Hầu hết các quá trình phát triển ở thực vật được điều khiển bởi các hormon thực vật mà chúng hoạt động riêng rẽ hoặc kết hợp. Hàm lượng của mỗi loại hormon trong cơ thể thực vật rất quan trọng đối với các phản ứng trong tế bào. Sự cảm ứng tạo phôi vô tính nói chung được kiểm soát bằng cách điều khiển các thành phần của chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường nuôi cấy. Nói chung trong giai đoạn nuôi cấy phôi ban đầu trong môi trường có chứa auxin, sau đó chuyển đến môi trường không có auxin hay môi trường có auxin với nồng độ thấp để kích thích sự tái sinh. Ngoài ra việc bổ sung các acid amine ngoại sinh vào môi trường nuôi cấy được báo cáo là có tác dụng thúc đẩy sự phát sinh phôi vô tính ở một số loại thực vật (Wang và cộng sự, 2002). Acid amine là một nguồn nitơ hữu cơ (dạng khử) được chuyển hóa rất nhanh trong tế bào thực vật, kích thích tế bào sinh trưởng và phát triển nhanh hơn (Grimes và Hodges, 1990). Vì vậy việc bổ sung acid amine vào môi trường nuôi cấy cung cấp cho tế bào và mô một nguồn nitơ hữu cơ phù hợp ở một mức độ nhất định. Ở các loại thực vật khác nhau thì như cầu về các chất bổ sung (acid amine…) và thành phần của chất điều hòa sinh trưởng cũng khác nhau.
Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi được cấy chuyền vào môi trường có bổ sung proline ở các nồng độ từ 0,25 – 1 mg/l. Sau 4 tuần nuôi cấy xuất hiện các phôi vô tính. Các mẫu mô sẹo ban đầu tăng sinh và sau đó xuất hiện các phôi hình cầu trên bề mặt mô sẹo. Ở các nồng độ khác nhau thì số lượng phôi hình thành, trọng lượng tươi của phôi cũng có sự khác biệt (bảng 4.1).
Bảng 4.1. Ảnh hưởng của proline lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào Nghiệm
thức
Tỷ lệ hình
thành phôi (%) Số lượng phôi Trọng lượng tươi của phôi (g)
Pr0 23,33d 11,66c 0,013c
Pr1 50,00c 45,07b 0,050b
Pr2 60,00bc 47,87b 0,053b
Pr3 86,66a 72,33a 0,081a
Pr4 66,66b 50,70b 0,057b
36
Hình 4.1. Ảnh hưởng của proline lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào a. Mẫu ban đầu; b. Mẫu đối chứng; c. Nồng độ 0,25 g/l;
d. Nồng độ 0,5 g/l; e. Nồng độ 0,75 g/l; f. Nồng độ 1,00 g/l
37
Theo bảng 4.1, nồng độ proline có ảnh hưởng đáng kể đến số lượng phôi, trọng lượng tươi cũng như tỷ lệ hình thành phôi sau 4 tuần nuôi cấy, các nồng độ proline khác nhau thì cho ra kết quả khác nhau và cao hơn so với nghiệm thức đối chứng không bổ sung proline. Khi tăng dần nồng độ proline từ 0,25 lên 0,75 g/l thì tỷ lệ mẫu tạo phôi, số lượng phôi hình thành và trọng lượng tươi của phôi đều tăng dần. Đạt cao nhất ở nghiệm thức Pr3, tỷ lệ mẫu tạo phôi cao nhất đạt 86,66%; số lượng phôi là 72,33; trọng lượng tươi của phôi là 0,0814. Khi tăng nồng độ proline lên 1,00 g/l thì các chỉ tiêu giảm xuống rõ rệt, tỷ lệ mẫu tạo phôi chỉ còn 66,66%, số lượng phôi hình thành đạt 50,7 và trọng lượng tươi của phôi là 0,0568 g. Khi tăng nồng độ proline lên thì không còn hiệu quả trong hình thành phôi vô tính từ các mẫu mô sẹo. Như vậy, môi trường có bổ sung 0,75 g/l proline là nồng độ tối ưu ảnh hưởng đến khă năng cảm ứng phát sinh phôi vô tính và nâng cao tầng suất phát sinh phôi vô tính thông qua nuôi cấy mô sẹo cây Cọc rào.
Proline riêng lẻ hay kết hợp với các acid amine khác có tác dụng kích thích phát sinh phôi ở các loại thực vật khác nhau như trong trường hợp cây Đậu xanh và Đậu nành, phôi vô tính chỉ hình thành trên môi trường chỉ có bổ sung proline (Shetty và McKersie, 1993), ở Cà rốt thì sự phát sinh phôi vô tính xuất hiện khi trong môi trường nuôi cấy có bổ sung 100 mM proline kết hợp 100 mM serine (Nuti và cộng sự, 1984), cây cỏ Linh lăng, số lượng phôi được gia tăng khi môi trường nuôi cấy có bổ sung 50 300 mM proline hoặc những chất tương tự proline khi có sự hiện diện đồng thời của NH4+…
Acid amine đóng một vai trò quan trọng trong việc kích thích phát sinh phôi vô tính ở một số loài thực vật (George, 1993). Proline là một trong những Acid amine được biết đến là có ảnh hưởng đến sự kích thích phát sinh phôi (Shimizu và cộng sự, 1997; Hita và cộng sự, 2003). Santos và cộng sự (1996) đã phát hiện rằng việc bổ sung proline mang lại hiệu quả rõ ràng trên tổng số lượng protein của mô sẹo phát sinh phôi. Họ nghĩ rằng sự có mặt của proline trong môi trường nuôi cấy có vẻ như đáp ứng được các điều kiện stress, giảm điện thế nước trong môi trường nuôi cấy tế bào thực vật, tăng sự tích tụ các chất dinh dưỡng trong tế bào và cuối cùng tăng khả năng phát sinh phôi vô tính. Trong những báo cáo trước đó, proline
38
được phát hiện đưa ra những phản hồi tối ưu nhất trong sự phát sinh phôi vô tính cả sơ cấp và thứ cấp trên cây Hoa hồng (Marchant và cộng sự, 1996). Một số báo cáo khác cũng đề cập đến những vai trò rõ ràng của proline lên sự phát sinh phôi ở cây Ngô (Suprasanna và cộng sự, 1994) và cây Kê (Vikrant và Rashid, 2002).
Proline được xem như là nguồn nitơ khử quan trọng được chuyển hóa và hấp thụ rất nhanh trong tế bào thực vật, ngoài ra proline được xem như là một nguồn năng lượng sẵn có cho tế bào. Bên cạnh đó, proline còn có chức năng quan trọng khác như là một chất đệm bên trong tế bào chất, chống lại sự gia tăng nồng độ các ion trong không bào, có chức năng như một chất điều khiển cấu trúc của nước, làm tăng tính tan của protein và các phân tử sinh học khác dưới điều kiện thế nước giảm (Schobert, 1977).
Trong thí nghiệm này, mẫu cấy mô sẹo được cấy chuyền sang môi trường có bổ sung proline tại các nồng độ khác nhau. Cũng tương tự với các nghiên cứu của Nhựt và cộng sự (2012) trên cây Sâm Ngọc Linh khi tỷ lệ phát sinh phôi chỉ đạt 86,7%. Tỷ lệ này còn thấp hơn nữa ở cây Lúa khi chỉ đạt 63% (Chowdhry và cộng sự, 1992). Nhưng khi kết hợp proline với một số chất khác bổ sung trong môi trường nuôi cấy tạo phôi vô tính trên cây Mía đường, thì tỷ lệ phôi hình thành đạt được khá cao là 97,77% (Navdeep và cộng sự, 2003). Điều này chỉ ra rằng proline nếu chỉ bổ sung riêng lẻ vào môi trường cảm ứng tạo phôi vô tính thì không có nhiều tác dụng tích cực trong quá trình phát sinh phôi vô tính với tần suất cao.
Khi nuôi cấy tạo phôi Sâm Ngọc Linh, Nhựt và cộng sự (2012) nhận thấy nồng độ proline tối ưu là 0,3 g/l. Trong khi đó trên đối tượng cây Dâu tây thì nồng độ proline là 0,5 g/l cho hiệu quả tạo phôi tốt nhất (Manosh và cộng sự, 2007). Một số loài thực vật khác như Đậu phộng, Cà rốt lại tỏ ra có hiệu quả phát sinh phôi ở nồng độ proline là 0,1 g/l (Murch và cộng sự, 1998; Victoria và cộng sự, 1984).
Điều này cho thấy, ở mỗi loại thực vật khác nhau thì có tác dụng với mỗi nồng độ proline khác nhau.
39