Phương pháp nhân giống hiện đại

2.1. Giới thiệu cây Cọc rào

2.1.6.2. Phương pháp nhân giống hiện đại

Các phương pháp nhân giống hiện đại có ưu điểm lớn là có khả năng tạo giống cây với số lượng lớn trong khoảng thời gian ngắn với chất lượng cao và đồng nhất. Tuy nhiên những nghiên cứu này còn ít hoặc chưa được công bố.

Sujatha và Mukta (1996) đã phát triển kỹ thuật tái sinh cây Cọc rào từ nhiều bộ phận khác nhau của cây như phần trụ dưới lá mầm, cuống lá và lá. Sự tạo thành chồi non bất định được chứng minh là hiệu quả nhất ở môi trường MS bổ sung 2,22 M BA và 4,9 M IBA. Sau đó mô sẹo được tái sinh gián tiếp trên môi trường MS bổ sung 0,44 M BA và 0,49 M IBA. Chồi non hình thành được nuôi và tạo rễ trong môi trường MS không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng cho đến khi phát triển thành cây hoàn chỉnh để đưa ra vườn ươm.

Sự tái sinh cây con từ các mẫu cấy epicotyl (trụ trên lá mầm) của cây Cọc rào cũng đã được nghiên cứu thành công (Wei và cộng sự, 2004). Các mẫu epicotyl in vitro được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung IBA và BA. Các chồi bất định được hình thành trực tiếp trên bề mặt của mẫu cấy epicotyl trong điều kiện kết hợp của 0,1 mg/l IBA và 0,5 mg/l BA với tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất. Trong khi đó, sự tái sinh chồi gián tiếp thông qua mô sẹo cần phải có sự kết hợp 1,0 mg/l IBA và 0,5 mg/l BA. Chồi tái sinh có thể hình thành rễ trên môi trường MS không có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng.

Sujatha và cộng sự (2005) đã thành công trong nhân giống in vitro cây Cọc rào bằng phương pháp tạo cụm chồi. Nghiên cứu đã tạo chồi non bằng cách nuôi nách lá cây Cọc rào trên môi trường MS bổ sung TDZ nồng độ 2,3 – 4,5 M sau đó chuyển sang môi trường MS bổ sung IBA và BA. Hiệu quả tạo chồi cao 10 – 12,3 chồi/mẫu cấy. Việc tạo chồi bất định từ lá thu được bằng cách nuôi mẫu lá trên môi trường bổ sung 8,9 – 44,4 M BA và 4,9 M IBA để tạo thành mô sẹo có màu trắng

13

xanh, các chồi bất định sẽ được tạo thành sau khoảng 3 tuần và tiếp tục cấy chuyền sang môi trường bổ sung 8,9 M BA và 2,5 M IBA.

Sự cảm ứng tạo đa chồi của cây Cọc rào từ các chồi nách (khoảng 0,7 cm) cũng đã được nghiên cứu bởi Thepsamran và cộng sự (2006). Các chồi được hình thành trên môi trường MS có bổ sung BA và IBA ở các nồng độ đơn lẻ hoặc kết hợp. Trờn mụi trường MS cú bổ sung 2,22 àM BA và 0,049 àM IBA cho sự tỏi sinh chồi tốt nhất, trung bình khoảng 5,9 chồi/chồi nách sau 6 tuần nuôi cấy. Chồi tái sinh bắt đầu hỡnh thành rễ trờn mụi trường MS cú bổ sung 2,46 àM IBA sau 5 tuần.

Cây Cọc rào đã được tạo dòng in vitro từ các mẫy cấy đốt thân (Datta và cộng sự, 2007; Kalimuthu và cộng sự, 2007; Singh và cộng sự, 2010). Các chồi được tái sinh từ đốt thân trên môi trường có bổ sung auxin và cytokinin riêng lẻ hoặc kết hợp. Các chồi được cấy chuyền sang môi trường khác để nhân nhanh số lượng chồi (Datta và cộng sự, 2007) hoặc cấy sang môi trường chỉ có auxin để hình thành rễ. Cây con sau khi chuyển ra vườn ươm thì cho tỷ lệ sống sót cao (trên 80%).

Nuôi cấy tạo mô sẹo và huyền phù tế bào cây Cọc rào cũng đã được thực hiện bởi Soomro và Memon (2007). Mẫu lá và hypocotyl được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng: 2,4 D; BA; GA3 và nước dừa.

Các mô sẹo được hình thành trên môi trường có bổ sung 0,5 mg/l 2,4 D và 2%

(v/v) nước dừa. Mô sẹo màu xanh, xốp được sử dụng để nuôi cấy huyền phù. Sự gia tăng tối đa của nuôi cấy huyền phù đạt được trong môi trường bổ sung 0,5 mg/l 2,4 D với mật độ tế bào ban đầu khoảng 1%. Tổng chlorophyll có trong tế bào nuôi cấy thay đổi trong khoảng 50,7 – 75,7 ug/g FW suốt chu kỳ phát triển.

Một quy trình tái sinh đơn giản, cho hiệu quả cao để cảm ứng chồi bất định và tái sinh cây con từ mẫu cấy lá của cây của Cọc rào đã được báo cáo (Deore và cộng sự, 2008; Kumar và cộng sự, 2010). Các chồi bất định được cảm ứng từ các mẫu cấy lá trên môi trường MS có bổ sung 2,27 M TDZ; 2,22 M BA và 0,49 M IBA, các chồi này sẽ được nhân nhanh và phát triển sau khi chuyển sang môi trường MS có bổ sung 4,44 M BA; 2,33 M kinetin; 1,43 M IAA và 0,72 M GA3. Các chồi phát triển tốt sẽ hình thành rễ trên môi trường MS có bổ sung 0,5 M IBA sau 30 ngày (Deore và cộng sự, 2008). Trong khi đó, Kumar và cộng sự (2010) đã nuôi

14

cấy lá của cây Cọc rào 2 năm tuổi trên môi trường MS có bổ sung TDZ, BAP và IBA riêng lẻ. Số chồi hình thành cao nhất (9,7 chồi/mẫu) đã đạt được sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 3 M của BAP. Các chồi hình thành rễ trên môi trường MS có bổ sung 1,5 M IBA với tỷ lệ 53,3%. Ngoài ra, việc thêm 200 M phloroglucinol vào môi trường nuôi cấy giúp tăng cường tỷ lệ hình thành rễ lên 76,7%. Cây con tái sinh được chuyển ra vườn ươm đã thích nghi với điều kiện tự nhiên. Quy trình này có thể được sử dụng trong sản xuất hàng loạt các cây con và sản xuất cây trồng chuyển gen.

Meena và cộng sự (2008) cũng đã nghiên cứu về sự tái sinh in vitro của cây Cọc rào. Các mẫu cấy đốt thân đã hình thành mô sẹo (96%) khi nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung 4 mg/l 2,4 D và 4 mg/l BA. Trên môi trường MS có bổ sung 4 mg/l 2,4 D riêng lẻ cho tỷ lệ tăng sinh mô sẹo là 95%. Bổ sung 300 mg/l than hoạt tính và 100 mg/l acid ascorbic giúp tăng tỷ lệ tăng sinh mô sẹo với trọng lượng tươi 9,96 ± 0,09 g. Tuy nhiên, các mô sẹo có nguồn gốc từ đốt thân không có tế bào có khả năng sinh phôi và do đó đã không tái sinh chồi và rễ. Các đốt thân khi nuôi cấy trên môi trường có bổ sung 5 mg/l BA có sự phát triển hình thành 2 – 3 chồi, nhưng những chồi này không có sự hình thành rễ. Ngược lại, các mô nội nhũ khi được nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung với 3 mg/l BA, 1 mg/l IBA cùng với 300 mg/l than hoạt tính và 100 mg/l acid ascorbic đã hình thành chồi và rễ sau 4 tuần nuôi cấy.

Ảnh hưởng của các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy trong nhân giống cây Cọc rào cũng đã được nghiên cứu (Shrivastava và Banerjee, 2008). Sử dụng mẫu đốt cây của cây 3 tháng tuổi nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 3 mg/l BA;

1 mg/l IBA; 25 mg/l adenine sulfate; 50 mg/l glutamine; 15 mg/l L arginine và 25 mg/l citric acid trong 3 tuần. Trung bình, trong 1 chu kì 3 lần cấy chuyền, từ một mẫu ban đầu tạo ra 100 chồi tương ứng, do đó sẽ giúp tiết kiệm chi phí cho vật liệu và thời gian. Sự cảm ứng tạo rễ tốt nhất được nhận thấy khi nuôi cấy chồi trên môi trường 1/2 MS có bổ sung 3 mg/l IBA. Những cây con có chồi và rễ phát triển tốt được chuyển sang túi polythene nhỏ có chứa hỗn hợp đất vườn, chất khoáng bón cây và cát (1:1:1) và sau đó được thích nghi dần dần với khí hậu tự nhiên.

15

Nghiên cứu tái sinh chồi từ hạt cũng đã được thực hiện bởi Warakagoda và Subasinghe (2009). Hạt của cây Cọc rào (chưa trưởng thành, trưởng thành, hoàn toàn trưởng thành) sau khi được thu thập và khử trùng bề mặt sẽ được cấy vào môi trường MS, WPM và B5, có hoặc không có bổ sung 1 g/l than hoạt tính. Hạt giống trưởng thành trong môi trường B5 cho thấy tỷ lệ nảy mầm sớm và tăng trưởng tốt nhất so với các hạt chưa trưởng thành và hoàn toàn trưởng thành trong môi trường B5, MS và WPM. Các chồi được nảy mầm từ hạt sẽ được cấy vào môi trường B5 có chứa BA, kinetin, NAA ở các nồng độ kết hợp khác nhau. Chồi được nhân nhanh và phát triển trên môi trường B5 có bổ sung 1 mg/l BA, 1 mg/l kinetin và 2 mg/l NAA đạt số lượng chồi cao nhất là 6,6 chồi/mẫu cấy. Bổ sung than hoạt tính vào môi trường B5 không có ảnh hưởng đáng kể đến sự nảy mầm của hạt và sự tăng trưởng của cây con.

Kaewpoo và Te chato (2009) đã báo cáo về ảnh hưởng của các loại mẫu cấy và chất điều hòa sinh trưởng lên sự hình thành chồi. Các loại mẫu cấy khác nhau (đoạn thân, chồi bên, chồi đỉnh) được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung với sự kết hợp các nồng độ khác nhau của BA và IBA. Kết quả chứng minh rằng môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA và 0,25 mg/l IBA cho số chồi cao ở mẫu cấy chồi bên. Chồi tái sinh được tạo rễ (60%) trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IBA sau 30 – 40 ngày nuôi cấy.

Phương pháp phát sinh phôi từ tế bào soma (somatic embryogenesis) – một công cụ mạnh của ngành công nghệ sinh học để tạo giống cây trồng – đã được áp dụng thành công lần đầu tiên trên cây Cọc rào bởi Jha và cộng sự (2007). Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi được thu nhận bằng cách nuôi cấy mẫu lá trên môi trường MS có bổ sung 2,0 mg/l kinetin. Các khối mô sẹo này được chuyển sang môi trường có bổ sung 0,5 mg/l kinetin và 0,25 mg/l IBA cho thấy tần suất mô sẹo phát sinh phôi hình cầu cao nhất. Phôi được kích thích phát triển bằng cách bổ sung thêm adenine sulphate trong môi trường. Các phôi soma trưởng thành sẽ tạo các cây con trờn mụi trường ẵ MS. Toàn bộ quỏ trỡnh nhõn giống kộo dài 12 – 16 tuần. Quỏ trình phát sinh phôi soma ở cây Cọc rào có thể trở thành một hệ thống lý tưởng cho nghiên cứu chuyển gen trong tương lai.

16

Nuôi cấy phôi soma đã được biết đến để tích lũy các chất dự trữ như chất béo, và có khả năng tiếp tục phát triển thành cây con, vì vậy phôi soma được nuôi cấy trên quy mô lớn bằng cách sử dụng bioreactor. Ismidianty và Esyanti (2010) đã nghiên cứu xác định thành phần của các acid béo trong các phôi soma được nuôi cấy bằng bioreactor với mục đích là thu được phôi soma trưởng thành, tối ưu lưu lượng không khí để duy trì tăng trưởng, tạo ra thành phần acid béo thích hợp cho dầu diesel sinh học. Các mẫu hypocotyl được nuôi cấy trên MS có bổ sung vitamin B5; 13,5 M 2,4 D; 4,4 M kinetin và 30 g/l sucrose để cảm ứng mô sẹo có khả năng sinh phôi. Các mô sẹo bở sau bốn tuần tuổi được chuyển vào môi trường MS lỏng cú bổ sung vitamin B5; 6,75 àM 2,4 D; 0,4 àM kinetin và 20 g/l sucrose để khởi đầu nuôi cấy tạo huyền phù các tế bào phôi soma. Ban đầu, các mô sẹo tạo ra khối tiền phôi (PEM), chủ yếu là phôi hình cầu với một cấu trúc bề mặt tròn trơn nhỏ gọn. Dịch huyền phù được nuôi cấy trong môi trường MS lỏng có bổ sung vitamin B5; 6 g/l K citrate monohydrate; 13,5 M 2,4 D; 0,4 àM kinetin, 20 g/l sucrose và nuôi cấy trong hai tuần. Ở giai đoạn này, các cấu trúc hình cầu đã được hình thành nhiều hơn và phôi ở giai đoạn hình tim bắt đầu phát triển. Tiếp tục nuôi cấy trong mụi trường trưởng thành phụi là mụi trường ẵ MS, cú bổ sung 10 mg/l acid ascorbic; 50 mg/l acid citric; 25 mg/l adenine sulphate; 100 mg/l glutamine; 0,5 ppm IAA; 0,3 ppm GA3 và 20 g/l sucrose. Ở giai đoạn này, các phôi hình cầu và hình tim hình thành nhiều hơn. Sau đó, các phôi được nuôi cấy trong bioreactor với các tỷ lệ trao đổi khí khác nhau là 0,1; 0,2 và 0,4 l/phút ở 16 giờ chiếu sáng trong 10 ngày. Kết quả cho thấy rằng tốc độ dòng chảy không khí 0,2 l/phút cho tăng trưởng cao nhất (7,85 g) và tổng số lipid (63,6%) với hàm lượng acid béo chủ yếu là acid palmitic (53%), acid stearic (12%), acid oleic (33%) và acid linoleic (2%). Do đó cần tiếp tục tối ưu hóa cho việc cảm ứng acid béo với thành phần thích hợp để phát triển dầu diesel sinh học.

Gần đây, Đỗ Vũ Tuyết Trinh (2009) đã nghiên cứu sự tạo mô sẹo có khả năng phát sinh chồi và rễ từ nuôi cấy lớp mỏng tế bào mảnh lá cây Cọc rào trên môi trường WPM có bổ sung 0,1 mg/l IBA và 1,0 mg/l BA. Môi trường WPM có bổ sung 1,0 mg/l BA thích hợp cho sự tái sinh chồi từ mô sẹo trong khi NAA ở nồng độ 1,0 mg/l có khả năng kích thích sự tạo rễ từ mô sẹo rất tốt.

17

Bùi Văn Thế Vinh và cộng sự (2011) đã nghiên cứu tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu cấy lá cây Cọc rào trên môi trường MS có bổ sung 1 mg/l BA và 1 mg/l kinetin. Các chồi này được cấy chuyền sang môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l GA3 và 20% nước dừa để kéo dài chồi và ngăn hiện tượng rụng lá. Các chồi phát triển tốt được chuyển sang mụi trường cảm ứng ra rễ là mụi trường MSẵ cú bổ sung 0,5 mg/l NAA. Cây tái sinh sau 4 tháng được chuyển ra vườn ươm với tỷ lệ sống sót đạt trên 80%. Đây là một quy trình hiệu quả để tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu cấy lá cây Cọc rào, quy trình này có thể được áp dụng trong các nghiên cứu chuyển gen nhằm nâng cao hàm lượng dầu trong hạt mà không qua giai đoạn tạo mô sẹo.