Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.2. Vật liệu, nội dung và phương pháp thực hiện
3.2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Sử dụng mẫu lá cây Cọc rào được trồng tại vườn ươm Viện Sinh học Nhiệt đới làm vật liệu nuôi cấy tạo phôi. Các cặp lá thứ hai từ đỉnh sau khi thu nhận được khử trùng sơ bộ bằng cách đặt dưới vòi nước chảy (30 phút), dùng xà phòng loãng rửa sơ bề mặt lá, sau đó ngâm lá trong cồn 70° (30 giây) rồi rửa lại bằng nước cất vô trùng (3 – 4 lần). Mẫu lá được chuyển vào tủ cấy và lắc khử trùng với dung dịch Javel có bổ sung 2 – 3 giọt Tween-20 (10 phút), sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng (4 – 5 lần).
Các lá sau khi được khử trùng sẽ được cắt nhỏ theo kỹ thuật lớp mỏng tế bào (TCL). Mỗi mảnh nhỏ lá có kích thước 0,5 mm x 10 mm được cấy vào môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung 1 mg/l Kinetin và 1,5 mg/l 2,4- D. Sau 4 tuần nuôi cấy trong điều kiện tối và sáng thì các mô sẹo có khả năng phát sinh phôi được hình thành.
3.2.1.2. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
Thiết bị: Phòng sáng với giàn nuôi cây được trang bị hệ thống đèn huỳnh quang 1,2 m chiếu sáng, máy đo nhiệt độ và độ ẩm, máy đo cường độ sáng, tủ cấy
30
vô trùng, nồi hấp tiệt trùng, máy đo pH, cân phân tích, máy lạnh, kính hiển vi quang học, kính hiển vi lập thể,…
Dụng cụ: Kéo, kẹp, dao cấy, đĩa petri, đèn cồn, ống đong,…
Hóa chất: Cồn 96º, 70º, javel, agar, xà phòng, các hóa chất pha môi trường, các chất điều hóa sinh trưởng thực vật, các acid amine, polyamine,…
3.2.1.3. Môi trường nuôi cấy
Môi trường cơ bản được sử dụng trong các thí nghiệm là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962), WPM (Woody Plant Medium) (Lloyd và Mc Cown, 1980), White (White, 1963), B5 (Gamborg, 1968).
Tùy thuộc từng thí nghiệm sẽ bổ sung các thành phần môi trường khác nhau.
Môi trường sẽ được điều chỉnh về pH = 5,7 – 5,8. Sau đó hấp khử trùng ở 1 atm (121ºC) trong 20 phút.
3.2.1.4. Điều kiện nuôi cấy
Thời gian chiếu sáng 10h/ngày, cường độ chiếu sáng 2500 lux.
Nhiệt độ: 25 2ºC.
Độ ẩm trung bình: 60 5%.
3.2.2. Nội dung nghiên cứu
3.2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của proline lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào
Mục tiêu: Xác định nồng độ proline thích hợp cho sự hình thành và phát triển của phôi vô tính cây Cọc rào.
Cách tiến hành: Các mô sẹo có khả năng sinh phôi được cấy vào môi trường cơ bản MS có bổ sung 1mg/l kinetin và proline ở các nồng độ khác nhau.
Ghi nhận ảnh hưởng của proline lên sự hình thành phôi vô tính.
31
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của proline
Nghiệm thức Nồng độ proline (g/l)
Pr0 0,00
Pr1 0,25
Pr2 0,50
Pr3 0,75
Pr4 1,00
3.2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của glutamine lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào
Mục tiêu: Xác định nồng độ glutamine thích hợp cho sự hình thành và phát triển của phôi vo tính cây cọc rào.
Cách tiến hành: Các mô sẹo có khả năng sinh phôi được cấy vào môi trường cơ bản MS có bổ sung 1mg/l kinetin và glutamine ở các nồng độ khác nhau.
Ghi nhận ảnh hưởng của glutamine lên sự hình thành phôi vô tính.
Bảng 3.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của glutamine
Nghiệm thức Nồng độ glutamine (mg/l)
Gl0 0
Gl1 50
Gl2 100
Gl3 150
Gl4 200
3.2.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của adenine sulphate lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào
Mục tiêu: Xác định nồng độ adenine sulphate thích hợp cho sự hình thành và phát triển của phôi vô tính cây Cọc rào.
Cách tiến hành: Các mô sẹo có khả năng sinh phôi được cấy vào môi trường cơ bản MS có bổ sung 1mg/l kinetin và adenine sulphate ở các nồng độ khác nhau. Ghi nhận ảnh hưởng của tyrosine lên sự hình thành phôi vô tính.
32
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của adenine sulphate
Nghiệm thức Nồng độ adenine sulphate (mg/l)
A0 0
A1 50
A2 100
A3 150
A4 200
3.2.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của tyrosine lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào
Mục tiêu: Xác định nồng độ tyrosine thích hợp cho sự hình thành và phát triển của phôi vô tính cây Cọc rào.
Cách tiến hành: Các mô sẹo có khả năng sinh phôi được cấy vào môi trường cơ bản MS có bổ sung 1mg/l kinetin và tyrosine ở các nồng độ khác nhau.
Ghi nhận ảnh hưởng của tyrosine lên sự hình thành phôi vô tính.
Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tyrosine
Nghiệm thức Nồng độ tyrosine (mg/l)
T0 0
T1 50
T2 100
T3 150
T4 200
3.2.2.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hưởng của spermidine lên sự hình thành phôi vô tính cây Cọc rào
Mục tiêu: Xác định nồng độ spermidine thích hợp cho sự hình thành và phát triển của phôi vô tính cây Cọc rào.
Cách tiến hành: Các mô sẹo có khả năng sinh phôi được cấy vào môi trường cơ bản MS có bổ sung 1mg/l kinetin và spermidine ở các nồng độ khác nhau. Ghi nhận ảnh hưởng của spermidine lên sự hình thành phôi vô tính.
33
Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của spermidine
Nghiệm thức Nồng độ spermidine (mM)
Sp0 0,0
Sp1 0,2
Sp2 0,4
Sp3 0,6
Sp4 0,8
3.2.2.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng môi trường khoáng lên sự hình thành rễ của cây con tái sinh từ phôi cây Cọc rào
Mục tiêu: Xác định môi trường khoáng thích hợp cho sự tái sinh thành cây con từ phôi vô tính nuôi cấy in vitro.
Cách tiến hành: Các phôi vô tính hình thành lá mầm sẽ được cấy chuyền vào các môi trường khoáng khác nhau, không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật.
Bảng 3.6. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các loại môi trường khoáng Nghiệm thức Các loại môi trường khoáng
M1 MS
M2 ẵ MS
M3 White
M4 B5
M5 WMP
3.2.2.7. Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng của IBA, NAA lên sự hình thành rễ của cây con tái sinh từ phôi cây Cọc rào
Mục tiêu: Xác định nồng độ NAA, IBA thích hợp cho sự tái sinh thành cây con từ phôi vô tính nuôi cấy in vitro.
Cách tiến hành: Các phôi vô tính hình thành lá mầm sẽ được cấy chuyền vào các môi trường khoáng thích hợp, có bổ sung NAA, IBA ở các nồng độ khác nhau.
34
Bảng 3.7. Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA, IBA Nghiệm thức Nồng độ NAA (mg/l) Nồng Độ IBA (mg/l)
R1 0,0 -
R2 0,5 -
R3 1,0 -
R4 1,5 -
R5 2,0 -
R6 - 0,5
R7 - 1,0
R8 - 1,5
R9 - 2,0