Sự phát triển thành cây con từ phôi vô tính

2.2. Giới thiệu về phôi vô tính

2.2.2. Quá trình phát sinh phôi vô tính

2.2.2.4. Sự phát triển thành cây con từ phôi vô tính

Sự phát sinh phôi là một giai đoạn phức tạp trong đó sự sống sót và tăng trưởng của thực vật có nguồn gốc từ phôi phụ thuộc vào các điều kiện nuôi cấy trong các giai đoạn đầu. Do vậy, để phát triển kỹ thuật nhân giống số lượng lớn bằng phôi vô tính phải loại trừ các nhân tố có thể ảnh hưởng xấu đến biểu hiện ex vitro của thực vật.

Chỉ có các phôi trưởng thành với hình thái bình thường có tích lũy đủ các vật chất dự trữ và vượt qua giai đoạn làm khô là phát triển thành cây bình thường được.

Các phôi vô tính thường phát triển thành các cây con nhỏ khi nuôi cấy trên môi trường không có chất điều hòa sinh trưởng. Tuy nhiên, có vài trường hợp auxin và cytokinin thúc đẩy sự nảy mầm. Hơn nữa, cần có vài biến đổi trong môi trường cơ bản để thúc đẩy nảy mầm. Ở vài loài phải thêm vào các hợp chất như glutamine và casein hydrolysate.

Khi các cây con đạt đến kích thước phù hợp chúng sẽ được chuyển sang nuôi cấy ex vitro. Trong vài báo cáo cho thấy là thực vật từ phôi vô tính tăng tưởng tương tự như các cây từ hạt bình thường. Tuy nhiên, ở vài loài bị biến đổi gen trong quá trình nuôi cấy thì lại là vấn đề. Nhìn chung, sử dụng 2,4 D và (hoặc) nuôi cấy giai đoạn callus dài sẽ làm thay đổi bộ gen hoặc kiểu hình của phôi.

2.2.3. Sự ảnh hưởng của polyamine và acid amine trong nuôi cấy mô thực vật 2.2.3.1. Polyamine

Polyamine là những polycation phân tử nhỏ được tìm thấy trong tất cả các cơ quan sống. Ở thực vật, chúng được mô tả trong một chuỗi các quá trình sinh học bao gồm sự sinh trưởng, phát triển và những phản ứng ở trạng thái stress không có sự sống (Flores và cộng sự, 1989). Những dạng chính của polyamine là putrescine,

23

spermidine và spermine. Hỗn hợp của chúng cũng cần thiết trong thực vật, phản ứng với những vi sinh vật cộng sinh quan trọng trong dinh dưỡng của thực vật. Các polycation tự nhiên của polyamine tại pH sinh lý là một trong những bản chất chính làm trung gian cho hoạt động sinh học của chúng. Thật ra, chúng cũng có thể gắn kết một vài phân tử âm như DNA, protein, màng phospholipide và protein, polysaccharide pectic. Chúng cũng liên quan đến sự phosphoryl hóa protein, sự cải thiện sau quá trình phiên mã và sự vận chuyển thích hợp của DNA. Có một dấu hiệu trực tiếp cho thấy chúng cũng cần thiết cho sự sinh trưởng, phát triển ở procaryote và eucaryote (Slocum, 1991) và vai trò của chúng trong quá trình điều hòa sự sinh trưởng, phát triển thực vật đã được thu hút trong những thập kỷ vừa qua (Evans và Malmberg, 1989).

Trong những năm đầu tiên sau khi thăm dò polyamine trong tế bào thực vật, một điều đáng chú ý về khả năng của chúng chứa những hoạt động sinh trưởng cao ở những giai đoạn phát triển. Những tác động của polyamine ngoại sinh và nội sinh được nhận thấy rõ ở cấp độ thực vật tương đồng không làm ảnh hưởng đến tác động của phytohormone. Điều đáng chú ý là nó tác động gián tiếp và trực tiếp giữa polyamine và các phytohormone cảm ứng phát triển. Vì vậy, trong một vài thực vật, auxin, gibberellin và cytokinin kích thích sinh tổng hợp và gia tăng hàm lượng polyamine, ở đó polyamine ngoại sinh tác động đến các phytohormone nội sinh.

Đối với Arabidopsis, nó cho thấy IAA cảm ứng gen ACL5 ghi mã tổng hợp Spermine nhưng ABA hay acid gibberellic có thể không cảm ứng gen này. Sự không hoạt động của gen này làm chậm trễ sự kéo dài thân và ức chế sự phân chia tế bào.

Theo như sự hoạt động sinh hóa của chúng, polyamine có thể phân chia thành 2 nhóm: Putrescine và catalase kích thích sự phân chia tế bào và hình thành rễ như những auxin và gibberellin, trong khi đó spermidine và spermine điều hòa sự phân chia tế bào, hình thành các cơ quan và nhiễm sắc thể như những cytokinin.

Đó là sự thành lập chính xác, ở những nồng độ polyamine cao thường có mặt trong hoạt động của các mô sinh trưởng thực vật và trong giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi sinh dưỡng. Trong nuôi cấy tế bào Cà rốt, nó được biến nạp với gen ODC cDNA và nồng độ putrescine được gia tăng trong không bào. Điều này cho phép

24

được đưa vào sử dụng như hoạt động của auxin ở giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi trong tế bào sinh dưỡng Cà rốt.

Sự thay đổi trong trao đổi polyamine ở giai đoạn phát sinh phôi sinh dưỡng được nghiên cứu trong nhiều hệ thống khác nhau ở thực vật. Vì vậy những nghiên cứu gần đây, sự phân tích toàn diện hàm lượng của polyamine, hoạt động của những enzyme tổng hợp nên chúng, sự biểu hiện của gen điều hòa phiên mã được biểu diễn ở những giai đoạn khác nhau của sự phát sinh phôi sinh dưỡng ở Vitis vinifera:

hình tim, hình cá đuối, phôi trưởng thành và tái sinh cây. Hoạt động của ODC vượt quá ADC. Sự biểu hiện của gen ODC và SAMDC có liên quan đến hoạt động của những enzyme tương ứng với những cấp độ của putrescine và spermidine ở giai đoạn sớm của sự phát sinh phôi. Mối quan hệ không có mặt giữa hàm lượng polyamine tự do, hoạt động của enzyme để sinh tổng hợp và cấp độ biểu hiện gen ở giai đoạn sau của sự phát sinh phôi và tái sinh cây có thể mang lại kết quả từ việc cắt từ hệ thống điều hòa tế bào.

Polyamine trong môi trường dinh dưỡng có hiệu quả kích thích sự hình thành phôi vô tính (Minocha, 1995). Có một số bằng chứng cho thấy rằng polyamine cần thiết cho sự phát triển của phôi in vivo và in vitro (Altman và cộng sự, 1990;

Mengoli và Bagni, 1992). Nagl (1990) quan sát thấy sự chuyển nhanh chóng của putrescine qua cuống noãn của Phaseolus. Phôi tâm của các giống Xoài đa phôi có chứa polyamine, putrescine, spermidine và spermine cao hơn đáng kể so với các giống đơn phôi (Litz và Schaffer, 1987). Tăng mức độ polyamine nội sinh (Montague và cộng sự, 1978) và các enzyme sinh tổng hợp (Fienberg và cộng sự, 1984) đồng thời với sự cảm ứng của phôi soma trong Cà rốt và ngăn cản sự phát sinh phôi bằng việc ức chế sinh tổng hợp polyamine (Minocha và cộng sự, 1990;

Altman và cộng sự, 1990).

Spermidine

Spermidine là một polycation phổ biến được tổng hợp từ putrescine và được xem như là một tiền chất của spermine. Putrescine, spermidine và spermine đều là polyamine tham gia trong nhiều các phản ứng sinh học.

25

Sự tổng hợp spermidine làm chất ức chế methylglyoxal bis guanylhydrazone (MGBG) và dicyclohexylammordum sulfate (DCHA) là 2 chất làm giảm quá trình tăng trưởng và hình thành phôi trong quá trình nuôi cấy cây Cà rốt hoang dại. Hàm lượng polyamine trong tế bào cũng bị ảnh hưởng bởi các chất ức chế này, khi bổ sung vào môi trường DCHA làm giảm hàm lượng spermidine. Tương tự, MGBG ức chế sự phát sinh cơ quan của chồi được nuôi cấy từ trụ dưới lá mầm của cây Dương.

Những kết quả này cho thấy rằng các polyamine, đặc biệt là spermidine đóng một vai trò quan trọng trong sự tăng trưởng và phát triển của thực vật.

Khi bổ sung putrescine vào môi trường nuôi cấy, hàm lượng spermidine nội bào tăng cao hơn cả lượng putrescine, điều này cho thấy spermidine có thể là nhân tố chịu trách nhiệm phục hồi quá trình hình thành phôi. Môi trường nuôi cấy có bổ sung spermidine vào thời điểm 0 đã dẫn đến việc hàm lượng spermidine tăng trong tế bào.

Quá trình làm giảm nồng độ spermidine khi xử lý với MGBG đã được chứng minh trong hạt lúa mạch nảy mầm. Quá trình tăng trưởng và phát triển của cây rau Diếp xoăn cũng bị giảm khi bổ sung MGBG (Serafini Fracassini,1984). Nồng độ spermidine trong tế bào Cà rốt hoang dã cũng đã được bị ảnh hưởng bởi các chất ức chế, khi bổ sung spermidine vào môi trường làm tăng hàm lượng polyamine trong tế bào. Cũng có điều đáng chú ý là hàm lượng putrescine trong tế bào cao khi được xử lý bởi DCHA, nhưng dường như nó chỉ đóng vai trò như một “chất nền” cho sự sinh tổng hợp spermidine. Chất ức chế này cũng làm giảm đáng kể sự phát triển và tạo phôi nuôi cấy cây Cà rốt hoang dại, điều này cho thấy spermidine đóng một vai trò quan trọng trong quá trình này. Một nghiên cứu khác gần đây cũng chỉ ra rằng DCHA làm giảm nồng độ của polyamine và quá trình tạo phôi trong nuôi cấy Cà rốt (Sung và cộng sự, 2002). Quá trình tạo phôi đã được phục hồi trong môi trường có DCHA khi bổ sung spermidine vào môi trường nuôi cấy.

Tầm quan trọng về mặt sinh lý học của spermidine trong thực vật đã được ghi nhận trong nghiên cứu về quá trình lão hóa của cây Yến mạch (Kaur Sawhney và cộng sự, 1982). Vai trò của spermidine trong sự phát triển của thực vật cũng đã được chứng minh trong các dòng tế bào thuốc lá kháng MGBG, trong đó có nồng

26

độ của spermidine (Malmberg và McIndoo, 1983). Sự phát triển bất thường của hoa trong mẫu cấy này cũng đã được tìm thấy. Các nghiên cứu trước đó cho thấy spermidine riêng lẻ có thể khôi phục lại quá trình tạo phôi trong môi trường có bổ sung DFMA và sau khi bổ sung putrescine vào môi trường (ở nồng độ có thể phục hồi quá trình tạo phôi) nồng độ spermidine sẽ tiến gần đến nồng độ thích hợp tạo phôi hơn nồng độ putrescine (Feirer và cộng sự, 1984).

2.2.3.2. Acid amine

Các nitơ hữu cơ bao gồm các acid amine và các amit được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi. Glutamine và asparagine có tác dụng kích thích phát triển phôi Datura và nhiều loài thực vật khác, nhưng glutamine có hiệu quả rõ rệt hơn. Những hỗn hợp hữu cơ không xác định như casein (CH), nước dừa cũng có ảnh hưởng tốt đối với sự hình thành phôi, do chúng chứa nhiều thành phần khoáng, các acid amine,… Sự phát sinh phôi đã xảy ra trong nuôi cấy tế bào trần trụ dưới lá mầm cây Brassica naplus và Brassica nigra. Các mô sẹo hình thành từ trụ dưới lá mầm sau hai tuần nuôi trên môi trường MS có bổ sung 2,4 D và 10% CW được chuyển sang môi trường không chứa chất kích thích sinh trưởng đã hình thành phôi. Theo Chatteerjee và cộng sự (1985), Kranz (1988), phát sinh phôi vô tính trực tiếp và tái sinh cây con có thể xảy ra trong nuôi cấy tế bào trần Brassica juncea và B. naplus.

Proline riêng rẽ hay kết hợp với các acid amine khác được biết là có tác dụng kích thích sự phát sinh phôi vô tính ở thực vật. Proline kết hợp với serine kích thích sự phát sinh phôi vô tính ở những cây cỏ non (Trigianno và Conger, 1987). Proline riêng rẽ kích thích sự phát sinh phôi vô tính in vitro ở cây Cà rốt (Nuti Ronchi và cộng sự, 1984). Proline và glutamine kích thích sự cảm ứng tạo mô sẹo ở các loại thân thảo Agrostis alba (Shetty và Asano, 1991). Ngoài ra những chất tương tự proline, thioproline được sử dụng để bảo vệ các dòng tế bào phát sinh phôi từ những hạt riêng lẻ không đồng nhất về mặt di truyền của Agrostis Alba (Shetty và Asano, 1991). Proline cũng được sử dụng để kích thích cytokinin cảm ứng sự phát sinh chồi in vitro ở Dưa gang và Dưa leo, auxin cảm ứng phát sinh phôi vô tính ở cỏ Linh lăng (Shetty và McKersie, 1993). Proline, những chất tương tự proline và những tiền chất của proline, ornithine được sử dụng có hiệu quả trong việc kích

27

thích cytokinine cảm ứng sự phát sinh chồi ở Dưa gang. Quá trình phát sinh chồi in vitro cũng được kích thích khi sử dụng dịch thuỷ phân protein của cá giàu acid glutamic và proline kết hợp với các hợp chất tương tự proline. Điều này chứng minh rằng trong các nghiên cứu về sự nhân chồi ở Dưa gang có liên quan đến việc tăng hàm lượng proline trong các mô đã biệt hoá.

Sinh tổng hợp proline là một đáp ứng stress phổ biến ở thực vât, đặc biệt là những stress nước ngọt và nước mặn (Taylor, 1996). Acid amine này tích luỹ trong những thực vật ưa mặn, dưới những stress nước, phấn hoa khô, nuôi cấy tế bào thực vật dưới dạng stress nước, stress muối, khi thực vật già, trong những đáp ứng với abscisic acid, với những chất tương tự proline, sự khử nước. Proline được đề nghị có tác dụng bảo vệ màng tế bào và các protein khi gặp các stress khác nhau được đề cập ở trên. Proline cũng có thể hoạt động như một chất chống oxy hoá thông qua hoạt động thấm lọc ở rễ.

Ngoài khả năng chống chịu với stress thì proline cũng có vai trò khác trong cơ thể thực vật. Sinh tổng hợp proline được thúc đẩy khi thực vật trở nên già. Ngoài ra, nó cũng được cho là có liên quan đến việc chuyển đổi năng lượng và điều khiển sinh tổng hợp purine trong nốt rễ cố định đạm ở cây Đậu tương. Nó gắn liền với sự phát triển gắn liền với sự hình thành rễ trong điều kiện khô hạn và những đáp ứng sinh nhiệt trong phát hoa ở Voodoo Lily (Skubatz và công sự, 1989). Nó cũng gắn liền với các điều kiện phát triển bình thường. Tỷ lệ về hàm lượng proline tự do và liên kết cao trong quá trình phát triển sớm ở cây Đậu, sau đó giảm xuống ở giai đoạn sau thành thục (Venkamp và Koot, 1984). Hàm lượng proline cao không phải do kết quả của stress nước. Điều này có thể do proline tự do có một chức năng đặc trưng trong quá trình phát triển sớm (Venkamp và Koot, 1984). Những nghiên cứu trước đây ở cây Đậu tương (Singh và Gupta, 1983) đã chỉ ra rằng sự tích luỹ proline không gắn liền với stress nước. Một chức năng của proline trong sự ra hoa cũng được đề nghị.

Một vai trò khác của proline trong những đáp ứng stress cảm ứng sự tổng hợp phenol cũng được đề nghị (Shetty, 1997). Những khái niệm này dựa vào vai trò của proline và pyproline 5 carboxylase (P5C) trong việc điều khiển quá trình oxy

28

hoá khử và ion hydro gián tiếp kích thích con đường pentose phophate, mà nó lần lượt điều khiển quá trình đồng hoá proline trong tế bào động vật. Trong mô hình này, sự kích thích sinh tổng hợp proline điều khiển tỷ lệ NADP+/NADPH2 và đường phosphate (mà nó cần thiết cho quá trình đồng hoá purine) thông qua sự kích thích NADPH2 được tạo ra từng bước trong con đường pentose phosphate. Ngoài ra, nó đề nghị rằng quá trình dị hoá của proline xảy ra nhanh khi những đáp ứng stress được phục hồi, có thể tạo ra các đương lượng oxy hoá khử trong phosphoryl hoá oxy hoá ở ty thể, cho nên nó là một quá trình khác để tổng hợp nên ATP (Shetty, 1997).