1 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Protein là hợp chất hữu cơ có ý nghĩa quan trọng bậc nhất trong cơ thể sống, về mặt số lượng, protein chiếm không dưới 50 % trọng lượng khô của tế bào
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu thí nghiệm
- Rễ cây sâm đất được thu nhận từ Tây Ninh
Hình 3.1: Bột rễ sâm đất đã nghiền sau khi sấy khô
3.1.2 Dụng cụ và hóa chất
- Pipette 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 25ml
- Cốc thủy tinh 100ml, cốc 500ml, cốc 1000ml
- Bình định mức 50ml, 10ml, 1000ml
- Chai đựng hóa chất pha và đựng mẫu
- Máy điện di (Bio – Rad)
- Máy sắc ký lọc gel (Bio – Rad)
- Tủ sấy hút chân không (Thermosi)
* Hóa chất tách chiết và thu nhận hoạt chất glycoprotein từ rễ cây sâm đất
- Natrium acetat – Trihydrat (Bio - Rad)
* Hóa chất tinh sạch hoạt chất glycoprotein từ rễ cây sâm đất
- Sephadex G25 và Sephadex G-50 Fine (Sweden)
* Hóa chất xác định trọng lượng phân tử và hàm lượng glycoprotein
- SDS sodium dodecyl sulfate (Bio - Rad)
- Coomassie Brilliant Blue 250R (Bio - Rad)
Nội dung và phương pháp nghiên cứu thí nghiệm
3.2.1 Phương pháp phân tích chỉ tiêu sinh hóa ở rễ cây sâm đất
3.2.1.1 Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu của rễ cây sâm đất a) Thiết bị
- Cân phân tích có độ chính xác 0.0001g
- Tủ sấy bằng điện, có khả năng điều chỉnh nhiệt độ 100 0 C- 105 0 C b) Cách tiến hành thí nghiệm
- Cốc đã được sấy khô trong tủ sấy ở 105 0 C trong 3 giờ và sau đó làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng, đem cân chính xác (m 0 )
- Cân mẫu thử 1g cho vào cốc đã xác định khối lượng (m 0 ) thì ta được (m 1 )
- Để cốc có chứa mẫu thử vào tủ sấy ở nhiệt độ 105 0 C trong thời 3 giờ Sau đó làm nguội trong bình hút ẩm ở nhiệt độ phòng rồi đem cân xác định (m2)
- Lập lại thao tác trên nhưng mỗi lần chỉ để khoảng 30 phút trong tủ sấy cho đén khi lượng mất đi của hai lần cân liên tiếp không chênh lệch nhau quá 0,002- 0.004g c) Công thức tính kết quả Độ ẩm tính bằng phần % khối lượng được tính theo
Trong đó: m 0 : khối lượng cốc (g) m 1 : khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g) m 2 : khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g)
3.2.1.2 Phương pháp xác định khoáng tổng số ở rễ cây sâm đất a) Nguyên tắc
Tro thô là phần vật chất của mẫu còn lại sau khi nung (vô cơ hóa) ở nhiệt độ
550 0 C – 700 0 C trong 4 giờ Để nguội trong bình hút ẩm Cân tính sự chênh lệch trước và sau khi nung, ta có được hàm lượng tro trong mẫu b) Cách tiến hành thí nghiệm
- Lấy mẫu thử và chuẩn bị mẫu thử, mẫu khô không khí đã xử lý sơ bộ rồi đem di sấy ở 105 0 C trong 3 giờ rồi đem để nguội trong bình hút ẩm ở nhiệt độ phòng
- Cân 1 ± 0,001g vào chén nung đã biết P 0 (trọng lượng bì) ta được P1
- Đặt chén có mẫu vào lò nung (100 0 C) để mẫu cháy hết đến khói đen, đóng cữa lò nung, điều chỉnh đến nhiệt độ 600 0 C và nung trong 4 giờ đến khi mẫu có màu trắng hay màu xám xanh là được
- Để hạ nhiệt độ khoảng 200 0 C, làm nguội trong bình hút ẩm (15 phút) và đem cân P2 lặp lại quá trình nung mẫu đến khối lượng không đổi c) Công thức tính kết quả
P 1 : Khối lượng chén và mẫu trước khi nung (g)
P 2 : Khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g) m : Khối lượng mẫu đem nung (g)
3.2.1.3 Phương pháp định lượng Ca và Mg ở rễ cây sâm đất bằng phương pháp complexon III [1, tr.109] a) Nguyên tắc
- Acid etylen diamin tetracetic (trilon B) có khả năng tạo những phức có nhiều cation, đặc biệt là Ca và Mg Acid etylen diamin tetracetic hoặc muối natri của nó Complexon III ở môi trường kiềm, cho với Ca một phức bền vững mà
30 oxalate ammonium cũng không lấy Ca để tủa được
- Chỉ một vài chỉ thị màu đặc biệt mới phát hiện sự có mặt của Ca 2+ và Mg 2+ , nên eriocrom đen T cho màu đỏ khi có Ca 2+ và Mg 2+ tự do và màu lơ khi có những ion đó ở dạng phức chất b) Hóa chất
- Dung dịch đệm amonium pH 10: cân 6.7g NH 4 Cl + 30ml nước cất, khấy cho tan, thêm 57ml NH4OH và nước cất cho đủ 100ml
- Dung dịch Trilon B 0.02N: cân 3.73g Trilon B + nước cất cho đủ 1000ml
- Chỉ thị Đen Eriochrom T: cân 0.1g Đen Eriochrom T + 50g NaCl tinh khiết, nghiền nhuyễn trong cối, cất vào chai thủy tinh đậy nút kín
- Chỉ thị murexid: cân 0.1g murexid + 50g NaCl tinh khiết Nghiền nhuyễn trong cối, cho vào chai thủy tinh đậy nút kín c) Cách tiến hành thí nghiệm
- Chuẩn bi mẫu thử: cân 1g mẫu, nung thành tro trắng, hòa với 5ml HCl tinh khiết, đun sôi cách thủy tới khô Làm lại lần hai như trên Lần thứ 3 cho thêm 5ml HCl 20%, hòa tan, lọc trên giấy lọc không tro Rửa chén nung nhiều lần bằng nước cất nóng Dịch lọc và cả nước rửa cho cả vào bình định mức 50ml rồi định mức đến 50ml, ta có được dịch thử
* Xác định tổng hàm lượng Ca 2+ và Mg 2+ có trong dịch thử
- Cho vào bình tam giác 100ml
+ Dung dịch đệm pH 10 2 ml
+ Chỉ thị màu Eriochrom T 1/2hạt gạo
- Lắc đều và chuẩn độ bằng dung dịch Trilon B cho đến khi dung dịch từ màu đỏ tím chuyển sang màu xanh lam Thể tích Trilon B 0.02N chuẩn độ dung dịch có giá trị tương đương với hàm lượng Ca và Mg Thực hiện song song với mẫu thử không
* Xác định tổng hàm lượng canxi có trong dịch thử
- Cho vào bình tam giác 100ml
+ Chỉ thị màu murexid 1/2hạt gạo
- Lắc đều và chuẩn độ bằng dung dịch Trilon B cho đến khi dung dịch từ màu hồng chuyển sang màu tím Thực hiện song song với mẫu thử không d) Công thức tính kết quả
- Lượng canxi (mg) trong 100g mẫu khô là
- Lượng magie (mg) trong 100g mẫu khô
V: Thể tích Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ tổng Ca và Mg
V1: Thể tích Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ Ca
C: Độ nguyên chuẩn của dung dịch Trilon B a: trọng lượng mẫu khô tương đương với thể tích dung dịch mẫu lấy để chuẩn độ
3.2.1.4 Phương pháp định lượng Phospho tổng số ở rễ cây sâm đất bằng quang phổ kế [1, tr.116] a) Nguyên tắc
Phương pháp dựa vào khả năng ion Orthophosphate phản ứng với ammonium molybdate tạo thành phosphormolybdate, phức chất có màu xanh lơ 2(MoO 2 4MoO 3 ) + H 3 PO 4 (MoO 2 4MoO 3 ).2H 3 PO 4 4H 2 O
Hàm lượng phospho phụ thuộc vào cường độ màu của mẫu, đo ở bước sóng hấp
32 thụ cực đại 650nm với cuvet có chiều dày 10mm, dung dịch đối chứng là dung dịch nước cất b) Hóa chất
- Dung dịch 1: Dung dịch Na 2 SO 3 20% là cân 20g Na2SO 3 hòa vào trong 100ml cất
- Dung dịch 2: Dung dịch hydroquinone [C 6 H 4 (OH) 2 ] 0.5% là cân 0.5g hydroquinone hòa tan trong một ít nước và 3 giọt H 2 SO 3 , thêm nước cất cho đủ 100ml
- Dung dịch 3: Dung dịch amoni molybdate 5%
Cân 50g amoni molybdate hòa tan trong 100ml nước cất Cho 150ml H 2 SO 4 đậm đặc vào trong 400ml nước cất, để nguôi thêm tiếp dung dịch amoni molybdate 5% rồi để nguội thêm nước cất cho đủ 100ml
- Hỗn hợp thuốc thử: Trộn các dung dịch 1,2,3 theo tỷ lệ 1:1:1 thì ta được hỗn hợp thuốc thử
- Dung dịch HCl 10%: 250ml HCl đậm đặc cộng với 750ml nước cất
- Dung dịch chuẩn phosphate: Dung dịch chuẩn gốc ( chứa 100àg/ml phospho) Hòa tan 1.4394g KH 2 SO 4 trong bình định mức 1000ml bằng nước cất và định mức đúng 1000ml c) Cách tiến hành thí nghiệm
* Chuẩn bị dung dịch tro phân tích
- Cân chính xác 1g mẫu đem đi vô cơ hóa ở 5500C trong 4 giờ, để nguội đến nhiệt độ phòng thấm ướt tro bằng vài giọt nước cất và thêm 10ml HCl 10% + 0.5ml HNO 3 đậm đặc
- Đun nhẹ trong 5 phút (đến khi thấy bay hơi), để nguội đến nhiệt độ phòng Rửa sạch chén nung và định mức thể tích dung dịch tro đến 50ml bằng nước cất
Bảng 3.1: Đường chuẩn Phospho Ống 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Dung dịch phopspho chuẩn (ml)
Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Dung dịch thuốc thử (ml) 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
- Lắc đều và để 30 phút rồi đo ở bước sóng 650nm
* Xác định hàm lượng phospho có trong cây sâm đất
- Lấy 1ml dung tro cho vào ống nghiệm
- Thêm 3ml hỗn hợp thuốc thử + nước cất cho đủ 10ml Lắc đều hỗn hợp, để 30phút Đo ở bước sóng 650nm d) Công thức tính kết quả
X: số àg P cú trong 1ml dung dịch tro
V ddtro : thể tích dung dịch sau khi tro hóa m: khối lượng mẫu thử (g)
3.2.1.5 Phương pháp định lượng Sắt ở rễ cây sâm đất [1, tr.122] a) Nguyên tắc
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Một số chỉ tiêu sinh hóa ở rễ cây sâm đất
Bảng 4.1 : Kết quả phân tích chỉ tiêu sinh hóa ở rễ cây sâm đất Độ ẩm 68.81%
- Từ kết quả ở bảng 4.1 ta khảo sát các yếu tố ảnh hưởng sự tách chiết glycoprotein từ rễ cây sâm đất
- Trong quá trình tách chiết ta phải khảo sát trong dung dịch đệm natriacetate 0.02M, từ đó ta có kết quả nghiên cứu như sau.
Tỷ lệ dung dịch đệm tối ưu cho tách chiết Glycoprotein ở rễ cây sâm đất
Tỷ lệ bột rễ : dung dịch đệm 1:3 1:4 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9 Hàm lượng glycoprotein (%) 3.41 4.43 5.06 4.62 4.01 3.92 3.76
61 Đồ thị 4.1: Tỷ lệ đệm tách chiết glycoprotein ở bột rễ cây sâm đất
Từ kết quả ở bảng 4.2 và đồ thị 4.1 ta có tỷ lệ đệm tối ưu để tách chiết glycoprotein ở bột rễ cây sâm đất là 1:5 cho hàm lượng glycoprotein cao 5.06% Nên việc lựa chọn tỷ lệ dung môi tách chiết phụ thuộc vào bản chất của glycoprotein cần tách trong đó quan trọng hơn cả là độ phân cực Glycoprotein cần tách, thường được dùng dung môi hữu cơ ở trạng thái không phân cực
Do vậy, tỷ lệ dung môi nhỏ hơn tỷ lệ 1:5 thì không đủ hòa tan hết glycoprotein và tỷ lệ dung môi lớn hơn tỷ lệ 1:5 thì quá trình tách chiết giảm Nên để quá trình tách chiết diễn ra tốt nhất là tỷ lệ 1:5 Vậy ta chọn tỷ lệ 1:5 làm thí nghiệm tiếp theo.
Khảo sát pH ảnh hưởng đến sự tách chiết Glycoprtein ở rễ cây sâm đất
- Khi ta chọn được tỷ lệ đệm tách chiết tối ưu dựa vào kết quả bảng 4.2 chúng ta khảo sát ảnh hưởng theo từng pH khác nhau, để tìm ra pH tối ưu đến sự tách chiết hoạt chất glycoprotein ở rễ cây sâm đất
Bảng 4.3: Kết quả khảo sát pH tách chiết glycoprotein trong 100g bột rễ cây sâm đất pH 4.0 4.4 4.8 5.2 5.6 6.0 6.4 6.8 7.2 7.6 8.0 Hàm lượng
3.40 3.64 4.32 4.52 4.88 5.12 5.52 5.56 5.48 5.28 5.20 Đồ thị 4.2: pH tách chiết glycoprotein ở bột rễ cây sâm đất
Từ kết quả ở bảng 4.3 và đồ thị 4.2, ta nhận thấy pH tối ưu ảnh hưởng sự tách chiết glycoprotein ở bột rễ cây sâm đất là pH=6.8 cho hàm lượng glycoprotein cao 5.56%
Vì dung dịch đệm phải có độ kiềm yếu để trung hòa độ acid trong dịch chiết nhằm tăng độ hòa tan của glycoprotein mà không phá vỡ cấu trúc bậc 4 của protein Nếu pH quá cao hay quá thấp đều làm giảm độ hòa tan của glycoprotein trong rễ cây sâm đất mà còn làm cho glycoprotein dễ bị biến tính
Khảo sát thời gian ảnh hưởng đến sự tách chiết hoạt chất Glycoprotein ở rễ cây sâm đất
- Khi ta chọn được tỷ lệ đệm tách chiết tối ưu (1:5), pH tối ưu (5.2) từ đó ta khảo thời gian tách chiết, để tìm ra thời gian tối ưu đến sự tách chiết hoạt chất glycoprotein ở rễ cây sâm đất
Bảng 4.4: Kết quả khảo sát thời gian tách chiết glycoprotein trong 100g bột rễ cây sâm đất
Hàm lượng glycoprotein (%) 3.39 4.38 4.83 5.17 5.76 6.01 5.92 5.67 5.45 Đồ thị 4.3: Thời gian tách chiết glycoprotein ở bột rễ cây sâm đất
Từ kết quả ở bảng 4.4 thời gian tối ưu tách chiết glycoprotein ở bột rễ cây sâm đất là 12 giờ cho hàm lượng glycoprotein cao 6.01% Nếu thời gian nhỏ hơn
12 giờ thì không đủ thời gian để tách chiết hết hàm lượng glycoprotein và lớn hơn
12 giờ làm tăng mức độ ion hóa của hoạt chất glycoprotein nên làm giảm hàm lượng glycoprotein.Vậy trong quá trình khảo sát sự tách chiết ta tìm thấy được tỷ
64 lệ đệm 1:5, pH 6.8, thời gian 12 giờ để đạt giá trị tối ưu nhất để tách chiết glycoprotein ở rễ cây sâm đất, để làm cơ sơ nghiên cứu tiếp theo.
Khảo sát quá trình tủa theo các nồng độ muối (NH 4 ) 2 SO 4 , tỷ lệ cồn 96 0 và tỷ lệ
tỷ lệ acetone ảnh hưởng thu hàm lượng glycoprotein ở dịch chiết rễ cây sâm đất
4.5.1 Nồng độ muối (NH 4 ) 2 SO 4 tối ưu tủa glycoprotein ở dung dịch chiết rễ cây sâm đất
- Khi ta chọn được dịch chiết tốt nhất có chứa hàm lượng glycoprotein cao nhất, dựa vào đó ta khảo sát quá trình tủa theo nồng độ muối (NH4)2SO4 ảnh hưởng hàm lượng glycoprotein
Bảng 4.5: Kết quả khảo sát nồng độ muối (NH 4 ) 2 SO 4 tủa glycoprotein trong 100ml dung dịch chiết rễ cây sâm đất
Hàm lượng glycoprotein (%) 2.81 6.91 8.97 10.05 11.1 10.9 9.3 Đồ thị 4.4: Nồng độ muối (NH 4 ) 2 SO 4 tủa glycoprotein ở dịch chiết rễ cây sâm đất
Hàm Lượng Muối (NH 4 ) 2 SO 4 (%)
- Từ kết quả ở bảng 4.5 và đồ thị 4.4 nồng độ muối (NH 4 ) 2 SO 4 tối ưu tủa glycoprotein ở trong 100ml dung dịch chiết rễ cây sâm đất là nồng độ muối (NH 4 ) 2 SO 4 60% ta thu được hàm lượng glycoprotein cao (11.1%)
- Vì nồng độ muối cao glycoprotein tủa (cạnh tranh dung môi giữa muối và glycoprotein) Khi nồng độ muối quá cao ảnh hưởng đến lực hút tĩnh điện làm giảm khả năng kết tủa glycoprotein Còn nồng độ thấp không đủ để kết tủa hết glycoprotein
- Vậy trong quá trình khảo sát nồng độ muối (NH 4 ) 2 SO 4 tủa hoạt chất glycoprotein, ta tìm thấy được nồng độ muối (NH 4 ) 2 SO 4 60% là đạt được giá trị tối ưu nhất để làm cơ sở nghiên cứu tiếp theo
4.5.2 Tỷ lệ cồn tối ưu tủa glycoprotein ở dung dịch chiết rễ cây sâm đất
- Khi ta chọn được dịch chiết tốt nhất có chứa hàm lượng glycoprotein cao nhất, dựa vào đó ta khảo sát quá trình tủa theo tỷ lệ cồn ảnh hưởng hàm lượng glycoprotein
Bảng 4.6: Kết quả khảo sát tỷ lệ cồn tủa glycoprotein trong 100ml dung dịch chiết rễ cây sâm đất
Tỷ lệ dịch chiết : Cồn 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 Hàm lượng glycoprotein (%) 1.71 2.78 5.88 7.94 6.89 5.87 Đồ thị 4.5: Tỷ lệ cồn tủa glycoprotein ở dịch chiết rễ cây sâm đất
Tỷ lệ dịch chiết: Cồn
- Từ kết quả ở bảng 4.6 và đồ thị 4.5 tỷ lệ cồn tối ưu tủa glycoprotein ở trong 100ml dung dịch chiết rễ cây sâm đất là ở tỷ lệ dịch chiết : cồn = 1 : 4 ta thu được hàm lượng glycoprotein cao 7.94%
Vì phương pháp này được dựa vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử glycoprotein, phân tử nước Sự tương tác đó sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch glycoprotein bằng cồn 96 0 làm cho glycoprotein tủa Quá trình trộn
2 dung môi hữu cơ và dịch chiết cho phép sự vận chuyển ion giữa chúng Trộn cho đến khi cân bằng được thiết lập ( sự vận chuyển ion kết thúc) Dòng dung môi đi vào bể lắng, tách liên tục thành 2 lớp từ bể lắng Nếu tỷ lệ cồn cao hay thấp đều ảnh hưởng quá trình tủa
- Vậy trong quá trình khảo sát tỷ lệ cồn 96 0 tủa hoạt chất glycoprotein, ta tìm thấy được tỷ lệ cồn 96 0 (1:4 ) là đạt được giá trị tối ưu nhất để làm cơ sở nghiên cứu tiếp theo
4.5.3 Tỷ lệ acetone tối ưu tủa glycoprotein ở dung dịch chiết rễ cây sâm đất
- Khi ta chọn được dịch chiết tốt nhất có chứa hàm lượng glycoprotein cao nhất, dựa vào đó ta khảo sát quá trình tủa theo tỷ lệ acetone ảnh hưởng hàm lượng glycoprotein
Bảng 4.7: Kết quả khảo sát tỷ lệ acetone tủa glycoprotein trong 100ml dung dịch chiết rễ cây sâm đất
Tỷ lệ dịch chiết : acetone 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 Hàm lượng glycoprotein (%) 2.75 4.83 7.92 9.98 8.94 7.91
67 Đồ thị 4.6: Tỷ lệ acetone tủa glycoprotein ở dịch chiết rễ cây sâm đất
Từ kết quả ở bảng 4.7, đồ thị 4.6 tỷ lệ acetone tối ưu tủa glycoprotein ở trong 100ml dung dịch chiết rễ cây sâm đất là ở tỷ lệ dịch chiết : acetone = 1 :
4 ta thu được hàm lượng glycoprotein cao 9.98%
Vì phương pháp này được dựa vào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử glycoprotein, phân tử nước Sự tương tác đó sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch glycoprotein bằng acetone làm cho glycoprotein tủa Quá trình trộn
2 dung môi hữu cơ và dịch chiết cho phép sự vận chuyển ion giữa chúng Trộn cho đến khi cân bằng được thiết lập ( sự vận chuyển ion kết thúc) Dòng dung môi đi vào bể lắng, tách liên tục thành 2 lớp từ bể lắng Nếu tỷ lệ acetone cao hay thấp đều ảnh hưởng quá trình tủa
- Vậy trong quá trình khảo sát tỷ lệ acetone tủa hoạt chất glycoprotein, ta tìm thấy được tỷ lệ acetone (1:4) là đạt được giá trị tối ưu nhất để làm cơ sở nghiên cứu tiếp theo
Tỷ lệ dịch chiết: Acetone
Khảo sát thời gian tủa muối (NH 4 ) 2 SO 4 , cồn 96 0 và acetone tối ưu tủa
4.6.1 Khảo sát thời gian tủa muối (NH 4 ) 2 SO 4 tối ưu tủa glycoprotein từ dịch chiết cây sâm đất
- Khi ta chọn được nồng độ muối (NH 4 ) 2 SO 4 tối ưu là 60% để tủa hoạt chất glycoprotein từ dịch chiết rễ cây sâm đất Dựa vào bảng 4.5 ta khảo sát thời gian ảnh hưởng nồng độ muối (NH 4 ) 2 SO 4 đến sự tủa hoạt chất glycoprotein
Bảng 4.8: Kết quả khảo sát thời gian tủa glycoprotein từ dịch chiết bột rễ cây sâm đất với tác nhân tủa muối (NH 4 ) 2 SO 4
Thời gian 1h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h 27h 30h 33h HL(%) 1.89 2.46 2.95 3.96 5.96 5.43 5.12 4.81 4.72 3.65 3.18 2.87 Đồ thị 4.7: Thời gian tủa glycoprotein với tác nhân muối (NH 4 ) 2 SO 4
Từ kết quả ở bảng 4.8 và đồ thị 4.7 thời gian tối ưu nhất tủa glycoprotein với tác nhân muối (NH 4 ) 2 SO 4 trong 100ml dịch chiết ở rễ cây sâm đất là 12 giờ thì thu
69 được hàm lượng glycoprotein cao 5.96%
Nếu thời gian tủa nhỏ 12 giờ thì không đủ tủa hết glycoprotein và thời gian lớn hơn 12 giờ thì glycoprotein chứa quá lâu trong muối (NH4)2SO4, làm các gốc liên kết của glycoprotein hoạt động hỗn độn và làm cho glycoprotein biến tính thì làm giảm hàm lượng glycoprotein
4.6.2 Khảo sát thời gian tủa cồn 96 0 tối ưu tủa glycoprotein từ dịch chiết cây sâm đất
- Khi ta chọn được tỷ lệ cồn 96 0 tối ưu là 1:4 để tủa hoạt chất glycoprotein từ dịch chiết rễ cây sâm đất Dựa vào bảng 4.6 ta khảo sát thời gian ảnh hưởng tỷ lệ cồn 96 0 đến sự tủa hoạt chất glycoprotein
Bảng 4.9: Kết quả khảo sát thời gian tủa glycoprotein từ dịch chiết bột rễ cây sâm đất với tác nhân tủa cồn 96 0
Thời gian 1h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h 27h 30h 33h HL(%) 0.75 1.81 1.97 2.04 2.18 3.29 3.69 3.98 4.25 3.43 3.01 2.39 Đồ thị 4.8: Thời gian tủa glycoprotein với tác nhân cồn
Từ kết quả ở bảng 4.9 và đồ thị 4.8 thời gian tối ưu nhất tủa glycoprotein với tác nhân cồn 96 0 trong 100ml dịch chiết ở rễ cây sâm đất là 24 giờ thì thu được hàm lượng glycoprotein cao 4.25%
Nếu thời gian tủa nhỏ hơn 24 giờ thì không đủ thời gian tủa hết glycoprotein và thời gian lớn hơn 24 giờ thì glycoprotein chứa quá lâu trong cồn 96 0 , làm các gốc liên kết của glycoprotein hoạt động hỗn độn và làm cho glycoprotein biến tính thì làm giảm hàm lượng glycoprotein
4.6.3 Khảo sát thời gian tủa acetone tối ưu tủa glycoprotein từ dịch chiết cây sâm đất
- Khi ta chọn được tỷ lệ acetone tối ưu là 1:4 để tủa hoạt chất glycoprotein từ dịch chiết rễ cây sâm đất Dựa vào bảng 4.6 ta khảo sát thời gian ảnh hưởng tỷ lệ acetone đến sự tủa hoạt chất glycoprotein
Bảng 4.10: Kết quả khảo sát thời gian tủa glycoprotein từ dịch chiết bột rễ cây sâm đất với tác nhân tủa acetone
Thời gian 1h 3h 6h 9h 12h 15h 18h 21h 24h 27h 30h 33h HL(%) 0.78 1.86 2.89 2.94 3.96 4.18 4.45 4.73 4.95 3.84 2.47 1.87 Đồ thị 4.9: Thời gian tủa glycoprotein với tác nhân acetone
Từ kết quả ở bảng 4.10 và đồ thị 4.9 thời gian tối ưu nhất tủa glycoprotein với tác nhân acetone trong 100ml dịch chiết ở rễ cây sâm đất là 24 giờ thì thu được hàm lượng glycoprotein cao 4.95%
Nếu thời gian tủa nhỏ hơn 24 giờ thì không đủ tủa hết glycoprotein và thời gian lớn hơn 24 giờ thì glycoprotein chứa quá lâu trong acetone, làm các gốc liên kết của glycoprotein hoạt động hỗn độn và làm cho glycoprotein biến tính thì làm giảm hàm lượng glycoprotein.
So sánh sự tuả hoạt chất glycoprotein trong cồn 96 0 , muối (NH 4 ) 2 SO 4 và
- Khi ta chọn được nồng độ muối (NH 4 ) 2 SO 4 60% với thời gian 12 giờ, tỷ cồn 1:4 với thời gian 24 giờ, tỷ lệ acetone 1:4 với thời gian 24giờ là kết quả tối ưu nhất để tủa hoạt chất glycoprotein, dựa vào bảng 4.11 ta so sánh 3 tác nhân tủa để tìm ra tác nhân tủa tốt nhất
Bảng 4.11: Kết quả tủa glycoprotein với 3 tác nhân tủa cồn,acetone, muối
Tác nhân tủa Nồng độ (hoặc tỷ lệ) Thời gian tủa
Từ kết quả bảng 4.11 cho biết, hàm lượng glycoprotein thu được bằng tủa muối là cao nhất 5.96%, nhưng chỉ mất thời gian là 12 giờ so với tủa bằng cồn và acetone là mất 24 giờ để có thể tủa hết hàm lượng glycoprotein Đối với phương pháp tủa glycoprotein bằng cồn và acetone cho hàm lượng glycoprotein thấp hơn tủa bằng muối (muối 5.96%) nhưng với thời gian tủa 24 giờ Tuy nhiên, phương pháp tủa bằng acetone và cồn có hàm lượng glycoprotein tương đối cao, nhưng vì phương pháp tủa bằng acetone và cồn sau khi tủa glycoprotein rất khó hòa tan nên dễ ảnh hưởng đến hàm lượng glycoprotein khi
72 chạy sắc ký Còn phương pháp tủa glycoprotein bằng muối thì rất dễ hòa tan nên dễ dàng thực hiện quá trình chạy sắc ký
Từ những suy luận trên, chúng tôi nhận thấy rằng, phương pháp tủa bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 là tốt nhất.
Tinh sạch hoạt chất Glycoprotein qua lọc gel
Sau khi tiến hành chiết xuất và tủa glycoprotein bằng 3 tác nhân: cồn lạnh, acetone và muối (NH 4 ) 2 SO 4 bão hòa, chúng ta tiến hành chạy sắc ký các sản phẩm tủa ở các tỷ lệ và các nồng độ tối ưu Đối với sản phẩm tủa bằng cồn lạnh và acetone, muối quá trình tinh sạch chỉ được thực hiện qua lọc gel Sephadex G-50
4.8.1 Tinh sạch hoạt chất glycoprotein qua lọc gel Sephadex G-50 sau khi tủa glycoprotein bằng cồn 96 0
Lấy 2ml dịch glycoprotein từ 3ml dịch tủa đã pha trong đệm, cho chạy qua hệ sắc ký cột sephadex G50
Hình 4.1: Sắc ký đồ qua tinh sạch hoạt chất glycoprotein bằng sắc ký lọc gel sau khi tủa glycoprotein bằng cồn
Kết quả tinh sạch glycoprotein qua lọc gel sau khi tủa glycoprotein bằng cồn 96 0 thu được 2 peak với thứ tự như sau
Peak 1:Từ ống 18 đến ống 35 thu được 16ml
Peak 2:Từ ống 42 đến ống 68 thu được 32ml
Xác định hàm lượng cho từng peak Tuy nhiên hàm lượng protein của peak 2 là cao nhất nên có thể dự đoán peak 2 có chứa glycoprotein quan tâm
Bảng 4.12: Kết quả xác định hàm lượng glycoprotein trước và sau khi tinh sạch qua tác nhân tủa glycoprotein bằng cồn 96 0
∑hàm lượng (mg) Độ tinh sạch Hiệu suất (%)
Sau khi tinh sạch glycoprotein qua sắc ký lọc gel ta có thể nhận thấy hàm lượng glycoprotein sau khi tinh sạch thấp hơn hàm lượng glycoprotein trước khi tinh sạch Vì một số protein tạp được loại bỏ sau khi chạy sắc ký lọc gel sephadex G50
4.8.2 Tinh sạch hoạt chất glycoprotein qua lọc gel Sephadex G-50 sau khi tủa glycoprotein bằng acetone
Lấy 2ml dịch glycoprotein từ 3ml dịch tủa đã pha trong đệm, cho chạy qua hệ sắc ký cột sephadex G50
Hình 4.2: Sắc ký đồ qua tinh sạch hoạt chất glycoprotein bằng sắc ký lọc gel sau khi tủa glycoprotein bằng acetone
Kết quả tinh sạch qua lọc gel bằng tác nhân tủa hoạt chất glycoprotein bằng Acetone thu được 1 peak như sau
Peak: Từ ống 41 đến ống 51 thu được 30ml
Xác định hàm lượng cho peak
Bảng 4.13: Kết quả sát định hàm lượng glycoprotein trước và sau khi tinh sạch qua tác nhân tủa glycoprotein bằng Acetone
∑hàm lượng (mg) Độ tinh sạch Hiệu suất (%)
Sau khi tinh sạch glycoprotein qua sắc ký lọc gel ta có thể nhận thấy hàm lượng protein sau khi tinh sạch thấp hơn hàm lượng protein trước khi tinh sạch Vì một số protein tạp được loại bỏ sau khi chạy sắc ký lọc gel sephadex G50
4.8.3 Tinh sạch hoạt chất glycoprotein qua lọc gel Sephadex G-50 sau khi tủa glycoprotein bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4
- Lấy dung dịch ở các peak loại muối ở cột sephadex G25 cho chạy qua hệ sắc kí cột sephadex G50
Hình 4.3: Sắc ký đồ qua tinh sạch hoạt chất glycoprotein bằng sắc ký lọc gel sau khi tủa glycoprotein bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4
Kết quả tinh sạch qua lọc gel bằng tác nhân tủa hoạt chất glycoprotein bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 96 0 C thu được 3 peak với thứ tự như sau
Peak 1: Từ ống 18 đến ống 24 thu được 15ml
Peak 2: Từ ống 42 đến ống 45 thu được 5ml
Peak 3: Từ ống 47 đến ống 63 thu được 25ml
Xác định hàm lượng cho từng peak Tuy nhiên hàm lượng protein của peak 3 là cao nhất nên có thể dự đoán peak 3 có chứa glycoprotein quan tâm,
Bảng 4.14: Kết quả sát định hàm lượng glycoprotein trước và sau khi tinh sạch qua tác nhân tủa glycoprotein bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4
TT ∑hàm lượng (mg) Độ tinh sạch Hiệu suất (%)
Sau khi tinh sạch glycoprotein qua sắc ký lọc gel ta có thể nhận thấy hàm lượng glycoprotein sau khi tinh sạch thấp hơn hàm lượng glycoprotein trước khi tinh sạch Vì một số protein tạp được loại bỏ sau khi chạy sắc ký lọc gel sephadex G50
4.8.4 So sánh kết quả tinh sạch hoạt chất glycoprotein với 3 tác nhân tủa bằng cồn 96 0 , acetone, muối
Bảng 4.15: Kết quả tinh sạch hoạt chất glycoprotein với 3 tác nhân tủa bằng cồn 96 0 , acetone, muối qua sắc ký lọc gel
Hàm lượng glycoprotein (mg) Độ tinh sạch
Dịch thu được sau khi chạy sắc ký, sau khi tủa glycoprotein bằng muối
Dịch thu được sau khi chạy sắc ký, sau khi tủa glycoprotein bằng cồn 96 0
Dịch thu được sau khi chạy sắc ký, sau khi tủa glycoprotein bằng acetone 3.48 3.48 34.15
- Độ tinh sạch glycoprotein sau sắc ký như sau:
+ Khi tủa glycoprotein bằng muối : Độ tinh sạch gấp 6.08 lần so với chế phẩm glycoprotein thô ban đầu
+ Khi tủa glycoprotein bằng cồn : Độ tinh sạch gấp 2.23 lần so với chế phẩm glycoprotein thô ban đầu
+ Khi tủa glycoprotein bằng acetone : Độ tinh sạch gấp 3.48 lần so với chế phẩm glycoprotein thô ban đầu
- Vậy sau khi tinh sạch glycoprotein trên sắc ký cột sephadex G50 thu hàm lượng cao trong quá trình tinh sạch, một số protein tạp được loại bỏ
- Ta dựa vào bảng 4.15 thì độ tinh sạch và hiệu suất thu nhận của tủa muối là tốt nhất khi qua gel sephadex G50 và tủa cồn là thấp nhất.
Kết quả phân tách hệ glycoprotein bằng phương pháp chạy điện di trên gel SDS- PAGE
Tiến hành chạy điện di dịch glycoprotein thu được từ các peak 2 sau khi chạy sắc ký của các mẫu tủa bằng cồn, muối và acetone Các speak 1 không được chạy điện di vì hàm lượng glycoprotein thấp, các peak 2 được chạy điện di và cho kết quả như hình 4.4
Hình 4.4: Kết quả chạy điện di của các dịch glycoprotein sau tinh sạch
Thứ tự cho mẫu vào các giếng :
Giếng 2: Dịch glycoprotein thu từ peak 3 sau khi chạy sắc ký của mẫu tủa muối Giếng 3: Dịch glycoprotein thu từ peak 1 sau khi chạy sắc ký của mẫu tủa acetone Giếng 4: Dịch glycoprotein thu từ peak 2 sau khi chạy sắc ký của mẫu tủa cồn
Từ kết quả chạy điện di, tính giá trị Rf của từng glycoprotein trong thang chuẩn Từ đó xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính giữa các giá trị Rf và Log( trọng lượng phân tử ) của các glycoprotein trong thang chuẩn bằng phần mềm Excel
Bảng 4.16: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử glycoprotein chuẩn
LogMW 5.176 5.000 4.875 4.699 4.544 4.398 4.176 MW(Dal) 150000 100000 75000 50000 35000 25000 15000 Đồ thị 4.10: Sự tương quan giữa logMW và giá tri Rf
Phương trình hồi quy tuyến tính thu được từ độ thị như sau:
Y=Log(MW) là log (trọng lượng phân tử glycoprotein)
X=Rf là tỷ số giữa khoảng cách di chuyển của glycoprotein và khoảng cách di
79 chuyển vạch màu bromophenol blue cuối cùng tính từ gel phân cách
Từ phương trình hồi quy tuyến tính, có thể suy ra công thức tính trọng lượng phân tử của glycoprotein:
Trong hai peak thu được sau khi chạy sắc ký, peak 2 có hàm lượng glyprotein cao nhất và cho các vạch trên điện di đồ.Từ đó có thể dự đoán các vạch của peak
2 có chứa glycoprotein từ dịch chiết cây sâm đất Giá trị Rf và trọng lượng phân tử của các loại glycoprotein được tính dựa vào kết quả và phương trình hồi quy tuyến tính thì ta có kết quả các bảng
Bảng 4.17: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử của dịch glycoprotein tủa bằng muối
Bảng 4.18: Giá trị Rf và trọng lượng phân tử của dịch glycoprotein tủa bằng Acetone
Bảng 4.19 : Giá trị Rf và trọng lượng phân tử của dịch glycoprotein tủa bằng cồn
Phương pháp khỏa sát ảnh hưởng của các yếu tố lý hóa đến hoạt tính Glycoprotein
4.10 Phương pháp khỏa sát ảnh hưởng của các yếu tố lý hóa đến hoạt tính Glycoprotein
4.10.1 Ảnh hưởng pH đến hoạt chất glycoprotein từ tác nhân tủa cồn, acetone, muối (NH 4 ) 2 SO 4
Bảng 4.20 : Kết quả khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt chất glycoprotein từ tác nhân tủa cồn, acetone, muối (NH 4 ) 2 SO 4 pH
Hàm lượng glycoprotein với tác nhân tủa Cồn
Hàm lượng glycoprotein với tác nhân tủa
Hàm lượng glycoprotein với tác nhân tủa Muối ĐC 0.76 0.81 0.96
8.2 0.64 0.65 0.73 Đồ thị 4.11: Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt chất glycoprotein từ tác nhân tủa cồn, acetone, muối (NH 4 ) 2 SO 4
Nhận xét: Glycoprotein rất nhạy với pH của môi trường, pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất và ảnh hưởng đến độ bền của glycoprotein Chính vì thế pH ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của glycoprotein Vậy glycoprotein thích hợp với một vùng pH nhất định là pH= 6.7 Ở pH thấp hơn hay cao hơn pH tối ưu thì hàm lượng glycoprotein đều giảm
4.10.2 Ảnh hưởng NaCl % đến hoạt chất glycoprotein thu được từ tủa cồn, acetone, muối (NH 4 ) 2 SO 4
Bảng 4.21: Kết quả khảo sát ảnh hưởng NaCl % đến hoạt chất glycoprotein với tác nhân tủa cồn, acetone, muối (NH 4 ) 2 SO 4
Hàm lượng glycoprotein với tác nhân tủa Cồn 960 (%)
Hàm lượng glycoprotein với tác nhân tủa Acetone (%)
Hàm lượng glycoprotein với tác nhân tủa Muối (%) ĐC 0.73 0.86 1.08
82 Đồ thị 4.12: Khảo sát ảnh hưởng NaCl % đến hoạt chất glycoprotein với tác nhân tủa cồn, acetone, muối (NH 4 ) 2 SO 4
Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 4.21 và hình 4.12 cho thấy nồng độ NaCl % có ảnh hưởng đến hoạt chất glycoprotein Vậy khi nồng độ NaCl tăng thì hoạt chất glycoprotein giảm dần Ở nồng độ NaCl % cao, các ion liên kết mạnh với phân tử nước, tạo áp suất thẩm thấu lớn, kéo theo phân tử nước ra khỏi liên kết với phân tử glycoprotein, phá vỡ lớp vỏ hydrat hóa bao quanh, làm cấu trúc không gian bậc cao của phân tử mất đi, phân tử glycoprotein duỗi ra bị biến tính làm cho hoạt chất glycoprotein giảm đi