và Paecilomyces sp...43 Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và phát triển của nấm Pacilomyces sp.. Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh d
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
SẢN XUẤT NẤM PAECILOMYCES SP ĐỂ PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG MEILODOGYNE SP GÂY
HẠI TRÊN CÂY HỒ TIÊU.
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn: TS NGUYỄN THỊ HAI Sinh viên thực hiện : PHAN ÁNH NGÂN MSSV: 1211100132 Lớp: 12DSH02
TP Hồ Chí Minh, 2016.
Trang 2LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứuthực sự của cá nhân em dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Hai – giảng viênKhoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học CôngNghệ Tp HCM Đề tài được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiếnhành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, KhoaCông Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM Tất cả các số liệu, hình ảnh, các kết quả là nghiên cứu hoàn toàn trung thực
Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu có phát hiện sự gianlận em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm
Tp HCM, ngày 15 tháng 8 năm 2016
Sinh viên thực hiện
Phan Ánh Ngân
Trang 3LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập tại trường đến nay, em đã nhậnđược rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè Với lòngbiết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghệ Sinh học –Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp HCM đã cùng với trithức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng emtrong suốt thời gian học tập tại trường Và đặc biệt, trong học kỳ này Nếu không cónhững lời hướng dẫn, dạy bảo của các thầy cô thì em nghĩ bài thu hoạch này của emrất khó có thể hoàn thiện được Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy Bàibáo cáo đồ án tốt nghiệp thực hiện trong khoảng thời gian 3 tháng Bước đầu đi vàothực tế của em còn hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ Do vậy, không tránh khỏi nhữngthiếu sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báucủa quý Thầy Cô và các bạn học cùng lớp để kiến thức của em trong lĩnh vực nàyđược hoàn thiện hơn
Em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các thầy cô củatrường Đại học Công Nghệ Tp HCM, đặc biệt là TS Nguyễn Thị Hai, giảng viênkhoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường đã tạo điều kiệncho em để em có thể hoàn thành tốt bài báo cáo đồ án tốt nghiệp này Và em cũngxin chân thành cám ơn các thầy cô ở phòng thí nghiệm, các anh chị, các bạn đãnhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành báo cáo đồ án tốt nghiệp
Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, cũng như là trong quá trình làmbài báo cáo, khó tránh khỏi sai sót đồng thời do trình độ lý luận cũng như kinhnghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót,
em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của Thầy/Cô để em học thêm được nhiềukinh nghiệm và áp dụng vào công việc sắp tới
Em xin chân thành cảm ơn !
Trang 4MỤC LỤC
i LỜI CẢM ƠN ii MỤC
LỤC iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi
DANH MỤC BẢNG
vii DANH MỤC HÌNH
viii ĐẶT VẤN ĐỀ .1
MỤC ĐÍCH 2
NỘI DUNG 2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .3
Giới thiệu về nấm Paecilomyces sp .3
1.1.1 Phân loại khoa học 3
1.1.2 Đặc điểm hình thái 4
1.1.3 Cơ chế tiết độc tố của nấm Paecilomyces 5
1.1.4 Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp đối với tuyến trùng 6
1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. .7
Tổng quan về tuyến trùng Meloidogyne sp gây bệnh bướu rễ trên cây hồ tiêu 11 1.2.1 Tổng quan về tuyến trùng ký sinh thực vật 11
1.2.2 Phân loại khoa học 14
Các nghiên cứu nước ngoài về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces sp. trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng 19
Các nghiên cứu trong nước về nhân nuôi và sử dụng Paecilomyces sp trong phòng trừ tuyến trùng hại cây 22
Trang 54CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24Thời gian và địa điểm nghiên cứu 24
Trang 6Vật liệu nghiên cứu, thiết bị và hóa chất 24
2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 24
2.2.2 Thiết bị 24
2.2.3 Các loại môi trường sử dụng 25
Phương pháp nghiên cứu 26
2.3.1 Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomycse sp .27
2.3.2 Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng 28
2.3.3 Các phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật 28
2.3.4 Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014)29 2.3.5 Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp trên các loại môi trường nhân sinh khối (theo Lê Hữu Phước, 2009) 30
2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của nấm Paecilomyces sp 30
2.3.7 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp .31
2.3.8 Khảo sát khả năng kí sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne sp của nấm Paecilomyces sp 35
2.3.9 Đánh giá tác động của chế phẩm nấm Paecilomyces sp trong việc phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp trên cây hồ tiêu 36
2.3.10 Phương pháp xử lý số liệu 37
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38
Kết quả hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp 38
Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm, trừ sâu đến sự phát triển của Paecilomyces sp 39
Trang 73.2.1 Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu đến sự phát triển của Paecilomyces sp.
39
3.2.2 Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của Paecilomyces sp. .41
3.2.3 Khảo sát khả năng đồng sinh trưởng của nấm Trichoderma sp và Paecilomyces sp 43
Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và phát triển của nấm Pacilomyces sp (môi trường lỏng) .44
3.3.1 Khảo sát môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm Paecilomyces sp 44
3.3.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và phát triển của nấm Paecilomyces sp (môi trường rắn) 49
Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces sp 52
3.4.1 Trong điều kiện phòng thí nghiệm 52
3.4.2 Trên đồng ruộng 55
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58
Kết luận 58
Kiến nghị 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO 59
Tài liệu tiếng việt 59
Tài liệu tiếng anh 59
Tài liệu từ internet 61
PHỤ LỤC 1
Trang 8PDA: Potato D – Glucose Agar
SDAY1: Sabourand dextrose Yeast
SDAY3: Sabourand dextrose Yeast bổ sung khoáng
Trang 9DANH MỤC BẢNG
Bảng 2 1 Bố trí thí nghiệm 31
Bảng 2 2 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thuốc trừ sâu 32
Bảng 2 3 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng thuốc trừ nấm 33
Bảng 2 4 Bố trí thí nghiệm khả năng đồng sinh trưởng của Trichoderma sp và Paecilomyces sp 35
Bảng 2 5 Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Paecilomyces sp .37
Bảng 3 1 Đường kính tản nấm Paecilomyces sp trên 4 loại môi trường trừ nấm .40 Bảng 3 2 Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển nấm Paecilomyces sp 40
Bảng 3 3 Đường kính tản nấm Paecilomyces sp .41
Bảng 3 4 Tỷ lệ khuẩn lạc bị ức chế 41
Bảng 3 5 Đường kính tản nấm Paecilomyces sp .43
Bảng 3 6 Đường kính tản nấm Trichoderma sp khi cấy đồng thời với nấm Paecilomyces sp 43
Bảng 3 7 Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp sau thời gian nuôi cấy trên môi trường lỏng lắc 44
Bảng 3 8 Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp tính theo logarit 46
Bảng 3 9 Số lượng bào tử sau 14 ngày nuôi cấy 51
Bảng 3 10 Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp nhân nuôi trên khay ngô mảnh và gạo tấm 52
Bảng 3 11 Tỷ lệ phần trăm số tuyến trùng cái Meloidogyne sp bị nấm Paecilomyces sp ký sinh 53
Bảng 3 12 Đánh giá cấp hại của tuyến trùng trên cây hồ tiêu .55
Trang 10DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Đại thể nấm Paecilomyces sp được nuôi nấy trên môi trường PDA .4
Hình 1.2 Nấm Paecilomyces sp, được chụp dưới kính hiển vi 5
Hình 1.3 Cấu trúc Leucinostatins (paecilotoxin) 6
Hình 1.4 Cấu tạo tuyến trùng ký sinh thực vật 15
Hình 1.5 Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne sp .17
Hình 1.6 Một số chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp phòng trừ tuyến trùng .22
Hình 3.1 Nấm Paecilomyces sp trên môi trường PDA 38
Hình 3.2 Tản nấm Paecilomyces sp trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc hóa học (A: Actara 25WG; B: Sherpa 25EC; C: Plutel 1,8 EC; D: Oshin 20WP; E: đối chứng) 39
Hình 3.3 Nấm Paecilomyces sp trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc hóa học (A: Antracol 70WP; B: Cup 2,9 SL; C: Saizole 5SC; D: Carbenzin 50WP; E: đối chứng) 42
Hình 3.4 Đĩa nấm khi cấy đồng thời Trichoderma sp và Paecilomyces sp .44
Hình 3.5 Dịch nuôi cấy nấm Paecilomyces sp trên 4 loại môi trường (A: Môi trường CDB; B: Môi trường CMB; C: Môi trường SDAY1; D: Môi trường SDAY3) .45
Hình 3.6 Mật độ bào tử tính theo logarit trên bốn loại môi trường lỏng .48
Hình 3.7 Hình nấm Paecilomyces sp được nuôi cấy trên 4 loại môi trường rắn(A: môi trường ngô mảnh, B: môi trường gạo tấm, C: môi trường lúa, D: môi trường cám) 50
Hình 3.8 Mật độ tế bào sau 14 ngày lên men rắn trên 4 loại môi trường .51
Hình 3.9 Nấm Paecilomyces sp nhân nuôi trên khay .52 Hình 3.10 Tỷ lệ tuyến trùng cái Meloidogyne sp bị chết ở các ngày sau khi lây
nhiễm Error! Bookmark not
defined Hình 3.11 Nấm Paecilomyces sp tấn công con cái và trứng tuyến trùng
Meloidogyne sp.; (A, B: con cái tuyến trùng trước khi lây nhiễm nấm; C, E: con cái
tuyến trùng bị lây nhiễm nấm được soi dưới kính hiển vi; D, F: con cái và con cái
Trang 11mang túi trứng của tuyến trùng bị nhiễm nấm Paecilomyces sp soi dưới kính hiển
vi sau khi nhuộm Methylene blue) 54
Hình 3.12 Người dân pha chế phẩm Paecilomyces sp tưới vào gốc cây hồ tiêu 56
Hình 3.13 Trước khi tưới .57Hình 3.14 Sau khi tưới .57
Trang 12Đồ án tốt nghiệp
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hồ tiêu được xem là một trong những cây trồng chủ lực chính của Việt Nam
Hồ tiêu (piper nigrumL.) được xem là “vua của các loại gia vị” và trở thành sảnphẩm nông nghiệp quan trọng nhất của Việt Nam Năm 2015, mặc dù chưa có thống
kê đầy đủ, nhưng dự báo diện tích hồ tiêu cả nước đã vượt con số 100.000 ha (Theo
số liệu Hiệp Hội hồ tiêu Việt Nam, 2015) Tuy nhiên, cũng như các ngành nôngnghiệp khác, ngành hồ tiêu cũng phải đối mặt với các vấn đề về thiệt hại năng suấtgây nên do dịch hại Do đó, bảo vệ thực vật là một trong những phần rất quan trọngtrong việc nâng cao năng suất hồ tiêu vì dịch hại được xem như nguyên nhân chínhlàm giảm năng suất và chất lượng hồ tiêu (Trịnh Thị Thu Thủy và ctv, 2012) Bêncạn các loại bệnh hại, tuyến trùng là dịch hại nguy hiểm trên cây hồ tiêu Theo kếtquả điều tra của Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp miền Nam thì tuyến trùngxuất hiện phổ biến ở tất cả các vùng trồng tiêu trong cả nước với mức độ gây hạicao Việc tìm ra giải pháp để kiếm soát tác nhân tuyến trùng gây hại rất quan trọng.Hiện nay, đa số nông dân thường sử dụng các loại thuốc hóa học để phòng trừ Tuy
có tác dụng nhanh và hiệu quả nhưng các loại thuốc hóa học lại gây ra tác động xấuđối với môi trường, để lại tồn dư trong nông sản, tăng tính kháng của sâu bệnh làmcho việc phòng trừ trở nên khó khăn hơn Vì vậy, hiện nay, các tác nhân sinh học làmột trong những hướng tiềm năng trong việc phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu
Trên thế giới hiện nay có rất nhiều nghiên cứu sử dụng tác nhân sinh học để
phòng trừ tuyến trùng Đặc biệt, nấm Paecilomyces sp được xem là một trong
những loài nấm diệt tuyến trùng giệu quả cao nhất (Burges H D., 1998; Butt T M
và Copping L., 2000) Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về nấm Paecilomyces
vẫn còn hạn chế Năm 2014, Phùng Lê Kim Yến thuộc trường đại học Công nghệ
thành phố Hồ Chí Minh, phân lập được chủng nấm Paecilomyces sp và đã chứng
minh chủng nấm này có hiệu lực trừ tuyến trùng tốt Tuy nhiên, tác giả chưa đưa rađược môi trường sản xuất thích hợp đối với chủng nấm này để ứng dụng trên đồng
ruộng Vì vậy, sinh viên chọn đề tài: “Sản xuất nấm Paecilomyces sp để phòng
trừ tuyến trùng Meloidogyne sp gây hại trên cây hồ tiêu”.
Trang 13Đồ án tốt nghiệp
MỤC ĐÍCH
Chọn môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm
Paecilomyces sp và đánh giá khả năng phòng trừ tuyến trùng của chế phẩm nấm Paecilomyces sp.
NỘI DUNG
❖ Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp.
❖ Khảo sát ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của
Trang 14Đồ án tốt nghiệp
Giới thiệu về nấm Paecilomyces sp.
1.1.1 Phân loại khoa học
Giới: Fungi Ngành:
Ascomycota Lớp:
Eurotiomycetes Bộ:
EurotialesHọ: Trichocomaceace
Chi: Paecylomyces Chi Paecilomyces do Bainier mô tả năm 1907, sau đó được nhiều tác giả chấp nhận chi mới này và bổ sung nhiều loài mới Paecilomyces lilacinum đã được
phân loại trong phần Isarioidea, mà trạng thái hoàn hảo vẫn chưa được tìm thấy
Nấm Paecilomyces spp có rất nhiều loài trên thế giới, khoảng 31 loài và phân bố trên diện rộng trong đó có thể kể đến là Paecilomyces farinosus, Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces amoeneroseus, Paecilomyces javanicus, Paecilomyces tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces lilacinus (Dilip K Arora, P D.
Bridge, Deepak Bhatnagar, 2004)
Nấm Paecilomyces sp có rất nhiều loài, có phổ ký sinh tuyến trùng rất rộng,
cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002) Nấm Paecilomyces spp dễ
dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ và thức ăn, xác bã hữu cơ, dư thừa thựcvật Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên Một sốloài quan trọng trong phòng trừ sinh học như:
- Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết tuyến trùng
- Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất
- Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, tuyến trùng.
- Paecilomyces lilacinus phân lập từ xác bã hữu cơ, đôi khi ở tuyến trùng
chết, rừng cao su, đất trồng tiêu (Crop Protection Compennium, 2002)
Trang 15Đồ án tốt nghiệp
1.1.2 Đặc điểm hình thái
Paecilomyces sp là loài nấm sợi được tìm thấy trong đất hay xác tuyến
trùng Khi được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo nấm thường phát triển kháchậm, có dạng thảm nhung, dạng bó sợi và thường lúc đầu có màu trắng sau đố khibào tử phát triển thì chuyển sang màu hồng nhạt, màu tím hay màu lục nhạt (nênthường được gọi là nấm tím) tùy vào từng loài Cũng có loài màu nâu hay vàngsẫm Sợi nấm mềm, có vách, trong suốt và rộng từ 2,5 - 4 µm (Wikipedia) Cuống
bào tử phân sinh phân nhánh, mức độ phân nhánh của nấm Paecilomyces sp thường lớn hơn nấm mốc xanh Penicillium, gốc cuống dạng bình phình to, phía trên nhỏ và
uốn cong Cuống bình thường sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều Bào tửphân sinh đơn bào, không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc
có gai (Trần Văn Mão, 2002) Khuẩn lạc mọc theo đường tròn đồng tâm Có thể
phân biệt các loài khác nhau của Paecilomyces thông qua hình thái đại thể và vi thể.
(Phùng Lê Kim Yến, 2014)
Hình 1.1 Đại thể nấm Paecilomyces sp được nuôi nấy trên môi trường
PDA.
(Nguồn : h tt p : // g a l l ery h i p c o m/ s c o pu l a r i op s i s h t m)
Thể bình gồm một phần đuôi phình to, thon dần ở phần đầu như một cái cổ.Bào tử trong chuỗi có nhiều dạng từ elip đến hình thoi Bào tử có thành trơn hoặc hơi nhám, không có bào tử chống chịu
Trang 16Đồ án tốt nghiệp
Hình 1.2 Nấm Paecilomyces sp, được chụp dưới kính hiển vi
(Nguồn: h tt p: // w ww.w iki w and c o m / d e / P a e c il o m y c es _ v a r i o tii)
1.1.3 Cơ chế tiết độc tố của nấm Paecilomyces
Khi được nuôi cấy lên men chìm người ta đã chiết tách được hoạt chất sinh học cótên gọi là leucinostatins (còn gọi là paecilitoxin) Leucinostatins là một peptidetrung tính với cấu trúc gồm: α - aminoisobutyric acid, L-leucine, β - alanine và theosau bởi 3 acid amin bất thường (L – threo – β - hydroxy leucine, 2 – amino – 2 –hydroxy – 4 – methyl – 8 oxodecanoicacid và cis – 4 – methyl – L - proline (theoMori et al 1982) Leucinostatins có 6 loại đã được mô tả là A, B, C, D, E, F.Leucinostatins có khả năng kháng khuẩn, chống lại vi khuẩn Gram dương và nhiềuloại nấm (theo Fukushima et al 1983 a,b) Tuy nhiên trong cơ chế kiểm soát tuyến
trùng không có sự tham gia của loại độc tố này Tùy từng loài Paecilomyces khác
nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriunbin,viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin Các hợp chất chuyển hóa thứcấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng
Trang 17Đồ án tốt nghiệp
Hình 1.3 Cấu trúc Leucinostatins (paecilotoxin)
1.1.4 Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp đối với tuyến
trùng
Nhiều loài vi nấm được phân lập từ trứng tuyến trùng sần rễ (Stirling và
West, 1991) Được nghiên cứu nhiều nhất là Paecilomyces lilacinus và Paecilomyces chalmydosporia, chúng được xem là có khả năng ký sinh tuyến trùng
hiệu quả nhất, có thể kí sinh cả trứng lẫn con cái (Siddiqui và Mahmood, 1996)
Có hai rào cản đối với nấm kí sinh tuyến trùng khi xâm nhiễm kí chủ là lớpbiểu bì ấu trùng tuổi 2 (J2) và vỏ trứng Một trong những yếu tố quan trọng ảnhhưởng đến quá trình xâm nhiễm là khả năng tiết enzyme protease và chitinase, bởi
vì vỏ trứng được cấu tạo bởi 3 lớp riêng biệt: lớp vitelline bên ngoài, một lớp chitin
và một lớp lipoprotein bên trong Theo Llorca và Claugher (1990), trong quá trìnhxâm nhiễm, ở giai đoạn đầu, một mạng lưới sợi nấm phân nhánh tiếp xúc với vỏtrứng, sau đó chúng tiết enzyme để phân hủy vỏ trứng dẫn đến sự tan rã của lớp
vitellin, sự phân hủy lớp chitin và lipoprotein (Morton et al., 2004).
Các loài nấm khác nhau có khả năng xâm nhiễm tuyến trùng và trứng theocác phương thức khác nhau Ban đầu, các bào tử và sợi nấm tiếp xúc với vỏ trứng.Nấm kí sinh tuyến trùng sử dụng cả cách thức hóa học (tiết enzyme) và cơ học.Nấm tiết ra các enzyme làm mềm vỏ trứng và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tửmộc mầm, thông qua lổ thủng đó mầm của bào tử nấm sẽ xâm nhập vào bên trong
Trang 18Đồ án tốt nghiệp
trứng tuyến trùng (Perry và Starr, 2009) Khả năng tiết enzyme chitinase và proteaseđóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập trứng tuyến trùng của các loài
nấm (Tikhonov et al., 20002) do vỏ trứng được cấu tạo từ chitin và protein tạo
thành một cấu trúc sợi nhỏ và vô định hình (Wharton, 1980) Sau khi xâm nhập vàobên trong chúng hoạt động, tiết ra các độc tố làm tê liệt và phá hủy bên trong cơ thểtuyến trùng, hút dinh dưỡng để sinh sản, tiêu diệt trứng, ấu trùng, làm thay đổi sựtrao đổi chất, hoạt động sinh lý, dẫn đến cái chết của tuyến trùng
1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp.
Các nhà khoa học cũng cho biết rằng nấm Paecilomyces spp khi tấn công
vào cơ thể tuyến trùng nếu gặp những điều kiện không thích hợp về nhiệt độ và ẩm
độ, ánh sáng thì nấm sẽ tạo nên những thể chịu đựng (resistant structures) để đốiphó lại với môi trường (Penland, 1982)
1.1.5.1 Nguồn dinh dưỡng
Trong quá trình phát triển, nấm Paecilomyces sp cần nhiều dưỡng chất, nếu
thiếu dinh dưỡng sẽ làm hạn chế khả năng gây bệnh của nấm đối với tuyến trùng(theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002) Carbon và Nitơ cùng với sự cân bằnggiữa chúng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển cũng như sự hình thành
bào tử của nấm Paecilomyces sp (theo trích dẫn của Rayati và ctv, 2001) Các
nghiên cứu cho biết, việc bổ sung nguồn đường có ảnh hưởng đến khả năng sinhenzyme của nấm (dẫn theo Rayati và ctv, 2001) Các tác giả còn cho biết sucrose là
cơ chất tốt nhất (8,725 cm) cho sự tăng trưởng, tiếp theo là glucose (5,625 cm)
Liang, K (1981) đã cho biết nấm Paecilomyces tenuipes khi thiếu nguồn nitơ động
vật tính gây bệnh giảm xuống rõ rệt (Hill, K L, 1999, trích dẫn bởi Trần Văn Mão,2002)
1.1.5.2 Nhiệt độ
Nhiệt độ và độ ẩm tương đối được coi là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sựphát triển, hình thành bào tử và lây nhiễm của các loài nấm kí sinh tuyến trùng(Ayyasamy và Baskaran, 2005) Nhiệt độ thích hợp cho nấm trong khoảng 20 – 25
0C, nhưng ở 25 0C nấm phát triển tốt nhất (Lee et al., 1999) Gần đây, Stather và
Trang 19Đồ án tốt nghiệp
ctv đã công bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát
triển của nấm Paecilomyces sp và xác định nấm Paecilomyces sp thích hợp ở nhiệt
độ 28 0C Nếu nhiệt độ cao bào tử dễ bị chết hoặc không hình thành, khi tấn côngtuyến trùng nếu gặp điều kiện nhiệt độ, ẩm độ hay ánh sáng không thích hợp thì
nấm Paecilomyces sp sẽ tạo nên những thể chịu đựng để đối phó lại môi trường (theo Penland, 1982) Khi nuôi nấm Paecilomyces farinosus ở các điều kiện nhiệt
độ khác nhau cho thấy nhiệt độ 15 0C có lợi cho sự hình thành bào tử hơn là nhiệt
độ 24 0C Khi nuôi nấm Paecilomyces papillata, nhiệt độ thích hợp nhất là 24 - 26
0C, nhưng ở nhiệt độ 18 0C tỷ lệ ký sinh cao hơn 18 % so với nhiệt độ 25 0C.Nguyên nhân có thể là do dưới nhiệt độ thấp sẽ làm giảm quá trình, dị hóa, làm tăngquá trình đồng hóa, từ đó làm tăng hoạt chất cho cá thể (Trần Văn Mão, 2002) Julio
J D và ctv (2004) đã chứng minh rằng rất ít hoặc không có bào tử nấm được tạonên ở các nhiệt độ 12 0C, 16 0C và 30 0C
1.1.5.3 Ẩm độ
Nấm phát triển thích hợp ở ẩm độ 80 – 90% (Phạm Thị Thùy, 2004) Ẩm độcao sẽ rất có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, tuy nhiên ẩmđộthấp sẽ có lợi cho duy trì sự sống của nấm Bào tử phân sinh của nấm
Paecilomyces sp có khả năng sống lâu trong điều kiện ẩm độ từ 0 – 34 % hơn là khi
ẩm độ 75 %
1.1.5.4 pH
pH môi trường được quyết định bởi nồng độ ion H+, chính nồng độ ion H+
có ảnh hưởng đến hệ thống enzyme của tế bào và ảnh hưởng việc hấp thu khoáng,acid hữu cơ của tế bào nấm cho quá trình phát triển cũng như hình thành bào tử(Dasrupta, 1994) Nấm thường sống trong phạm vi pH = 3,5 – 8 Nhưng nấm tuyếntrùng ưa pH hơi acid và nấm phát triển thích hợp ở pH = 5,5 – 6 Theo nghiên cứu
của Sung Mi Shim et al., (2003), thì giá trị pH phù hợp cho sự phát triển của P fumosoroseus nằm trong khoảng 6 – 9, còn P japonica phát triển tối ưu ở pH 7 (Choi et al., 1999), P sinclairii phát triển tối ưu ở pH 8 (Shim et al., 2003).
1.1.5.5 Ánh sáng
Trang 20Đồ án tốt nghiệp
Các loài nấm ký sinh tuyến trùng, tuyến trùng rất cần ánh sáng cho sự pháttriển và tạo bào tử Ánh sáng là nhân tố không thể thiếu cho việc hình thành bào tử(theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002) Ánh sáng cũng rất cần thiết cho quá trình
sinh bào tử của nấm Paecilomyces spp Nếu thiếu ánh sáng thì nấm Paecilomyces
spp sẽ không tạo nhiều bào tử
1.1.5.6 Độ thoáng khí
Nấm tuyến trùng đa số đều thuộc loại hiếu khí Khi nấm phát triển chúng đòihỏi có lượng oxy thích hợp trong dụng cụ nhân nuôi hay trong cả biên độ rộng củakhông gian nuôi cấy, nếu phù hợp nấm sẽ phát triển tốt
1.1.5.7 Môi trường nuôi cấy
Năm 1986, tác giả Jeanne M M I và CS (1986) đã thử nghiệm nuôi cấy
nấm Paecilomyces sp bằng phương pháp lên men chìm Tác giả đã tiến hành thử
nghiệm các điều kiện nhân sinh khối tạo bào tử chồi (Blastospore) bằng các nguồnnitơ và cacbon khác nhau Kết quả cho thấy trong các nguồn nitơ thử nghiệm thì(NH4)2SO4 thích hợp nhất cho nấm Paecilomyces sp phát triển, tạo bào tử chồi nhiều nghiên cứu về sản xuất nấm Paecilomyces sp trong điều kiện nuôi cấy lỏng
đã chỉ ra rằng để tối ưu hóa cho sản xuất tối đa sinh khối sợi nấm và exo –
polysaccharide của nấm Paecilomyces japonica Kết quả cho thấy với thành phần
glucose 30g, 20 g cao nấm men, 0,5g KH2PO4 và 0,1 g CuCl2.2H2O và 1 lít nước
cất được cho là môi trường tối ưu để sản xuất nấm Paecilomyces japonica ở nhiệt
độ 27 0C sẽ cho sinh khối sợi nấm và lượng polysaccharide lần lượt là 23,1 g / l và2,5 g / l (Lee JS, Iung WC, Park SJ, Lee KE, Shin WC, Hong Ex, 2012) Nghiêncứu của Li Gao (2015) báo cáo về tác động của các yếu tố dinh dưỡng và môi
trường ảnh hưởng đến sản xuất sinh khối và bào tử nấm Paecilomyces lilacunus IPC
– P Các yếu tố này bao gồm nguồn carbon và nitơ, tỷ lệ C / N, các khoáng chất vàvitamin cùng với nguồn nước, nhiệt độ, chu kỳ sáng / tối và độ pH Các bào tử đãđược cấy trên môi trường cơ bản (sucrose 19.00 g / l, peptone đậu nành 4.06 g / l,
K2HPO4 1,00 g / l, KCl 0.50 g / l, MgSO4 0.50 g / l, FeSO4 0,01 g / l, agar 13,00 g /l) trong 4 ngày, trước khi được cấy chuyền qua môi trường hình thành bào tử
Trang 21Đồ án tốt nghiệp
(dextrin 2.27 g / l, urê 2.13 g / l, CaCl2 3,00 g / l, ZnSO4 · 7H2O 0,01 g / l, agar13.00 g / l) cho thêm 4 ngày theo các điều kiện môi trường sau đây: -3,9 MPa / pH7
/ ánh sáng 24 h / nhiệt độ 29 °C; những điều kiện đã được thay đổi để -0,3 MPa / pH
6 / ánh sáng 24 h / nhiệt độ 23 ° C để có được số lượng sinh khối tốt hơn Số liệucung cấp thông tin về nhu cầu dinh dưỡng và môi trường của loại nấm này, đó sẽ làđiều cần thiết cho việc sản xuất chế phẩm thương mại của nó Môi trường nuôi cấylỏng với nồng độ carbon khác nhau và tỷ lệ C / N đã được thử nghiệm để sản xuất
bào tử chịu khô hạn của Paecilomyces fumosoroseus Trong khi tất cả các môi
trường được thử nghiệm hỗ trợ hình thành bào tử trong môi trường lỏng, nồng độbào tử cao (5,8 × 108 bào tử / ml) được sản xuất trong môi trường có chứa 80 gglucose.l-1 và 13,2 g Casamino axit.l-1 (môi trường MS) và một tỷ lệ cao hơn đáng
kể (79 %) của các bào tử sống sót không khí khô có chứa nồng độ glucose trongmôi trường lớn hơn 20 g / l và axit Casamino nồng độ từ 13,2 và 40 g / l hỗ trợ sản
xuất tối đa của bào tử chịu khô hạn Tất cả 23 chủng nấm P fumosoroseus phân lập
trong trong môi trường MS được sản xuất cho nồng độ cao của bào tử chịu khô hạn.Khi bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, hơn 60 % số bào tử đông khô được sản xuất trongmôi trường MS vẫn còn hoạt tính sau khi bảo quản 7 tháng trong khi ít hơn 25 %của bào tử khô trong không khí sống sót sau 90 ngày lưu trữ
Hàng loạt các nghiên cứu về các loại cơ chất, thành phần môi trường để sản
xuất sinh khối nấm Paecilomyces sp đã được thực hiện S Prabhu, S.Kumar và S Subranmanian (2008) nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Paecilomyces lilacinus trên môi trường lỏng để trừ trứng tuyến trùng Thí nghiệm được thực
hiện trên 4 loại môi trường Potato dextrose broth (PDB), môi trường Richards; 10
% Molasses và môi trường Semi chọn lọc Kết quả thí nghiệm cho thấy khối lượngsợi nấm đạt cao nhất ở môi trường Semi chọn lọc (19,82g), tiếp theo là môi trường
10 % Molasses (16.85 g) Khối lượng sợi nấm đạt ít nhất ở môi trường PDB(10.5g) Sinh khối sợi nấm đạt cao nhất ở môi trường Semi chọn lọc (32.8 x 107
bào tử / g), tiếp theo là môi trường 10% Molasses (28.8 x 107 bào tử / g) Bào tử
Trang 22Đồ án tốt nghiệp
đạt ít nhất ở môi trường PDB (10.3 x 107 bào tử / g) Năm 2015, Zhen Yu, You –chi Zhang, Xiang
Trang 23Đồ án tốt nghiệp
Zhang và Yin Wang đã thực hiện nghiên cứu lên men nấm Paecilomyces lilacinus
bằng chất thải thực phẩm kiểm soát sinh học tuyến trùng sần rễ Điều kiện môi
trường nuôi cấy nấm P lilacinus được tối ưu hóa thông qua phương pháp lên men
bề mặt Kết quả chỉ ra rằng thời gian lên men, lượng chất thải thực phẩm, độ pH ban
đầu và nhiệt độ là các yếu tố quna trọng ảnh hưởng đến sản xuất P lilacinus Sinh khối nấm Paecilomyces lilacinus phát triển ở điều kiện tối ưu cho 109,6±0,3 bào tử /
ml Sau khi lên men, nhu cầu oxy hóa của chất thải thực phẩm giảm một cách hiệuquả với 81,92 % Hoạt tính enzyme protease và khả năng kiểm soát tuyến trùng sần
rễ của P lilacinus nuôi bằng chất thải thực phẩm được đánh giá cao hơn khi nuôi
bằng môi trường PDA lần lượt là 10,8 % và 27 %
Lê Hữu Phước và cộng sự (2009) đã thực hiện nghiên cứu nhân sinh khối
nấm Paecilomyces spp trên bốn loại môi trường CDB, CMB, SDAY1 và SDAY3
qua các thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng Khảnăng tạo bào tử ở 4 môi trường dinh dưỡng cao nhất ở 6 NSKL Mật số bào tử caonhất ở môi trường SDAY3 (5,6 x 108 bào tử / ml) và thấp nhất là môi trường CDB,chỉ có 0,6 x 108 bào tử / ml Hai môi trường SDAY1 và CAM cho mật số bào tử lầnlượt là 5,0 x 108 bào tử / ml và 4,8 x 108 bào tử / ml, tuy nhiên giữa chúng không có
sự khác biệt về mặt thống kê
tiêu
1.2.1 Tổng quan về tuyến trùng ký sinh thực vật
Tuyến trùng ký sinh thực vậy có thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ nhữngvết thương nhỏ đến toàn bộ vật chất của thực vật (Sharman et al., 1997) Tổn hại vềmặt kinh tế từ 40-50% hay thậm chí tổn hại còn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấncông bởi những loài tuyến trùng có khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry,1997)
Vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra không biểu hiện rõ ràng nên ngườinông dân thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra Thiệt hại
về cây trồng do tuyến trùng gây ra hậu quả cao đặc biệt vào mùa mưa, trong đó bao
Trang 24Đồ án tốt nghiệp
gồm các loại cây thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua bị ảnh hưởng nhiều
nhất Ở Việt Nam, sản lượng tiêu giảm đáng kể do tuyến trùng Meloidogyne spp.
gây ra bệnh sần rễ Chúng phá hoại bộ rễ, tạo nhiều vết thương làm cho các loài vinấm, vi khuẩn có khả năng xâm nhập và gây bệnh dễ dàng hơn Khi tuyến trùng gâyhại, cây ngừng sinh trưởng, lá vàng, ra hoa và đậu quả kém Đặc biệt, khi quan sátdưới rễ sẽ thấy có những nốt sần xuất hiện, nếu bệnh quá nặng cây sẽ chết Bệnhsần rễ không chỉ biểu hiện ở những cây lá vàng mà còn cả những cây xanh tươi dobệnh mới phát triển ở giai đoạn đầu, rễ vẫn vận chuyển nước và khoáng chất được
Tuyến trùng ký sinh trên hồ tiêu gồm tuyến trùng ngoại ký sinh và nội kýsinh, chích hút dinh dưỡng từ rễ làm suy giảm sức khỏe của cây, gây tổn thương rễ,ngăn cản sự hấp thu dinh dưỡng và nước, gây vàng lá cục bộ hoặc vàng toàn bộ cây,gây héo tạm thời vào mùa khô khi thiếu nướcvà có nhiều u bướu rễ, vết thâm đentại bướu, hoặc bướu bị mục nát, có rất ít rễ non được hình thành Hội chứng vàng lácây tiêu có liên quan đến mức độ rễ bị tổn thương do sự ký sinh của tuyến trùng.Triệu chứng sưng rễ thường do tuyến trùng nội ký sinh gây ra, hoặc chỉ là vết thâmnâu, nâu đen trên rễ do tuyến trùng ngoại ký sinh tạo ra
Tuyến trùng luôn hiện diện trong vùng rễ hồ tiêu và tập trung nhiều từ độ sâu
5 đến 40 cm, vì rễ là nơi cung cấp dinh dưỡng cho tuyến trùng Cây càng tốt, rễ hútdinh dưỡng càng nhiều, tuyến trùng càng phát triển nhanh về số lượng Mật độtuyến trùng trên một đơn vị khối lượng đất (50g, 100g) hoặc khối lượng rễ (1g, 5g),
số bướu trên đơn vị khối lượng đất hay khối lượng rễ (1g), số tuyến trùng cái trong
1 bướu rễ, là các chỉ tiêu dùng để đánh giá mức độ nhiễm tuyến trùng của đất trồng
và cây ký chủ Vì vây, biện pháp kiểm soát số lượng tuyến trùng cần thực hiện vàothời điểm cây hồ tiêu có tốc độ phát triển cao nhất và lúc tuyến trùng tập trung vàovùng rễ nhiều nhất
Tuyến trùng nhanh chóng tiếp cận và xâm nhiễm vào rễ non sau khi câyđược trồng và thiết lập quần thể với nhiều thế hệ cùng tồn tại Tuy nhiên cơ cấu đất,nguồn hữu cơ, vi sinh vật đối kháng hoặc ký sinh có ảnh hưởng đến số lượng tuyếntrùng Tuyến trùng rễ cây hồ tiêu ít định cư ở tầng đât sâu hơn 60 cm, vì vậy kỹ
Trang 25Đồ án tốt nghiệp
thuật trồng và chăm sóc cho hệ rễ phát triển theo chiều sâu sẽ giúp cây “thoát” sựxâm nhiễm tuyến trùng
Tuyến trùng phát tán theo nước mưa, nước tưới, động vật đi lại trong vườn,cây giống nhiễm tuyến trùng, hoặc do con người đi lại vô tình mang đất nhiễmtuyến trùng Tàn dư rễ có tuyến trùng định cư, cây ký chủ, mảng trứng trong đất lànơi lưu tồn nguồn tuyến trùng trên vườn hồ tiêu hằng năm
Sự phát triển của bệnh trải qua 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: tuyến trùng mới xâm nhập vào rễ và tạo nốt sần, lúc này
rễ chưa bị ảnh hưởng nhiều, rễ vẫn còn màu trắng
- Giai đoạn 2: rễ bị đổi màu, chức năng vận chuyển nước và chất dinhdưỡng bị ảnh hưởng Rễ bị tổn thương và tạo cơ hội cho các vi sinh vật tấn cônggây nhiều bệnh khác cho cây
- Giai đoạn 3: rễ bị đổi màu đen và chức năng vận chuyển đã không
Trang 26Đồ án tốt nghiệp
còn
Theo Trịnh Thị Thu Thủy và cộng sự (2007), có 29 loài tuyến trùng thuộccác họ khác nhau có mặt trong vùng đất trồng tiêu của Việt Nam, phổ biến nhất là
chi Meloidogyne Chúng hiện diện tương đối nhiều nơi trên thế giới, chúng ký sinh
bắt buộc với rễ của hàng ngàn loài thực vật
Meloidogyne gồm hơn 60 loài, 4 loài gây hại chính là Meloidogyne javanica, Meloidogyne arenaria, Meloidogyne incognita và Meloidogyne halpa Chúng có
mặt ở 23 trong số 43 loài cây chính yếu, từ các cây lương thực, đồng cỏ đến các loàicây cảnh
Việc kiểm soát tuyến trùng sẽ rất khó khăn nếu chúng tấn công vào các loàicây lâu năm vì các loài cây lâu năm có rễ ăn sâu vào đất
Meloidogyne spp được Neal phát hiện đầu tiên ở cây sắn vào năm 1889 Rễ
bị tuyến trùng xâm hại sẽ hấp thu nước và các khoáng chất yếu đi so với bìnhthường, làm giảm sự tăng trưởng, chất lượng, năng suất cây trồng, từ đó kéo theo sựsuy giảm sức đề kháng của cây trồng với sự tác động của các yếu tố ngoại cảnh nhưhạn hán, dịch bệnh,
Trang 271.2.2 Phân loại khoa học
Giới: Animalia Ngành: Nematoda Lớp: Secernentea Bộ: Tylenchida Họ: Heteroderidae
Loài: Meloidogyne
1.2.3 Đặc điểm sinh thái
Theo phân loại của Goldi (1887, có chỉnh sửa vào năm 2000), Meloidogyne
spp có đặc điểm sau:
Đối với con cái trưởng thành thì có hình tròn tới dạng quả lê, màu trắng, ítvận động Không có giai đoạn u nang Có kim chích nhỏ và mảnh, thường dài từ12–15 μm Lỗ bài tiết nằm trước tới khoang giữa khối tròn, thường chỉ sau kimchích Sáu tuyến trực tràng lớn tiết các chất đặc sệt để bảo quản trứng, đẻ trứng rangoài
Con đực trưởng thành có hình giống con giun, dài đến 2 mm, đuôi xoắn vàtròn, phát triển qua các lần biến thái trong rễ Có kinh chích nhỏ nhưng mảnh, dài18–25 μm Tuyến hầu chủ yếu nằm ở phần bụng đến ruột Gai nhỏ và mảnh, thườngdài 25–33 μm, ống dẫn dài từ 7–11 μm Có tinh hoàn duy nhất
Ấu trùng: trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra trong một bọcgelatin (còn gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt của sần rễ Ấu trùng cảm nhiễm tuổi
2 (J2) có dạng cân đối hình giun, dài khoảng 0,4 – 0,5 mm Kim chích và vùng đầukitin hóa yếu, đuôi hình chóp
Trang 28Hình 1.4 Cấu tạo tuyến trùng ký sinh thực vật
(Nguồn: thesoilhuggersjourney.wordpress.com)
1.2.4 Hình thức sinh sản
Tuyến trùng phần lớn sinh sản hữu tính là chủ yếu Tỷ lệ đực, cái phụ thuộcvào nhiều yếu tố Điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến quá trình sinh sản và pháttriển qua các giai đoạn từ tuyến trùng non lên tuyến trùng trưởng thành để phân giớiđực cái
Tuyến trùng đẻ trứng là chủ yếu, trứng được hình thành trong cơ thể mẹ vàphát triển trong tế bào trứng Một trứng đã thụ tinh là trứng có một nhân với cácnhiễm sắc thể, sau đó thực hiện quá trình phân chia nhân tế bào.Trứng sau khi thụtinh, một số phát triển trong vỏ trứng, vỏ cơ thể mẹ chuyển thành nang và tuyếntrùng non phát triển trong đó, sau đó chui ra ngoài ở tuổi 2 trong điều kiện ngoạicảnh phù hợp
1.2.5 Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne sp.
Con cái đẻ trứng trong một khối chất đặc sệt chứa chất nền glycoprotein,được tiết bởi bởi sáu tuyến lớn trong ruột thông qua hậu môn (Sharon và Spiegel,1993) Các khối trứng thường được tìm thấy trên bề mặt của sần rễ, đôi khi các bọctrứng này có thể nằm trong sần rễ Khối trứng ban đầu mềm, dính và trong vắt nhưpha lê nhưng lúc sau lại cứng và có màu nâu xẫm
Trang 29Sau quá trình phát triển phôi thai, lần lột xác thứ nhất xảy ra bên trong trứng
và phát triển thành ấu trùng tuổi 2 dạng cảm nhiễm (J2) J2 dễ bị tổn thương, do đóchúng cần xâm nhiễm và định cư vào kí chủ càng nhanh càng tốt Ấu trùng J2 cóthể xâm nhập vào rễ ngay cạnh nốt sần hoặc có thể xâm nhập vào rễ mới, ở đóchúng tấn công vào các mô phân sinh ở đỉnh rễ, tiết các hợp chất (ascorbic acid,gibberellin hay glutamic acid) và làm cho bề mặt rễ bị tổn thương (Bird và Loveys,1975)
Sau khi J2 xâm nhập, đỉnh rễ phình ra và sự phát triển của rễ dừng lại trongmột thời gian ngắn Tuyến trùng hút dinh dưỡng tại các tế bào mô mạch của rễ, tiếtmen tiêu hóa làm cho quá trình sinh lý sinh hóa của mô rễ thay đổi và hình thànhcác điểm dinh dưỡng của tuyến trùng (vùng dinh dưỡng này gồm 5–6 tế bào khổnglồ) Cùng với sự hình thành tế bào khổng lồ các mô rễ xung quanh nơi tuyến trùng
ký sinh cũng phình to tạo ra các bướu rễ
Sau khi xâm nhập vào rễ, J2 cũng nhanh chóng thay đổi về hình thái: cơ thểphình ra và các cơ quan cũng dần phát triển Quá trình phát triển của tuyến trùngtrong rễ từ J2 trải qua 3 lần lột xác và đạt đến trưởng thành Lần lột xác cuối cùng là
sự biến thái thật sự đối với con đực, từ dạng cuộn gấp khúc trong J2 chúng được nở
ra và có dạng hình giun, trong khi con cái có dạng hình tròn như quả lê hay quảchanh
Trang 30Hình 1.5 Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne sp.
(Nguồn: extension.umn.edu)
1.2.6 Cơ chế xâm nhiễm của tuyến trùng Meloidogyne sp lên rễ cây
Khi chuẩn bị xâm nhập vào rễ, J2 tập trung dọc theo các tế bào non gần hayngay tại vùng dính rễ J2 thường tấn công vào các mô phân sinh ở đỉnh rễ, nơi các
rễ bên mọc ra tạo nan điểm xâm nhập cho các J2 khác và làm cho bề mặt rễ bị tổnthương Khi J2 tiếp xúc với bề mặt rễ, chúng thường dùng kim chích và xâm nhậpngay vào trong rễ Sự xâm nhập của chúng có thể xảy ra ở bất kỳ phía nào của rễ.Sau khi xâm nhập vào trong rễ, tuyến trùng di chuyển giữa các tế bào vỏ rễ làm chocác tế bào bị tách dọc ra, sau đó tuyến trùng định vị tại vùng mô phân sinh của vỏ rễ
và bắt đầu quá trình hấp thu dinh dưỡng Khi hút dinh dưỡng, tuyến trùng cắm phầnđầu vào các tế bào mô mạch của rễ, tiết men tiêu hóa làm cho quá trình sinh lý sinhhóa của mô rễ thay đổi và hình thành các vùng dinh dưỡng cho tuyến trùng Vùngnày gồm 5-6 tế bào khổng lồ (tế bào có nhiều nhân) được tại thành trong vùng nhu
mô hoặc vùng mô libe Tế bào khổng lồ phát triển từ một tế bào ban đầu duy nhất.Các tế bào khổng lồ thường chứa nhiều nhân (có thể lê đến 80 nhân trong mỗi tế
Trang 31bào) và các nhân bên trong tế bào khổng lồ thường là đa bội (Huang và Maggenti,1969; Wiggers và công sự, 1990) Đây là sự thích nghi chuyên hóa cao của tế bàođược tạo ra và duy trì do tuyến trùng ký sinh Cùng với sự hình thành tế bào khổng
lồ, các mô rễ xung qunah nơi tuyến trùng ký sinh cũng phình to ra tạo thành sần rễ.Sần rễ thường được tạo thành trong vòng 1-2 ngày sau khi tuyến trùng xâm nhập.Kích thước của nốt sần liên quan đến cây chủ, số lượng J2 xâm nhập và loài tuyếntrùng ký sinh
Khi tế bào khổng lồ được hình thành, tuyến trùng J2 trở nên ít vận động vàlớn dần, hình thành dạng “xúc xích” Dưới những điều kiện thuận lợi, J2 sẽ biếnthái thành ấu trùng tuổi 3 (J3) sau 14 ngày, sau đó đến giai đoạn ấu trùng tuổi 4(J4), và cuối cùng đến giai đoạn trưởng thành Tổng cộng thời gian ấu trùng ở giaiđoạn tuổi 3 và 4 là ngắn hơn so với giai đoạn ấu trùng tuổi 2 hoặc tươnrg thành,thường là từ 4-6 ngày J3 và J4 thiếu kiêm chích và do đó không hút thức ăn được.Con đực, khi đã được hình thành, giống hình con giun và không có bằng chứng nàocho thấy chúng hút chất dinh dưỡng Các con đực có thể được tìm thấy nhiều trongcác loài có khả năng di chuyển không giao hợp khi các điều kiện không thuận lợicho sự phát triển của con cái, như khi mật độ tuyến trùng quá cao và có sự giới hạn
về nguồn thức ăn (Perry và Starr, 2009)
1.2.7 Một số biện pháp phòng trừ
Ở Việt Nam, việc kiểm soát tuyến trùng chủ yếu dựa vào các phương phápvật lý (cày ải, luân canh cây trồng, ) hay hóa học Hoạt chất sinh học được nghiêncứu nhiều nhất có thể phòng trừ tuyến trùng là chitosan và azzadiractin được chiếtxuất từ cây neem (Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh, 1996) Có rất ítnghiên cứu sử dụng vi sinh vật (nấm, vi khuẩn) để kiểm soát tuyến trùng hại thực
vật Gần đây, viện sinh học nhiệt đới đã sử dụng phân ủ có chứ T harzianum và
bánh dầu neem để phòng trừ tuyến trùng sần rễ trên tiêu và cho thấy sự giảm mật độtuyến trùng từ 2-4 lần so với đối chứng (Dương Đức Hiếu và cộng sự, 2010)
Từ những năm 1970 trở lại đây các loại thuốc hóa học khác nhau đã được sửdụng rộng rãi để phòng trừ tuyến trùng ký sinh thực vật như các loại thuốc xông
Trang 32hơi, các loại thuốc không xông hơi Tuy nhiên biện pháp này lại gây hậu quả xấuđến môi trường và sức khỏe cộng đồng, đặc biệt thuốc hóa học cũng làm cho nhiềuloại tuyến trùng trở nên kháng thuốc Do đó cũng chỉ nên dùng thuốc hóa học trongtrường hợp cần thiết và phải sử dụng chúng một cách hợp lý Đưa thuốc vào độ sâu
35 – 40 cm đã cày bừa kỹ, ẩm độ 75 % và nhiệt độ phải phù hợp trong thời điểmcần xử lý với từng loại thuốc Dùng thuốc vào đúng giai đoạn mẫn cảm nhất củatuyến trùng, có thể thực hiện trước khi trồng, sau khi thu hoạch và trong bảo quản
Các nghiên cứu nước ngoài về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces sp.
trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng
Nấm gây bệnh cho tuyến trùng và tuyến trùng là một tác nhân sinh học quantrọng trong việc khống chế tuyến trùng và tuyến trùng gây hại Vai trò trấn ápnhững trận dịch lớn do tuyến trùng gây hại của các chủng nấm ký sinh được trìnhbày rất rõ trong nhiều công trình của các tác giả trên thế giới: V.P Paspelop (1932-1940), Dusky S.R (1959), Tanada I (1959 -1964), Hall I M (1964)…(dẫn theoNguyễn Ngọc Tú, 1997) Đây là một nhân tố hữu dụng trong hệ thống quản lý sâuhại tổng hợp IPM (Gillespie; Rombach và CS., 1986) Trên thế giới, việc sử dụngnấm ký sinh gây bệnh để phòng trừ sinh học đối với các loài tuyến trùng và tuyếntrùng đã được quan tâm nghiên cứu từ đầu thế kỷ 19 Nhiều loài nấm có khả năngnhiễm và tiêu diệt trứng tuyến trùng Hầu hết các loài nấm này có cơ chế hoạt động
là hoại sinh và xâm nhập vào trứng gây chết Các loài nấm ký sinh trứng tuyến
trùng bao gồm Paecilomyces, Pochonia và Verticilium Paecilomyces lilacinus và Pochonia chlamydosporiaare cho hiệu quả ký sinh trứng tuyến trùng tốt nhất Paecilomyces lilacinus được chứng minh kiểm soát thành công tuyến trùng sần rễ,
M javanica và M incognita trên cà chua, cà tím và các loài rau khác (Cayrol et al,
1989; Verdejo – Lucas et al, 2003; Goswami và Mittal, 2004; Van Damme et al,2005; Goswami et al., 2006; Haseeb và Kumar, 2006) Huma Abbas , Nazir Javed ,Sajid Aleem Khan , Muhammad Kamran , Muhammad Atiq (2016) thực hiện
nghiên cứu sử dụng nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng sần rễ trên
cây cà tím Thí nghiệm này được thực hiện trong điều kiện nhà lưới vào 7 ngày đã
Trang 33chứng minh được rằng, Paecilomyces lilacinus có khả năng làm giảm số lượng lớn
tuyến trùng và có khả năng thay thế cho các loài thuốc hóa học phòng trừ tuyếntrùng
Trong những thập kỷ 60 đến 80 của thể kỷ trước, việc nghiên cứu nuôi cấycác nấm ký sinh gây bệnh cho tuyến trùng và tuyến trùng hại đã được phát triển rất
mạnh mẽ nhưng chủ yếu là nấm Metarhizium và Beauveria Trong đó phải kể đến
các công trình nghiên cứu của Muller Cogler E (1961), Hall I M (1963- 1964),Camera J W., Mac Bain (1963- 1967), Madelin M F (1965- 1966), Ignoffo C M.(1977), H.D Burges và CS (1982), N K Maniania và CS (1984) (theo NguyễnNgọc Tú và CS.,1997), Ferron P (1978) Các công trình đã tập trung nghiên cứu rất
tỷ mỷ về phương pháp để nhân giống, các môi trường dinh dưỡng, các thiết bị nuôicấy, phương pháp thu bào tử từ sinh khối nấm, tạo chế phẩm sinh học và sử dụngchúng để phòng trừ sâu hại và tuyến trùng trên đồng ruộng
Trong những năm gần đây, một số các công trình nghiên cứu sản xuất và ứngdụng chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm kí sinh tuyến trùng Các chế phẩm sinhhọc từ các nguồn nấm ký sinh có một vai trò quan trọng trong việc phòng chống sâuhại cây trồng, đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe con người (Noris và CS.,2002) Alamgir Khan, Kleith L Williams, Helena K.M Nevalainen (2004) thựchiện nghiên cứu về ảnh hưởng của enzyme protease và chitinase từ nấm
Paecilomyces lilacinus trên cấu trúc vỏ và sự nở của tuyến trùng Meloidogyne javanica Một serine protease và một enzyme được chuẩn bị từ 6 chitinase, được tách chiết và tinh sạch từ môi trường nuôi cấy lỏng chủng nấm Paecilomyces lilacinus 251, tấn công vào các trứng tuyến trùng Meloidogyne javanica để nghiên
cứu hiệu quả của các loại enzyme đến cấu trúc vỏ trứng Quan sát bằng kính hiển viđiện tử chứng minh rằng enzyme protease và chitinase đã làm thay đổi lớn cấu trúccủa vỏ trứng khi chúng tấn công riêng lẻ hoặc kết hợp với nhau Dưới tác độngprotease lên vỏ trứng, lớp lipid biến mất và lớp chitin mỏng hơn Khi sử dụngchitinase có lớp không bào lớn, lớp viteline bị chia ra và mất đi tính toàn vẹn của
nó Những thay đổi lớn trên lớp vỏ trứng xảy ra do ảnh hưởng khi kết hợp enzyme
Trang 34protease và chitinase của nấm Paecilomyces lilacinus Lớp chitin bị thủy phân và
lớp vitelline mất đi tính vẹn toàn Hiệu lực của enzyme chitinase và protease từ nấm
Paecilomyces lilacinus khi sử dụng riêng rẻ hoặc kết hợp cũng cho kết quả làm giảm sự nở của con cái tuyến trùng M javanica Nghiên cứu chỉ ra rằng một số
tuyến trùng đã nở khi được tiếp xúc với enzyme của nấm sẽ có sự hiện diện của
enzyme chitinase từ nấm Paecilomyces lilacinus giữ lại hoạt động của chúng dưới
sự hiện diện của protease nội sinh
Mendoza A R., R A Sikora, và S Kiewnick (2007) đã thực hiện nghiên
cứu về sự ảnh hưởng của Paecilomyces lilacinus chủng 251 lên kiểm soát sinh học tuyến trùng Radopholus similis ở cây chuối Khả năng nâng cao hiệu quả diệt tuyến
trùng của chủng nấm đã được chứng minh Sự tương quan đáng kể giữa liều dùng
và nồng độ để kiềm hãm R similis đã được xác định Ở nồng độ 6 × 106 cfu /g đất
khô được xem là liều dùng tối ưu của P lilacinus Tác giả chứng minh rằng P lilacinus là tác nhân kiểm soát sinh học hiệu quả chống lại R similis và cũng là
nhân tố quan trọng trong việc kiểm soát tuyến trùng trên cây chuối
Năm 2006, M Nasr Esfahani và B Ansari Pour nghiên cứu hiệu quả của
nấm Paecilomyces lilacinus trong kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne Javanica và
ảnh hưởng của nấm đến sự phát triển của cây cà chua trong điều kiện nhà kính Kết
quả chứng minh rằng P lilacinus cải thiện sự phát triển cây trồng và làm giảm đáng
kể số lượng tuyến trùng và trứng tuyến trùng khi bị nhiễm M Javanica như tác
nhân gây bệnh làm rễ sần to Nấm sẽ đạt hiệu quả cao nhất khi nấm và tuyến trùngđược nhiễm đồng thời hoặc nấm được nhiễm trước và tuyến trùng nhiễm sau Tuyếntrùng đã trưởng thành bị tấn công hoặc bị chết đều có sự hiện diện của sợi nấm trên
cơ thể chúng Cheu Guan Pau và cộng sự (2012) đã phân lập được 10 chủng nấm
Paecilomyces lilacinus từ đất vườn trồng 2 loại tiêu đen ở Sarawark có thể phòng
trừ tuyến trùng gây sần rễ Sau quá trình nghiên cứu, thí nghiệm đã chỉ ra rằng cả 10chủng nấm nêu trên đều có khả năng phòng trừ tuyến trùng với mật độ bào tử 105
bào tử / ml
Trang 35Hiện nay, có rất nhiều nơi trên thế giới đã nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm
từ nấm Paecilomyces spp vào trong thực tiễn đời sống Một số sản phẩm phòng trừ
tuyến trùng đã được thương mại hóa như nemaxxion biol do công tyGreencorp,2014 sản xuất lên men lỏng, bao gồm các loại vi khuẩn và nấm
(Bacillus subtilis, Trichoderma spp và Paecilomyces spp.) hay REM G cũng là một sản phẩm phòng trừ tuyến trùng bao gồm các chủng nấm Arthrobotrys spp., Mycorrhia (Glomus spp.), Dactyllela spp., Paecilomyces spp., và các loại vi khuẩn (B spp) và (Pseudomonas spp.), sản phẩm được bổ sung enzyme chitinolytic,
protease và enzyme lipolytic nhằm phá vỏ thành tế bào của tuyến trùng Các sảnphẩm này có hiệu lực cao trên cây cà chua ở vùng Souss – Massa Draa ở Morocco
Hình 1.6 Một số chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp phòng trừ tuyến
trùng.
trong phòng trừ tuyến trùng hại cây
Ở Việt Nam, kiểm soát tuyến trùng chủ yếu dựa vào các phương pháp vật lý(cày ải, luân canh cây trồng, ) hay hóa học Hoạt chất sinh học được nghiên cứu nhiều nhất để phòng trừ tuyến trùng là chitosan và azadiractin được chiết xuất từcây neem (Nguyễn Ngọc Châu và Nguyễn Vũ Thanh, 1996) Có rất ít nghiên cứu
sử dụng vi sinh vậy (vi nấm, vi khuẩn) để kiểm soát tuyến trùng hại thực vật Gầnđây, Viện sinh học nhiệt đới đã sử dụng phân ủ chứa T harzianum và bánh dầuneem để
Trang 36phòng trừ tuyến trùng sần rễ trên tiêu và cho thấy có sự giảm mật độ tuyến trùng từ
2 – 4 lần so với đối chứng (Dương Đức Hiểu và cộng sự, 2010)
Trần Thị Tho và cộng sự (2014) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn dinh
dưỡng đến sự phát triển của nấm tím Paecilomyces javanicus; khả năng hình thành bào tử của các chủng nấm P javanicus và ảnh hưởng của một số loại thuốc trừ nấm
đến sự phát triển của nấm này Kết quả cho thấy môi trường có bổ sung pepton và
cao nấm men là môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm P javanicus Sau 14 ngày nuôi cấy nấm P javanicus cho mật số bào tử 108 cfu / cm2.Nghiên cứu do nhóm tác giả Lê Thị Mai Linh, Nguyễn Thị Duyên, Trịnh QuangPháp, Nguyễn Thị Phương Anh, Phạm Văn Ty ( Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinhvật, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Trường Đại học Khoa học
tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội) thực hiện nghiên cứu khả năng ức chế tuyến
trùng Meloidogyne Incognita trên cà phê của nấm Paecilomyces Javanicus Kết quả nghiên cứu cho thấy dịch nuôi cây nấm P javannicus với nồng độ 5, 10, 20% có
ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng nở trứng và gây chết đối với tuyến trùng M.incognita Với nồng độ 20% dịch nuôi cấy nấm tương ứng với 106 bào tử / ml thìhiệu lực là cao nhất, có thể ức chế nở trứng đến 96% và khả năng gây chết cao nhất
đối với ấu trùng M incognita là 75% so với đối chứng Do vậy, nguồn nấm P javannicus có khả năng được phát triển trong phòng trừ sinh học đối với tuyến trùng
M incognita trên đồng ruộng.
Trang 37CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Đề tài được thực hiện từ ngày đến ngày tại phòng thí nghiệm trường Đại họcCông nghệ Tp.HCM
2.2.1 Vật liệu nghiên cứu
Chủng nấm Paecilomyces sp được phân lập bởi Phùng lê Kim Yến (2014)
tại phòng thí nghiệm trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM
Chủng nấm Trichoderma sp được phân lập bởi Lê Nhật Đăng (2015) tại
phòng thí nghiệm trường Đại học Công Nghệ Tp HCM
Mẫu rễ tiêu nghi nhiễm tuyến trùng thu nhận tại vườn tiêu thuộc tỉnh BìnhPhước
Trang 382.2.3 Các loại môi trường sử dụng
2.2.3.2 Môi trường PDA (Potato D-glucose Agar)
Trang 39Ống giống (Phòng thí nghiệm trường ĐH Công nghệ Tp HCM)
Lây nghiễmTuyến trùng cái
Phân lập (từ tuyến trùng bị chết)
Trang 40Làm thuần Giữ giống Bảo quản
Nhân giống Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của