CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu thí nghiệm
3.2.1. Phương pháp phân tích chỉ tiêu sinh hóa ở rễ cây sâm đất
- Cân phân tích có độ chính xác 0.0001g - Cốc sứ
- Bình hút ẩm
- Tủ sấy bằng điện, có khả năng điều chỉnh nhiệt độ 1000C- 1050C b) Cách tiến hành thí nghiệm.
- Cốc đã được sấy khô trong tủ sấy ở 1050C trong 3 giờ và sau đó làm nguội trong bình hút ẩm đến nhiệt độ phòng, đem cân chính xác (m0)
- Cân mẫu thử 1g cho vào cốc đã xác định khối lượng (m0) thì ta được (m1)
- Để cốc có chứa mẫu thử vào tủ sấy ở nhiệt độ 1050C trong thời 3 giờ. Sau đó làm nguội trong bình hút ẩm ở nhiệt độ phòng rồi đem cân xác định (m2).
- Lập lại thao tác trên nhưng mỗi lần chỉ để khoảng 30 phút trong tủ sấy cho đén khi lượng mất đi của hai lần cân liên tiếp không chênh lệch nhau quá 0,002- 0.004g.
c) Công thức tính kết quả.
Độ ẩm tính bằng phần % khối lượng được tính theo .
Trong đó:
m0 : khối lượng cốc (g)
m1 : khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g) m2 : khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy (g)
% Độ ẩ = −
− 100%
29
3.2.1.2. Phương pháp xác định khoáng tổng số ở rễ cây sâm đất a) Nguyên tắc.
Tro thô là phần vật chất của mẫu còn lại sau khi nung (vô cơ hóa) ở nhiệt độ 5500C – 7000C trong 4 giờ. Để nguội trong bình hút ẩm. Cân tính sự chênh lệch trước và sau khi nung, ta có được hàm lượng tro trong mẫu.
b) Cách tiến hành thí nghiệm.
- Lấy mẫu thử và chuẩn bị mẫu thử, mẫu khô không khí đã xử lý sơ bộ rồi đem di sấy ở 1050C trong 3 giờ rồi đem để nguội trong bình hút ẩm ở nhiệt độ phòng.
- Cân 1 ± 0,001g vào chén nung đã biết P0 (trọng lượng bì) ta được P1.
- Đặt chén có mẫu vào lò nung (1000C) để mẫu cháy hết đến khói đen, đóng cữa lò nung, điều chỉnh đến nhiệt độ 6000C và nung trong 4 giờ đến khi mẫu có màu trắng hay màu xám xanh là được.
- Để hạ nhiệt độ khoảng 2000C, làm nguội trong bình hút ẩm (15 phút) và đem cân P2 lặp lại quá trình nung mẫu đến khối lượng không đổi.
c) Công thức tính kết quả.
Trong đó:
P0 : Khối lượng chén nung (g)
P1 : Khối lượng chén và mẫu trước khi nung (g) P2 : Khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g) m : Khối lượng mẫu đem nung (g)
3.2.1.3. Phương pháp định lượng Ca và Mg ở rễ cây sâm đất bằng phương pháp complexon III . [1, tr.109]
a) Nguyên tắc.
- Acid etylen diamin tetracetic (trilon B) có khả năng tạo những phức có nhiều cation, đặc biệt là Ca và Mg. Acid etylen diamin tetracetic hoặc muối natri của nó Complexon III ở môi trường kiềm, cho với Ca một phức bền vững mà
% ℎ á ổ ố = −
100%
30
oxalate ammonium cũng không lấy Ca để tủa được.
- Chỉ một vài chỉ thị màu đặc biệt mới phát hiện sự có mặt của Ca2+ và Mg2+,
nên eriocrom đen T cho màu đỏ khi có Ca2+ và Mg2+ tự do và màu lơ khi có những ion đó ở dạng phức chất.
b) Hóa chất.
- Dung dịch KCN 3%
- Dung dịch đệm amonium pH 10: cân 6.7g NH4Cl + 30ml nước cất, khấy cho tan, thêm 57ml NH4OH và nước cất cho đủ 100ml.
- Dung dịch Trilon B 0.02N: cân 3.73g Trilon B + nước cất cho đủ 1000ml.
- Chỉ thị Đen Eriochrom T: cân 0.1g Đen Eriochrom T + 50g NaCl tinh khiết, nghiền nhuyễn trong cối, cất vào chai thủy tinh đậy nút kín.
- Chỉ thị murexid: cân 0.1g murexid + 50g NaCl tinh khiết. Nghiền nhuyễn trong cối, cho vào chai thủy tinh đậy nút kín.
c) Cách tiến hành thí nghiệm.
- Chuẩn bi mẫu thử: cân 1g mẫu, nung thành tro trắng, hòa với 5ml HCl tinh khiết, đun sôi cách thủy tới khô. Làm lại lần hai như trên. Lần thứ 3 cho thêm 5ml HCl 20%, hòa tan, lọc trên giấy lọc không tro. Rửa chén nung nhiều lần bằng nước cất nóng. Dịch lọc và cả nước rửa cho cả vào bình định mức 50ml rồi định mức đến 50ml, ta có được dịch thử.
* Xác định tổng hàm lượng Ca2+ và Mg2+ có trong dịch thử.
- Cho vào bình tam giác 100ml
+ Dịch thử 10ml
+ Dung dịch KCN 3% 3 giọt + Dung dịch đệm pH 10 2 ml + Chỉ thị màu Eriochrom T 1/2hạt gạo
- Lắc đều và chuẩn độ bằng dung dịch Trilon B cho đến khi dung dịch từ màu đỏ tím chuyển sang màu xanh lam. Thể tích Trilon B 0.02N chuẩn độ dung dịch có giá trị tương đương với hàm lượng Ca và Mg. Thực hiện song song với mẫu thử không
* Xác định tổng hàm lượng canxi có trong dịch thử.
31
= 1
20.04 100
=( − )
12.16 100 - Cho vào bình tam giác 100ml
+ Dịch thử 10ml
+ Dung dịch NaOH 1ml + Dung dịch KCN 3% 3 giọt + Chỉ thị màu murexid 1/2hạt gạo
- Lắc đều và chuẩn độ bằng dung dịch Trilon B cho đến khi dung dịch từ màu hồng chuyển sang màu tím. Thực hiện song song với mẫu thử không
d) Công thức tính kết quả.
- Lượng canxi (mg) trong 100g mẫu khô là.
- Lượng magie (mg) trong 100g mẫu khô.
Trong đó:
V: Thể tích Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ tổng Ca và Mg.
V1: Thể tích Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ Ca.
C: Độ nguyên chuẩn của dung dịch Trilon B.
a: trọng lượng mẫu khô tương đương với thể tích dung dịch mẫu lấy để chuẩn độ.
3.2.1.4. Phương pháp định lượng Phospho tổng số ở rễ cây sâm đất bằng quang phổ kế [1, tr.116]
a) Nguyên tắc.
Phương pháp dựa vào khả năng ion Orthophosphate phản ứng với ammonium molybdate tạo thành phosphormolybdate, phức chất có màu xanh lơ
2(MoO24MoO3) + H3PO4 (MoO24MoO3).2H3PO4.4H2O
Hàm lượng phospho phụ thuộc vào cường độ màu của mẫu, đo ở bước sóng hấp
32
thụ cực đại 650nm với cuvet có chiều dày 10mm, dung dịch đối chứng là dung dịch nước cất.
b) Hóa chất.
- Dung dịch 1: Dung dịch Na2SO3 20% là cân 20g Na2SO3 hòa vào trong 100ml cất
- Dung dịch 2: Dung dịch hydroquinone [C6H4(OH)2] 0.5% là cân 0.5g hydroquinone hòa tan trong một ít nước và 3 giọt H2SO3, thêm nước cất cho đủ 100ml.
- Dung dịch 3: Dung dịch amoni molybdate 5%.
Cân 50g amoni molybdate hòa tan trong 100ml nước cất. Cho 150ml H2SO4 đậm đặc vào trong 400ml nước cất, để nguôi thêm tiếp dung dịch amoni molybdate 5% rồi để nguội thêm nước cất cho đủ 100ml.
- Hỗn hợp thuốc thử: Trộn các dung dịch 1,2,3 theo tỷ lệ 1:1:1 thì ta được hỗn hợp thuốc thử.
- Dung dịch HCl 10%: 250ml HCl đậm đặc cộng với 750ml nước cất.
- Dung dịch chuẩn phosphate: Dung dịch chuẩn gốc ( chứa 100àg/ml phospho).
Hòa tan 1.4394g KH2SO4 trong bình định mức 1000ml bằng nước cất và định mức đúng 1000ml.
c) Cách tiến hành thí nghiệm.
* Chuẩn bị dung dịch tro phân tích.
- Cân chính xác 1g mẫu đem đi vô cơ hóa ở 5500C trong 4 giờ, để nguội đến nhiệt độ phòng thấm ướt tro bằng vài giọt nước cất và thêm 10ml HCl 10% + 0.5ml HNO3 đậm đặc.
- Đun nhẹ trong 5 phút (đến khi thấy bay hơi), để nguội đến nhiệt độ phòng.
Rửa sạch chén nung và định mức thể tích dung dịch tro đến 50ml bằng nước cất.
33
% =
10 100%
Bảng 3.1: Đường chuẩn Phospho
Ống 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Nống độ phospho (àg/ml)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Dung dịch phopspho chuẩn (ml)
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 Dung dịch
thuốc thử (ml) 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
- Lắc đều và để 30 phút rồi đo ở bước sóng 650nm
* Xác định hàm lượng phospho có trong cây sâm đất.
- Lấy 1ml dung tro cho vào ống nghiệm
- Thêm 3ml hỗn hợp thuốc thử + nước cất cho đủ 10ml. Lắc đều hỗn hợp, để 30phút. Đo ở bước sóng 650nm.
d) Công thức tính kết quả
Trong đó:
X: số àg P cú trong 1ml dung dịch tro Vddtro: thể tích dung dịch sau khi tro hóa m: khối lượng mẫu thử (g)
3.2.1.5. Phương pháp định lượng Sắt ở rễ cây sâm đất [1, tr.122]
a) Nguyên tắc.
Fe2+ trong dung dịch kết hợp với orthophenaltrolin thành một phức chất có màu đỏ khá bền vững trong môi trường pH=3-9. Nếu muốn màu không bi ảnh hưởng của thuốc thử thừa và sự có mặt của các ion khác, phản ứng cần tiến hành ở pH=3.5-4.5.
34
Phức này gồm có 3 phân tử orthophenaltrolin kết hợp với một ion Fe2+. Phản ứng đặc hiệu cho Fe2+ nên phải chuyển hết Fe3+thành Fe2+ bằng cách khử vơi hydroquinon.
b) Hóa chất.
- Dung dịch HCl đậm đặc - Dung dịch HCl 20%
- Dung dịch orthophenaltrolin 0.5% trong nước
- Dung dịch đệm pH=3.5-4.5 gồm 650ml CH3COOH 0.1M +350ml CH3COONa 0.1M
- Dung dịch hydroquinon 1% trong dung dịch đệm pH=4.5
- Dung dịch chuẩn sắt: cân 0.7203g (NH4)2Fe(SO4)26H2O, thêm nước cất cho đủ 1000ml. Như vậy dung dịch này chứa 10mg/l Fe2+ .
c) Cách tiến hành thí nghiệm.
- Chuẩn bị mẫu: Cân 1g mẫu đem nung thành tro trắng, hòa tro với 5ml HCl đậm đặc, đun trên bếp cách thủy cho đến khô, lập lại lần thứ hai như trên. Lần thứ ba hòa tan tro trong 5ml HCl 20%, lọc, rửa cặn, giấy lọc và phễu nhiều lần bằng nước cất nóng. Dung dịch lọc và nước rửa cho vào bình định mức 50ml, thêm nước cất vừa đủ 40ml. Điều chỉnh pH=3.5-4.5 bằng CH3COONa 0.2M. Sau đó thêm nước cất cho đủ 50ml. Ta được dịch thử.
Bảng 3.2: Đường chuẩn Sắt
Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 7
Nồng độ Fe chuẩn (mg/l) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.5 Dung dịch Fe chuẩn (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.5
Nước cất (ml) 10 9.8 9.6 9.4 9.2 9.0 8.5
Dung dịch hydroquinon (ml) 1 1 1 1 1 1 1
Dung dịch orthophenaltrolin (ml) 1 1 1 1 1 1 1
Lắc đều để yên trong 1 giờ rồi đem đọc mật quang ở bước sóng 485nm
* Xác định hàm lượng sắt có trong dịch thử của rễ cây sâm đất.
35 - Cho vào ống nghiệm:
+ Dịch thử 10ml
+ Dung dịch hydroquinon 1ml
- Lắc đều và để yên trong 2 phút, cho thêm 1ml orthophenaltrolin và lắc đều.
Để 1 giờ, đem đọc mật độ quang trên máy so màu ở bước sóng 485nm, thực hiện mẫu thử không bằng nước cất .
d) Công thức tính kết quả.
- So sánh kết quả đọc được trên biểu đồ mẫu và từ độ pha loãng dung dịch chuẩn, tính hàm lượng Fe (mg) trong 100g mẫu khô
3.2.1.6. Phương pháp định lượng đường tổng số ở rễ cây sâm đất [1, tr.88]
a) Nguyên tắc.
Sự định phân này căn cứ vào phản ứng đặc trưng của đường và nhiều chất hưu cơ (phenol ) với sự hiện diện của H2SO4
b) Hóa chất.
- Cồn 960. - Cồn 800.
- Phenol 5% ( 5g phenol mới cất hòa trong 100ml nước cất).
- Dung dịch H2SO4 60%.
- Dung dịch đường chuẩn: Sacharose 0.1% (500mg sacharose, sấy khô ở 600C hòa tan trong 500ml nước cất )
c) Cách tiến hành thí nghiệm.
* Trích ly đường trong rễ cây sâm đất.
- Lấy 1g nguyên liệu khô cho vào cốc thủy tinh 50ml và thêm 10ml cồn 960 vào.
- Sau đó để cốc đun trên nồi cách thủy cho sôi 3 lần, khuấy đều bằng đũa thủy tinh.
- Sau đó để nguội, lọc qua giấy lọc không tro, khi lọc chỉ lấy dịch cồn ở lớp trên.
- Sau đó cho tiếp 10ml cồn vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun 2 lần cho đến sôi trong nồi cách thủy. Để nguội lại lọc tiếp, chiết rút như vậy khoảng 2 lần, xong đưa bã lên lọc và rửa 2-3 lần bằng cồn 800 nóng.
36
- Cồn qua lọc cho bay hơi trên nồi cách thủy, sau khi cho bay hơi cồn thì mẫu có thể để lâu trong bình hút ẩm.
- Cặn khô trong cốc được pha loãng với 50ml nước cất, rồi đem lọc qua giấy lọc để loại cặn ta được dịch đường.
Bảng 3.3: Hàm lượng Đường tổng số
Ống 0 1 2 3
Dung dịch đường (ml) 0 1 1 1
Nước cất (ml) 1 0 0 0
Phenol 5% (ml) 1 1 1 1
H2SO4 đậm đặc (ml) 5 5 5 5
- Để yên 10 phút rồi lắc và để yên trên bể ổn nhiệt từ 10 – 20 phút ở 25 – 300C để xuất hiện màu. Màu bền vững trong vài giờ.
- Xác định màu trên quang phổ kế ở bước sóng 490nm.
37 Bảng 3.4: Đường chuẩn Đường tổng
Ống nghiệm
Nồng độ đường chuẩn
(àg/ml)
Dung dịch đường chuẩn
(àl)
Nước cất (àl)
Phenol 5%
(ml)
Dung dịch H2SO4 (ml)
0 0 0 1000 1 5
1 10 10 990 1 5
2 20 20 980 1 5
3 30 30 970 1 5
4 40 40 960 1 5
5 50 50 950 1 5
6 60 60 940 1 5
7 70 70 930 1 5
8 80 80 920 1 5
9 90 90 910 1 5
10 100 100 900 1 5
- Để yên 10 phút rồi lắc và để yên trên bể ổn nhiệt từ 10 – 20 phút ở 25 – 300C để xuất hiện màu. Màu bền vững trong vài giờ.
- Xác định màu trên quang phổ kế ở bước sóng 490nm, rồi vẽ đồ thị mẫu.
d) Công thức tính kết quả.
Dựa vào đồ thị mẫu tính hàm lượng đường có trong dịch đường trích ly từ rễ cây sâm đất.
3.2.1.7. Phương pháp định lượng Lipid ở rễ cây sâm đất theo phương pháp Soxhlet [1, tr.97]
a) Nguyên tắc.
- Dựa vào tính chất hòa tan của lipid trong dung môi hưu cơ ( ether ) để chiết rút lipid khỏi nguyên liệu.
b) Hóa chất.
- Petroleum ether.
38 c) Cách tiến hành thí nghiệm.
- Chuẩn bị bao đựng mẫu: cắt một mảnh giấy lọc có kích thước 8 x 10 cm, gấp thành bao đựng mẫu sấy khô ở nhiệt độ 1050C trong 3 giờ, để nguội trong bình hút ẩm, cân khối lượng bao đựng mẫu.
- Mẫu sấy khô ở nhiệt độ 1050C trong 3 giờ, để nguội trong bình hút ẩm.
- Cân 2g mẫu đã sấy khô cho vào bao đựng mẫu gấp miệng bao lại. Sấy bao đựng mẫu cho đến khi trọng lượng không thay đổi . Sau đó lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, cân lại bao có chứa mẫu.
* Chuẩn bị mẫu trên máy Soxhlet.
- Cho mẫu vào ống hình trụ đựng mẫu một cách thận trọng để tránh rơi rớt.
- Đặt bình cầu đựng dung môi lên bếp đung.
- Lắp ống đựng mẫu với bình cầu đựng dung môi theo nguyên tắc bình thông nhau.
- Mở nước để nước chảy vào hệ thống sinh hàn.
- Sau cùng đổ dung môi chiết lipid qua phễu thủy tinh sao cho lượng dung môi đủ ngập mẫu và chiếm 2/3 dung tích của bình đựng dung môi.
* Chiết rút lipid trên máy soxhlet.
- Đặt lên bếp cách thủy chỉnh nhiệt độ 450C – 500C, đun cách thủy để trích lipid trong thời gian từ 10 – 12 giờ.
- Dung môi hũu cơ sôi 450C – 500C được chuyển dạng hơi theo xi phông được dẫn lên phía trên của bình chiết vào ống sinh hàn gặp lạnh ngưng thành giọt chảy xuống bình chiết ngập xi phông, ether chảy xuống bình đun.
- Sau khi chiết rút hết lượng lipid, đem sấy khô ở nhiệt độ 1050C khoảng 3 giờ, để nguội trong bình hút ẩm, cân lại.
d) Công thức tính kết quả.
39
% = −
− 100
Trong đó:
m1: trọng lượng bì.
m2: ( bì + mẫu ) trước khi chiết.
m3: ( bì + mẫu ) sau khi chiết.
3.2.1.8. Phương pháp định lượng Nitơ tổng số ở rễ cây sâm đất theo phương pháp Kjeldahl [1, tr.15]
a) Nguyên tắc.
Dưới tác dụng của H2SO4 đặc và các chất xúc tác, tất cả các dạng đạm hữu cơ được chuyển thành NH4+.
Đẩy NH4+ bằng dung dịch kiềm và hứng NH3 thoát ra bằng dung dịch axit.
b) Hóa chất.
- H3BO4 4%.
- HCl 0.25N.
- NaOH 40%.
- H2SO4 đậm đặc.
- Chất xúc tác ( K2SO4 : CuSO4 =3:1) c) Cách tiến hành thí nghiệm.
Bước 1: Vô cơ hóa mẫu.
- Cân 0.2g mẫu cho vào ống phá mẫu, bổ sung 1g chất xúc tác và 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc, nối vào bộ thu khí và bắt đầu phá mẫu.
- Khi thời gian phá mẫu kết thúc, để ống phá mẫu nguội (khoảng 5 phút) cho thêm 10ml nước cất, trộn đều, để nguôi và lắc vào máy chưng cất.
Bước 2: Chưng cất mẫu.
-Lắp ống phá mẫu vào bộ chưng cất, bổ sung thêm 30ml dung dịch NaOH 40%.
-Khởi động quy trình chưng cất, dịch chưng cất được thu nhờ bình thu có bổ sung trước 20ml H3BO4 4% và hỗn hợp chất chỉ thị. Ngừng chưng cất khi cho giấy quỳ
40
% = H ệ số qui đổ i 0.35
vào đầu thu mẫu mà thấy giấy quỳ không thay đổi thì ngừng chưng cất.
Bước 3: Chuẩn độ.
Chuẩn độ bằng HCl 0.25N, khi phát hiện màu phớt đỏ thì dừng chuẩn độ.
d) Công thức tính kết quả
Trong đó:
VHCl : thể tích HCl chuẩn độ nitơ tổng số.
m: trọng lượng mẫu thí nghiệm
Hệ số qui đổi: là 100/16 = 6.25 vì thông thường protein chứa khoảng 16%N.
3.2.1.9. Phương pháp xác định hàm lượng Cellulose ở rễ cây sâm đất [1, tr.87]
a) Nguyên tắc:
Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất biến đổi với tác dụng của acid mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu, còn chất khác thường đi kèm theo vơi cellulose như hemicellulose,lignin…ít bền hơn đối với tác dụng của acid và kiềm, nên bị oxy hóa, phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu và dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp acid nitric với acetic.
b) Hóa chất.
- Dung dịch acid nitric (HNO3) đặc.
- Dung dịch acid acetic (CH3COOH) đặc - Rượu ethylic 96%
c) Cách tiến hành thí nghiệm.
- Cân 1g mẫu cho vào bình dung tích 250ml.
- Thêm vào bình 16.5ml hỗn hợp gồm 15ml HNO3 đặc + 15ml CH3COOH đặc rồi lắp ống sinh hàn làm lạnh hồi lưu vào bình và đun sôi hỗn hợp 30 phút rồi để nguội.
- Rửa kết tủa cellulose nhiều lần bằng nước cất nóng ( mỗi lần 10-15ml) - Rửa rượu ethylic 96% 1-2 lần.
- Sấy giấy lọc có chứa cellulose ở nhiệt độ 100-1050C đến trọng lượng không đổi thời gian 3-4 giờ.
41
= 100%
d) Công thức tính kết quả .
Hàm lượng cellulose được tính bằng công thức:
Trong đó:
X: hàm lượng cellulose tính bằng (%) a: trọng lượng cellulose.
w: trọng lượng mẫu làm thí nghiệm (g)