Phương pháp nghiên cứu thu nhận glycoprotein từ rễ sâm đất, phương pháp trích ly bằng dung môi

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu thí nghiệm

3.2.2. Phương pháp nghiên cứu thu nhận glycoprotein từ rễ sâm đất, phương pháp trích ly bằng dung môi

Sơ đồ 3.1: Quy trình thu nhận glycoprotein.

Chiết xuất Glycoprotein dạng thô Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lọc gel

Thu dịch glycoprotein sau tinh sạch Xác định hàm lượng Glycoprotein Xác định trọng lượng phân tử của

protein thu sau sắc ký Rễ sâm đất

42

3.2.2.1. Phương pháp xác định hàm lượng glycoprotein theo phương pháp Bradford [1, tr.46]

a). Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sóng 595nm. Độ hấp thu ở bước sóng 595nm có liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein.

Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là Bovine plasm – globulin hoặc Bovine serum albumin. Sau khi cho dung dịch thuốc nhuộm vào dung dịch protein, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ.

Bảng 3.5: Đường chuẩn Albumine

Ống nghiệm DC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Nồng độ Albumin

chuẩn (àg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dung dịch protein

0.1 (mg/ml) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

Thuốc thử

Bradford (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Tiến hành đo OD dung dịch trong các ống nghiệm ở bước sóng 595 nm.

b). Tính kết quả

Trị số mật độ quang (OD) của các ống từ 1 đến 10 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ xây dựng được đồ thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ protein chuẩn (μg/ml). Tương tự như vậy, trị số mật độ quang của mẫu thí nghiệm cũng trừ đi trị số của ống thử không, rồi chiếu vào đường chuẩn albumin để suy ra lượng protein có trong dịch mẫu thí nghiệm (μg/ml).

43

3.2.2.2. Nguyên tắc tách chiết glycoprotein từ bột rễ cây sâm đất

- Rễ Sâm Đất rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ 500C và nghiền mịn. Bột rễ cây Sâm đất được ngâm trong dung dịch đệm natri acetat 0,02 M và đem ủ ở 40C .

- Sau đó thêm Mercaptoethanol vào với tỷ lệ 0,1 % (w/v) và đem ủ ở 40C.

- Hỗn hợp sau đó được lọc qua phin lọc (đường kính 0,1 mm), dịch thu được sau khi vắt được ly tâm loại cặn ở tốc độ 8000 v/p trong 20 phút ở 40C.

- Cồn 960C và acetone rồi đem ủ ở 40C.

- Sau đó ly tâm ở tốc độ 8000 v/p trong 10 phút ở 40C thu kết tủa.

- Sấy kết tủa bằng thiết bị sấy hút chân không ở 400C.

- Hòa tan glycoprotein thô trong một lượng vừa đủ dung dịch đệm natri axetat 0,02M loại muối (NH4)2SO4 qua sắc ký lọc gel sephadex G25.

- Dung dịch này được lọc qua cột Sephadex G-50, thu dịch glycoprotein tinh sạch.

3.2.2.3. Khảo sát tỷ lệ đệm tách chiết tối ưu cho quá trình thu nhận glycoprotein từ bột rễ cây sâm đất

Thí nghiệm 1.

Bột rễ cây sâm đất ngâm trong dung dịch đệm Natri-acetat 0,02 M, với tỷ lệ bột rễ/dung dịch natri acetat tương ứng (w/v) và đem ủ ở 4oC.

44

Sơ đồ 3.2: Khảo sát tỷ lệ đệm natri acetate tối ưu cho quá trình tách chiết thu nhận glycoprotein

Sau 12 giờ đem lọc thu dịch chiết và đem xác định hàm lượng glycoprotein ở các tỷ lệ bột rễ và dung dịch đệm, để tìm ra tỷ lệ dung dịch đệm tối ưu nhất cho tách chiết glycoprotein từ bột rễ sâm đất.

3.2.2.4. Khảo sát pH và thời gian tối ưu cho quá trình tách chiết glycoprotein ở rễ cây sâm đất

a). Khảo sát pH tối ưu cho quá trình tách chiết glycoprotein ở rễ cây sâm đất.

Thí nghiệm 2.

Bột rễ cây sâm đất ngâm trong dung dịch đệm Natri-acetat 0,02M, pH tương ứng với tỷ lệ bột rễ và dung dịch natri acetat đã chọn được ở thí nghiệm 1 và đem ủ ở 4oC.Khảo sát từng pH của dung dịch đệm Natri-acetat theo sơ đồ sau:

45

Sơ đồ 3.3: Khảo sát pH tối ưu cho quá trình tách chiết thu nhận glycoprotein Sau khi có hàm lượng glycoprotein ứng với từng pH. Ở pH nào cho hàm lượng glycoprotein cao nhất, đó là pH tối ưu cho quá trình tách chiết thu nhận glycoprotein và cố định pH này cho các thí nghiệm tiếp theo.

b). Khảo sát thời gian tối ưu cho quá trình tách chiết glycoprotein ở bột rễ cây sâm đất.

Thí nghiệm 3:

Tương tự, ta sẽ khảo sát thời gian tối ưu cho quá trình tách chiết thu nhận glycoprotein, quá trình đó được thực hiện theo sơ đồ sau:

46

Sơ đồ 3.4: Khảo sát thời gian tối ưu cho quá trình tách chiết thu nhận glycoprotein.

- Sau khi khảo sát thời gian, ta có hàm lượng glycoprotein ứng với từng thời gian. Ở thời gian nào cho hàm lượng glycoprotein cao nhất, thì đó là thời gian tối ưu cho quá trình tách chiết thu nhận glycoprotein và ta sẽ cố định thời gian này cho các thí nghiệm tiếp theo.

3.2.2.5. Khảo sát tủa cồn 960, muối (NH4)2SO4 và aceton để xác định tỷ lệ tủa tối ưu thu nhận glycoprotein [1, tr.36]

Từ dịch chiết có hàm lượng protein cao nhất ứng với pH và thời gian tối ưu, ta sẽ lấy dịch chiết này bắt đầu thực hiện thí nghiệm tiếp theo, khảo sát các tỷ lệ của cồn 960, muối ((NH4)2SO4) và acetone tối ưu cho quá trình tách chiết thu nhận glycoprotein.

47

Sơ đồ 3.5: Khảo sát tỷ lệ giữa dịch chiết với cồn 960, muối (NH4)2SO4, acetone tối ưu cho quá trình thu nhận glycoprotein.

Sau khi có hàm lượng glycoprotein ứng với các tỷ lệ tủa bằng cồn 960, muối (NH4)2SO4, a cetone. Ở tỷ lệ nào của 3 tác nhân cho hàm lượng glycoprotein cao nhất, đó là tỷ lệ tối ưu cho việc thu nhận glycoprotein từ dịch chiết cây Sâm Đất. Cố định tỷ lệ này cho các thí nghiệm tiếp theo.

48

a). Phương pháp tủa glycoprotein bằng muối (NH4)2SO4. Bảng 3.6: Tỉ lệ tủa bằng muối

Nồng độ (NH4)2SO4 (%) 40% 45% 50% 55% 60% 65% 70%

Dịch glycoprotein (ml) 10 10 10 10 10 10 10

Hàm lượng (NH4)2SO4 (g) 2.42 2.77 3.14 3.51 3.90 4.30 4.72

- Tiến hành tủa trong điều kiện nhiệt độ thấp để đảm bảo hoạt chất glycoprotein không bị biến tính và quá trình tủa xảy ra tốt.

- Thể tích dịch glycoprotein và khối lượng muối (NH4)2SO4 tương ứng với mỗi nồng độ được sử dụng như trong bảng.

- Dịch chiết glycoprotein thô được cho vào becher 100ml đặt trong chậu nhỏ chứa đá vụn xung quanh becher. Tất cả được đặt trên máy khuấy từ.

- Cho từ từ muối (NH4)2SO4 vào để muối có thời gian hòa tan trong dich glycoprotein.

- Khi muối hòa tan hết trong dung dịch glycoprotein thì để yên trong 30 phút ở nhiệt độ 40C.

- Lấy dịch đi ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút.

- Thu tủa, hòa tan 2ml trong dung dịch đệm natriacetate 0.02M, pH 6.8 rồi bảo quản lạnh ở 40C.

b). Phương pháp tủa glycoprotein bằng cồn 960 Bảng 3.7: Tỉ lệ tủa bằng cồn 960

Tỷ lệ dịch chiết : cồn 960 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6

Dịch glycoprotein (ml) 10 10 10 10 10 10

Dung dịch cồn 960 (ml) 10 20 30 40 50 60

- Để tránh làm biến tính glycoprotein, cồn 960 phải được làm lạnh trước khi tiến hành tủa.

49

- Thể tích dịch glycoprotein và thể tích cồn tương với tỷ lệ được sử dụng trong bảng.

- Lắc đều hỗn hợp bảo quản lạnh ở 40C trong 30 phút.

- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút.

- Thu tủa, hòa tan trong 2ml dung dịch đệm natriacetate pH 6.8 rồi đem bảo quản lạnh ở 40C.

c). Phương pháp tủa Glycoprotein bằng acetone Bảng 3.8: Tỉ lệ tủa bằng acetone

Tỷ lệ dịch chiết : acetone 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6

Dịch glycoprotein (ml) 10 10 10 10 10 10

Dung dịch acetone (ml) 10 20 30 40 50 60

- Để tránh làm biến tính glycoprotein, acetone phải được làm lạnh trước khi tiến hành tủa.

- Thể tích dịch glycoprotein và thể tích cồn tương với tỷ lệ được sử dụng trong bảng.

- Lắc đều hỗn hợp bảo quản lạnh ở 40C trong 30 phút.

- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút.

- Thu tủa, hòa tan trong 2ml dung dịch đệm natriacetate pH 6.8 rồi đem bảo quản lạnh ở 40C.

3.2.2.6. Khảo sát thời gian tủa tối ưu trong quá trình thu nhận glycoprotein Bảng 3.9: Thí nghiệm khảo sát thời gian tủa (NH4)2SO4 tối ưu thu nhận glycoprotein ở dịch chiết cây sâm đất

Thời gian tủa (giờ)

1 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 Dịch

glycoprotein 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Hàm lượng

(NH4)2SO4 60% 3.9 3.9 3.9 3.9 3.9 3.9 3.9 3.9 3.9 3.9 3.9 3.9

50

Bảng 3.10: Thí nghiệm khảo sát thời gian tủa acetone tối ưu thu nhận glycoprotein ở dịch chiết cây sâm đất.

Thời gian tủa (giờ) 1 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 Dịch glycoprotein 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Dung dịch acetone 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 Bảng 3.11: Thí nghiệm khảo sát thời gian tủa (NH4)2SO4 tối ưu thu nhận glycoprotein ở dịch chiết cây sâm đất.

Thời gian tủa (giờ) 1 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 Dịch glycoprotein 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Dung dịch Cồn (ml) 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 40 - Ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút.

- Thu tủa, hòa tan trong 2ml dung dịch đệm natriacetate pH 6.8 rồi đem bảo quản lạnh ở 40C.

- Sau khi sát định hàm lượng glycoprotein ứng với từng thời gian. Ở thời gian nào cho hàm lượng glycoprotein cao nhất, đó là thời gian tối ưu cho quá trình tủa glycoprotein.

3.2.2.7 . Tinh sạch glycoprotein từ cây sâm đất bằng sắc ký lọc gel [10,tr.60]

a). Nguyên tắc

Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để phân tách những phân tử có kích thước, trọng lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di chuyển nhanh và được thoát ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ chạy trong lỗ gel.

51

Hình 3.2: Bộ máy chạy sắc ký lọc gel

b). Dụng cụ và hóa chất

* Dụng cụ và thiết bị.

- Hệ thống sắc ký cột áp suất thấp, hãng Bio-Rad, Mỹ.

- Phễu đổ gel

- Bình hút chân không - Flow Adapor 1,5 cm

- Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 50x1,5cm

- Bình đựng dung dịch đệm natri acetate 0.02M, pH 6.8

* Hóa chất

- Gel Sephadex G-50 có các đặc tính: Dạng hạt mịn, kích thước hạt 45-90m;

khả năng ngậm nước: 12ml/1g gel khô; phạm vi phân tách: 4.000-150.000 daltons.

- Sephadex G25 để loại muối (NH4)SO4

- Đệm Acetate pH 5.0: Dùng khử bọt khí trước khi dùng.

c). Các bước tinh sạch glycoprotein.

Chuẩn bị cột sắc ký : Sử dụng cột sắc ký Bio - Rad, kích thước 50 x 1.5 cm.

Bước1: Chuẩn bị gel

Cho 5g bột gel Sephadex G-50 từ từ vào dung dịch đệm Natri-acetat 20 mM;

52

pH 6.8 đựng trong cốc, không khuấy, để yên trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng cho quá trình tương nở xảy ra hoàn toàn tạo thể huyền phù đồng nhất của các hạt, sau khi quá trình tương nở xảy ra hoàn toàn gạn lớp nổi trên bề mặt bỏ đi, đổ thêm đệm cho ngập phần gel và đuổi bọt khí bằng máy đánh sóng siêu âm.

Để gel ổn định cho đến khi 90 - 95% số hạt ổn định, gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để lọai các hạt mịn. Lặp lại công việc trên 4 lần để loại hơn 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel.

Bước 2 : Nhồi cột

Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột. Rót đều, vừa rót vừa khuấy nhẹ để gel hấp phụ lắng từ từ theo trọng trường. Tránh không cho tạo thành bọt khí, phải rót liên tục. Dịch đệm thừa cho chảy qua van dưới cột. Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 - 5 cm, mở khóa đầu ra của cột cho đến khi cột được nạp đầy gel.Khi cột đã được nạp đầy gel, đặt một đĩa giấy lọc hoặc ít bông thủy tinh lên bề mặt nền cột để bảo vệ mặt cột khi cho mẫu vào hoặc khi thay đổi dịch rửa trôi, khóa đầu ra của cột và gắn adaptor vào.

Cho chạy máy sắc ký để ổn định cột bằng đệm Natri-acetat có chứa 2- mecaptoethanol và natriazit với lượng đệm chạy bằng 2 - 3 lần thể tích cột. Sau khi cột đã ổn định đóng đầu ra của cột và điều chỉnh adaptor xuống sát lớp nền gel.

Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền gel qua adaptor.

Bước 3:Nạp mẫu vào cột

Chuẩn bị mẫu: Mẫu chạy sắc ký phải sạch, hòa tan mẫu trong dung dịch đệm Natri- acetat 20 mM; pH 6.8. Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0,45 micrometre) để làm gia tăng độ bền và thời gian sử dụng của cột.

Dùng xi lanh hút mẫu, bơm mẫu vào hệ thống sắc ký.

53

Sơ đồ 3.6: Chuẩn bị mẫu chạy sắc ký

Bước 4: Thêm dung dịch đêm rửa

Sau khi mẫu thấm hết vào cột, bổ sung ngay vài ml dung dịch đệm để rửa, để cho mẫu còn đọng lại thấm hết vào nền cột. Mâu va dung dịch đêm di chuyên qua côt. Các phân tử di chuyển vào và ra ngoài lỗ hạt gel. Sau đó nối cột với bình chứa dịch thổi cột.

Bước 5: Thổi cột

Dịch thổi cột được giữ ổn định ở tốc độ thích hợp. Điều này rất quan trọng vì tốc độ thổi cột cao cho kết quả tách mẫu thấp, ngược lại, tốc độ thổi cột thấp kéo dài thời gian tách mẫu, các peak bị hoãng ra cho kết quả tách thấp.

Thổi cột liên tục bằng dung dịch đệm natri acetate.

Bước 6: Thu mâu va xác định mẫu tách được

Dịch ra khỏi cột được đo độ hấp thụ ở bước sóng 280 nm bằng detector trong hệ thống sắc ký và được thể hiện độ hấp thu dưới dạng sắc ký đồ bằng phần

Dịch chiết thu được ở pH và thời gian

tối ưu

Tỷ lệ tủa tối ưu của cồn Tỷ lệ tủa tối ưu của muối (NH4)2SO4

Tỷ lệ tủa tối ưu của Acetone

Hòa tan tủa bằng dung dịch đệm và định mức thành 3ml

Dùng 1ml xác định hàm lượng protein trước sắc ký

Dùng 2ml tiến hành chạy sắc ký lọc gel

54 mềm LP - Data View trên máy tính.

Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (collector).

Dựa vào sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak. Các peak sẽ được phân tích hàm lượng glycoprotein sau sắc ký theo phương pháp Bradford.

 Tính kết quả

Xác định hiệu suất quá trình tinh sạch bằng hệ thống sắc ký lọc gel:

3.2.2.8 Xác định trọng lượng phân tử Glycoprotein bằng phương pháp điện di SDS – PAGE [3]

a). Nguyên tắc.

Điện di là một kỹ thuật được dùng để phân tách tốt đối với các phân tử có kích thước tương đối lớn và đôi khi có thể tinh sạch các đại phân tử đặc biệt là các protein và các nucleic acid trên cơ sơ kích thước trên khối lượng , điện tích và cấu hình của chúng.

Các phân tử protein có thể chạy điện di trên một khuôn đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel.

Trong đó, gel của agarose và polyacrylamide được sử dụng phổ biến nhất. Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có các giếng để nạp (loading) mẫu. Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điện và một vài loại đệm để duy trì pH ở một giá trị không đổi.

b) . Cách tiến hành chạy điện di.

Bước 1: Chuẩn bị hóa chất pha gel

Pha 100mg ammonium persulphate trong 1ml nước cất 2 lần (pha mới mỗi lần chỉ sử dụng trong ngày).

ệ ấ ℎ ạ ℎ = ượ ắ ý

ượ ướ ắ ý 100%

55

Thành phần Lớp gel phân giải (lớp gel dưới 12%)

Lớp gel chồng lên (lớp gel trên 4%)

30% w/v Acrylamid – bis 4ml 1.3

1.5M Tris - HCl (pH8.8) 2.5ml 0

0.5M Tris – HCl (pH6.8) 0 2.5ml

10% w/v SDS 100μl 100μl

Nước cất 2 lần 3.4ml 6.1ml

Cho trước khi đổ gel

TEMED 10μl 10μl

Ammonium persulphate 50μl 50μl

Gel chỉ được pha trước khi đổ và sau khi pha xong phải đổ ngay để tránh gel bị đông.

Bước 2: Lớp gel thứ 1

Pha dung dịch để đổ lớp gel thứ 1 (lớp gel dưới 12%) theo bảng trên và trộn đều. Sau khi pha gel phải được đổ ngay vào khuôn, khi đổ phải nhanh tránh gel bị đông và bọt khí. Lớp gel thứ nhất cách miệng khuôn 1cm. Sau đó đổ ngay nước cất vào cho đầy khuôn để tạo đường phân cách thẳng giữa 2 lớp gel.

Đợi gel đông khoảng 1 giờ.

Bước 3: Lớp gel thứ 2

Sau khi lớp gel thứ nhất đông, đổ nước cất ra hết (không tháo dời khuôn ra khỏi khung). Pha dung dịch đổ lớp gel thứ 2 (lớp gel trên 4%) và đổ vào khuôn cho đến khi đầy miệng khuôn, cũng đổ nhanh để tránh gel bị đông và bọt khí.

Sau đó đặt lược từ từ vào khuôn và đợi gel đông khoảng 1 giờ.

Bước 4: Chạy điện di

Lớp gel thứ 2 đông gỡ lược ra khỏi gel và khuôn kính ra khỏi khung cố định và đặt vào khung chuẩn bị chạy điện di.

Pha 100ml buffer (dung dịch mẹ) với 900ml nước cất và đổ vào bể điện di khoảng 2/3 bể.

* Chuẩn bị mẫu

Pha 950μl SDS reducing buffer và 50μl β – mercaptothanol, sau đó pha loãng mẫu bằng dung dịch vừa pha với tỷ lệ là 20àl mẫu và 30àl dung dịch pha loóng.

56

Mẫu được dun nóng 95oC trong 5 phút và được đổ vào giếng.

Đậy lắp khung và cắm điện, cài đặt máy chạy 100v, thời gian 1h30 phút.

Bước 5: Cách pha thuốc nhuộm gel

* Pha thuốc nhuộm gel:

- Coomassie R250 1g

- Methanol 450ml

- Nước cất 450ml

- Acid acetic đậm đặc 100ml

- Dẫn về 1000ml

* Pha thuốc giải nhuộm:

- Methanol 100ml

- Acid acetic đậm đặc 100ml

- Nước cất 800ml

Bước 6: Nhuộm gel

Sau khi chạy xong, gel được lấy ra khỏi khuôn và để vào nước cất, rửa với nước cất và được thay 3 lần. Cho thuốc nhuộm coomassie vào nhuộm khoảng 1 giờ và tiếp tục rửa bằng nước cất 2 hoặc 3 lần, sau đó cho thuốc giải nhuộn cho đến khi nước trong.

c). Tính trọng lượng phân tử

Đo khoảng cách di chuyển của các vạch protein từ gel phân tách tới các vạch protein và khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối cùng.

Tính giá trị Rf :

Vẽ biểu đồ Log của các giá trị trọng lượng phân tử của các protein chuẩn và các giá trị Rf của chúng.

Trọng lượng phân tử của các vạch protein chưa biết trọng lượng phân tử có thể xác định thông qua giá trị Rf của chúng qua phương pháp ngoại suy từ đồ thị.

= ℎ ả á ℎ ℎ ể ủ

ℎ ả á ℎ ℎ ể ủ ạ ℎ à ℎ