Phương pháp điện di là phương pháp nghiên cứu sự dịch chuyển của các điện tử mang điện tích trong điện trường. Sự di chuyển điện tử trong điện trường phụ thuộc vào độ lớn, điện tích, hình dạng, và thành phần hóa học của phân tử. Điện di là phương pháp thuận lợi và không đắt tiền đặt biệt để phân tích và tinh sạch vài dạng phân tử sinh học nhất là acid nucleic.
Phương pháp điện di rất phù hợp để phân tích độ tinh sạch và nhận dạng các phân tử lớn. Một phân tử trong một hỗn hợp đều có một điện tích và độ lớn duy nhất, vì vậy độ dịch chuyển của chúng trong một điện trường là duy nhất.
Gel Polyacryamide được tạo thành từ phản ứng polimer hóa acrylamide với các ưu điểm sau: (1) có thể dùng để phân tách các phân tử protein nhỏ và vừa.
(2) có thể thích hợp với mẫu có độ lớn khác nhau ở dải rộng, (3) màng giá đỡ không ảnh hưởng tới quá trình dịch chuyển của phân tử tích điện trong điện trường, vì giữa màng đỡ và phân tử tích điện có tương tác yếu, (4) màng giá đỡ có độ bền vật lý cao. Sau khi qua các bước ly trích và tinh sạch, người ta thường kiểm tra lại độ tinh sạch của protein nhờ kỹ thuật điện di. Nhờ kỹ thuật này ta còn có thể xác định trọng lượng phân tử và độ tinh sạch của chúng.
24
Điện di trên gel là tách các phân tử sinh học (DNA, RNA, Protein) bằng cách cho đi qua chất nền là gel trong một điện trường.
Kỹ thuật điện di SDS - PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) là một kỹ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS.Gel polyacrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân tử acrylamide và N,N’- methylene – bis - acrylamide. Quá trình polymer hóa được xúc tác bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS), N, N, N’, N’ – tetramethylenediamine (TEMED).
Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc điện trường và kích thước của lỗ gel. Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách phụ thuộc vào nồng độ acrylamide và bis- acrylamide, nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân tử sinh học có kích thước lớn và ngược lại. SDS là tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kỹ thuật này protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfide là mercaptoethanol. Với các tác nhân này protein từ cấu trúc bậc 2,3,4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều được tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định. Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường.
Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác nhau đã biết. Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên tục ( discontinuous gel). Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp:
+ Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên) : các protein trong mẫu được dồn lại và tạo một lớp băng mỏng.
+ Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới) : tạo ra các băng protein có trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban đầu.
25
Hai lớp gel này được phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide và vị trí .
Kỹ thuật SDS - PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng lượng phân tử từ 10.000-200.000 Daltons. Những phân tử protein có trọng lượng lớn hơn 200.000 daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide hơn 2,5%.
26