Phòng trừ nấm aspergillus flavus link gây hại trên lạc trước và sau thu hoạch bằng chế phẩm trichoderma spp tại nghi lộc nghệ an vụ xuân năm 2012 luận văn thạc sĩ nông nghiệp

LỜI CAM ĐOANTôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn “Phòng trừ nấm Aspergillus flavus Link gây hại trên lạc trước và sau thu hoạch bằng chế phẩm nấm Trichoderma

Bộ giáo dục và đào tạo

Trờng đại học vinh

-Nguyễn thị minh thu

Phòng trừ nấm Aspergillus flavus Link gây hại

trên lạc trớc và sau thu hoạch bằng chế

phẩm Trichoderma spp tại Nghi Lộc - Nghệ An

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn

“Phòng trừ nấm Aspergillus flavus Link gây hại trên lạc trước và sau thu

hoạch bằng chế phẩm nấm Trichoderma spp tại Nghi Lộc - Nghệ An vụ Xuân năm 2012” là trung thực và chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị, một

công trình nghiên cứu nào

Tôi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn nàyđều đã được cảm ơn Trong luận văn tôi có sử dụng các thông tin từ nhiềunguồn khác nhau, các thông tin trích dẫn được sử dụng đều được ghi rõcác nguồn gốc, xuất xứ

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Minh Thu

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn thạc sĩ này, ngoài sự nỗ lực phấn đấu của bản thân

tôi còn nhận được nhiều rất nhiều sự giúp đỡ quý báu khác

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Trần Ngọc Lân, TS.Nguyễn Thị Thanh đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện vàhoàn thành luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô khoa Nông Lâm Ngư và ThS HồThị Nhung đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận vănnày

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các tập thể, cá nhân, bạn bè vàngười thân đã động viên khích lệ tôi trong thời gian học tập tại trường và thựchiện đề tài tốt nghiệp

Vinh, tháng 10 năm 2012

Tác giả luận văn

4 ICRISAT International Crops Research Institute

for the Semi-Arid Tropics

lý hạt giống bằng chế phẩm Trichoderma spp .47 Bảng 3.6 Hiệu lực phòng trừ của chế phẩm Trichoderma spp đối với nấm bệnh A flavus hại lạc vụ Xuân 2012 khi xử lý hạt giống với chế phẩm……50 Bảng 3.7 Diễn biến số lượng mầm bệnh A flavus trong đất ở thử nghiệm xử

lý hạt giống kết hợp tưới giai đoạn sinh trưởng bằng chế phẩm Trichoderma

spp trên lạc vụ Xuân 2012……….……….52

Bảng 3.8 Hiệu lực phòng trừ của chế phẩm Trichoderma spp đối với bệnh A.

flavus hại lạc khi xử lý hạt giống kết hợp tưới các giai đoạn sinh trưởng … 55

Bảng 3.9 Diễn biến số lượng mầm bệnh A flavus trong đất ở thử nghiệm tưới vào các giai đoạn sinh trưởng bằng chế phẩm Trichoderma spp trên lạc

vụ Xuân 2012 ……….58

Bảng 3.10 Hiệu lực phòng trừ của chế phẩm Trichoderma spp đối với bệnh

A flavus hại lạc khi tưới các giai đoạn sinh trưởng ………60

Bảng 3.11 Năng suất khô của lạc vụ Xuân 2012 tại Nghi Lộc - Nghệ An khi

sử dụng chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma spp phòng trừ bệnh nấm

Aspergillus flavus bằng các phương pháp khác nhau 62

Bảng 3.12 Tỷ lệ bệnh Aspergillus flavus của lạc hạt trong kho bảo quản trước và sau xử lý bằng chế phẩm Trichoderma spp ………65 Bảng 3.13 Hiệu lực phòng trừ của chế phẩm Trichoderma spp đối với bệnh nấm Aspergillus flavus hại lạc………… ……….66

Trichoderma spp với phân hữu cơ bón lót ……….46

Hình 3.4 Hiệu lực phòng trừ của chế phẩm Trichoderma spp phòng trừ bệnh

A flavus khi trộn bón lót với phân hữu cơ……… 46

Hình 3.5 Diễn biến số lượng mầm bệnh A flavus trong đất ở thí nghiệm xử lý hạt giống bằng chế phẩm Trichoderma spp .48 Hình 3.6 Tỷ lệ bệnh A flavus hại lạc ở thí nghiệm xử lý hạt giống bằng chế phẩm Trichoderma spp ……….………51 Hình 3.7 Hiệu lực phòng trừ của chế phẩm Trichoderma spp đối với A.

flavus khi xử lý hạt giống 51

Hình 3.8 Diễn biến số lượng mầm bệnh A flavus trong đất ở thí nghiệm xử lý

hạt giống kết hợp tưới các giai đoạn sinh trưởng của lạc bằng chế phẩm

Trichoderma spp………53

Hình 3.9 Tỷ lệ bệnh A flavus hại lạc ở thí nghiệm xử lý hạt giống kết hợp tưới các giai đoạn sinh trưởng của lạc bằng chế phẩm Trichoderma spp 56 Hình 3.10 Hiệu lực phòng trừ của chế phẩm Trichoderma spp đối với A.

flavus khi xử lý hạt giống kết hợp tưới các giai đoạn sinh trưởng 56

Hình 3.11 Diễn biến số lượng mầm bệnh A flavus trong đất ở thí ghiệm tưới các giai đoạn sinh trưởng của lạc bằng chế phẩm Trichoderma spp ……….59 Bảng 3.12 Tỷ lệ bệnh A flavus hại lạc ở thí nghiệm tưới các giai đoạn sinh trưởng của lạc bằng chế phẩm Trichoderma spp ……… 61

Hình 3.13 Hiệu lực phòng trừ của chế phẩm Trichoderma spp đối với A.

flavus khi tưới các giai đoạn sinh trưởng 61

Hình 3.14 Năng suất khô của lạc vụ Xuân 2012 tại Nghi Lộc - Nghệ An khi

sử dụng chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma spp phòng trừ bệnh nấm

Aspergillus flavus bằng các phương pháp khác nhau……… 63

Hình 3.15 Hiệu lực phòng trừ của chế phẩm Trichoderma spp đối với bệnh

hoạch 67

MỤC LỤC

LỜì cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Danh mục chữ viết tắt iii

Danh mục bảng biểu iv

Danh mục hình vi

Mục lục viii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài nghiên cứu 1

2 Mục đích và yêu cầu của đề tài 4

2.1 Mục đích của đề tài 4

2.2 Yêu cầu của đề tài 4

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 4

3.1 Ý nghĩa khoa học 4

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 5

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Cơ sở khoa học 6

1.1.1 Một số bệnh nấm gây hại trên cây lạc 6

1.1.2 Tác hại của nấm Aspergillus flavus đối với lạc 12

1.1.3 Quá trình sản sinh độc tố aflatoxin của loài Aspergillus 13

1.1.4 Nấm đối kháng Trichoderma 15

1.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng Trichoderma phòng trừ bệnh hại Aspergillus trên thế giới 18

1.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng Trichoderma phòng trừ bệnh hại cây trồng tại Việt Nam 22 1.4 Những vấn đề còn tồn tại mà đề tài luận văn tập trung nghiên cứu,

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 26

2.3 Vật liệu nghiên cứu 26

2.4 Nội dung nghiên cứu 26

2.5 Phương pháp nghiên cứu 27

2.5.1 Phương pháp điều tra thành phần và diễn biến của bệnh hại lạc 27

2.5.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm sử dụng chế phẩm Trichoderma spp phòng trừ bệnh nấm mốc Aspergillus flavus trên lạc 27

2.5.2.1 Thí nghiệm trước thu hoạch 27

2.5.2.2 Thí nghiệm sau thu hoạch 30

2.6 Các chỉ tiêu nghiên cứu 32

2.7 Xử lý số liệu 33

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34

3.1 Tình hình gây hại của các loài nấm bệnh trên lạc vụ Xuân năm 2012 tại huyện Nghi Lộc - Nghệ An 34

3.1.1 Thành phần các loài nấm bệnh hại lạc vụ Xuân năm 2012 tại các xã thuộc huyện Nghi Lộc, tỉnh Nghệ An 34

3.1.2 Diễn biến của một số loài nấm bệnh hại chủ yếu trên lạc vụ Xuân 2012 37 3.2 Sử dụng chế phẩm từ nấm Trichoderma spp phòng trừ bệnh Aspergillus flavus xâm nhiễm cây lạc trên đồng ruộng trong điều kiện thực nghiệm tại huyện Nghi Lộc - Nghệ An vụ Xuân 2012 41

3.2.1 Xử lý chế phẩm Trichoderma spp trộn với phân hữu cơ bón lót 41

3.2.2 Xử lý hạt giống bằng chế phẩm Trichoderma spp 47

3.2.3 Xử lý hạt giống bằng chế phẩm Trichoderma spp kết hợp tưới chế phẩm vào các giai đoạn sinh trưởng của cây lạc 52

3.2.4 Tưới chế phẩm Trichoderma vào một số giai đoạn sinh trưởng của

cây lạc 57

3.3 Năng suất khô của lạc vụ Xuân 2012 tại Nghi Lộc - Nghệ An khi sử dụng chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma spp phòng trừ bệnh nấm Aspergillus flavus bằng các phương pháp khác nhau 62

3.4 Sử dụng chế phẩm từ nấm Trichoderma spp hạn chế sự xâm nhiễm của nấm mốc Aspergillus flavus hại lạc trong kho bảo quản sau thu hoạch .64

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 68

1 Kết luận 68

2 Đề nghị 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC 1

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài nghiên cứu

Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày cho dầu

chủ yếu, với diện tích trồng khoảng 256.000 ha và sản lượng đạt 533.800 tấn,hàng năm lạc cung cấp dầu ăn chất lượng cao (36 đến 54% hàm lượng chấtkhô) và dễ dàng chiết xuất protein (12 đến 36%) trong hạt lạc Sản xuất lạccủa cả nước đã khẳng định sự thích nghi của cây lạc với điều kiện thổ nhưỡngcủa nước ta, tập quán canh tác của nông dân, dễ trồng và chăm sóc, thời giansinh trưởng ngắn, thu hoạch cho năng suất cao, đồng thời còn có khả năng cố

định đạm do rễ lạc có sự cộng sinh với vi khuẩn Rhizobium vigna có khả năng

cố định nitơ từ khí quyển thành đạm cung cấp cho cây và để lại trong đất từ

40 - 60 kg N/ha có tác dụng cải tạo đất rất tốt Đặc biệt ở vùng Bắc Trung Bộ,nhất là ở Nghệ An, Hà Tĩnh, Thanh Hóa, cây lạc là một trong ba cây côngnghiệp hàng năm chủ lực (lạc, mía và vừng), sản lượng lạc hàng năm manglại cho người nông dân sản xuất tương đương 9 vạn tấn thóc

Nghệ An là tỉnh có diện tích trồng lạc lớn nhất cả nước Tính đến năm

2009, diện tích trồng lạc ở Nghệ An là 23.757 ha với sản lượng 53.078 tấn.Không những chỉ ở trong tỉnh Nghệ An, mà các giống lạc Sen và lạc Sen lai(như L14) ngày càng được mở rộng gieo trồng ở nhiều địa phương khác nhau

ở các tỉnh Thanh Hóa, Hà Tĩnh Lạc là nông sản chủ lực của Nghệ An và cóthương hiệu Theo kế hoạch, những năm tới sẽ gieo trồng 28.000 – 30.000 ha,sản lượng 80.000 – 90.000 tấn lạc vỏ Năm 2010, Nghệ An có 10 doanhnghiệp tham gia xuất khẩu với số lượng 3.151 tấn lạc nhân, đạt kim ngạch 3,8triệu USD Nhu cầu tiêu thụ lạc trên thế giới lớn và có xu hướng tăng, khôngdưới 1,5 triệu tấn/năm, tập trung ở châu Á, EU

Tuy nhiên, vấn đề sản xuất, thu hoạch, bảo quản và tiêu thụ lạc hiện vẫncòn nhiều bất cập Diện tích trồng hạn chế, năng suất thấp, công tác thu hoạch

và chế biến sau thu hoạch ít được quan tâm đầu tư, hệ thống kho tàng, côngnghệ chế biến, bảo quản lạc hậu trong khi yêu cầu đối với lạc xuất khẩu là rấtcao, đặc biệt là về chất lượng

Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm quanh nămnên thuận lợi cho việc gieo trồng nhiều loại cây trồng khác nhau, đặc biệt làcác loại cây trồng cạn Điều kiện thời tiết khí hậu của nước ta cũng rất thuậnlợi cho các loài vi sinh vật xâm nhiễm gây hại đối với cây trồng Trong đó cácloài nấm gây bệnh, nhóm tác nhân chính gây bệnh trên hầu hết các loại cây

trồng, đặc biệt là nhóm nấm đất (A flavus, Penicilium spp ,

Fusarium sp., Pythium sp v.v ) Một trong những loài nấm đất điển hình

hại vùng rễ cây trồng cạn là nấm Aspergillus flavus gây bệnh mốc vàng.

Nguồn bệnh của nấm tồn tại chủ yếu trong đất, trong tàn dư thực vật, cây

ký chủ và trong các vật liệu giống nhiễm bệnh dưới dạng sợi nấm, hạchnấm Hạch nấm tồn tại từ năm này qua năm khác ở tầng đất bề mặt và lànguồn gây bệnh phổ biến cho các cây trồng vụ sau, năm sau Nấm bệnh gâyhại trên một số loại cây trồng như lạc, đậu, ngô,…, đặc biệt gây hại nặngđối với các hạt nông sản sau thu hoạch được cất giữ trong kho Sau khi nấmxâm nhiễm vào hạt nông sản thì chúng sản sinh ra loại độc tố có tên làaflatoxin, độc tố này có khả năng gây hại cho con người, động vật và gây ônhiễm môi trường

Vùng Bắc Trung Bộ, nơi có khí hậu nhiệt đới nóng và ẩm, là 1 trong 2vùng chính sản xuất cây có dầu (lạc, vừng) ở Việt Nam Đây cũng là vùng mà

sự phát triển của nấm mốc Aspergillus flavus và sự sản sinh độc tố aflatoxin

của nấm mốc ở mức nghiêm trọng Có thể nói aflatoxin là nguyên nhân gâynên tổn thất nặng nề về kinh tế cho nông nghiệp, đời sống người nông dân vàsức khỏe con người, vật nuôi Sự nhiễm aflatoxin không chỉ làm ảnh hưởng

đến năng suất, sản lượng lạc, mà còn là rào cản cho quá trình tiêu thụ, xuấtkhẩu lạc.

Từ những năm 1970 trên thế giới đã có các công trình nghiên cứu liên

quan đến việc làm giảm thiểu độc tố aflatoxin do Aspergillus flavus và

Aspergillus parasiticus sinh ra Các nhà khoa học đã có những nỗ lực trong

việc áp dụng kỹ thuật di truyền để cải tiến tính kháng cho giống lạc nhằmgiảm thiểu độc tố aflatoxin (Upadhyaya et al., 1995, 2001) [23], sử dụng cácloại thuốc thảo mộc, biện pháp canh tác, bảo quản sau thu hoạch và thậm chí

là cả nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học làm thay đổi con đường tổnghợp aflatoxin hoặc sử dụng các dạng enzyme thủy phân (chitinases và

glucanases) để bảo vệ sự xâm nhập của nấm Aspergillus, Tuy nhiên, những

nỗ lực nghiên cứu đó cũng chưa mang lại kết quả như mong đợi

Trên thế giới, nghiên cứu ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma để kiểm soát Aspergillus flavus bằng “cạnh tranh sinh học” hiện nay là hướng nghiên

cứu ứng dụng đang được quan tâm

Nấm Trichoderma có mặt gần như trong tất cả các loại đất và trong một

số môi trường sống khác Nấm Trichoderma tấn công, ký sinh và lấy chất

dinh dưỡng từ các loài nấm khác, phát triển tốt nhất là vùng nhiều rễ cây

khỏe, vì Trichoderma có nhiều cơ chế chống nấm gây bệnh cũng như cơ chế

kích thích sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng

Nấm Trichoderma là một tác nhân quan trọng trong kiểm soát sinh học

vi sinh vật gây hại sau thu hoạch và đang được nghiên cứu triển khai trên toàn

thế giới Nấm Trichoderma harzianum đã được thử nghiệm kiểm soát một số

bệnh hại trên lạc và kết quả nghiên cứu đã cho thấy khả năng kiểm soát củachúng là rất tốt (Rama Bhadra Raju et al., 2000) [28]

Nghệ An là địa phương sản xuất lạc chuyên canh, ngoài sự phá hại củacác loài bệnh hại thì đây cũng là vùng có nhiều tiềm năng về nguồn lợi nấm

đối kháng Trichoderma, vì sự khắc nghiệt của tự nhiên đã chọn tạo nên nhiều

“Phòng trừ nấm Aspergillus flavus Link gây hại trên lạc trước và sau thu hoạch bằng chế phẩm Trichoderma spp tại Nghi Lộc - Nghệ An vụ Xuân năm 2012”.

2 Mục đích và yêu cầu của đề tài

2.1 Mục đích của đề tài

(1) Xác định thành phần và mức độ nhiễm bệnh trên lạc vụ Xuân 2012trong đất trồng lạc tại vùng Nghi Lộc - Nghệ An

(2) Đánh giá hiệu quả phòng trừ của Trichoderma spp đối với A flavus

hại lạc trên đồng ruộng ở huyện Nghi Lộc - Nghệ An

(3) Khảo sát hiệu quả phòng trừ của Trichoderma spp đối với A flavus

hại lạc trong kho bảo quản sau thu hoạch

2.2 Yêu cầu của đề tài

- Điều tra tình hình bệnh hại trên lạc ở các xã Nghi Trường, NghiThịnh - huyện Nghi Lộc vụ Xuân 2012

- Điều tra thành phần các mầm bệnh, đánh giá diễn biến lượng mầm

bệnh A flavus trong đất trồng lạc huyện Nghi Lộc.

- Tìm hiểu khả năng phòng trừ A flavus bằng biện pháp sinh học sử dụng

Trichoderma spp trên lạc trước và sau thu hoạch.

3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

3.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài cung cấp những số liệu khoa học về tình hình nhiễm nấm A.

flavus trên cây lạc và lạc trong kho bảo quản tại Nghi Lộc và một số huyện

phụ cận vụ Xuân 2012

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đánh giá được hiệu quả của hướng kiểm soát A flavus trên hạt lạc bằng biện pháp sinh học sử dụng nấm đối kháng Trichoderma spp., làm cơ sở khoa học cho việc giảm thiểu lượng nấm A flavus sinh độc tố aflatoxin trên hạt lạc

giống, lạc thương phẩm, bảo vệ sức khỏe con người và bảo vệ môi trường

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cơ sở khoa học

1.1.1 Một số bệnh nấm gây hại trên cây lạc

Trong các nguyên nhân làm giảm năng suất của lạc thì bệnh hại là mộttrong những nguyên nhân chính Bệnh hại lạc là do một lượng lớn các loại

nấm, vi khuẩn, Phytoplasma, hơn 20 loại virút và khoảng 100 loài tuyến

trùng, bị nhiễm bệnh do các nhóm nấm và vi khuẩn gây hại đáng kể nhất.Theo Lesster, W.Burgess và CS (2001) 28 cho rằng “Nấm là một trongnhững nguyên nhân gây ra nhiều loại bệnh hại trên nhiều loại cây trồng, cókhoảng 100 nghìn loài nấm đã được miêu tả trong đó có trên 8 nghìn loài lànguồn gây bệnh hại cây trồng vì thế còn rất nhiều loài chưa được quan tâm vànghiên cứu Nguồn nấm tồn tại trên các tàn dư cây trồng, trong đất, trongkhông khí, trong nước, trên quả, hạt hay trong các dụng cụ bảo quản bởichúng sống không phụ thuộc vào ánh sáng, chúng có thể tồn tại và phát triểntrong bóng tối giống như ngoài ánh sáng”

1 Bệnh lở cổ rễ (Rhizoctonia solani Kuhn)

Là loại bệnh phổ biến xuất hiện ở khắp các vùng trồng trọt trên thế giới.Loài nấm này có phạm vi ký chủ rộng, hại trên 32 họ cây trồng khác nhau và

20 loài cỏ dại thuộc 11 họ Chỉ tính riêng ở Mỹ đã có khoảng 550 loài cây

khác nhau thuộc phạm vi ký chủ của nấm R solani

Nấm R solani Kuhn là một trong những loại nấm có nguồn gốc trong đất

điển hình Nấm được mô tả đầu tiên bởi Kuhn vào năm 1858 [5]

Nấm R solani thuộc bộ nấm trơ Mycelia sterilia, lớp nấm bất toàn Fungi imperfecti Sợi nấm R solani được sinh ra tạo thành các nhánh bên và hợp

với sợi chính tạo thành một góc xiên Sợi nhánh thắt lại một đoạn ngắn ở phần

gốc, thường có 1 vách ngăn ở gần gốc sợi nhánh Nấm R solani cũng sinh sợi

Monilioid Những tế bào Monilioid hòa lẫn với nhau tạo ra cấu trúc dày đặcđược gọi là hạch nấm để chống lại điều kiện môi trường bất thuận, đảm bảonấm sống sót trong điều kiện bất lợi.

Triệu chứng gây bệnh của nấm thường thấy sau khi cây con mọc nấm bắtđầu xâm nhiễm gây hại Tại gốc cây sát mặt đất chỗ bị bệnh có vết màu thâmđen hoặc màu nâu nhạt bao quanh làm cho mô tế bào cây bị hủy hoại mềmnhũn, giai đoạn cây con thường bị gãy gục và chết [43]

Bệnh có thể xuất hiện ngay trên thân sau khi mầm nhú lên khỏi mặt đất,làm chết cây con, làm giảm mật độ trồng, nấm gây bệnh còn có thể phát triểntrên các vết nứt gây hiện tượng thối thân ở cây con, vết bệnh có màu nâu đenhoặc đỏ nhạt, bệnh phát triển bao quanh thân và làm cho cây bị chết, sự pháttriển của bệnh phụ thuộc vào điều kiện đất đai và sự phá huỷ của độc tố nấmvào mô cây, nấm bệnh còn gây ra hiện tượng làm cho bó mạch trong thân bịtắc hoặc chỗ vết bệnh trên thân lở loét, cuối cùng làm cho cây đổ và chết

Nấm R solani gây hại ở tất cả các vụ trong năm, những cây bị nhiễm bệnh mà

còn sống sót trên đồng ruộng thì cho năng suất rất thấp

R solani sản sinh ra một lượng lớn enzyme cellulilitic, pectinolitic và

các độc tố thực vật Đây chính là nguyên nhân gây ra bệnh thối hạt làm chếtcây con, thối lá mầm, thối rễ, thối tia củ và gây cháy lá lạc khi nấm này xâmnhập vào cây

Nấm R solani cùng với Fusarium sp gây ra bệnh chết vàng lạc, làm

cho cây con héo vàng từ từ, ở phần gốc thân biến mầu nâu và có thể làm cholớp vỏ thân cây hơi bị nứt

2 Bệnh héo gốc mốc trắng (Sclerotium rolfsii Saccardo)

Nấm S rolfsii gây bệnh héo gốc mốc trắng trên 500 loài nhiều loại cây

trồng thuộc nhiều họ thực vật ở khắp các vùng sinh thái nông nghiệp trên thếgiới, được Peter Henry Rolfsii phát hiện và nghiên cứu đầu tiên vào năm

1892 Bệnh phổ biến ở Nam Mỹ, Argentina, Brazil, Canada Bệnh được pháthiện nhiều ở vùng có khí hậu ấm áp và đặc biệt là trên những cây trồng thuộc

họ cà, bầu bí, đậu đỗ và một số cây trồng luân canh với cây họ đậu

Nấm S rolfsii thuộc bộ nấm trơ Myceliales Sợi nấm đa bào trong suốt

phân nhánh rất mảnh và phát triển thành sợi nấm màu trắng, từ sợi nấm hìnhthành hạch nấm có dạng hình cầu, đường kính từ 1-2 mm, lúc đầu hạch màutrắng sau chuyển thành màu nâu (Purseglove J.W.1968) [5] Hạch nấm có thểtồn tại lâu dài trong đất từ năm này sang năm khác ở tầng đất mặt, tầng đấtcanh tác Hạch nấm và sợi nấm có thể tồn tại lâu dài trong đất và trong tàn dư

cây bệnh Nấm S rolfsii gây bệnh có thể sử dụng các chất hữu cơ làm nguồn

dinh dưỡng, nấm sản sinh ra axit oxalic và men phân hủy mô tế bào ký chủ

Nấm S rolfsii thuộc loại vi sinh vật hảo khí, thích hợp phát triển trong điều

kiện có nhiệt độ và ẩm độ cao

Giai đoạn cây con, nấm S rolfsii thường xâm nhập vào bộ phận cổ rễ,

gốc thân sát mặt đất tạo thành vết bệnh màu nâu đen, trên vết bệnh mọc ra lớpnấm trắng xốp như bông bao quanh gốc làm mô cây thối mục, cây khô chết

Nấm S rolfsii phát triển trong điều kiện nóng ẩm, nhiệt độ thích hợp từ

25 - 300C, ở điều kiện nhiệt độ 400C nấm ngừng sinh trưởng [42] Nấm S.

rolfsii là một nấm đa thực, có phổ ký chủ rất rộng, chúng có khả năng lây

nhiễm trên 500 cây ký chủ thuộc nhóm cây một lá mầm và hai lá mầm, đặcbiệt trên những cây thuộc họ đậu đỗ, bầu bí và một số rau trồng luân canh vớicây họ đậu Chúng có khả năng xâm nhiễm trực tiếp qua biểu bì hoặc qua vếtthương cơ giới

3 Bệnh thối thân (Fusarium solani (Mart) Appel & Wollned)

Nấm F solani gây hại nhiều loại cây trồng khác nhau, chúng gây hại từ

khi cây con có 1 lá thật đến khi thu hoạch Bệnh trên hạt thường có màu trắng

các bào tử phân sinh trên các nhánh dài của cành bào tử phân sinh, giọt nướcmang bào tử không màu, trong suốt không có hình dạng nhất định Có 17 loàinấm Fusarium đã được phân lập từ đất trồng lạc, nhưng trong số 17 loại nấm

đó chỉ có 6 loài gây bệnh cho cây lạc [7]

Cây con bị bệnh sẽ bị ức chế sinh trưởng, chóp rễ bị hoá nâu, dẫn đến bị

thối khô do F solani.Trên thân lạc, nấm Fusarium sp xâm nhiễm làm cho cây

non, rễ và trụ dưới lá mầm bị biến mầu xám, mọng nước Khi cây đã trưởng

thành F oxysporum gây hiện tượng thối rễ làm cho cây héo từ từ hoặc héo rũ, lá

cây chuyến sang màu vàng hoặc xanh xám, đôi khi lá bị rụng trước khi chết, bó

mạch và rễ bị thâm nâu (Kokalis et al., 1997) [27].

Nấm F oxysporum có sợi đa bào, màu sắc tản nấm màu trắng phớt hồng,

sinh sản vô tính tạo ra hai loại bào tử lớn và bào tử nhỏ Bào tử lớn cong nhẹmột đầu thon nhọn, một đầu thon gẫy khúc dạng hình bàn chân nhỏ, thường có

3 ngăn ngang Bào tử nhỏ đơn bào hình trứng, bầu dục dài hoặc hình quả thậnđược hình thành trong bọc giả trên cành bào tử không phân nhánh, trong khi đóbào tử lớn hình thành từ cành bào tử phân nhánh nhiều, xếp thành tầng Nấmcòn sinh ra bào tử hậu hình cầu, màng dày màu nâu nhạt, kích thước bào tử lớn

4 Bệnh héo gốc mốc đen (Aspergillus niger van Tieghem)

Nấm A niger thuộc họ Moniliaceae, bộ Hyphales, lớp Hyphomycetes Các loài thuộc giống Aspergillus có đặc điểm cành không phân nhánh, không

màu, đỉnh cành phình to, mang các cụm bào tử phân sinh hình cầu

Khi nuôi cấy A niger trên môi trường Czapek's agar bào tử phân sinh có

đặc điểm màu đen Cụm bào tử phân sinh có dạng hình cầu, kích thước từ 500

- 600 m Cành bào tử phân sinh không màu, đỉnh cành phình to mang cáccụm bào tử phân sinh dày đặc và đâm tia, kích thước đầu cành bào tử phânsinh khoảng 75 m

Hầu hết các loài Aspergillus spp là những loài nấm hoại sinh nhưng lại

ảnh hưởng rất lớn, đóng vai trò tác nhân gây bệnh cơ hội (lá chết hoặc thốiphôi mầm hạt) làm mất sức nảy mầm của hạt Chúng hợp thành nhóm nấmhoại sinh quan trọng đối với các nước nhiệt đới và cây trồng chịu nhiệt

Trên cây lạc nấm A niger gây triệu chứng thối đen cổ rễ, nấm thường

xuyên hại phần rễ và phần thân dưới hai lá mầm và giai đoạn hạt giống nảymầm ở điều kiện nhiệt độ trên 300C, gây hiện tượng thối xung quanh vùng rễ.Ngoài ra nấm còn gây thối hạt và chết mầm, bệnh thường xuất hiện rất nhanhsau khi hạt nảy mầm và triệu chứng quan sát được thường thấy ở vùng cổ rễ,trên vết bệnh có các sợi nấm và cành bào tử phân sinh trên đó có các bào tửphân sinh đính thành chuỗi màu đen [46]

Nấm Aspegillus niger gây ra hiện tượng thối hạt, lạc chết mầm và chết

héo cây con trong vòng 30 ngày sau trồng Trên vết bệnh, sợi nấm và cànhbào tử phân sinh thường được quan sát thấy ở vùng cổ rễ và xuất hiện nhanh

sau khi hạt nẩy mầm Aspegillus niger tồn tại trong đất, trên hạt giống với tỷ

lệ hạt bị nhiễm bệnh lên tới 90% Nấm bệnh truyền qua đất và có khả năngphát triển mạnh trong điều kiện biến động lớn về độ ẩm đất, chất lượng hạt

Bệnh thối gốc mốc đen do nấm A niger đến nay vẫn là một bệnh quan

trọng được công nhận ở hầu hết các vùng trồng lạc chính trên thế giới Thiệthại về năng suất và sản lượng do bệnh héo rũ gốc mốc đen thay đổi và khóđánh giá, thiệt hại về sản lượng cá biệt lên tới 50% nhưng thường dao động ởmức trên dưới 1%

5 Bệnh mốc vàng (Aspergillus flavus Link)

Chi Aspergillus phân bố rất rộng trong tự nhiên Chúng có thể tạo khuẩn

lạc và gây nhiễm vào hạt trước khi thu hoạch và trong quá trình bảo quản

Cây chủ rất dễ bị gây nhiễm bởi Aspergillus sau phơi nhiễm kéo dài trong môi

trường có độ ẩm cao hoặc bị tổn thương các điều kiện xấu như hạn hán

Các môi trường sống bản địa của Aspergillus là trong đất, thực vật mục

nát và ngũ cốc đang bị giảm sức đề kháng vi sinh vật và nó xâm nhập tất cảcác loại chất hữu cơ mỗi khi có điều kiện được thuận lợi cho sự phát triển của

nó Điều kiện thuận lợi bao gồm độ ẩm cao (ít nhất là 7%) và nhiệt độ cao

Nấm Aspergillus flavus gây hại chủ yếu trên hạt ở giai đoạn bảo quản

gây hiện tượng thối hạt Trong quá trình bảo quản, điều kiện bảo quản khôngtốt bệnh dễ phát sinh và lan sang các hạt khác làm giảm chất lượng hạt, đặcbiệt nấm có khả năng sinh độc tố gây bệnh ung thư cho người và động vật.Đây là loài nấm bán hoại sinh, phát triển rất nhanh và có thể phát hiện mộtcách dễ dàng bằng phương pháp đặt ẩm Tuy nhiên, nếu bảo quản hạt giốngtốt, đảm bảo độ ẩm hạt dưới 13% và nhiệt độ dưới 20oC thì tỷ lệ hạt nhiễm

nấm A flavus giảm đáng kể.

Nấm A flavus thường bảo tồn dưới dạng sợi nấm hoặc bào tử phân sinh

tồn tại trên vỏ hạt hoặc trong phôi hạt ngoài ra chúng còn tồn tại rất phổ biếntrong đất, rác thực vật hoặc tàn dư cây trồng và dễ dàng lan truyền gây bệnhhại cho cây vụ sau

Hạt bị nhiễm nấm A flavus bị bao phủ bởi lớp nấm mầu vàng đến nâu

vàng xen lẫn là các đốm trắng đó là những thể bình còn non, bào tử dạng hìnhcầu đến gần cầu thường gồ ghề có màu xanh nhạt Cành bào tử phân sinh mọcthành cụm, đỉnh cành phình to Cuống cấp 1 có sự hiện diện nhỏ, cuống cấp 2nhỏ hình ống tiêm Nấm có khả năng sinh độc tố trên hạt như: Aflatoxin B1

và B2, axit Aspergillic, axit – nitripropionic

1.1.2 Tác hại của nấm Aspergillus flavus đối với lạc

Lạc và sản phẩm từ lạc chắc chắn là nơi phát triển ưu thích nhất của A.

flavus Không phải chỉ có mình loại này, có nhiều loài nấm khác thường đi

kèm với loài nấm này một số lớn loài cũng có tính độc đối với súc vật

Không phải tất cả các chủng của nấm mốc A flavus đều sinh độc tố Ở

giống nấm mốc này sự sản sinh ra aflatoxin thay đổi theo từng chủng Hơnnữa, sự sản sinh ra độc tố này còn phụ thuộc rất nhiều vào các điều kiện xungquanh Sự sản sinh ra aflatoxin là kết quả của tác động qua lại giữa gienotipcủa chủng đó với các điều kiện phát triển của nó

Lượng aflatoxin sinh ra cũng thay đổi rất nhiều tuỳ theo các chủng riêngbiệt Ta nhìn thấy điều này khi nuôi cấy chúng để so sánh trên cùng một cơchất và trong những điều kiện như nhau Các chủng sinh ra độc tố còn tuỳthuộc vào nguồn gốc địa lý cư trú của chúng, tuỳ thuộc vào cơ chất chúng lâynhiễm và hàng loạt các điều kiện tự nhiên (mùa khô, mùa mưa, mùa hè, haymùa đông) Người ta đã thử phân biệt chủng sinh độc tố hoặc không sinh độc

tố qua đặc điểm hình thái Một số cho rằng các chủng sinh độc tố bao giờcũng có bào tử đính màu xanh lục, ngay cả giống nuôi cấy lâu ngày, thể bìnhhai lớp, cuống bào tử đính có vách, có gai… các chủng này có sự phình tomột số phẩn của sợi nấm tạo thành những cục nhỏ Những dị thường này mộtvài tác giả coi là đặc trưng của các chủng sản sinh aflatoxin Dù vậy, cũng rất

khó đoán chắc chủng nào sinh độc tố hay không, nếu không kết hợp với cácphương pháp sinh học và hoá học.

Các chủng sinh độc tố có thể mất hoạt tính khi cấy chuyển liên tiếp vàilần trên môi trường tổng hợp, hoặc ngược lại nếu như cấy vài lần trên môitrường tự nhiên thích hợp thì khả năng sinh độc tố được tăng lên Như vậy,chúng ta có thể thu được các chủng đột biến tự nhiên hoặc nhân tạo

Các chủng phát triển trên hạt có dầu, nhất là hạt lạc hoặc các sản phẩm

từ lạc hình như sinh độc tố nhiều hơn các chủng phân lập được trên ngũ cốc.Các chủng từ thịt ôi, bánh mỳ, các thực phẩm bột sống, hoặc phomát bị nhiễm

tự nhiên thường không hoặc ít sinh độc tố Các chủng phân lập từ gia vị đến30% số chủng sinh aflatoxin Vấn đề này qua nhiều công trình nghiên cứutrong cả thời gian dài vẫn chưa khái quát được một quy luật chung nào cả, thí

dụ: khó giải thích được vì sao chủng A flavus US26 phân lập được từ lạc mốc

lại không sinh aflatoxin

1.1.3 Quá trình sản sinh độc tố aflatoxin của loài Aspergillus

Aflatoxin là độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên bởi một số loài Aspergillus,

là một loại nấm mốc, đáng chú ý nhất là Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus Aflatoxin là độc tố và là tác nhân gây ung thư Sau khi thâm nhậpvào cơ thể, các aflatoxin có thể được gan chuyển hóa thành dạng trung gianepoxit hoạt hóa hoặc được thuỷ phân và trở thành M1 ít độc hơn

Các nấm này có trong đất và phá hoại cây trồng (có thể nhiễm vào lạcngay tại ruộng), gây nên hiện tượng hấp nhiệt làm thối hạt dự trữ Ngô, lạc,khô dầu lạc, hạt bông và khô dầu hạt bông rất mẫn cảm với nấm mốc

Điều kiện lý tưởng để nấm mốc xâm nhập vào nhân: nhiệt độ cao, độ ẩmcao xung quanh nhân, và độ ẩm của nhân dưới 30% (dạng sử dụng)

Các loại nông sản thường bị nhiễm aflatoxin là ngũ cốc (ngô, kê, lúamiến, gạo, lúa mì), hạt có dầu (lạc, đậu tương, hạt hướng dương, hạt bông),

gia vị (ớt, hạt tiêu đen, rau mùi, nghệ, gừng) và các loại quả hoặc hạt khácnhư hạt dẻ, dừa…

Kết quả khảo sát phân tích trên 243 mẫu ngô, lạc và sản phẩm chế biếnlàm thức ăn gia súc tại 3 xã thuộc huyện Tân Kỳ Nghệ An tháng 6/2002, đãphát hiện mức độ và nguy cơ nhiễm aflatoxin (AF) rất cao, có tới hơn 90% sốmẫu lạc, ngô lấy từ các hộ gia đình đang được bảo quản bị nhiễm AF và tỷ lệnhiễm vượt giới hạn cho phép quy định giới hạn hàm lượng AF có trong thựcphẩm của Bộ Y tế là trên 23% (56/243 mẫu) (Phan Thị Kim và cs., 2002) [10] Aflatoxin cũng có thể xuất hiện trong sữa của động vật được cho ăn bằngthức ăn nhiễm aflatoxin

Aflatoxin M1, M2 thường được phát hiện trong sữa của bò được cho ănbởi các loại hạt bị nhiễm nấm mốc Các độc tố này là sản phẩm của một quátrình chuyển hóa trong gan động vật Tuy nhiên, aflatoxin M1 cũng có mặt

trong sản phẩm lên men bởi Aspergillus parasiticus.

Tại Hoa Kỳ, hầu như tất cả các nguồn của bơ lạc thương mại có hàmlượng aflatoxin từ 0 ppb đến 20 ppb cho tiêu dùng trực tiếp, mặc dù thức ăndùng để vỗ béo cho bò thịt/lợn/gia cầm trong giai đoạn cuối có thể chấp nhậnmức 300 ppb nhưng trong thực tế thường thấp hơn nhiều mức khuyến cáo antoàn của Cục Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA)

Trong kho cất giữ: nhiệt độ tối ưu để sản sinh aflatoxin: 25-32oC Độ ẩm tối

ưu cho nấm mốc phát triển: khi trong nhân là 18% hoặc trong thùng đựng là 85%hay cao hơn

Nhân hạt có độ ẩm dưới 15%: hạn chế phát triển nấm mốc và aflatoxin

Ở Thái Lan, năm 1967 nhóm nghiên cứu của Shank cho thấy các mẫulương thực thực phẩm bị mốc thì 50-60% số mẫu đó có aflatoxin Ðồng thờinhóm tác giả này tiến hành trên thức ăn gia đình (lấy mẫu lương thực thực

Ở Việt Nam cho đến nay còn ít có những công thành công bố vế vấn đếnày Theo kết quả của Viện Vệ Sinh Dịch Tễ đã nghiên cứu trên 29.381 mẫulương thực thực phẩm thấy có 30 loại men mốc khác nhau, trong đó mốc

Aspergillus chiếm tỉ lệ cao nhất (5,2 - 80,39%) bao gồm 12 chủng loại Aspergillus khác nhau Trong số đó có 11 chủng có khả năng sinh độc tố.

Năm 1984 theo tài liệu của Viện dinh dưỡng quốc gia đã nghiên cứu trên 200

mẫu gạo bán ở Hà Nội thấy ở 2 mẫu có nhiều nấm Aspergillus flavus, một

loại nấm có khả năng tạo ra Aflatoxin

Năm 1988, Viện dinh dưỡng đã thông báo kết quả thăm dò Aflatoxin B1trong lạc và sản phẩm từ lạc như sau: Có: 7/55 số mẫu lạc nhân có AflatoxinB1 (13%) 2/6 mẫu xì dầu có Aflatoxin (33%)

Theo kết quả nghiên cứu bước đầu của Bộ môn Dinh dưỡng và An toànthực phẩm trường Đại học Y Hà Nội (1990) kết quả nghiên cứu 30 mẫu tương

ăn và trên 60 mẫu sữa mẹ ở Hà Nội, kết quả cho thấy xấp xỉ 30% số mẫutương có độc tố aflatoxin; còn trên sữa mẹ thì chưa phát hiện thấy

1.1.4 Nấm đối kháng Trichoderma

Nấm Trichoderma thuộc nhóm nấm bất toàn (Deuteromycetes hay Fungi Imperfecti), trong đó khuẩn lạc của Trichoderma có màu lục (khi tăng trưởng

dưới nắng mặt trời) Là nhóm nấm bất toàn nên chúng là những nấm sinh sản

vô tính bằng bào tử bụi mang bởi những giá bào tử có hình dạng khác nhauxếp thành chuỗi (đính bào tử) ở đầu ngọn có cuống bào tử

Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và

trong một số môi trường sống khác Chúng là loại nấm được nuôi cấy thôngdụng nhất Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ củacây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ Những giống này cóthể được bổ sung vào trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp Ngaykhi chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc

vào từng giống Vì vậy, khi được dùng trong xử lý hạt giống, những giốngthích hợp nhất sẽ phát triển trên bề mặt rễ ngay cả khi rễ phát triển dài hơn1m phía dưới mặt đất và chúng có thể tồn tại và có hiệu lực cho đến 18 thángsau khi sử dụng Tuy nhiên không nhiều giống có khả năng này.

Ngoài sự hình thành khuẩn lạc trên rễ, nấm Trichoderma còn tấn công,

ký sinh và lấy chất dinh dưỡng từ các loài nấm khác Bởi vì nơi Trichoderma phát triển tốt nhất là nơi có nhiều rễ khỏe mạnh, vì Trichoderma sở hữu nhiều

cơ chế cho việc tấn công các loài nấm gây bệnh cũng như cơ chế cho việcnâng cao sự sinh trưởng và phát triển của cấy Nhiều phương pháp mới trongkiểm soát sinh học và nâng cao sinh trưởng của cây hiện nay được chứngminh rõ ràng Quá trình này được điều khiển bởi nhiều gen và sản phẩm từgen khác nhau Sau đây là một số cơ chế chủ yếu: Ký sinh nấm, kháng sinh,cạnh tranh chất dinh dưỡng và không gian; sự chịu đựng các điều kiện bất lợibằng việc gia tăng sự phát triển của cây và rễ, làm hòa tan và cô lập chất dinhdưỡng vô cơ, cảm ứng sự kháng bệnh, bất hoạt enzyme gây bệnh

Những phát hiện mới hiện nay cho thấy rằng một số giống nấm

Trichoderma có khả năng hoạt hóa cơ chế tự bảo vệ của thực vật, từ đó những

giống này cũng có khả năng kiểm soát những bệnh do các tác nhân khácngoài nấm

* Cơ chế đối kháng của vi nấm Trichoderma:

- Sự đối kháng của nấm Trichoderma thông qua nhiều cơ chế Vào năm

1932 Weinding đã mô tả hiện tượng nấm Trichoderma ký sinh nấm gây bệnh

và đặt tên cho hiện tượng đó là "Giao thoa sợi nấm" (Cnyder, 1976)

- Hiện tượng giao thoa sợi nấm gồm ba giai đoạn như sau:

(1) Sợi nấm Trichoderma vây quanh sợi nấm gây bệnh

(2) Sau sự vây quanh, sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm gây bệnh

cây

(3) Cuối cùng là sợi nấm Trichoderma đâm xuyên làm thủng lớp tế bào

của nấm gây bệnh, dẫn đến sự gây bệnh làm cho chất nguyên sinh trong nấmgây bệnh bị phân hủy và dẫn đến nấm bệnh chết

Sau này quan sát dưới kính hiển vi, hiện tượng ký sinh của nấm

Trichoderma được mô tả như sau:

+ Tại những điểm nấm Trichoderma tiếp xúc với nấm gây bệnh đã làm

cho nấm gây bệnh teo lại và chết (Dubey, 1995; Rousscu và ctv, 1996)

+ Ngược lại ở những điểm không có sự tiếp xúc của nấm Trichoderma

với nấm gây bệnh vẫn chết thì các nhà nghiên cứu cho là tác động của chất

kháng sinh của nấm Trichoderma sinh ra gây độc cho nấm gây bệnh

(Agrowcal và ctv, 1979; Michrina và ctv, 1996)

Nấm Trichoderma có khả năng sinh ra một số chất kháng sinh Khả năng

sinh ra chất kháng sinh của các loài, chủng, các dạng sinh thái của nấm

Trichoderma không giống nhau.

Ngoài ra đã xác định một số chất kháng sinh khác do nấm Trichoderma

sinh ra như: chất kháng sinh U- 21693 được Meyer phát hiện năm 1996 do

chủng UC - 4785 (loài T viride) sinh ra [36].

Nhiều loài Trichoderma có khả năng sản sinh ra men phân giải (như men

Laminarinaza, Chitinaza,…) (Score và cs., 1994) [36]

Khi phát triển ở trên thành tế bào nấm vật chủ thì nấm Trichoderma có thể

tiết ra những loại men gây suy biến thành tế bào nấm gây bệnh cho cây như men

(1-3) glucanase và chitinase (Chet và cs., 1981; Jones and Watson, 1969) [25]

Nấm Trichoderma có thể biểu hiện tính đối kháng thông qua việc cạnh tranh với nấm gây bệnh cây về dinh dưỡng, nơi cư trú Nấm Trichoderma

thường định cư trước so với nấm gây bệnh cây

Sử dụng nấm đối kháng trong công tác bảo vệ thực vật là một trongnhững biện pháp sinh học mang tính khả thi cao

Hiện tượng giao thoa sợi nấm

1.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng Trichoderma phòng trừ bệnh hại Aspergillus trên thế giới

Cơ chế kiểm soát sinh học được điều khiển bởi nhiều gene và sản phẩm từgene khác nhau Một số cơ chế chủ yếu là ký sinh nấm, kháng sinh, cạnh tranhdinh dưỡng và không gian; sự chịu đựng các điều kiện bất lợi bằng việc gia tăng

sự phát triển của cây và rễ cây; làm hòa tan và cô lập chất dinh dưỡng vô cơ,cảm ứng sự kháng bệnh, bất hoạt enzyme gây bệnh.Sau khoảng 50 năm từ khithế giới phát hiện ra độc tố aflatoxin (năm 1960), nhiều phương pháp kiểm soát đãđược nghiên cứu và áp dụng Bên cạnh những nghiên cứu chọn tạo các giống

lạc kháng Aspergillus, còn có những nghiên cứu sử dụng một số loài vi khuẩn

và nấm để phòng trừ sự nhiễm aflatoxin trong nông sản (Palumbo et al., 2006;

Masoud và Kaltoft, 2006) [21, 20]

Khả năng đối kháng của các loài Trichoderma đã được phát hiện từ 70 năm trước (Weindling, 1932) Hoạt động của nấm đối kháng Trichoderma với

A niger được đánh giá thông qua kỹ thuật nuôi cấy trên môi trường PDA và

tiềm năng đối kháng của những chủng này được sắp xếp theo thang điểm từ 1đến 5 (Bell et al., 1982) [25] Cơ chế chính của sự đối kháng trong

Trichoderma là do mycoparasitism Nấm đối kháng Trichoderma cũng là đối

thủ cạnh tranh tốt trong đất, sản xuất thuốc kháng sinh để ngăn chặn tác nhângây bệnh (Chet, 1987) [26]

Các xu hướng hiện nay là kiểm soát sinh học Aspergillus flavus, A.

parasiticus sinh độc tố aflatoxin với 3 hướng chính: (i) Hướng nghiên cứu sử

dụng Bacillus (B pumilus, B subtilis) (Munimbazi et al., 1998;…) [25]; (ii) Hướng nghiên cứu sử dụng các chủng Aspergillus flavus, A parasiticus

không sinh độc tố, đã có những thành công, đặc biệt là ở Hoa Kỳ, như chủng

Aspergillus flavus AF36 (Cotty et al., 2004, 2007; ) [21]; (iii) Hướng nghiên

cứu sử dụng nấm đối kháng Trichoderma đã có những thành công nhất định, đặc biệt ở Ấn Độ, như sử dụng 5 loài T harzianum, T viride, T auroviride,

T longibrachiatum, T hamatum kiểm soát sinh học Aspergillus flavus sinh

độc tố aflatoxin (Mausam et al., 2007; Reddy et al., 2010;…) [23]

Trong suốt thời gian gần 50 năm qua, tính từ thời điểm phát hiện ra độc

tố aflatoxin gây ra cái chết cho 100.000 con gà do bệnh “Turkey X” ở nướcAnh (Blount, 1961; Forgacs và Carll, 1962) [24], thì thành công trong kiểmsoát sinh học sự nhiễm độc tố aflatoxin ở cả trước và sau thu hoạch nông sản

đã đạt được là áp dụng các chủng Aspergillus không sinh độc tố cạnh tranh với các chủng A flavus và A parasiticus sinh độc tố

Theo Cotty (1990) [21] chủng nấm không độc tố A flavus làm giảm sự

nhiễm aflatoxin trong hạt bông, kết quả thực nghiệm trong nhà lưới cho thấy,

có 6 trong 7 chủng nấm không sinh độc đã làm giảm lượng aflatoxin gây ra

bởi các chủng nấm sinh độc ở trong hạt bông khi nuôi cấy cả chủng độc và

chủng không độc, chủng A flavus AF36 có hiệu quả nhất trong việc làm giảm

sự nhiễm aflatoxin Thử nghiệm khả năng kiểm soát aflatoxin ở ngô khi nuôi

cấy chủng A flavus AF36 và chủng có độc tính của loài A flavus hoặc những bắp ngô được nuôi cấy riêng rẽ với chủng A flavus AF36 trong 24 h, kết quả

nghiên cứu cho thấy nồng độ aflatoxin giảm có ý nghĩa, nếu so với việc chỉnuôi cấy chủng gây độc trên ngô (Brown et al., 1991) [18]

Kết quả nghiên cứu của Choudhary A.K (1992) [20] cho thấy, chủng T.

viride làm giảm thiểu sự sản sinh độc tố aflatoxin B1 (73,5%) và aflatoxin G

(100%) khi nuôi cấy chung với chủng A flavus; sử dụng kết hợp của cả hai loài nấm như T harzianum và A niger ức chế sản xuất aflatoxin B1 gần 100% Theo Calistru và McLean (1997) [23], 2 chủng T harzianum và 2 chủng

T viride có khả năng ức chế phát triển của A flavus Quan sát dưới kính hiển

vi điện tử cho thấy, sự xâm nhập và kiểm soát của các loài Trichoderma đối với A flavus Hai chủng A niger và T viride có thể kết hợp để ức chế A.

flavus sản sinh aflatoxin (Aziz và Shahin, 1997) [20].

Nghiên cứu của Srilakshmi P et al (2001) [38], đã đánh giá tiềm năng

đối kháng của 212 chủng Trichoderma được thu thập, phân lập từ các mẫu đất

từ ở bang Andhra Pradesh và Karnataka, Ấn Độ; trong đó có 145 chủng phânlập đối kháng với AF11-4 và có 39 chủng có khả năng ức chế mạnh đối với

chủng nấm AF11-4 Những chủng Trichoderma này được nghiên cứu xác

định và đánh giá khả năng đối kháng, liên quan đến sản xuất thuốc kháng sinhphòng trừ chủng nấm với AF11-4.Kết quả nghiên cứu của Kishore et al

(2001) [27] cho thấy tiềm năng kiểm soát sinh học của 16 chủng Trichoderma đối kháng với A niger và hiệu lực phòng trừ của các chủng phân lập kiểm soát A niger trong điều kiện nhà lưới được so sánh với thuốc trừ nấm Trong

ICRISAT (Ấn Độ) thuộc 4 loài là T hamatum, T harzianum, T.

longibrachiatum và T viride Trong số 16 chủng phân lập của Trichoderma, có

2 chủng phân lập của loài T harzianum là A3 và A11 và 1 chủng của loài T.

viride là A14 có tính đối kháng cao với A niger và được xếp ở thang điểm 1,

trong 13 chủng còn lại, có 9 chủng ở mức điểm 2

Kết quả nghiên cứu của Kishore G.K et al (2001) [27] về kiểm soát sinhhọc sự nhiễm aflatoxin ở lạc cho thấy, trong tổng số 212 chủng phân lập

thuộc nhóm Trichoderma hiện có ở ICRISAT, có 48 chủng có khả năng kiểm soát sự nhiễm aflatoxin gây ra bởi A flavus Kết quả phân tích PCR trong

nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài đã xác định được 48 chủng này thuộc 10

loài trong giống Trichoderma Dựa vào những nghiên cứu chuyên sâu về công

nghệ enzyme, các nhà khoa học ICRISAT đã xác định được 7 chủng thuộc 6 loài

của giống Trichoderma có khả năng kiểm soát aflatoxin trên đồng ruộng và

chúng có tác động hiệu quả hơn so với việc dùng thuốc hóa học trừ nấm bệnh

Theo Thakur R.P et al (2003) [40] có 6 chủng Trichoderma và 3 chủng

Pseudomonas có tính đối kháng cao với A flavus AF trong phòng thí nghiệm,

là 2 chủng T viride (Tv 17 và Tv 23), 1 chủng T harzianum (Th 23) và 1 chủng

Pseudomonas (Pf 2) có khả năng đối kháng cao hơn so với 2 chủng còn lại, làm

giảm đáng kể mật độ nấm A flavus trên quả lạc và trong vùng rễ cây lạc Trong

thí nghiệm chậu vại và thí nghiệm trên đồng ruộng, các chủng nấm đối kháng

Trichoderma có tác dụng làm giảm ở mức ý nghĩa sự xâm nhiễm của A flavus

vào hạt và giảm 50% quần thể A flavus trên ruộng lạc (Anjaiah, 2006) [19]

Krishnamurthy Y.L., Shashikala J (2006) [38], đã đánh giá tác dụng của

sản phẩm tự nhiên và tác nhân sinh học với sự sản xuất aflatoxin B1 của A.

flavus trong hạt đậu tương ở các mức 10, 20 và 30 ngày ủ bệnh, tất cả các

phương pháp kiểm soát đều cho thấy có hiệu lực ức chế sản xuất aflatoxin;

trong đó sự kết hợp của bào tử T harzianum và A niger (100%), bào tử A.

niger (98,25%), bào tử T harzianum (97,90%) đã cho thấy hiệu quả tối đa

trong việc kiểm soát sản xuất aflatoxin B1

Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm của Luisa E.M.A et al (2008) [30]cho thấy, điều kiện môi trường nhân nuôi có ảnh hưởng đến hiệu lực nấm

Trichoderma harzianum Nếu nhân nuôi 15 ngày trên môi trường Malt

Extract Agar (MEA) có khả năng kiểm soát làm giảm sinh khối và sản xuất

afatoxin B1 tương ứng là 31,7% và 51,87%; trong khi đó, nấm T harzianum

được nuôi trên môi trường là mầm ngô - vỏ trấu (DCGRH) thì hiệu lực giảm

đi nhiều Tuy nhiên khi sử dụng trên quy mô nhỏ thì sự phát triển của A favus

bị ức chế (90%) Những kết quả này chứng minh tiềm năng sử dụng nấm T.

harzianum như một tác nhân sinh học quan trọng để kiểm soát nấm Aspergillus sinh độc tố và giảm độc tố mycotoxin trong bảo quản

1.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng Trichoderma

phòng trừ bệnh hại cây trồng tại Việt Nam

Ở nước ta, đã có một số công trình nghiên cứu ứng dụng Trichoderma,

theo báo cáo của Trần Thị Thuần (Bộ môn bệnh cây - Viện BVTV, 1995 [16])

bước đầu thành công khi sử dụng một số chủng Trichoderma phân lập được trong đất nhằm hạn chế bệnh khô vằn hại ngô do Rhizoctonia gây ra.

Gần đây, Hoàng Quốc Khánh - Phòng vi sinh ứng dụng - Viện sinh họcnhiệt đới (2001) [8] thử nghiệm thành công trên diện rộng chế phẩm

BIOPROMOT bao gồm 2 chủng giống T harzianum và T konigii trên 2 loại

cây cà chua và cây cải, chế phẩm dùng để xử lý đất nhằm hạn chế bệnh vàkích thích cây tăng trưởng

Kết quả điều tra thu thập nấm đối kháng Trichoderma trên đồng ruộng

trồng lạc ở huyện Nghi Lộc tỉnh Nghệ An (năm 2010) đã xác định được 5 loài

nấm đối kháng Trichoderma, trong đó loài Trichoderma sp3 có tính kháng

pháp kiểm soát nấm sinh độc tố Aspergillus flavus nói chung và ứng dụng nấm đối kháng Trichoderma phòng trừ Aspergillus flavus chưa được quan

tâm nghiên cứu

Theo Lê Như Cương (2004) [3], sử dụng T viride với liều lượng 90kg/ha để phòng trừ bệnh héo rũ hại lạc do nấm A niger, S rolfsii,

Fusarium spp., R solani gây ra cho hiệu quả cao Năm 1996, trong thí

nghiệm chậu vại khảo sát hiệu lực đối kháng của T viride với S rolfsii hại lạc

hiệu lực phòng trừ đạt 97,1% (Trần Thị Thuần, 1997) [15]

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Trường Thọ (2004) [15] hiệu lực sử

dụng nấm mốc Trichoderma harzianum phòng trừ bệnh héo rũ cây dưa leo do nấm Pythium sp gây ra cho thấy có hiệu quả trong việc phòng bệnh nếu trộn

chế phẩm với hạt nảy mầm tỷ lệ 1:10 theo khối lượng và phun dịch chế phẩmtrước khi gieo ở mật độ 106 bào tử/ml

Việt Nam, hướng nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật trong phòng trừ nấm

mốc Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin bằng nấm mốc Aspergillus flavus

không sinh độc tố đã có một số kết quả bước đầu Nguyễn Thùy Châu (2010)

[2], nghiên cứu phòng chống Aspergillus sp sản sinh aflatoxin và ochratoxin

A trên cà phê ở giai đoạn ngoài đồng và trong quá trình bảo quản bằng chủng

Aspergillus flavus không sản sinh aflatoxin; Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy

Châu (2010) [2], nghiên cứu tác dụng của chủng Aspergillus flavus

DA2 không sinh và phòng chống aflatoxin trên ngô ở giai đoạn ngoài đồng vàtrong quá trình bảo quản; Lê Thiên Minh, Nguyễn Thùy Châu (2010) [2],

nghiên cứu đánh giá hiệu quả của chế phẩm Aspergillus flavus (AF) không

sinh aflatoxin để phòng chống aflatoxin trên lạc ở Vĩnh Phúc

Kết luận môi trường SAB với giá trị pH là 5,6 có bổ sung các chất kháng

sinh nhất định là môi trường tối ưu cho phép phát hiện A flavus sinh độc tố

aflatoxin dưới đèn UV ở điều kiện nuôi cấy 280C trong 3 ngày Dựa theo

nghiên cứu mới nhất của Võ Thị Thanh Trang (2009) [17], bước đầu xây

dựng quy trình phát hiện Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin trên ngũ cốc

bằng phương pháp phát quang Phương pháp này tạo tiền đề cho hướngnghiên cứu mới ứng dụng cho việc kiểm tra chất lượng nông sản phẩm sauthu hoạch trước khi xuất nhập kho có bị nhiễm nấm hại không để có biệnpháp phòng trừ kịp thời

Nấm Trichoderma mới chỉ có các nghiên cứu ứng dụng phòng trừ một số bệnh hại rễ cây, như bệnh do nấm Pythium, Rhizoctonia và Fusarium Cơ chế

đó được gọi là ký sinh nấm (mycoparasitism) Nấm Trichoderma tiết ra một

enzyme làm tan vách tế bào của các loài nấm khác và sau đó nó có thể tácđộng vào bên trong loài nấm gây hại đó và phá hủy vách tế bào của nấm

bệnh Chủng Trichoderma sử dụng là T-22 tiết ra enzyme endochitinase nhiều hơn, so với các chủng hoang dại Các chế phẩm nấm Trichoderma được sản

xuất và sử dụng như là chất kiểm soát sinh học một cách có hiệu quả Hìnhthức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phânhữu cơ để bón cho cây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khảnăng kháng bệnh của cây (Dương Hoa Xô, 2008) [19]

Một số kết quả nghiên cứu ban đầu ở Việt Nam về phòng trừ Aspergillus

flavus sinh độc tố aflatoxin chưa thể đáp ứng được yêu cầu cấp thiết để có thể

kiểm soát độc tố aflatoxin trong cây trồng, nông sản và thực phẩm Vì vậy cần

có một chiến lược, giải pháp thực sự có hiệu quả trong việc giảm thiệu độc tốaflatoxin

Có nhiều cách tiếp cận, nhưng cho đến nay hướng ứng dụng công nghệsinh học và công nghệ vi sinh với kiểm soát sinh học hiện nay là hướng triển

vọng, đặc biệt là sử dụng các chủng nấm Trichoderma đối kháng phòng trừ sinh học các chủng Aspergillus flavus sinh độc tố aflatoxin ngoài đồng ruộng

kháng Aspergillus flavus trong nông sản (lạc) bảo quản trong kho được đánh

giá là giải pháp tối ưu

1.4 Những vấn đề còn tồn tại mà đề tài luận văn tập trung nghiên cứu, giải quyết

* Những vấn đề còn tồn tại:

- Nấm đối kháng Trichoderma là một hướng nghiên cứu mới trên thế

giới Việc ứng dụng vào sản xuất thực tế của nông nghiệp là rất hữu ích ỞViệt Nam trong những năm gần đây có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng nấm

Trichoderma vào sản xuất như sử dụng trong phân bón, là thuốc phòng bệnh

gây hại trên cây trồng

- Hiện nay việc ứng dụng vi nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ nấm bệnh hại lạc Aspergillus flavus tại khu vực Bắc Trung Bộ là chưa được

quan tâm đúng mức

- Vấn đề xâm nhiễm nấm mốc A flavus đối với lạc trong kho bảo quản

sinh ra độc tố aflatoxin gây hại cho sức khoẻ con người, động vật nuôi đang làvấn đề cấp bách

* Những vấn đề mà đề tài tập trung nghiên cứu, giải quyết:

- Kiểm soát sự phát sinh gây hại của nấm hại Aspergillus flavus gây hại

trên lạc trước và sau khi thu hoạch được bảo quản trong kho nông sản bằng vi

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Loài nấm bệnh Aspergillus flavus gây hại trên lạc trước và sau thu hoạch

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: từ 20/01/2012 đến 15/8/2012

- Địa điểm nghiên cứu:

+ Địa điểm thu thập mẫu nấm Trichoderma spp trên đồng ruộng thuộc

huyện Nghi Lộc - Nghệ An

+ Điạ điểm phân lập và nuôi cấy thành chế phẩm để phòng trừ bệnh nấmmốc hại lạc tại phòng thí nghiệm trường Đại học Vinh

+ Địa điểm tiến hành thử nghiệm phòng trừ trên diện rộng là tại xã NghiTrường, xã Nghi Thịnh - huyện Nghi Lộc

2.3 Vật liệu nghiên cứu

 Chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma spp phân lập được từ đất trồng

lạc Nghi Lộc - Nghệ An

 Giống lạc L14

 Dụng cụ thí nghiệm: Kính hiển vi, kính lúp điện, tủ sấy, buồng cấy, nồihấp, đèn cồn, đĩa petri, bếp từ, cân điện tử, bình tam giác, lọ thuỷ tinh,v.v

2.4 Nội dung nghiên cứu

- Điều tra, xác định thành phần bệnh nấm hại và diễn biến một số bệnhnấm chính hại vùng rễ cây lạc vụ Xuân 2012 tại Nghi Lộc - Nghệ An

- Thử nghiệm trên đồng ruộng hiệu lực phòng trừ của chế phẩm nấm đối

kháng Trichoderma spp đối với bệnh nấm Aspergillus flavus hại vùng rễ cây

lạc vụ Xuân năm 2012 tại Nghi Lộc - Nghệ An

- Đánh giá khả năng kiểm soát của chế phẩm Trichoderma spp đối với nấm Aspergillus flavus hại lạc trong kho bảo quản sau thu hoạch.

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp điều tra thành phần và diễn biến của bệnh hại lạc

Phương pháp điều tra dựa vào “Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phươngpháp điều tra phát hiện dịch hại cây trồng” - QCVN 01-38: 2010/BNNPTNT(2010) để điều tra thành phần và diễn biến của bệnh hại

- Thời gian điều tra: Điều tra định kỳ 7 ngày/lần ở tuyến với các yếu tốđiều tra trong khu vực điều tra cố định ngay từ đầu vụ Trong vụ tiến hànhđiều tra bổ sung vào thời kỳ xung yếu của cây trồng và dịch hại

- Khu vực và điểm điều tra: Đối với cây lạc điều tra từ 2 ha trở lên Mỗiyếu tố điều tra 10 điểm ngẫu nhiên nằm trên đường chéo của khu vực điều tra.Điểm điều tra cách bờ 2 m

- Số mẫu điều tra tại một điểm: Bệnh trên thân/lá/củ, quả/rễ điều tra 10thân/lá/củ, quả/rễ/điểm

- Đối với các thử nghiệm đồng ruộng: Điều tra 5 điểm chéo góc, mỗiđiểm điều tra 10 cây

2.5.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm sử dụng chế phẩm

Trichoderma spp phòng trừ bệnh nấm mốc Aspergillus flavus trên lạc

2.5.2.1 Thí nghiệm trước thu hoạch

Thử nghiệm sử dụng các chủng nấm Trichoderma spp để kiểm soát tỷ lệ nhiễm bệnh nấm mốc Aspergillus flavus gây hại trên cây lạc trong điều kiện

thực nghiệm ngoài đồng ruộng

1) Thí nghiệm xử lý chế phẩm Trichoderma spp vào đất trộn với phân

hữu cơ bón lót

 Phân hữu cơ được ủ hoai mục, dùng chế phẩm nấm đối kháng

Trichoderma spp xử lý với các công thức có khối lượng khác nhau 0,4 kg;

0,6 kg; 0,8 kg trộn với 200 kg phân hữu cơ đem bón vào đất cho ô thí nghiệm

100 m2 trồng lạc

 Thí nghiệm gồm 3 công thức xử lý, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗi lần(ô) thí nghiệm 100 m2 Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy đủ(RCB)

CT 1.1: (0,8 kg Trichoderma + 200 kg phân hữu cơ)/100 m2

CT 1.2: (0,6 kg Trichoderma+ 200 kg phân hữu cơ)/100 m2

CT 1.3: (0,4 kg Trichoderma + 200 kg phân hữu cơ)/100 m2

CT 1.4: Đối chứng: Chỉ bón phân hữu cơ, không xử lý

 Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh Aspergillus flavus trên lạc (%), Hiệu lực của chế phẩm từ nấm Trichoderma spp

2) Thí nghiệm sử dụng chế phẩm Trichoderma spp xử lý hạt giống lạc

 Dùng chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma spp với các mức liều

lượng khác nhau là 40 g; 60 g và 80 g, mỗi công thức trộn đều với 2 kg hạtgiống lạc

 Thí nghiệm gồm 3 công thức xử lý, mỗi công thức nhắc lại 3 lần, mỗilần (ô) thí nghiệm 100 m2 Thí nghiệm được bố trí theo khối ngẫu nhiên đầy

đủ (RCB)

CT 2.1: 80 g Trichoderma/2 kg hạt/100 m2

CT 2.2: 60 g Trichoderma/2 kg hạt/100 m2

CT 2.3: 40 g Trichoderma/2 kg hạt/100 m2

CT 2.4: (đối chứng) Không xử lý Trichoderma.

 Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh Aspergillus flavus trên lạc (%), Hiệu lực của chế phẩm từ nấm Trichoderma spp

3) Thí nghiệm sử dụng chế phẩm Trichoderma spp xử lý hạt giống kết

hợp tưới vào các giai đoạn sinh trưởng của cây lạc

 Trộn 40 g chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma spp với 2 kg hạt giống

lạc rồi đem gieo cho ô thí nghiệm 100 m2, sau đó tưới 40 g chế phẩm

nấm đối kháng Trichoderma spp trên ô thí nghiệm trồng lạc ở các công

thức: khi cây mọc đều, cây bắt đầu ra hoa, có củ non và trước thu hoạch

Trichoderma/100 m2 trước khi thu hoạch 14 ngày

CT 3.5: Đối chứng (Không xử lý Trichoderma)

 Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh Aspergillus flavus trên lạc (%), Hiệu lực của chế phẩm từ nấm Trichoderma spp

4) Thí nghiệm dùng chế phẩm Trichoderma spp tưới ở các giai đoạn sinh trưởng của cây lạc.

 Dùng 40 g chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma spp tưới cho ô thí

nghiệm 100 m2 trồng lạc ở công thức thí nghiệm: cây mọc đều, cây bắtđầu ra hoa, có củ non và trước thu hoạch 14 ngày