứng, tương ứng với năm mức bổ sung bùn Mỗi mức bổ sung được chuẩn bị bằng cách cân 5 g bùn hòa vào 1 L nước và được bổ sung ở các mức khác nhau, đồng thời được bố trí ngẫu nhiên Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
- Năm nghiệm thức trên đƣợc đặt tên lần lƣợt là : NT1, NT2, NT3, NT4,NT5
- Thể tích mỗi nghiệm thức là 100ml: Trong đó, 50% môi trường + 50%(thể tích NB + thể tích bùn)
- Năm thể tích bùn bổ sung: 0 – 15 – 25 – 35 – 50ml
- Nhiệt độ: nhiệt độ phòng
Sau khi thu nhận biopolymer ở từng nghiệm thức, tiến hành so sánh kết quả và xác định thể tích bùn bổ sung vào nghiệm thức nào cho ra lượng biopolymer nhiều nhất Nghiệm thức tối ưu sẽ được dùng làm cơ sở để so sánh với môi trường A và đánh giá sự khác biệt về sản lượng biopolymer Quá trình đánh giá giữa các nghiệm thức giúp xác định điều kiện tối ưu cho sản xuất biopolymer và cung cấp dữ liệu tham chiếu cho phân tích hiệu quả của môi trường A Các bước này nhằm tối ưu hoá sản phẩm biopolymer và đảm bảo tính khách quan của kết quả so sánh với môi trường A.
Bảng 3.2 Khảo sát các nghiệm thức của môi trường B bổ sung bùn kết hợp 0.4% CMC
Nghiệm thức Môi trường tổng hợp biopolymer (ml)
Chọn ra môi trường vừa tạo nhiều biopolymer vừa tiết kiệm được chế phẩm CMC bổ sung vào môi trường để tổng hợp biopolymer
3.4.5 Khảo sát yếu tố tỉ lệ giống bổ sung vào môi trường tổng hợp biopolymer
Môi trường nuôi cấy lỏng NB được khử trùng ở 121°C trong 15 phút và làm nguội xuống 40–50°C; ta nuôi cấy 10% dung dịch vi khuẩn đã tăng sinh 24 giờ vào môi trường nuôi cấy và ủ ở nhiệt độ phòng (30–32°C), pH 7.0, trong các thời điểm 24, 36, 48, 60 và 72 giờ Sau khi nuôi cấy, canh trường và ly tâm ở 1000 vòng/phút trong 5 phút để loại bỏ cặn (sinh khối của vi khuẩn) và thu dịch Dịch tủa được hình thành bằng cách xử lý với cồn lạnh 95% theo tỉ lệ 1:2 (v/v); sau đó ly tâm ở 5000 vòng/phút trong 20 phút để thu biopolymer.
Bố trí bốn nghiệm thức một cách ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần và đƣợc đặt tên lần lƣợt là: NA1, NA2, NA3, NA4
Tỉ lệ giống ở mỗi nghiệm thức là : 5% - 10% - 15% - 20%
Cố định các yếu tố thời gian, nhiệt độ và pH để duy trì điều kiện thí nghiệm ổn định Đồng thời, đánh giá hai chỉ tiêu mật độ vi khuẩn và lượng biopolymer thu được nhằm xác định tỉ lệ giống bổ sung tối ưu nhất.
3.4.6 Khảo sát yếu tố pH của môi trường tổng hợp biopolymer
Bố trí bốn nghiệm thức ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần và đƣợc đặt tên lần lƣợt là: NB1 , NB2, NB3, NB4
Bốn khoảng pH khảo sát là: 5 - 6 - 7 - 8
Cố định lượng giống cho vào môi trường là 10% và các chất dinh dưỡng cũng như
3.4.7 Khảo sát yếu tố nhiệt độ của môi trường tổng hợp biopolymer
Bố trí bốn nghiệm thức ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần và đƣợc đặt tên lần lƣợt là: NC1, NC2, NC3, NC4
Bốn khoảng nhiệt độ đƣợc chọn để khảo sát là: 30-35-40-45 0 C
Trong nghiên cứu này, lượng giống được cố định ở mức phù hợp và các yếu tố như dinh dưỡng, thời gian nuôi và pH được cân nhắc nhằm tối ưu hoá quá trình tổng hợp biopolymer Quá trình nuôi diễn ra ở các nhiệt độ khác nhau trong một chu kỳ cố định để xác định nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp biopolymer Kết quả cho thấy điều kiện nuôi ảnh hưởng đáng kể đến sản lượng biopolymer, từ đó xác định được nhiệt độ và điều kiện nuôi tối ưu cho tăng trưởng và hiệu suất sản xuất Quy trình này cung cấp cơ sở cho tối ưu hoá trong ứng dụng công nghiệp và cải thiện hiệu quả sản xuất biopolymer.
3.4.8 Khảo sát thời gian tối ƣu để vi khuẩn tổng hợp biopolymer
Thiết kế thí nghiệm bao gồm 7 nghiệm thức tương ứng với 7 ngày nuôi cấy, được bố trí ngẫu nhiên để giảm nhiễu và sai lệch trong quá trình thu thập dữ liệu Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, và các lần lặp này được đặt tên lần lượt là ND1, ND2, ND3, ND4, ND5, ND6 và ND7 Phương pháp bố trí ngẫu nhiên kết hợp với sự lặp lại này đảm bảo tính tin cậy và cho phép so sánh khách quan giữa các ngày nuôi cấy cũng như các nghiệm thức khác nhau trong nghiên cứu.
Để tối ưu sản xuất biopolymer, tập trung xác định lượng giống tối ưu và điều chỉnh các yếu tố môi trường như dinh dưỡng, nhiệt độ và độ pH nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho sự tổng hợp biopolymer Quá trình nuôi cấy được theo dõi và đánh giá liên tục để xác định thời điểm thu hoạch phù hợp nhất, từ đó tăng sản lượng biopolymer một cách hiệu quả và bền vững.
3.4.9 Tiến hành lên men tổng hợp từ các biểu thức tối ƣu hóa
Từ các biểu thức đã tối ưu hóa chúng tôi tiến hành lên men trong môi trường lên men tổng hợp để thu đƣợc nhiều biopolymer nhất
Bảng 3.3 Bảng tổng hợp các điều kiện tối ưu hóa của môi trường lên men
Môi trường tổng hợp biopolymer kết hợp với 0.4% CMC và bùn (NT3)
Tỉ lệ giống bổ sung tối ƣu 10% pH tối ƣu 8
Thời gian nuôi cấy tối ƣu 3 ngày
Ứng dụng biopolymer trong xử lý nước thải dệt nhuộm
- Sử dụng biopolymer thu nhận được từ vi khuẩn để xử lý nước thải dệt nhuộm
- Đánh giá mức độ xử lý của biopolymer
Tiến hành thí nghiệm xác định các chỉ số mẫu nước thải a Chuẩn bị thí nghiệm
Nước thải đầu vào để thí nghiệm lấy tại tiệm nhuộm quần áo ở địa chỉ 83 Xô Viết b Hóa chất
- H 2 SO 4 , NaOH tinh khiết dùng để pha chế dung dịch điều chỉnh pH
- Dung dịch MnSO 4 , KI–NaOH, Na 2 S 2 O 3 tiêu chuẩn 0,1N, đệm photphat (phosphate buffer solution), MgSO 4 ,CaCl 2 , FeCl 3
- Chỉ thị hồ tinh bột 1% c Dụng cụ và thiết bị
- Ống đong 100ml, buret, chai BOD, pipet,
- Giấy lọc sợi thủy tinh, tủ sấy 103-105 0 C, bình làm nguội hút ẩm, cân phân tích d Phương pháp xử lý mẫu nước thải
Xử lý sơ bộ nước thải dệt nhuộm
- Trung hòa mẫu: Nếu pH của mẫu không nằm trong khoảng từ 5-8, cần dùng
H 2 SO 4 , NaOH để trung hòa mẫu Khi trung hòa không cần quan tâm đến kết tủa nếu có tạo thành
Quá trình trung hòa clo tự do và clo liên kết được thực hiện bằng dung dịch Natri sunfit Thêm 1 ml axit axetic (pha 1:1) hoặc H2SO4 (pha 1:50) vào 1 lít mẫu Sau đó bổ sung tiếp 10 ml KI 10% Định phân bằng Na2SO3 cho đến khi dung dịch có màu vàng nhạt Thêm 1 ml chỉ thị màu hồ tinh bột 0,5% cho đến khi xuất hiện màu xanh dương, rồi tiếp tục định phân cho đến khi màu biến mất (không màu).
- pH đƣợc xác định bằng pH kế và sử dụng H 2 SO 4 , NaOH tinh khiết để điều chỉnh e Phương pháp phân tích một số chỉ tiêu trong nước thải
Phương pháp điện thế đo pH xác định pH trực tiếp bằng phép đo điện thế Sức điện động (EMF) của tế bào galvanic liên quan đến hoạt động của ion H+ trong dung dịch theo công thức của định lý Nernst Điện thế do tế bào sinh ra tỉ lệ với nồng độ ion H+ trong mẫu nước, và giá trị điện thế này được đo bằng một điện kế, sau đó được thiết bị đặc biệt chuyển đổi thành giá trị pH và hiển thị trên màn hình của máy.
Nhiệt độ Để xác định nhiệt độ của nước, người ta thường dùng nhiệt kế thủy ngân có chia độ
Xác định tổng chất rắn lơ lửng TSS (Total Suspended Solid)
Chất rắn lơ lửng tổng hợp (TSS) được xác định bằng phương pháp cân trọng lượng các chất rắn còn lại trên giấy lọc sau quá trình lọc nước mẫu TSS thể hiện lượng chất rắn không hòa tan tồn tại lơ lửng trong nước và được biểu thị ở đơn vị mg/L.
Chất rắn trong nước gồm hai dạng chính: chất rắn lơ lửng và chất rắn hòa tan Hàm lượng chất rắn cao làm giảm chất lượng nước hoặc nước thải, khiến nguồn nước có vị và có thể gây ra các phản ứng lý học không thuận lợi cho người sử dụng Bên cạnh đó, cặn lơ lửng còn ảnh hưởng nghiêm trọng đến việc kiểm soát và hiệu quả xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học.
- Thu mẫu vào bình 1 lít và đậy kín Bảo quản lạnh 4 0 C
- Lọc mẫu bằng giấy lọc có cấu tạo bằng chất liệu sợi thủy tinh đường kính Φ 9cm
- Đánh số mẫu trên giấy lọc
- Sấy giấy lọc ở 105 0 C trong 2-3 giờ
- Cân và ghi khối lƣợng giấy lọc (Wo)
- Lắc đều mẫu nước trước khi lọc
- Lọc mẫu nước, ghi thể tích mẫu nước đã lọc (V = 50 mL)
- Sấy ở 105 0C trong 2-3 giờ, hút ẩm 30 phút trong bình hút ẩm, cân khối lƣợng (W1)
- Sấy lại ở nhiệt độ 103-105 0 C trong 2-3 giờ, sau đó đem cân tương tự nhƣ trên đƣợc W 2 , nếu W 2 bằng W 1 thì dừng lại nếu W 2 khác W 1 thì tiếp tục các bước như trên
- Chỉ tiêu về tổng chất rắn lơ lửng đƣợc tính theo công thức sau:
Xác định nhu cầu oxy sinh hóa BOD (Biochemical Oxygen Demand)
BOD, viết tắt của Biochemical Oxygen Demand, được ứng dụng rộng rãi trong kỹ thuật môi trường để đánh giá mức độ ô nhiễm của nước thải sinh hoạt và nước thải công nghiệp Chỉ tiêu này đo lượng oxy cần thiết cho quá trình oxy hóa sinh học các chất hữu cơ trong nước, từ đó cho biết khả năng tự làm sạch và mức độ ô nhiễm của nguồn nước Ngoài ra, BOD còn là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá hiệu quả xử lý nước thải và quản lý chất lượng nước trong các hệ thống xử lý, giúp thiết kế và vận hành các cơ sở xử lý một cách tối ưu.
BOD (Biochemical Oxygen Demand) đo lượng oxy tiêu thụ do vi sinh vật khi phân hủy chất hữu cơ có trong nước thải, là chỉ số liên quan trực tiếp đến mức độ ô nhiễm và khả năng phân hủy của nước thải Vì vậy BOD được ứng dụng để ước lượng công suất các công trình xử lý sinh học cũng như đánh giá hiệu quả xử lý của những công trình này, từ đó hỗ trợ thiết kế, vận hành và tối ưu hóa hệ thống xử lý nước thải.
Quy trình đo BOD được thực hiện bằng cách sử dụng chai BOD đặc biệt có thể tích 300 ml, cho mẫu nước vào đầy chai Đo hàm lượng oxy hòa tan ban đầu (DO) và DO sau 5 ngày (DO5) được ủ ở nhiệt độ 20°C Lượng oxy mà vi sinh vật tiêu thụ chính là giá trị BOD, phản ánh lượng chất hữu cơ có thể bị phân hủy trong mẫu.
Thu mẫu nước vào lọ màu nâu 300 ml có nắp nút mài, sau đó cho chất cố định MnSO4 1 ml và dung dịch KI–NaOH 1 ml, đậy nắp lại và lắc đều để hình thành kết tủa Lưu ý khi thu mẫu và sau khi cố định: không để bọt khí xuất hiện trong chai khi thu mẫu nước.
Sau khi cố định bằng hóa chất, để mẫu yên cho kết tủa lắng xuống Tiếp tục lắc đều thêm một lần nữa để kết tủa hình thành hoàn toàn, sau đó để yên khoảng 5 phút để kết tủa ổn định.
- Cho tiếp 2 ml H 2 SO 4 đậm đặc (vẫn không cho bọt khí xuất hiện trong lọ)
- Lắc đều cho đến khi kết tủa hòa tan Dung dịch có màu vàng nâu
- Đong 50 ml dung dịch vừa đƣợc acid hóa ở trên, cho vào bình tam giác 100 ml
Quy trình chuẩn độ được thực hiện bằng dung dịch Na2S2O3 0,01N cho đến khi dung dịch có màu vàng nhạt Tiếp theo cho 3 giọt chỉ thị hồ tinh bột và lắc đều để dung dịch chuyển sang màu xanh do hiện tượng hồ tinh bột–iodine, sau đó tiếp tục chuẩn độ cho đến khi màu xanh biến mất và dung dịch trở về màu không màu, dừng lại ở thời điểm này.
- Ghi thể tích (V 1 ml) dung dịch Na 2 S 2 O 3 0,01N đã sử dụng chuẩn độ mẫu
- Làm tương tự 2 hoặc 3 lần, ghi thể tích dung dịch Na2S 2 O 3 0,01N đã dùng chuẩn độ
DO 5 : oxy hòa tan đo đƣợc sau 5 ngày f : hệ số pha loãng
Đong 500 ml mẫu nước thải và pha loãng với tỉ lệ 20 lần để chuẩn bị đo BOD5 Vì mẫu nước còn độ màu gây khó khăn cho quá trình đo BOD5 nên cần pha loãng ở tỉ lệ phù hợp để thu được kết quả chính xác Lưu ý đảm bảo độ pha loãng sao cho sự khác biệt giữa hai lần đo BOD5 phải lớn hơn 1 mg/L.
Chiết mẫu pha loãng được chia vào 4 chai BOD dung tích 300 ml, mỗi chai ứng với một nghiệm thức riêng và được đậy kín bằng giấy parafin ở miệng chai để ngăn bay hơi; các chai được ủ ở nhiệt độ kiểm soát trong 5 ngày, sau đó tiến hành định phân để xác định BOD5.
Trong thí nghiệm khảo sát nồng độ biopolymer dùng cho xử lý nước, nồng độ biopolymer được đánh giá ở mức vừa phải, không quá cao cũng không quá thấp Quá ít biopolymer làm hiệu quả tạo bông kém, trong khi quá nhiều có thể khiến các hạt bông bị phá vỡ liên kết và quay trở về trạng thái ban đầu, khiến các hạt keo vẫn lơ lửng trong dung dịch Vì vậy, việc xác định nồng độ tối ưu là cần thiết để đảm bảo hiệu quả xử lý và ổn định hệ keo.
- Bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần, gồm 4 nghiệm thức:
NX1: mẫu nước thải để lắng tự nhiên
NX2: mẫu nước thải bổ sung 1g/l biopolymer
NX3: mẫu nước thải bổ sung 2g/l biopolymer
NX4: mẫu nước thải bổ sung 3g/l biopolymer
Chỉ tiêu đánh giá chất lượng nước được xác định bằng đo pH trước và sau xử lý, đo nhiệt độ trước và sau xử lý, đo BOD trước và sau xử lý với biopolymer, và đo TSS trước và sau xử lý với biopolymer.
Phương pháp xử lý số liệu
The data from the experiments were analyzed by ANOVA (analysis of variance) to identify significant effects, and the means were ranked using Duncan's multiple range test, with all procedures performed in Statgraphics Centurion XV software.