CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
4.8. Tinh sạch hoạt chất Glycoprotein qua lọc gel
Sau khi tiến hành chiết xuất và tủa glycoprotein bằng 3 tác nhân: cồn lạnh, acetone và muối (NH4)2SO4 bão hòa, chúng ta tiến hành chạy sắc ký các sản phẩm tủa ở các tỷ lệ và các nồng độ tối ưu. Đối với sản phẩm tủa bằng cồn lạnh và acetone, muối quá trình tinh sạch chỉ được thực hiện qua lọc gel Sephadex G-50
4.8.1. Tinh sạch hoạt chất glycoprotein qua lọc gel Sephadex G-50 sau khi tủa glycoprotein bằng cồn 960
Lấy 2ml dịch glycoprotein từ 3ml dịch tủa đã pha trong đệm, cho chạy qua hệ sắc ký cột sephadex G50.
Hình 4.1: Sắc ký đồ qua tinh sạch hoạt chất glycoprotein bằng sắc ký lọc gel sau khi tủa glycoprotein bằng cồn.
73
Kết quả tinh sạch glycoprotein qua lọc gel sau khi tủa glycoprotein bằng cồn 960 thu được 2 peak với thứ tự như sau.
Peak 1:Từ ống 18 đến ống 35 thu được 16ml Peak 2:Từ ống 42 đến ống 68 thu được 32ml
Xác định hàm lượng cho từng peak. Tuy nhiên hàm lượng protein của peak 2 là cao nhất nên có thể dự đoán peak 2 có chứa glycoprotein quan tâm.
Bảng 4.12: Kết quả xác định hàm lượng glycoprotein trước và sau khi tinh sạch qua tác nhân tủa glycoprotein bằng cồn 960.
∑hàm lượng (mg) Độ tinh sạch Hiệu suất (%)
Trước sắc ký 10.45 1 100
Sau sắc ký 2.23 2.23 21.33
Nhận xét:
Sau khi tinh sạch glycoprotein qua sắc ký lọc gel ta có thể nhận thấy hàm lượng glycoprotein sau khi tinh sạch thấp hơn hàm lượng glycoprotein trước khi tinh sạch. Vì một số protein tạp được loại bỏ sau khi chạy sắc ký lọc gel sephadex G50.
4.8.2. Tinh sạch hoạt chất glycoprotein qua lọc gel Sephadex G-50 sau khi tủa glycoprotein bằng acetone
Lấy 2ml dịch glycoprotein từ 3ml dịch tủa đã pha trong đệm, cho chạy qua hệ sắc ký cột sephadex G50.
74
Hình 4.2: Sắc ký đồ qua tinh sạch hoạt chất glycoprotein bằng sắc ký lọc gel sau khi tủa glycoprotein bằng acetone
Kết quả tinh sạch qua lọc gel bằng tác nhân tủa hoạt chất glycoprotein bằng Acetone thu được 1 peak như sau.
Peak: Từ ống 41 đến ống 51 thu được 30ml Xác định hàm lượng cho peak.
Bảng 4.13: Kết quả sát định hàm lượng glycoprotein trước và sau khi tinh sạch qua tác nhân tủa glycoprotein bằng Acetone.
∑hàm lượng (mg) Độ tinh sạch Hiệu suất (%)
Trước sắc ký 10.19 1 100
Sau sắc ký 3.48 3.48 34.15
Nhận xét:
Sau khi tinh sạch glycoprotein qua sắc ký lọc gel ta có thể nhận thấy hàm lượng protein sau khi tinh sạch thấp hơn hàm lượng protein trước khi tinh sạch. Vì một số protein tạp được loại bỏ sau khi chạy sắc ký lọc gel sephadex G50.
75
4.8.3. Tinh sạch hoạt chất glycoprotein qua lọc gel Sephadex G-50 sau khi tủa glycoprotein bằng muối (NH4)2SO4
- Lấy dung dịch ở các peak loại muối ở cột sephadex G25 cho chạy qua hệ sắc kí cột sephadex G50.
Hình 4.3: Sắc ký đồ qua tinh sạch hoạt chất glycoprotein bằng sắc ký lọc gel sau khi tủa glycoprotein bằng muối (NH4)2SO4.
Kết quả tinh sạch qua lọc gel bằng tác nhân tủa hoạt chất glycoprotein bằng muối (NH4)2SO4 960C thu được 3 peak với thứ tự như sau.
Peak 1: Từ ống 18 đến ống 24 thu được 15ml Peak 2: Từ ống 42 đến ống 45 thu được 5ml Peak 3: Từ ống 47 đến ống 63 thu được 25ml
Xác định hàm lượng cho từng peak. Tuy nhiên hàm lượng protein của peak 3 là cao nhất nên có thể dự đoán peak 3 có chứa glycoprotein quan tâm,
76
Bảng 4.14: Kết quả sát định hàm lượng glycoprotein trước và sau khi tinh sạch qua tác nhân tủa glycoprotein bằng muối (NH4)2SO4.
TT ∑hàm lượng (mg) Độ tinh sạch Hiệu suất (%)
Trước sắc ký 10.02 1 100
Sau sắc ký 6.08 6.08 60.67
Nhận xét:
Sau khi tinh sạch glycoprotein qua sắc ký lọc gel ta có thể nhận thấy hàm lượng glycoprotein sau khi tinh sạch thấp hơn hàm lượng glycoprotein trước khi tinh sạch. Vì một số protein tạp được loại bỏ sau khi chạy sắc ký lọc gel sephadex G50.
4.8.4. So sánh kết quả tinh sạch hoạt chất glycoprotein với 3 tác nhân tủa bằng cồn 960, acetone, muối
Bảng 4.15: Kết quả tinh sạch hoạt chất glycoprotein với 3 tác nhân tủa bằng cồn 960, acetone, muối qua sắc ký lọc gel.
Hàm lượng glycoprotein
(mg)
Độ tinh sạch
Hiệu suất
(%)
Chế phẩm glycoprotein thô 12.21 1 100
Dịch thu được sau khi chạy sắc ký, sau khi tủa glycoprotein bằng muối
(NH4)2SO4
6.08 6.08 60.67
Dịch thu được sau khi chạy sắc ký, sau khi tủa glycoprotein bằng cồn 960.
2.23 2.23 21.33
Dịch thu được sau khi chạy sắc ký, sau
khi tủa glycoprotein bằng acetone. 3.48 3.48 34.15
77 Nhận xét:
- Độ tinh sạch glycoprotein sau sắc ký như sau:
+ Khi tủa glycoprotein bằng muối : Độ tinh sạch gấp 6.08 lần so với chế phẩm glycoprotein thô ban đầu.
+ Khi tủa glycoprotein bằng cồn : Độ tinh sạch gấp 2.23 lần so với chế phẩm glycoprotein thô ban đầu.
+ Khi tủa glycoprotein bằng acetone : Độ tinh sạch gấp 3.48 lần so với chế phẩm glycoprotein thô ban đầu.
- Vậy sau khi tinh sạch glycoprotein trên sắc ký cột sephadex G50 thu hàm lượng cao trong quá trình tinh sạch, một số protein tạp được loại bỏ.
- Ta dựa vào bảng 4.15 thì độ tinh sạch và hiệu suất thu nhận của tủa muối là tốt nhất khi qua gel sephadex G50 và tủa cồn là thấp nhất.