kl le thanh tuan 072636s

Sau 4 tuần nuôi cấy, ảnh hưởng của các acid amine và polyamine cụ thể như sau: Nồng độ proline 0,75 g/l cho hiệu quả tốt nhất lên sự phát sinh phôi vô tính với tần suất đạt 86,66%; nồng

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG

KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ ACID AMINE VÀ POLYAMINE LÊN SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH CÂY CỌC RÀO

(JATROPHA CURCAS L.) NUÔI CẤY

IN VITRO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Ngành: Công Nghệ Sinh Học Chuyên ngành: Nông Nghiệp

SVTH: LÊ THANH TUẤN MSSV: 072636S

GVHD: TH.S ĐỖ ĐĂNG GIÁP

TH.S TRẦN TRỌNG TUẤN

TP HỒ CHÍ MINH – 2012

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy Thạc sỹ Đỗ Đăng Giáp, Thạc sỹ Trần Trọng Tuấn, những người đã tận tình hướng dẫn, góp ý, động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại Học Tôn Đức Thắng, Ban chủ nhiệm Khoa Khoa học ứng dụng và bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất

cả các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường, những kiến thức nhận được sẽ là hành trang giúp em vững bước trong tương lai

Em xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến chị Kim Loan đã hướng dẫn tận tình, giúp

đỡ, động viên em những lúc em khó khăn, truyền đạt cho em rất nhiều kinh nghiệm,

kỹ năng trong suốt quá trình em thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Em xin cảm ơn chị Huyền Trang, chị Phòng, bạn Thiên Tứ, bạn Thoan, bạn Ngọc Anh, bạn Hiền Trang, bạn Trường, bạn Hà, bạn Thư cùng các anh chị và các bạn trong phòng Thí nghiệm trọng điểm phía nam về Công nghệ Tế bào thực vật – Viện Sinh học nhiệt đới đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Xin cảm ơn các bạn Quốc Vinh, Như Vinh, Đức Tâm, Nguyễn Thuận, Chí

Ty, Văn Trình, Long Vương cùng các bạn trong tập thể lớp 07SH2D đã chia sẻ cùng mình những vui buồn, khó khăn cũng như hết lòng giúp đỡ, hỗ trợ mình trong suốt quá trình học tập cũng như trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Cuối cùng, con xin gởi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến ba, mẹ, anh, chị đã bên con, thương yêu con, động viên con những lúc khó khăn, là chỗ dựa tinh thần cho con, luôn tạo điều kiện tốt nhất cho con

TÓM TẮT

Khảo sát ảnh hưởng của acid amine và polyamine đến khả năng phát sinh phôi vô tính cây Cọc rào từ mô sẹo được trình bày trong nghiên cứu này Các mô sẹo có khả năng phát sinh phôi vô tính được cấy chuyền vào môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung riêng lẻ các acid amine và polyamine lần lượt ở các nồng độ như sau: proline (0,25 1,00 g/l), glutamine (50 200 mg/l), adenine sulphate (50 200 mg/l), tyrosine (50 200 mg/l) và spermidine (0,2 0,8 mM) Sau 4 tuần nuôi cấy, ảnh hưởng của các acid amine và polyamine cụ thể như sau: Nồng độ proline 0,75 g/l cho hiệu quả tốt nhất lên sự phát sinh phôi vô tính với tần suất đạt 86,66%; nồng độ glutamine 150 mg/l cho tần suất phát sinh phôi cao nhất với 83,33%; tần suất phát sinh phôi cao nhất ở môi trường bổ sung adenine sulphate là 76,67% với nồng độ 150 mg/l; nồng độ spermidine 0,4 mM cho hiệu quả phát sinh phôi cao nhất với tần suất 100%; môi trường có bổ sung tyrosine không có hiệu quả trong phát sinh phôi Các phôi sau khi được tái sinh từ mô sẹo tiếp tục được khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng (1/2 MS, MS, B5, White, WPM) đến khả năng tái sinh cây con Môi trường B5 (Gamborg, 1968) cho kết quả tốt ưu với 100% tỷ lệ mẫu tái sinh cây sau 5 tuần nuôi cấy Khảo sát ảnh hưởng của NAA (0,5 2,0 mg/l) và IBA (0,5 2,0 mg/l) được bổ sung riêng lẻ vào môi trường nuôi

cấy lên khả năng tái sinh cây con từ phôi vô tính cây Cọc rào nuôi cấy in vitro Kết

quả thu được cho thấy IBA ở nồng độ 1,5 mg/l được bổ sung vào môi trường B5 cho hiệu quả cao nhất với tần suất tái sinh cây con đạt 100% sau 5 tuần nuôi cấy

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Tóm tắt ii

Mục lục iii

Danh sách các chữ viết tắt vi

Danh sách các bảng vii

Danh sách các hinh viii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích của đề tài 2

1.3 Ý nghĩa của đề tài 2

1.3.1 Ý nghĩa của đề tài 2

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu 2

Chương 2 TỔNG QUAN 3

2.1 Giới thiệu cây Cọc rào 3

2.1.1 Phân loại 3

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố 4

2.1.3 Đặc điểm sinh học 5

2.1.3.1 Đặc điểm hình thái 5

2.1.3.2 Đặc điểm sinh thái, sinh trường và phát triển 7

2.1.4 Thành phân hóa học của cây Cọc rào 7

2.1.5 Công dụng của cây Cọc rào 7

2.1.5.1 Trong điều trị bệnh 7

2.1.5.2 Cọc rào và nhiên liệu sinh học 8

2.1.5.3 Bảo vệ môi trường 10

2.1.5.4 Sử dụng làm phân bón và thức ăn gia súc 10

2.1.6 Nhân giống 11

2.1.6.1 Phương pháp nhân giống truyền thống 11

2.1.6.2 Phương pháp nhân giống hiện đại 12

2.2 Giới thiệu về phôi vô tính 17

2.2.1 Khái niệm về phôi vô tính 17

2.2.2 Quá trình phát sinh phôi vô tính 18

2.2.2.1 Giả định về sự hình thành phôi vô tính 18

2.2.2.2 Bước đầu nuôi cấy cảm ứng tạo phôi vô tính 19

2.2.2.3 Sự phát triển của phôi vô tính 21

2.2.2.4 Sự phát triển thành cây con từ phôi vô tính 22

2.3 Sự ảnh hưởng của polyamine, acid amine trong nuôi cấy mô 22

2.3.1 Polyamine 22

2.3.2 Acid amine 26

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 29

3.1.1 Thời gian nghiên cứu 29

3.1.2 Địa điểm nghiên cứu 29

3.2 Vật liệu, nội dung và phương pháp thực hiện 29

3.2.1 Vật liệu 29

3.2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 29

3.2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất 29

3.2.1.3 Môi trường nuôi cấy 30

3.2.1.4 Điều kiện nuôi cấy 30

3.2.2 Nội dung nghiên cứu 30

3.2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của proline lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào 30

3.2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của glutamine lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào 31

3.2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của adenine sulphate lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào 31

3.2.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của tyrosine lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào 32

3.2.2.5 Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của spermidine lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào 32

3.2.2.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường khoáng

lên sự hình thành cây con tái sinh từ phôi vô tính

cây Cọc rào nuôi cấy in vitro 33

3.2.2.7 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA, NAA lên sự hình thành cây con từ phôi vô tính cây Cọc rào nuôi cấy in vitro 33

3.3 Chỉ tiêu theo dõi 34

3.4 Phân tích và xử lý số liệu 34

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của proline lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào 35

4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của glutamine lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào nuôi cấy in vitro 39

4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của adenine sulphate lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào nuôi cấy in vitro 42

4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của tyrosine lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào nuôi cấy in vitro 45

4.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của spermidine lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào nuôi cấy in vitro 48

4.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của môi trường khoáng lên sự hình thành cây con từ phôi vô tính cây Cọc rào nuôi cấy in vitro 51

4.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự hình thành rễ của cây con tái sinh từ phôi vô tính cây Cọc rào nuôi cấy in vitro 53

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 57

5.1 Kết luận 57

5.2 Đề nghị 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 63

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

½ MS : Môi trường MS với khoáng đa lượng giảm ½ và vi lượng giữ nguyên 2,4 D : 2,4 dichlorophenoxyacetic acid

ABA : Abcisic acid

B5 : Môi trường Gamborg và cộng sự (1968)

BA : 6 benzynadenine

BAP : N6 benzylaminopurine

CW : Coconut water (nước dừa)

DCHA : Dicyclohexylammordum sulfate

DFMA : α-difluoromethylarginine

FW : Fresh weight

GA3 : Gibberellic acid

IAA : Indole 3 acetic acid

IBA : Indole 3 butyric acid

IEDC : Induced embryogenic determined cell

MGBG : Methylglyoxal bis guanylhydrazone

MS : Môi trường Murashige và Skoog (1962)

NAA : α naphthaleneacetic acid

PEDC : Pre embryogenic determined cell

PEM : Proembryogenic mass

TDZ : Thidiazuron (N phenyl N’ 1,2,3 thidiazol 5 ylurea)

White : Môi trường White (1962)

WPM : Môi trường Woody Plant Medium (Lloyd và Mc Cown, 1980)

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của proline 31

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của glutamine 31

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của adenine sulphate 32

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tyrosine 32

Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của spermidine 33

Bảng 3.6 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường nuôi cấy 33

Bảng 3.7 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ IBA 34

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của proline lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào 35

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của glutamine lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào 39

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của adenine sulphate lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào 43

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của tyrosine lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào 46

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của spermidine lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào 48

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của các môi trường khoáng khác nhau lên sự hình thành cây con từ phôi vô tính cây Cọc rào nuôi cấy in vitro 52

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của IBA và NAA lên sự hình thành rễ của cây con tái sinh từ phôi vô tính cây Cọc rào nuôi cấy in vitro 54

cây Cọc rào 41 Hình 4.3 Ảnh hưởng của adenine sulphate lên sự hình thành phôi

vô tính cây Cọc rào 44 Hình 4.4 Ảnh hưởng của tyrosine lên sự hình thành phôi vô tính

cây Cọc rào 47 Hình 4.5 Ảnh hưởng của spermidine lên sự hình thành phôi vô tính

cây Cọc rào 50 Hình 4.6 Ảnh hưởng của môi trường khoáng, IBA và NAA lên sự

hình thành rễ của cây con tái sinh từ phôi vô tính cây

Cọc rào 56

Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong tình hình khủng hoảng năng lượng hiện nay, các nước trên thế giới đều đi tìm nguồn năng lượng có khả năng tái tạo được để thay thế một phân nguyên liệu từ dầu mỏ Mỹ, Trung Quốc với nhu cầu khổng lồ về năng lượng dầu mỏ, hiện

là các nước đứng đầu thế giới về đầu tư nghiên cứu cũng như sản xuất năng lượng không truyền thống trong đó có nhiên liệu sinh học Dựa trên điều kiện tự nhiên xã hội của mình, mỗi nước phát triển một loại cây nhiên liệu khác nhau như: Đỗ tương, Dầu cọ, Hướng dương, Cải dầu,… Khoảng 10 năm trở lại đây, nhiều nước trên thế giới trong đó có các nước khu vực châu Á, đặc biệt Việt Nam là nước quan tâm nghiên cứu và phát triển cây Cọc rào để sản xuất biodiesel Trồng cây Cọc rào chống được sa mạc hóa, mang lại việc làm cho người nghèo Cây Cọc rào có ý nghĩa kinh tế môi trường xã hội cao

Bản thân cây Cọc rào ngoài tự nhiên sinh trưởng rất mạnh, nhân giống bằng

hạt và giâm cành khá dễ Nhưng nhân giống in vitro lại gặp nhiều khó khăn mà đây

lại là khâu quan trọng trong công tác giống để góp phân nâng cao năng suất hạt

Tuy nhiên, nhân giống in vitro cây Cọc rào cũng đã đạt được một số kết quả nhất

định Hiện nay mới chỉ dừng ở mức nhận được cây hoàn chỉnh từ chồi ngọn, chồi nách và tái sinh cây nuôi cấy từ lớp mỏng tế bào lá một số cây Cọc rào đầu dòng Phôi vô tính được xem như kỹ thuật mang lại nhiều hiệu quả cao trong nhân giống cây trồng, cho phép tái sinh cây con từ tế bào đơn ban đầu, duy trì tính đồng nhất của các dòng tế bào và tránh hiện tượng biến dị di truyền Hơn 200 loài đã được nhân giống bằng phôi vô tính Thông thường phôi vô tính được phát sinh trong môi trường bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Gần đây, ứng dụng một số chất như oligosaccharide, jasmonate, polyamine, acid amine và brassinosteroid cho thấy lợi ích phát sinh phôi từ một số loại thực vật

Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát ảnh hưởng của một số

acid amine và polyamine lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào (Jatropha

curcas L.) nuôi cấy in vitro” nhằm hình thành một hướng mới, tạo nguồn phôi vô

tính để phục vụ cho các nghiên cứu xa hơn và công tác cải tạo giống loài cây này

Đây là một hướng nghiên cứu mới trong nuôi cấy in vitro tại Việt Nam trên

đối tượng cây Cọc rào Có ý nghĩa trong nhân giống vô tính, đặt cơ sở nền móng cho nghiên cứu sinh lý thực vật ở cấp độ tế bào, chuyển gen thực vật

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu

Phạm vi nội dung nghiên cứu của đề tài: (i) Nghiên cứu nồng độ của một số acid amine và polyamine thích hợp cho sự hình thành phôi vô tính từ mô sẹo, (ii) tạo nguồn cây con từ phôi vô tính cây Cọc rào

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN 2.1 GIỚI THIỆU VỀ CÂY CỌC RÀO

Loài : Jatropha curcas L

Jatropha là tên bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp: iatros (bác sĩ) và trophe (thực phẩm) ngụ ý dược tính của cây Theo Correll và cộng sự (1982), curcas là tên của

cây Cọc rào tại vùng Malabar, Ấn Độ Ở Việt Nam, cây Cọc rào còn được gọi là cây Cọc dậu, Cây li, Ba đậu nam, Dầu mè

Hình 2.1 Cây Cọc rào (Jatropha curcas L.)

Loài Jatropha curcas L dại phân bố nhiều ở vùng thung lũng á nhiệt đới khô

nóng và vùng rừng mưa nhiệt đới ẩm, thường ở vùng đồi núi, đất dốc có độ cao 700

– 1600 m so với mực nước biển J curcas sinh trưởng tự nhiên trong những vùng

nhiệt đới ở Mỹ, nhưng hiện nay đã được tìm thấy nhiều ở những vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới khắp châu Phi và châu Á

Ở Việt Nam, Cọc rào có mặt từ rất sớm, mọc nhiều ở những vùng núi, chủ yếu được người dân trồng để làm hàng rào Theo kết quả nghiên cứu của TS Lê Võ Định Tường (2005) cây Cọc rào được phát hiện ở nhiều vùng sinh thái khác nhau như:

Vùng trung du miền núi phía Bắc: tỉnh Lào Cai (Sa Pa), tỉnh Lai Châu (Tam Đường, Sìn Hồ, TX Lai Châu), tỉnh Điện Biên (TP Điện Biên), tỉnh Sơn La (Thuận Châu, Yên Châu, TX Sơn La), tỉnh Hòa Bình (Lạc Thủy, Hương Sơn, Lương Sơn), tỉnh Lạng Sơn (Chi Lăng, Lộc Bình, Mẫu Sơn, Tân Thanh)

Vùng Bắc Trung bộ: tỉnh Thanh Hóa (Cẩm Thủy, Sao Vàng, Bá Thước, Thạch Thành), tỉnh Quảng Trị (Hưng Hóa)

Vùng duyên hải Nam trung bộ: tỉnh Ninh Thuận (Ninh Sơn, Ninh Hòa), tỉnh Bình Thuận (Hàm Thuận Nam, Hàm Thuận Bắc, Bắc Bình), tỉnh Khánh Hòa (Cam Ranh, Diên Khánh, Khánh Sơn)

Vùng Đông Nam bộ: TP Hồ Chí Minh (Hoóc Môn), tỉnh Đồng Nai (Định Quán), tỉnh Lâm Đồng (Đức Trọng)

2.1.3 Đặc điểm sinh học

2.1.3.1 Đặc điểm hình thái

Cây Cọc rào là cây bụi gỗ mềm, vỏ xám nhẵn Cây thường cao 3 5m, trong các điều kiện thích hợp cây có thể cao 8 10m, thân thẳng cao trung bình 6m với tán rộng Cành non mập và mọng nước, nhựa cây có màu trắng sữa hay màu vàng nhạt, lá rụng sớm, mọc dày ở phần ngọn Lá có hình ovan hoặc hình trái tim, có lá chẻ thùy 3 đến 5 thùy Lá dài 6 – 40 cm, rộng 6 – 35 cm, cuống dài 2,5 – 7,5 cm Hoa thường nở vào tháng 4 – 5 tạo thành nhiều chùm có màu vàng nhạt, hình chuông Hoa đực có 10 nhị trong đó 5 nhị dính vào phần chân đế, 5 nhị kết lại thành

bó Hoa cái rời rạc với bầu nhụy hình elip, chia làm 3 ô, với 3 núm nhụy phân nhánh Cụm hoa ở nách lá, hoa đơn tính và hoa cái thường to hơn hoa đực, ra hoa vào mùa hè Quả có dạng nang, kích thước 2,5 – 4,0 cm Quả chia thành 3 ngăn, hạt nằm trong các ngăn này Hạt cây thuôn, màu đen kích thước 2 x 1 cm Cọc rào thụ phấn nhờ côn trùng Dehgan và Webster (1979) cho rằng, Cọc rào được thụ phấn nhờ vào bướm ban đêm Nếu trồng trong nhà kính, không có côn trùng, hạt khó đậu quả nếu không thụ phấn nhân tạo Rất hiếm có trường hợp hoa lưỡng tính có thể tự thụ phấn Heller (1996) đã quan sát nhiều lần sâu bọ tới và thụ phấn cho hoa Ở Senegal, Heller cũng đã phát hiện, nhị hoa mở muộn hơn nhụy hoa trên cùng một nhóm hoa, nhờ cơ chế này đã thúc đẩy quá trình thụ phấn chéo Münch (1986) không quan sát được cơ chế này ở Cape Verde, có thể do tác động của môi trường Sau khi thụ phấn, một quả hình bầu dục có 3 ô được hình thành Vỏ quả ngoài màu xanh cho tới khi hạt chín ở bên trong Gupta (1985) đã nghiên cứu tỉ mỉ về giải phẫu các bộ phận của cây Cọc rào là một loài lưỡng bội với công thức bộ gen là 2n = 22 nhiễm sắc thể

a b

Hình 2.2.Một số hình ảnh của cây Jatropha Curcas L.

a Cây; b Trái xanh; c Hạt; d Hoa

e Trái chứa hạt; f Cành, lá và trái xanh chứa hạt

2.1.3.2 Đặc điểm sinh thái, sinh trưởng và phát triển

Cây Cọc rào có thể phát triển trong các điều kiện khí hậu khô cằn Điều kiện thích hợp nhất cho cây phát triển là mưa ít (200 mm) nhưng cây vẫn có thể sống được ở nơi có lượng mưa cao lên đến 1200 mm Khi gặp hạn hán, cây thích ứng bằng cách rụng hầu hết lá để làm giảm sự thoát hơi nước Nhiệt độ thích hợp cho cây là 18 – 28,5 C Điều kiện để hạt nảy mầm là khí hậu nóng ẩm Hoa nở trong mùa mưa và tạo quả trong mùa đông

Cây có thể được trồng trên mọi loại đất Cây cũng có khả năng chịu được sương mù nhẹ nhưng chỉ trong thời gian ngắn Cây càng già càng có khả năng kháng cự tốt và sương mù sẽ làm chết cây non Cây dễ bén rễ, phát triển tương đối nhanh, cũng có khả năng chịu rét vừa phải, không bị trâu bò ăn hoặc các động vật khác gặm, thức ăn chính là phân bón hữu cơ Thời gian ra quả trong vòng 6 tháng đến 1 năm, có thể bén rễ từ hạt, cây non và từ cành giâm Vòng đời của cây Cọc rào khoảng 50 năm Nhưng có thể thu hái hạt trong khoảng thời gian ít nhất 40 năm

2.1.4 Thành phần hóa học củ

Thành phần hóa học của hạt: 18,20% protein, 38,00% dầu béo, 17,08% carbohydrate, tinh bột, acid hữu cơ, hai chất độc và một chất nhựa Dầu béo chứa acid myristic, acid palmitic, acid stearic, acid arachidic, acid oleic (37 63%), acid linoleic (19 40%), chất độc trong dầu béo là diterpen và

12 desoxy 16 hydroxyphorbol Hàm lượng dầu trong hạt là 20 – 40% và trong nhân là 46 58% Lá tươi có vitexin, isovitexin Thân, cành, lá chứa triacontanol,

7 ceto beta sitosterol Vỏ cây chứa tanin (37%), sáp, đường khử, saponin, một ít tinh dầu Nhựa mủ có curcain và 2 peptid mạch vòng là curcacyclin A và

curcacyclin B

2.1.5.1 Trong điều trị bệnh

Trong thành phần cây Cọc rào, đã phân tích được những hợp chất chủ yếu như tecpen, flavon, coumarin, lipid, sterol, alkaloid Nhiều bộ phận của cây này có thể chữa bệnh như lá, vỏ cây, hạt và rễ Rễ trị tiêu viêm, cầm máu, trị ngứa; dầu của

hạt có thể nhuận tràng; dịch nhựa trắng tiết ra từ vết thương của cành có thể trị viêm lợi, làm lành vết thương, chữa trị bệnh trĩ và mụn cơm; nước sắc từ lá dùng để chữa bệnh phong thấp, đau răng,… Trong cây có một số độc tố, nhất là phytotoxin (curcin) trong hạt, nếu được nghiên cứu sâu hơn rất có thể cung cấp cho chúng ta một loại dược liệu mới

Nhựa mủ

Nhựa cây Cọc rào có chứa các alkaloid như jatrophine, jatrophame, jatrophone và curcain là những chất có tính kháng bệnh ung thư Lá có chứa apigenin, vitecin và isovitecin Ngoài ra trong lá và cành non còn chứa amyrin, stigmosterol và stigmastene là những chất có tính kháng khuẩn, chống viêm, chống

dị ứng và oxy hóa Chất béo có trong hạt cây giàu palmitic, acid oleic và acid linoleic Hạt cây có tính độc là do thành phần alkaloid curcin của nó Nhựa cây được dùng để trị các bệnh ngoài da như u nhọt, hắc lào, xuất huyết da Cành non có tác dụng làm sạch răng miệng

Hạt và dầu

Hạt cây là loại thuốc trị bệnh phù, bệnh gút (gout), chứng liệt và các bệnh về

da (Võ Văn Chi, 1999) Dầu cây Cọc rào có tính tẩy rửa

2.1.5.2 Cọc rào và nhiên liệu sinh học

Ngoài các tác dụng trị bệnh kể trên, cây Cọc rào được sự chú ý đặc biệt bởi

nó là nguồn nguyên liệu để sản xuất diesel sinh học Hạt của cây có độ ẩm (6,62%), protein (18,2%), chất béo (38%), carbohydrate (17,3%), sợi (15,5%) và tro (4,5%) Dầu chiếm 35 – 40% hạt và 50 – 60% nhân hạt Trong dầu chứa 21% các acid béo không bão hòa Hạt được xay và ép lấy dầu hoặc dầu được tách bằng các dung môi

Dầu sau khi lọc được sử dụng ngay như là nguồn nhiên liệu sinh học ở dạng bổ sung, dầu từ hạt cây Cọc rào có thể trộn với dầu thường cho tỷ lệ lên đến 20% Mặc

dù diesel sinh học được sản xuất từ nhiều loại nguyên liệu: Cải dầu, Hướng dương, Dầu cọ, mỡ động vật,… nhưng sản xuất từ Cọc rào vẫn có giá thành rẻ nhất, chất lượng tốt, tương đương với dầu diesel hóa thạch truyền thống Đây là nguồn năng lượng mới an toàn, chi phí thấp, tái sinh được, hứa hẹn sẽ là nguồn năng lượng thay thế cho thủy điện, dầu diessel, dầu lửa, khí hóa lỏng (LPG), than, củi,… Nguồn năng lượng này sẽ giúp các nước cắt giảm một khoản tiền cho năng lượng và phần nào xóa đi sự mất cân bằng về sử dụng năng lượng giữa các vùng Ưu điểm là khói

từ dầu Cọc rào không có mùi và không cay như khói dầu hỏa và không để lại mùi cho thức ăn sau khi nấu Nếu 1 ha Cọc rào đạt năng suất 8 10 tấn hạt/ha/năm có thể sản xuất được 3 tấn diesel sinh học Loại dầu này sẽ thay thế được 1 phần dầu diesel truyền thống đang cạn kiệt, giảm thiểu lượng khí thải gây hiệu ứng nhà kính,

là loại dầu cháy hết và không có lưu huỳnh, dầu sạch, thân thiện với môi trường

Việt Nam phải chi khoảng 2 tỷ 410 triệu đô la một năm để nhập khẩu các sản phẩm dầu (năm 2003) và ngày càng tăng theo các năm Đây là khoản chi rất lớn của ngân sách quốc gia, có ảnh hưởng đến toàn bộ nền kinh tế Trong tương lai dầu được sản xuất từ cây Cọc rào sẽ thay thế dầu diesel bởi nó có những đặc tính lý hóa tương tự như dầu diesel, các động cơ chạy bằng dầu diesel thường khi chuyển sang

sử dụng dầu Cọc rào cũng không phải thay đổi nhiều về cấu trúc động cơ

Việc sử dụng cây Cọc rào để sản xuất nhiên liệu sinh học đang còn là một việc làm mới Năm 1995, quỹ Rockơphelơ và Chính phủ Đức tài trợ các nước Brazil, Nepal, Zimbabwe bắt đầu chế biến Cọc rào làm biodiesel sinh học Uỷ ban

kế hoạch Ấn Độ từ tháng 7 năm 2002 đã lập ra một tổ lãnh đạo phát triển nhiên liệu sinh học, xây dựng quy hoạch phát triển dầu sinh học quốc gia, phấn đấu đến năm

2011 2012, dầu sinh học thay thế 20% dầu mỏ, đưa diện tích trồng Cọc rào lên 5 triệu ha Năm 2003 2007 là giai đoạn thử nghiệm nghiên cứu về trồng trọt, tách hạt, chiết xuất dầu, chuyển hoá, pha trộn, tiêu thụ Dự kiến vào năm 2007, Ấn Độ sản xuất 1,5 triệu tấn hạt Cọc rào, sản xuất 480000 tấn dầu Công đoạn trồng Cọc rào sẽ thu hút được 124,4 triệu việc làm, công đoạn tách hạt hàng năm tạo ra 36,8

triệu việc làm, giúp cho 55 vạn gia đình nông dân thoát nghèo Việt Nam sẽ là một nước tiêu thụ lớn về nhiên liệu trong tương lai Nguồn dầu mỏ của nước ta không nhiều, nhất thiết phải có chiến lược sản xuất nhiên liệu thay thế nhiên liệu hoá thạch, đầu tư vào các cây nhiên liệu sinh học là một biện pháp thích hợp Ngày 19/6/2008, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã có quyết định 1842/QĐ BNN LN về phê duyệt Đề án “Nghiên cứu, phát triển và sử dụng sản

phẩm cây Cọc rào (Jatropha curcas L.) ở Việt Nam giai đoạn 2008 2015 và tầm

nhìn đến 2025”

Cọc rào còn tạo ra hiệu ứng xã hội cực kỳ to lớn Do trồng ở các vùng miền núi nghèo túng, cây Cọc rào sẽ tạo nhiều việc làm và thu nhập cho đồng bào các dân tộc, trong khi cho đến nay, trên đất dốc còn lại của các vùng này vẫn chưa tìm kiếm được bất cứ cây gì khả dĩ trồng được trên diện tích lớn, có thu nhập cao, lại có thị trường ổn định

2.1.5.3 Bảo vệ môi trường

Cọc rào là cây lâu năm, phủ đất rất tốt, tuổi thọ 50 năm, sinh trưởng phát triển được ở hầu hết các loại đất xấu, nghèo kiệt, đất dốc, đất trơ sỏi đá, gia súc không ăn Vì vậy, Cọc rào được trồng trên các vùng đất dốc sẽ được coi là cây “lấp đầy” lỗ hổng sinh thái ở các vùng sinh thái xung yếu miền núi, sớm tạo ra thảm thực

bì dày đặc chống xói mòn, chống cháy, nâng cao độ phì của đất Không những vậy, cây còn có thể trồng ở những vùng đất sa mạc hóa, bãi thải khai thác khoáng sản, góp phần phục hồi hệ sinh thái các vùng này, tạo ra hiệu ứng to lớn về bảo vệ môi trường

Cọc rào hấp thụ nhiều CO2 trong không khí Theo tính toán sơ bộ, một cây có khả năng hấp thụ 100 g CO2/ngày trong không khí, tính ra mỗi cây có khả năng hấp thụ 30 kg CO2/năm, mỗi ha có thể hấp thụ 48 tấn CO2/năm, góp phần giảm thiểu khí thải gây hiệu ứng nhà kính

2.1.5.4 Sử dụng làm phân bón và thức ăn gia súc

Sau khi ép dầu, bã khô dầu có hàm lượng Nitơ 4,14 – 4,78%; P2O5 0,50 – 0,66%; CaO 0,60 – 0,65%; MgO 0,17 – 0,21% được sử dụng làm phân hữu cơ rất

tốt để bón cho các loại cây trồng, nhất là cho vùng sản xuất nông nghiệp hữu cơ, nông nghiệp sạch, vừa góp phần sản xuất sản phẩm sạch, vừa nâng cao độ phì của đất

2.1.6 Nhân giống

Những nghiên cứu về nhân giống cây Cọc rào trên thế giới và ở Việt Nam còn rất hạn chế Cho đến nay phương pháp nhân giống cây Cọc rào chủ yếu vẫn theo lối cổ truyền là giâm cành và gieo hạt (Thái Xuân Du và Nguyễn Văn Uyển, 2006) Các phương pháp nhân giống hiện đại áp dụng trên cây Cọc rào chỉ mới phát triển trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây

2.1.6.1 Phương pháp nhân giống truyền thống

Ở Nam Phi, người dân trồng cây Cọc rào làm rào dậu hoặc trồng cây để chống xói mòn và bảo vệ đất thường sử dụng phương pháp giâm cành vì ưu điểm của phương pháp này là nhanh chóng tạo được cây trưởng thành Cành được cắt từ các cây Cọc rào đã trưởng thành cắm xuống đất, nếu được chăm sóc cẩn thận thì sau khoảng 2 đến 3 tháng là có được cây đủ lớn để đem trồng Cây tạo ra từ phương pháp giâm cành sau khoảng 1 năm sẽ bắt đầu sinh sản

Trồng cây để khai thác dầu lâu năm thì phương pháp nhân giống bằng gieo hạt được sử dụng nhiều hơn Bởi những nghiên cứu đã chỉ ra rằng, cây tạo thành từ nhân giống bằng giâm cành có đời sống ngắn hơn và khả năng chống hạn và bệnh tật kém hơn cây nhân giống bằng hạt Rễ của cây giâm cành phát triển yếu dễ bị gãy

đổ (Heller, 1996) Hạt trước khi đem gieo được lựa chọn là những hạt to, chắc, mẩy Hạt được ngâm nước qua đêm để làm tăng tỷ lệ nảy mầm Hôm sau, hạt được gieo vào trong các bầu đất Hạt sẽ nảy mầm sau khoảng 1 tuần và cây con có thể đem đi trồng sau 45 ngày Rễ của cây con mọc từ hạt phát triển, thường có 1 rễ cái và 4 rễ bên Cây trồng ngoài thực địa sẽ sinh sản sau khoảng 3 – 4 năm (Heller, 1996) Nhược điểm của phương pháp nhân giống bằng hạt là chất lượng cây con không đồng nhất bởi cây Cọc rào là cây thụ phấn chéo nên giữa các hạt có sự khác nhau về mặt di truyền Như xét tính trạng hàm lượng dầu trong hạt, các cây tạo ra bằng gieo hạt có hàm lượng dầu trong hạt không ổn định, giao động từ 4 đến 40% (Jha và cộng sự, 2007) Trong khi kiểm tra chất lượng hạt giống là một việc khó khăn thì tỷ

lệ sống và nảy mầm của hạt thấp, do đó nhân giống bằng phương pháp gieo hạt không thể đáp ứng đủ nhu cầu cây giống chất lượng tốt cho việc trồng cây trên qui

mô công nghiệp

2.1.6.2 Phương pháp nhân giống hiện đại

Các phương pháp nhân giống hiện đại có ưu điểm lớn là có khả năng tạo giống cây với số lượng lớn trong khoảng thời gian ngắn với chất lượng cao và đồng nhất Tuy nhiên những nghiên cứu này còn ít hoặc chưa được công bố

Sujatha và Mukta (1996) đã phát triển kỹ thuật tái sinh cây Cọc rào từ nhiều

bộ phận khác nhau của cây như phần trụ dưới lá mầm, cuống lá và lá Sự tạo thành chồi non bất định được chứng minh là hiệu quả nhất ở môi trường MS bổ sung 2,22

M BA và 4,9 M IBA Sau đó mô sẹo được tái sinh gián tiếp trên môi trường MS

bổ sung 0,44 M BA và 0,49 M IBA Chồi non hình thành được nuôi và tạo rễ trong môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cho đến khi phát triển thành cây hoàn chỉnh để đưa ra vườn ươm

Sự tái sinh cây con từ các mẫu cấy epicotyl (trụ trên lá mầm) của cây Cọc rào

cũng đã được nghiên cứu thành công (Wei và cộng sự, 2004) Các mẫu epicotyl in vitro được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung IBA và BA Các chồi bất định

được hình thành trực tiếp trên bề mặt của mẫu cấy epicotyl trong điều kiện kết hợp của 0,1 mg/l IBA và 0,5 mg/l BA với tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất Trong khi đó, sự tái sinh chồi gián tiếp thông qua mô sẹo cần phải có sự kết hợp 1,0 mg/l IBA và 0,5 mg/l BA Chồi tái sinh có thể hình thành rễ trên môi trường MS không có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng

Sujatha và cộng sự (2005) đã thành công trong nhân giống in vitro cây Cọc

rào bằng phương pháp tạo cụm chồi Nghiên cứu đã tạo chồi non bằng cách nuôi nách lá cây Cọc rào trên môi trường MS bổ sung TDZ nồng độ 2,3 – 4,5 M sau đó chuyển sang môi trường MS bổ sung IBA và BA Hiệu quả tạo chồi cao 10 – 12,3 chồi/mẫu cấy Việc tạo chồi bất định từ lá thu được bằng cách nuôi mẫu lá trên môi trường bổ sung 8,9 – 44,4 M BA và 4,9 M IBA để tạo thành mô sẹo có màu trắng

xanh, các chồi bất định sẽ được tạo thành sau khoảng 3 tuần và tiếp tục cấy chuyền sang môi trường bổ sung 8,9 M BA và 2,5 M IBA

Sự cảm ứng tạo đa chồi của cây Cọc rào từ các chồi nách (khoảng 0,7 cm) cũng đã được nghiên cứu bởi Thepsamran và cộng sự (2006) Các chồi được hình thành trên môi trường MS có bổ sung BA và IBA ở các nồng độ đơn lẻ hoặc kết hợp Trên môi trường MS có bổ sung 2,22 µM BA và 0,049 µM IBA cho sự tái sinh chồi tốt nhất, trung bình khoảng 5,9 chồi/chồi nách sau 6 tuần nuôi cấy Chồi tái sinh bắt đầu hình thành rễ trên môi trường MS có bổ sung 2,46 µM IBA sau 5 tuần

Cây Cọc rào đã được tạo dòng in vitro từ các mẫy cấy đốt thân (Datta và

cộng sự, 2007; Kalimuthu và cộng sự, 2007; Singh và cộng sự, 2010) Các chồi được tái sinh từ đốt thân trên môi trường có bổ sung auxin và cytokinin riêng lẻ hoặc kết hợp Các chồi được cấy chuyền sang môi trường khác để nhân nhanh số lượng chồi (Datta và cộng sự, 2007) hoặc cấy sang môi trường chỉ có auxin để hình thành rễ Cây con sau khi chuyển ra vườn ươm thì cho tỷ lệ sống sót cao (trên 80%)

Nuôi cấy tạo mô sẹo và huyền phù tế bào cây Cọc rào cũng đã được thực hiện bởi Soomro và Memon (2007) Mẫu lá và hypocotyl được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng: 2,4 D; BA; GA3 và nước dừa Các mô sẹo được hình thành trên môi trường có bổ sung 0,5 mg/l 2,4 D và 2% (v/v) nước dừa Mô sẹo màu xanh, xốp được sử dụng để nuôi cấy huyền phù Sự gia tăng tối đa của nuôi cấy huyền phù đạt được trong môi trường bổ sung 0,5 mg/l 2,4 D với mật độ tế bào ban đầu khoảng 1% Tổng chlorophyll có trong tế bào nuôi cấy thay đổi trong khoảng 50,7 – 75,7 ug/g FW suốt chu kỳ phát triển

Một quy trình tái sinh đơn giản, cho hiệu quả cao để cảm ứng chồi bất định

và tái sinh cây con từ mẫu cấy lá của cây của Cọc rào đã được báo cáo (Deore và cộng sự, 2008; Kumar và cộng sự, 2010) Các chồi bất định được cảm ứng từ các mẫu cấy lá trên môi trường MS có bổ sung 2,27 M TDZ; 2,22 M BA và 0,49 M IBA, các chồi này sẽ được nhân nhanh và phát triển sau khi chuyển sang môi trường

MS có bổ sung 4,44 M BA; 2,33 M kinetin; 1,43 M IAA và 0,72 M GA3 Các chồi phát triển tốt sẽ hình thành rễ trên môi trường MS có bổ sung 0,5 M IBA sau

30 ngày (Deore và cộng sự, 2008) Trong khi đó, Kumar và cộng sự (2010) đã nuôi

cấy lá của cây Cọc rào 2 năm tuổi trên môi trường MS có bổ sung TDZ, BAP và IBA riêng lẻ Số chồi hình thành cao nhất (9,7 chồi/mẫu) đã đạt được sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 3 M của BAP Các chồi hình thành rễ trên môi trường MS có bổ sung 1,5 M IBA với tỷ lệ 53,3% Ngoài ra, việc thêm

200 M phloroglucinol vào môi trường nuôi cấy giúp tăng cường tỷ lệ hình thành rễ lên 76,7% Cây con tái sinh được chuyển ra vườn ươm đã thích nghi với điều kiện

tự nhiên Quy trình này có thể được sử dụng trong sản xuất hàng loạt các cây con và sản xuất cây trồng chuyển gen

Meena và cộng sự (2008) cũng đã nghiên cứu về sự tái sinh in vitro của cây

Cọc rào Các mẫu cấy đốt thân đã hình thành mô sẹo (96%) khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 4 mg/l 2,4 D và 4 mg/l BA Trên môi trường MS có bổ sung

4 mg/l 2,4 D riêng lẻ cho tỷ lệ tăng sinh mô sẹo là 95% Bổ sung 300 mg/l than hoạt tính và 100 mg/l acid ascorbic giúp tăng tỷ lệ tăng sinh mô sẹo với trọng lượng tươi 9,96 ± 0,09 g Tuy nhiên, các mô sẹo có nguồn gốc từ đốt thân không có tế bào

có khả năng sinh phôi và do đó đã không tái sinh chồi và rễ Các đốt thân khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 5 mg/l BA có sự phát triển hình thành 2 – 3 chồi, nhưng những chồi này không có sự hình thành rễ Ngược lại, các mô nội nhũ khi được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung với 3 mg/l BA, 1 mg/l IBA cùng với

300 mg/l than hoạt tính và 100 mg/l acid ascorbic đã hình thành chồi và rễ sau 4 tuần nuôi cấy

Ảnh hưởng của các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy trong nhân giống cây Cọc rào cũng đã được nghiên cứu (Shrivastava và Banerjee, 2008) Sử dụng mẫu đốt cây của cây 3 tháng tuổi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 3 mg/l BA;

1 mg/l IBA; 25 mg/l adenine sulfate; 50 mg/l glutamine; 15 mg/l L arginine và 25 mg/l citric acid trong 3 tuần Trung bình, trong 1 chu kì 3 lần cấy chuyền, từ một mẫu ban đầu tạo ra 100 chồi tương ứng, do đó sẽ giúp tiết kiệm chi phí cho vật liệu

và thời gian Sự cảm ứng tạo rễ tốt nhất được nhận thấy khi nuôi cấy chồi trên môi trường 1/2 MS có bổ sung 3 mg/l IBA Những cây con có chồi và rễ phát triển tốt được chuyển sang túi polythene nhỏ có chứa hỗn hợp đất vườn, chất khoáng bón cây và cát (1:1:1) và sau đó được thích nghi dần dần với khí hậu tự nhiên

Nghiên cứu tái sinh chồi từ hạt cũng đã được thực hiện bởi Warakagoda và Subasinghe (2009) Hạt của cây Cọc rào (chưa trưởng thành, trưởng thành, hoàn toàn trưởng thành) sau khi được thu thập và khử trùng bề mặt sẽ được cấy vào môi trường MS, WPM và B5, có hoặc không có bổ sung 1 g/l than hoạt tính Hạt giống trưởng thành trong môi trường B5 cho thấy tỷ lệ nảy mầm sớm và tăng trưởng tốt nhất so với các hạt chưa trưởng thành và hoàn toàn trưởng thành trong môi trường B5, MS và WPM Các chồi được nảy mầm từ hạt sẽ được cấy vào môi trường B5 có chứa BA, kinetin, NAA ở các nồng độ kết hợp khác nhau Chồi được nhân nhanh và phát triển trên môi trường B5 có bổ sung 1 mg/l BA, 1 mg/l kinetin và 2 mg/l NAA đạt số lượng chồi cao nhất là 6,6 chồi/mẫu cấy Bổ sung than hoạt tính vào môi trường B5 không có ảnh hưởng đáng kể đến sự nảy mầm của hạt và sự tăng trưởng của cây con

Kaewpoo và Te chato (2009) đã báo cáo về ảnh hưởng của các loại mẫu cấy

và chất điều hòa sinh trưởng lên sự hình thành chồi Các loại mẫu cấy khác nhau (đoạn thân, chồi bên, chồi đỉnh) được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung với sự kết hợp các nồng độ khác nhau của BA và IBA Kết quả chứng minh rằng môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA và 0,25 mg/l IBA cho số chồi cao ở mẫu cấy chồi bên Chồi tái sinh được tạo rễ (60%) trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IBA sau

30 – 40 ngày nuôi cấy

Phương pháp phát sinh phôi từ tế bào soma (somatic embryogenesis) – một công cụ mạnh của ngành công nghệ sinh học để tạo giống cây trồng – đã được áp dụng thành công lần đầu tiên trên cây Cọc rào bởi Jha và cộng sự (2007) Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi được thu nhận bằng cách nuôi cấy mẫu lá trên môi trường

MS có bổ sung 2,0 mg/l kinetin Các khối mô sẹo này được chuyển sang môi trường

có bổ sung 0,5 mg/l kinetin và 0,25 mg/l IBA cho thấy tần suất mô sẹo phát sinh phôi hình cầu cao nhất Phôi được kích thích phát triển bằng cách bổ sung thêm adenine sulphate trong môi trường Các phôi soma trưởng thành sẽ tạo các cây con trên môi trường ½ MS Toàn bộ quá trình nhân giống kéo dài 12 – 16 tuần Quá trình phát sinh phôi soma ở cây Cọc rào có thể trở thành một hệ thống lý tưởng cho nghiên cứu chuyển gen trong tương lai

Nuôi cấy phôi soma đã được biết đến để tích lũy các chất dự trữ như chất béo, và có khả năng tiếp tục phát triển thành cây con, vì vậy phôi soma được nuôi cấy trên quy mô lớn bằng cách sử dụng bioreactor Ismidianty và Esyanti (2010) đã nghiên cứu xác định thành phần của các acid béo trong các phôi soma được nuôi cấy bằng bioreactor với mục đích là thu được phôi soma trưởng thành, tối ưu lưu lượng không khí để duy trì tăng trưởng, tạo ra thành phần acid béo thích hợp cho dầu diesel sinh học Các mẫu hypocotyl được nuôi cấy trên MS có bổ sung vitamin B5; 13,5 M 2,4 D; 4,4 M kinetin và 30 g/l sucrose để cảm ứng mô sẹo có khả năng sinh phôi Các mô sẹo bở sau bốn tuần tuổi được chuyển vào môi trường MS lỏng có bổ sung vitamin B5; 6,75 µM 2,4 D; 0,4 µM kinetin và 20 g/l sucrose để khởi đầu nuôi cấy tạo huyền phù các tế bào phôi soma Ban đầu, các mô sẹo tạo ra khối tiền phôi (PEM), chủ yếu là phôi hình cầu với một cấu trúc bề mặt tròn trơn nhỏ gọn Dịch huyền phù được nuôi cấy trong môi trường MS lỏng có bổ sung vitamin B5; 6 g/l K citrate monohydrate; 13,5 M 2,4 D; 0,4 µM kinetin, 20 g/l sucrose và nuôi cấy trong hai tuần Ở giai đoạn này, các cấu trúc hình cầu đã được hình thành nhiều hơn và phôi ở giai đoạn hình tim bắt đầu phát triển Tiếp tục nuôi cấy trong môi trường trưởng thành phôi là môi trường ½ MS, có bổ sung 10 mg/l acid ascorbic; 50 mg/l acid citric; 25 mg/l adenine sulphate; 100 mg/l glutamine; 0,5 ppm IAA; 0,3 ppm GA3 và 20 g/l sucrose Ở giai đoạn này, các phôi hình cầu và hình tim hình thành nhiều hơn Sau đó, các phôi được nuôi cấy trong bioreactor với các tỷ lệ trao đổi khí khác nhau là 0,1; 0,2 và 0,4 l/phút ở 16 giờ chiếu sáng trong 10 ngày Kết quả cho thấy rằng tốc độ dòng chảy không khí 0,2 l/phút cho tăng trưởng cao nhất (7,85 g) và tổng số lipid (63,6%) với hàm lượng acid béo chủ yếu là acid palmitic (53%), acid stearic (12%), acid oleic (33%) và acid linoleic (2%) Do đó cần tiếp tục tối ưu hóa cho việc cảm ứng acid béo với thành phần thích hợp để phát triển dầu diesel sinh học

Gần đây, Đỗ Vũ Tuyết Trinh (2009) đã nghiên cứu sự tạo mô sẹo có khả năng phát sinh chồi và rễ từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào mảnh lá cây Cọc rào trên môi trường WPM có bổ sung 0,1 mg/l IBA và 1,0 mg/l BA Môi trường WPM có bổ sung 1,0 mg/l BA thích hợp cho sự tái sinh chồi từ mô sẹo trong khi NAA ở nồng

Bùi Văn Thế Vinh và cộng sự (2011) đã nghiên cứu tái sinh chồi trực tiếp từ

mẫu cấy lá cây Cọc rào trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BA và 1 mg/l kinetin Các chồi này được cấy chuyền sang môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l

GA3 và 20% nước dừa để kéo dài chồi và ngăn hiện tượng rụng lá Các chồi phát triển tốt được chuyển sang môi trường cảm ứng ra rễ là môi trường MS½ có bổ sung 0,5 mg/l NAA Cây tái sinh sau 4 tháng được chuyển ra vườn ươm với tỷ lệ sống sót đạt trên 80% Đây là một quy trình hiệu quả để tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu cấy lá cây Cọc rào, quy trình này có thể được áp dụng trong các nghiên cứu chuyển gen nhằm nâng cao hàm lượng dầu trong hạt mà không qua giai đoạn tạo

mô sẹo

2.2 GIỚI THIỆU VỀ PHÔI VÔ TÍNH

2.2.1 Khái niệm về phôi vô tính

Ở thực vật bậc cao, quá trình thụ phấn trong sinh sản hữu tính sẽ hình thành phôi Tuy nhiên, quá trình thụ phấn không phải lúc nào cũng cần thiết để kích thích

tế bào trứng trải qua quá trình phát sinh phôi Bất kỳ tế bào của túi phôi, hoặc thậm chí là các mô xung quanh túi phôi có thể phát triển thành phôi Phôi cũng có thể hình thành từ các tế bào sinh dưỡng qua quá trình nuôi cấy mô, phôi này được gọi là phôi vô tính Phôi vô tính, phôi soma, phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ đều là cùng một khái niệm để mô tả một cấu trúc lưỡng cực bất đinh bao gồm cực chồi và cực

rễ, mà dưới những điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng hoàn chỉnh (Dương Tấn Nhựt, 2007)

Những quan sát in vivo cho thấy rằng sự phát triển của phôi đòi hỏi một môi

trường hóa lý đặc biệt chỉ có sẵn bên trong dịch của túi phôi Căn cứ vào sự phát triển nhanh chóng của nuôi cấy mô tế bào thực vật bậc cao trong những năm gần đây có thể nói rằng bất kỳ tế bào nếu được đặt trong một môi trường thích hợp, phát triển theo con đường phát sinh phôi và tạo thành cây hoàn chỉnh Về nguyên tắc thì những cây con được tái sinh bằng con đường này thì đều có vật chất di truyền giống hệt các tế bào sinh dưỡng của cha mẹ, nếu tế bào này được chuyển gen thì cây tái sinh là cây chuyển gen Nhân giống thực vật qua con đường phát sinh phôi vô tính cho hệ số nhân rất cao

Trong tự nhiên, phôi vô tính bất định không tuân theo trình tự phân chia giống như phôi hợp tử Ngay cả phôi hợp tử thường biểu hiện sai lệch mô hình phát triển bình thường (Borthwick, 1931) Phôi vô tính rất giống phôi hợp tử ở hình thái

và sinh lý, nhưng không có quá trình tái tổ hợp di truyền do phôi vô tính không phải

là sản phẩm của sự thụ phấn giữa giao tử đực và giao tử cái Phôi vô tính phát triển qua các giai đoạn tương tự như phôi hình thành từ hợp tử Đối với phôi của thực vật hai lá mầm thì sau giai đoạn tiền phôi sẽ là giai đoạn hình tim, hình cầu và giai đoạn

lá mầm Phôi của thực vật một lá mầm sẽ trải qua giai đoạn hình cầu, bao lá mầm và

lá mầm Sự hình thành phôi vô tính được coi là con đường phát triển riêng biệt, khác hẳn với con đường phát sinh cơ quan chồi và rễ Trong đó, một tế bào sẽ phát triển thành một cấu trúc có mô phân sinh chồi và rễ đầy đủ, và không có kết nối với

hệ thống mô mẹ ban đầu (Dương Tấn Nhựt, 2007)

Các nghiên cứu đầu tiên về sự phát sinh phôi vô tính in vitro đã được thực

hiện khi nuôi cấy tế bào Cà rốt (Reinert, 1958, 1959; Steward và cộng sự, 1958) Kể

từ đó, loài này đã được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu các khía cạnh khác nhau

trong phát sinh phôi vô tính in vitro (Terzi và cộng sự, 1985; Molle và cộng sự,

1993; Zimmerman, 1993) Một số loài thực vật khác cũng đã được nghiên cứu về

hình thành phôi vô tính là Citrus sp (Rangaswamy, 1961; Sabharwal, 1963; Rangan

và cộng sự, 1968; Kochba và Spiegel Roy, 1977b; Tisserat và Murashige, 1977;

Gavish và cộng sự, 1991, 1992), Coffea sp (Monaco và cộng sự, 1977; Sondahl và

cộng sự, 1979a, 1979b; Sharp và cộng sự, 1980; Nakamura và cộng sự, 1992),

Macleaya cordata (Kohlenbach, 1977), Medicago sp (Redenbaugh và Walker,

1990, McKersie và cộng sự, 1993.), Ranunculus sceleratus (Konar và Nataraja, 1969; Konar và cộng sự, 1972; Thomas và cộng sự, 1972), và Zea mays (Emons và

Kieft, 1991; Songstad và cộng sự, 1992; Emons, 1994)

2.2.2 Quá trình phát sinh phôi vô tính

2.2.2.1 Giả định về sự hình thành phôi vô tính

Phôi của thực vật không những chỉ được phát sinh từ tế bào trứng đã thụ phấn

mà nó còn có thể được tạo ra một cách tự nhiên hoặc nhân tạo từ nhiều loại tế bào khác nhau, bao gồm cả tế bào sinh dưỡng Tất cả các tế bào sinh dưỡng của thực vật

đều có chứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết cho sự hình thành nên một cơ thể thực vật hoàn chỉnh với đầy đủ các chức năng cần thiết Những tế bào có khả năng phát sinh phôi có đặc điểm là nhân nằm ở vị trí trung tâm, có những ống siêu nhỏ nổi bật ở gần nhân và những sợi nhỏ actin (Samaj và cộng sự, 2003) Ngoài ra, chúng còn có một thành tế bào có cấu trúc đặc biệt Các dạng tế bào này vừa có nguồn gốc từ các mô phân sinh (hoặc mô phát sinh phôi) vừa có thể được tạo ra từ những tế bào có khoảng không bào lớn trong một số điều kiện thích hợp

Phôi vô tính có thể được biệt hóa trực tiếp từ mẫu cấy không cần đi qua trung gian giai đoạn mô sẹo hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn tạo mô sẹo (callus) (Williams và Maheswaran, 1986) Evans và cộng sự (1981), Sharp và cộng sự (1982) là những người đầu tiên đưa ra một số thuật ngữ IEDC (induced embryogenic determined cell) nhằm mô tả những tế bào có khả năng sinh phôi xuất phát ban đầu là những tế bào không sinh phôi Những tế bào của phôi hợp tử đã có sẵn chương trình biểu hiện của các gen sinh phôi thì được gọi là PEDC (pre embryogenic determined cell) Cả IEDC và PEDC đều có chức năng tương tự nhau

là nhằm mục đích tái sinh Nếu mô cấy có các PEDC thì chỉ cần một sự kích thích phân chia tế bào là đủ để hình thành phôi, và quá trình này được gọi là sự hình thành phôi vô tính trực tiếp Ngược lại, nếu mô cấy là những tế bào đã phân hóa không còn khả năng sinh phôi thì chúng cần phải trải qua nhiều lần phân chia tế bào liên tiếp dưới sự cảm ứng của auxin trong suốt quá trình để được tái lập trình đi vào con đường phát sinh phôi Quá trình này được gọi là quá trình phát sinh phôi gián tiếp vì phải thông qua giai đoạn tạo mô sẹo Các mô sẹo có khả năng phát sinh phôi bao gồm các cụm tiền phôi (PEM proembryogenic mass) PEM là bước khởi đầu cho sự phát sinh phôi vô tính, theo sau đó là sự hình thành phôi vô tính, phôi trưởng thành, phôi ở giai đoạn miên trạng và cuối cùng là giai đoạn tái sinh cây

2.2.2.2 Bước đầu nuôi cấy cảm ứng tạo phôi vô tính

Trong suốt quá trình phát triển, sự biểu hiện gen ở thực vật được kiểm soát chặt chẽ theo không gian và thời gian để cho phép sự biệt hóa của rất nhiều cơ quan trong cơ thể Sự cảm ứng hình thành phôi vô tính phải làm kết thúc sự biểu hiện của một gen trong mô thực vật tại thời điểm đó và thay thế bằng chương trình biểu hiện

của gen sinh phôi (Evans và cộng sự, 1981; Sharp và cộng sự, 1982) Một cơ chế có thể làm ngừng biểu hiện gen là methyl hóa DNA, có thể tiến hành bằng auxin (LoSchiavo và cộng sự, 1989)

Một auxin, đặc biệt là 2,4 D, nói chung là cần thiết để cảm ứng phát sinh phôi trong thực vật như cỏ Linh lăng, Cà rốt và các loại ngũ cốc Tuy nhiên, yêu cầu của auxin ngoại sinh cho sự cảm ứng của phôi soma phụ thuộc vào bản chất của mẫu cấy được sử dụng Ví dụ, cuống lá (Ammirato, 1985), trụ dưới lá mầm (Kamada và Harada, 1979) và các tế bào đơn phân lập từ nuôi cấy huyền phù tế bào (Nomura và Komamine, 1985) của Cà rốt đòi hỏi 2,4 D trong môi trường nuôi cấy

để hình thành phôi Các mô sẹo nhỏ của cỏ Linh lăng cần có 2,4 D trong môi trường nuôi cấy với nồng độ tương đối cao (100 M) để sản xuất phôi (Dudits và cộng sự, 1991) Một hiện tượng quan trọng liên quan với sự cảm ứng phát sinh phôi soma là sự thay đổi phân cực tế bào

Một số quan sát đã hỗ trợ giả thuyết rằng chất điều hòa sinh trưởng thực vật

và các phương pháp xử lý khác được sử dụng để cảm ứng sự phát sinh phôi bằng cách làm thay đổi sự phân cực tế bào và thúc đẩy sự phân chia bất đối xứng của tế bào (de Jong và cộng sự, 1993) Trên môi trường có chứa cytokinin, phôi chưa trưởng thành của cỏ Ba lá phát triển thành phôi bất định trực tiếp từ lớp biểu bì trụ dưới lá mầm Ở Cà rốt, sự phân chia đầu tiên trong nuôi cấy huyền phù tế bào đơn

là không đối xứng (Komamine và cộng sự, 1990) và chỉ có các tế bào con nhỏ cuối cùng là phát triển thành phôi Các ảnh hưởng tích cực của pH (Smith và Krikorian, 1990b) và điện trường (Dijack và cộng sự, 1986) lên quá trình cảm ứng phôi xuất hiện là do tác dụng làm phân cực tế bào

Một khi tạo được các tế bào phôi, chúng tiếp tục tăng sinh, tạo thành cụm tiền phôi (PEM) Auxin rất cần cho việc tăng sinh PEM nhưng lại là chất ức chế PEM phát triển thành phôi vô tính (de Vries và cộng sự, 1988; Nomura và Komamine 1985; Filonova và cộng sự, 2000) Lượng auxin cần thiết cho mức độ biệt hóa phôi tùy thuộc ở từng loài thực vật Tuy nhiên auxin được hấp thu rất nhanh do đó chỉ sau vài ngày nuôi cấy là môi trường cạn kiệt auxin Nếu không

được thay môi trường mới mỗi tuần thì phôi vô tính sẽ khởi động ngay sự phát triển của nó

Sự chuyển tiếp từ PEM sang phôi có vai trò rất quan trọng, là kết nối giữa sự tăng sinh của PEM và sự phát triển có tổ chức của phôi Auxin tổng hợp, như 2,4 D, đặc biệt hiệu quả trong việc thúc đẩy sự thiết lập và tăng sinh nuôi cấy phôi hơn các loại auxin khác Do đó, để kích thích tăng trưởng của phôi vô tính cần phải chuyển chúng sang môi trường không có auxin Khi môi trường nuôi cấy thiếu auxin, các gen ngăn chặn phôi chuyển tiếp sang giai đoạn hình tim sẽ không biểu hiện được (Zimmerman, 1993)

2.2.2.3 Sự phát triển của phôi vô tính

Suốt giai đoạn trưởng thành, phôi vô tính trải qua các biến đổi về hình thái và sinh hóa Các bộ phận dự trữ như lá mầm, tăng trưởng mạnh mẽ cùng với việc tích lũy các vật chất dự trữ thì sự nảy mầm bị ức chế và phôi sẽ đi vào trạng thái miên trạng (Thomas, 1993)

Khi phôi Cà rốt được chuyển vào môi trường không có auxin, các tế bào ở mỗi đỉnh khác nhau phát triển thành phôi hình cầu Trong quá trình này, bước biệt hóa đầu tiên là sự hình thành của vỏ phân sinh ngon bên ngoài hạt nhỏ Các phôi hình cầu tiếp tục phát triển và hình thành phôi điển hình Trong cây Ngô, phôi giai đoạn hình cầu và phôi ở các giai đoạn sau đó phát triển trong sự có mặt của 2,4 D nhưng sự biệt hóa của vỏ phân sinh ngọn chỉ xảy ra sau khi chuyển sang môi trường không có 2,4 D (Emons, 1994) Sau khi vai trò của các auxin thay đổi trong việc cảm ứng phôi thì phôi bắt đầu tổng hợp auxin riêng cho mình (Michalczuk và cộng

sự, 1992a, 1992b) Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng sự vận chuyển auxin tích cực

là một điều kiện tiên quyết để tạo phôi bình thường sau giai đoạn hình cầu (Schiavone và Cooke, 1987; Liu và cộng sự, 1993b) Phôi được hình thành trên bề mặt của mô sẹo có phân cực bên trong bởi vì chúng được gắn vào các tế bào mô sẹo

ở một đầu Phần cực rễ của phôi luôn luôn hướng về phía trung tâm của mô sẹo Ở cây Ngô, việc gắn phôi vào mô sẹo là rất quan trọng Chỉ có như vậy phôi được gắn vào các mô sẹo cho đến khi có sự hình thành của đỉnh chồi thích hợp cho sự phát triển thành phôi hoàn chỉnh

Ở một vài loài, cần phải xử lý môi trường nuôi cấy phôi bằng ABA, thường ở nồng độ 10 50 μM để kích thích sự trưởng thành Một số trường hợp khác, ABA dùng để giảm quá trình phát sinh phôi thứ cấp hoặc ức chế sự nảy mầm sớm Tuy nhiên, tiếp xúc với ABA nhiều có thể ảnh hưởng xấu đến sự tăng trưởng thực vật sau này (Bozhkov và cộng sự, 1998) Nhiều nhân tố như ethylene, stress nước, pH

và quang kỳ cũng được cho là ảnh hưởng đến sự trưởng thành phôi của một số loài

2.2.2.4 Sự phát triển thành cây con từ phôi vô tính

Sự phát sinh phôi là một giai đoạn phức tạp trong đó sự sống sót và tăng trưởng của thực vật có nguồn gốc từ phôi phụ thuộc vào các điều kiện nuôi cấy trong các giai đoạn đầu Do vậy, để phát triển kỹ thuật nhân giống số lượng lớn

bằng phôi vô tính phải loại trừ các nhân tố có thể ảnh hưởng xấu đến biểu hiện ex vitro của thực vật

Chỉ có các phôi trưởng thành với hình thái bình thường có tích lũy đủ các vật chất dự trữ và vượt qua giai đoạn làm khô là phát triển thành cây bình thường được Các phôi vô tính thường phát triển thành các cây con nhỏ khi nuôi cấy trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng Tuy nhiên, có vài trường hợp auxin và cytokinin thúc đẩy sự nảy mầm Hơn nữa, cần có vài biến đổi trong môi trường cơ bản để thúc đẩy nảy mầm Ở vài loài phải thêm vào các hợp chất như glutamine và casein hydrolysate

Khi các cây con đạt đến kích thước phù hợp chúng sẽ được chuyển sang nuôi

cấy ex vitro Trong vài báo cáo cho thấy là thực vật từ phôi vô tính tăng tưởng

tương tự như các cây từ hạt bình thường Tuy nhiên, ở vài loài bị biến đổi gen trong quá trình nuôi cấy thì lại là vấn đề Nhìn chung, sử dụng 2,4 D và (hoặc) nuôi cấy giai đoạn callus dài sẽ làm thay đổi bộ gen hoặc kiểu hình của phôi

2.2.3 Sự ảnh hưởng của polyamine và acid amine trong nuôi cấy mô thực vật

2.2.3.1 Polyamine

Polyamine là những polycation phân tử nhỏ được tìm thấy trong tất cả các cơ quan sống Ở thực vật, chúng được mô tả trong một chuỗi các quá trình sinh học bao gồm sự sinh trưởng, phát triển và những phản ứng ở trạng thái stress không có

spermidine và spermine Hỗn hợp của chúng cũng cần thiết trong thực vật, phản ứng với những vi sinh vật cộng sinh quan trọng trong dinh dưỡng của thực vật Các polycation tự nhiên của polyamine tại pH sinh lý là một trong những bản chất chính làm trung gian cho hoạt động sinh học của chúng Thật ra, chúng cũng có thể gắn kết một vài phân tử âm như DNA, protein, màng phospholipide và protein, polysaccharide pectic Chúng cũng liên quan đến sự phosphoryl hóa protein, sự cải thiện sau quá trình phiên mã và sự vận chuyển thích hợp của DNA Có một dấu hiệu trực tiếp cho thấy chúng cũng cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển ở procaryote

và eucaryote (Slocum, 1991) và vai trò của chúng trong quá trình điều hòa sự sinh trưởng, phát triển thực vật đã được thu hút trong những thập kỷ vừa qua (Evans và Malmberg, 1989)

Trong những năm đầu tiên sau khi thăm dò polyamine trong tế bào thực vật, một điều đáng chú ý về khả năng của chúng chứa những hoạt động sinh trưởng cao

ở những giai đoạn phát triển Những tác động của polyamine ngoại sinh và nội sinh được nhận thấy rõ ở cấp độ thực vật tương đồng không làm ảnh hưởng đến tác động của phytohormone Điều đáng chú ý là nó tác động gián tiếp và trực tiếp giữa polyamine và các phytohormone cảm ứng phát triển Vì vậy, trong một vài thực vật, auxin, gibberellin và cytokinin kích thích sinh tổng hợp và gia tăng hàm lượng polyamine, ở đó polyamine ngoại sinh tác động đến các phytohormone nội sinh

Đối với Arabidopsis, nó cho thấy IAA cảm ứng gen ACL5 ghi mã tổng hợp

Spermine nhưng ABA hay acid gibberellic có thể không cảm ứng gen này Sự không hoạt động của gen này làm chậm trễ sự kéo dài thân và ức chế sự phân chia

tế bào

Theo như sự hoạt động sinh hóa của chúng, polyamine có thể phân chia thành 2 nhóm: Putrescine và catalase kích thích sự phân chia tế bào và hình thành rễ như những auxin và gibberellin, trong khi đó spermidine và spermine điều hòa sự phân chia tế bào, hình thành các cơ quan và nhiễm sắc thể như những cytokinin

Đó là sự thành lập chính xác, ở những nồng độ polyamine cao thường có mặt trong hoạt động của các mô sinh trưởng thực vật và trong giai đoạn sớm của sự phát

sinh phôi sinh dưỡng Trong nuôi cấy tế bào Cà rốt, nó được biến nạp với gen ODC

cDNA và nồng độ putrescine được gia tăng trong không bào Điều này cho phép

được đưa vào sử dụng như hoạt động của auxin ở giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi trong tế bào sinh dưỡng Cà rốt

Sự thay đổi trong trao đổi polyamine ở giai đoạn phát sinh phôi sinh dưỡng được nghiên cứu trong nhiều hệ thống khác nhau ở thực vật Vì vậy những nghiên cứu gần đây, sự phân tích toàn diện hàm lượng của polyamine, hoạt động của những enzyme tổng hợp nên chúng, sự biểu hiện của gen điều hòa phiên mã được biểu

diễn ở những giai đoạn khác nhau của sự phát sinh phôi sinh dưỡng ở Vitis vinifera: hình tim, hình cá đuối, phôi trưởng thành và tái sinh cây Hoạt động của ODC vượt quá ADC Sự biểu hiện của gen ODC và SAMDC có liên quan đến hoạt động của

những enzyme tương ứng với những cấp độ của putrescine và spermidine ở giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi Mối quan hệ không có mặt giữa hàm lượng polyamine tự do, hoạt động của enzyme để sinh tổng hợp và cấp độ biểu hiện gen ở giai đoạn sau của sự phát sinh phôi và tái sinh cây có thể mang lại kết quả từ việc cắt từ hệ thống điều hòa tế bào

Polyamine trong môi trường dinh dưỡng có hiệu quả kích thích sự hình thành

phôi vô tính (Minocha, 1995) Có một số bằng chứng cho thấy rằng polyamine cần

thiết cho sự phát triển của phôi in vivo và in vitro (Altman và cộng sự, 1990;

Mengoli và Bagni, 1992) Nagl (1990) quan sát thấy sự chuyển nhanh chóng của

putrescine qua cuống noãn của Phaseolus Phôi tâm của các giống Xoài đa phôi có

chứa polyamine, putrescine, spermidine và spermine cao hơn đáng kể so với các giống đơn phôi (Litz và Schaffer, 1987) Tăng mức độ polyamine nội sinh (Montague và cộng sự, 1978) và các enzyme sinh tổng hợp (Fienberg và cộng sự, 1984) đồng thời với sự cảm ứng của phôi soma trong Cà rốt và ngăn cản sự phát sinh phôi bằng việc ức chế sinh tổng hợp polyamine (Minocha và cộng sự, 1990; Altman và cộng sự, 1990)

Spermidine

Spermidine là một polycation phổ biến được tổng hợp từ putrescine và được xem như là một tiền chất của spermine Putrescine, spermidine và spermine đều là polyamine tham gia trong nhiều các phản ứng sinh học

Sự tổng hợp spermidine làm chất ức chế methylglyoxal bis guanylhydrazone (MGBG) và dicyclohexylammordum sulfate (DCHA) là 2 chất làm giảm quá trình tăng trưởng và hình thành phôi trong quá trình nuôi cấy cây Cà rốt hoang dại Hàm lượng polyamine trong tế bào cũng bị ảnh hưởng bởi các chất ức chế này, khi bổ sung vào môi trường DCHA làm giảm hàm lượng spermidine Tương tự, MGBG ức chế sự phát sinh cơ quan của chồi được nuôi cấy từ trụ dưới lá mầm của cây Dương Những kết quả này cho thấy rằng các polyamine, đặc biệt là spermidine đóng một vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng và phát triển của thực vật

Khi bổ sung putrescine vào môi trường nuôi cấy, hàm lượng spermidine nội bào tăng cao hơn cả lượng putrescine, điều này cho thấy spermidine có thể là nhân

tố chịu trách nhiệm phục hồi quá trình hình thành phôi Môi trường nuôi cấy có bổ sung spermidine vào thời điểm 0 đã dẫn đến việc hàm lượng spermidine tăng trong

tế bào

Quá trình làm giảm nồng độ spermidine khi xử lý với MGBG đã được chứng minh trong hạt lúa mạch nảy mầm Quá trình tăng trưởng và phát triển của cây rau Diếp xoăn cũng bị giảm khi bổ sung MGBG (Serafini Fracassini,1984) Nồng độ spermidine trong tế bào Cà rốt hoang dã cũng đã được bị ảnh hưởng bởi các chất ức chế, khi bổ sung spermidine vào môi trường làm tăng hàm lượng polyamine trong tế bào Cũng có điều đáng chú ý là hàm lượng putrescine trong tế bào cao khi được xử

lý bởi DCHA, nhưng dường như nó chỉ đóng vai trò như một “chất nền” cho sự sinh tổng hợp spermidine Chất ức chế này cũng làm giảm đáng kể sự phát triển và tạo phôi nuôi cấy cây Cà rốt hoang dại, điều này cho thấy spermidine đóng một vai trò quan trọng trong quá trình này Một nghiên cứu khác gần đây cũng chỉ ra rằng DCHA làm giảm nồng độ của polyamine và quá trình tạo phôi trong nuôi cấy Cà rốt (Sung và cộng sự, 2002) Quá trình tạo phôi đã được phục hồi trong môi trường có DCHA khi bổ sung spermidine vào môi trường nuôi cấy

Tầm quan trọng về mặt sinh lý học của spermidine trong thực vật đã được ghi nhận trong nghiên cứu về quá trình lão hóa của cây Yến mạch (Kaur Sawhney

và cộng sự, 1982) Vai trò của spermidine trong sự phát triển của thực vật cũng đã được chứng minh trong các dòng tế bào thuốc lá kháng MGBG, trong đó có nồng

độ của spermidine (Malmberg và McIndoo, 1983) Sự phát triển bất thường của hoa trong mẫu cấy này cũng đã được tìm thấy Các nghiên cứu trước đó cho thấy spermidine riêng lẻ có thể khôi phục lại quá trình tạo phôi trong môi trường có bổ sung DFMA và sau khi bổ sung putrescine vào môi trường (ở nồng độ có thể phục hồi quá trình tạo phôi) nồng độ spermidine sẽ tiến gần đến nồng độ thích hợp tạo phôi hơn nồng độ putrescine (Feirer và cộng sự, 1984)

2.2.3.2 Acid amine

Các nitơ hữu cơ bao gồm các acid amine và các amit được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi Glutamine và asparagine có tác dụng kích thích phát triển phôi

Datura và nhiều loài thực vật khác, nhưng glutamine có hiệu quả rõ rệt hơn Những

hỗn hợp hữu cơ không xác định như casein (CH), nước dừa cũng có ảnh hưởng tốt đối với sự hình thành phôi, do chúng chứa nhiều thành phần khoáng, các acid amine,… Sự phát sinh phôi đã xảy ra trong nuôi cấy tế bào trần trụ dưới lá mầm cây

Brassica naplus và Brassica nigra Các mô sẹo hình thành từ trụ dưới lá mầm sau

hai tuần nuôi trên môi trường MS có bổ sung 2,4 D và 10% CW được chuyển sang môi trường không chứa chất kích thích sinh trưởng đã hình thành phôi Theo Chatteerjee và cộng sự (1985), Kranz (1988), phát sinh phôi vô tính trực tiếp và tái

sinh cây con có thể xảy ra trong nuôi cấy tế bào trần Brassica juncea và B naplus

Proline riêng rẽ hay kết hợp với các acid amine khác được biết là có tác dụng kích thích sự phát sinh phôi vô tính ở thực vật Proline kết hợp với serine kích thích

sự phát sinh phôi vô tính ở những cây cỏ non (Trigianno và Conger, 1987) Proline

riêng rẽ kích thích sự phát sinh phôi vô tính in vitro ở cây Cà rốt (Nuti Ronchi và

cộng sự, 1984) Proline và glutamine kích thích sự cảm ứng tạo mô sẹo ở các loại

thân thảo Agrostis alba (Shetty và Asano, 1991) Ngoài ra những chất tương tự

proline, thioproline được sử dụng để bảo vệ các dòng tế bào phát sinh phôi từ những

hạt riêng lẻ không đồng nhất về mặt di truyền của Agrostis Alba (Shetty và Asano,

1991) Proline cũng được sử dụng để kích thích cytokinin cảm ứng sự phát sinh

chồi in vitro ở Dưa gang và Dưa leo, auxin cảm ứng phát sinh phôi vô tính ở cỏ

Linh lăng (Shetty và McKersie, 1993) Proline, những chất tương tự proline và những tiền chất của proline, ornithine được sử dụng có hiệu quả trong việc kích

thích cytokinine cảm ứng sự phát sinh chồi ở Dưa gang Quá trình phát sinh chồi

in vitro cũng được kích thích khi sử dụng dịch thuỷ phân protein của cá giàu acid

glutamic và proline kết hợp với các hợp chất tương tự proline Điều này chứng minh rằng trong các nghiên cứu về sự nhân chồi ở Dưa gang có liên quan đến việc tăng hàm lượng proline trong các mô đã biệt hoá

Sinh tổng hợp proline là một đáp ứng stress phổ biến ở thực vât, đặc biệt là những stress nước ngọt và nước mặn (Taylor, 1996) Acid amine này tích luỹ trong những thực vật ưa mặn, dưới những stress nước, phấn hoa khô, nuôi cấy tế bào thực vật dưới dạng stress nước, stress muối, khi thực vật già, trong những đáp ứng với abscisic acid, với những chất tương tự proline, sự khử nước Proline được đề nghị

có tác dụng bảo vệ màng tế bào và các protein khi gặp các stress khác nhau được đề cập ở trên Proline cũng có thể hoạt động như một chất chống oxy hoá thông qua hoạt động thấm lọc ở rễ

Ngoài khả năng chống chịu với stress thì proline cũng có vai trò khác trong

cơ thể thực vật Sinh tổng hợp proline được thúc đẩy khi thực vật trở nên già Ngoài

ra, nó cũng được cho là có liên quan đến việc chuyển đổi năng lượng và điều khiển sinh tổng hợp purine trong nốt rễ cố định đạm ở cây Đậu tương Nó gắn liền với sự phát triển gắn liền với sự hình thành rễ trong điều kiện khô hạn và những đáp ứng sinh nhiệt trong phát hoa ở Voodoo Lily (Skubatz và công sự, 1989) Nó cũng gắn liền với các điều kiện phát triển bình thường Tỷ lệ về hàm lượng proline tự do và liên kết cao trong quá trình phát triển sớm ở cây Đậu, sau đó giảm xuống ở giai đoạn sau thành thục (Venkamp và Koot, 1984) Hàm lượng proline cao không phải

do kết quả của stress nước Điều này có thể do proline tự do có một chức năng đặc trưng trong quá trình phát triển sớm (Venkamp và Koot, 1984) Những nghiên cứu trước đây ở cây Đậu tương (Singh và Gupta, 1983) đã chỉ ra rằng sự tích luỹ proline không gắn liền với stress nước Một chức năng của proline trong sự ra hoa cũng được đề nghị

Một vai trò khác của proline trong những đáp ứng stress cảm ứng sự tổng hợp phenol cũng được đề nghị (Shetty, 1997) Những khái niệm này dựa vào vai trò của proline và pyproline 5 carboxylase (P5C) trong việc điều khiển quá trình oxy

hoá khử và ion hydro gián tiếp kích thích con đường pentose phophate, mà nó lần lượt điều khiển quá trình đồng hoá proline trong tế bào động vật Trong mô hình này, sự kích thích sinh tổng hợp proline điều khiển tỷ lệ NADP+/NADPH2 và đường phosphate (mà nó cần thiết cho quá trình đồng hoá purine) thông qua sự kích thích NADPH2 được tạo ra từng bước trong con đường pentose phosphate Ngoài ra, nó

đề nghị rằng quá trình dị hoá của proline xảy ra nhanh khi những đáp ứng stress được phục hồi, có thể tạo ra các đương lượng oxy hoá khử trong phosphoryl hoá oxy hoá ở ty thể, cho nên nó là một quá trình khác để tổng hợp nên ATP (Shetty, 1997)