Sản xuất chế phẩm nấm paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp gây hại trên cây hồ tiêu

Khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne sp của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus trong điều kiện phòng thí nghiệm...28 2.3.4.1.. ...Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng tr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

SẢN XUẤT CHẾ PHẨM NẤM PAECILOMYCES LILACINUS PHÒNG TRỪ TUYẾN TRÙNG

MELOIDOGYNE SP GÂY HẠI TRÊN CÂY HỒ TIÊU

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Ts Nguyễn Thị Hai Sinh viên thực hiện : Đinh Thành Hiếu MSSV: 1311100296 Lớp: 13DSH03

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứuthực sự của cá nhân em dưới sự hướng dẫn của TS Nguyễn Thị Hai – giảngviên Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đạihọc Công Nghệ Tp HCM Đề tài được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu

lý thuyết và tiến hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm CôngNghệ Sinh Học, Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường,trường Đại học Công Nghệ Tp HCM Tất cả các số liệu, hình ảnh, các kếtquả là nghiên cứu hoàn toàn trung thực

Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu có phát hiện sự gianlận em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm

Tp HCM, ngày 26 tháng 7 năm 2017

Sinh viên thực hiện

Đinh Thành Hiếu

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập tại trường đến nay, em đã nhậnđược rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè.Với lòng biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Khoa CôngNghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp.HCM đã cùng với tri thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thứcquý báu cho chúng em trong suốt thời gian học tập tại trường Và đặc biệt,trong học kỳ này Nếu không có những lời hướng dẫn, dạy bảo của các thầy

cô thì em nghĩ bài thu hoạch này của em rất khó có thể hoàn thiện được Mộtlần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy Bài báo cáo đồ án tốt nghiệp thựchiện trong khoảng thời gian 3 tháng Bước đầu đi vào thực tế của em còn hạnchế và còn nhiều bỡ ngỡ Do vậy, không tránh khỏi những thiếu sót là điềuchắc chắn, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của quýThầy Cô và các bạn học cùng lớp để kiến thức của em trong lĩnh vực nàyđược hoàn thiện hơn

Em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các thầy cô củatrường Đại học Công Nghệ Tp HCM, đặc biệt là TS Nguyễn Thị Hai, giảngviên khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường đãtạo điều kiện cho em để em có thể hoàn thành tốt bài báo cáo đồ án tốtnghiệp này Và em cũng xin chân thành cám ơn các thầy cô ở phòng thínghiệm, các anh chị, các bạn đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoànthành báo cáo đồ án tốt nghiệp

Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, cũng như là trong quá trình làmbài báo cáo, khó tránh khỏi sai sót đồng thời do trình độ lý luận cũng nhưkinh nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏinhững thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của Thầy/Cô để

em học thêm được nhiều kinh nghiệm và áp dụng vào công việc sắp tới

Em xin chân thành cảm ơn !

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

MỞ ĐẦU .1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1.Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces 4

1.1.1 Phân loại khoa học 4

1.1.2 Đặc điểm sinh thái 5

1.1.3 Các nghiên cứu về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces lilacinus trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng 7

1.1.4 Nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự sản xuất và bảo quản chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus 10

1.2.Tổng quan về tuyến trùng 11

1.2.1 Đặc điểm sinh thái 12

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu 19

2.2.Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu 19

2.2.1 Thiết bị - hóa chất 19

2.2.1.1 Thiết bị 19

2.2.1.2 Hóa chất 19

2.2.2 Vật liệu nghiên cứu: 24

2.3.Phương pháp nghiên cứu 24

2.3.1 Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomycse lilacinus .24

2.3.2 Quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005) 24

2.3.3 Hoàn thiện quy trình nhân nuôi sản xuất chế phẩm từ nấm Paecilomyces lilacinus 26

2.3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm ban đầu của cơ chất đến sự phát triển

2.3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất mang đến thời gian tồn trữ chế phẩm 27 2.3.4 Khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne sp của chế phẩm

nấm Paecilomyces lilacinus trong điều kiện phòng thí nghiệm 28

2.3.4.1 Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014) 28

2.3.4.2 Phương pháp khảo sát khả năng ký sinh của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus 28

2.3.5 Đánh giá hiệu quả phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp hại cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus ở phạm vi đồng ruộng 29

2.3.5.1 Điều tra mức độ tuyến trùng gây hại cây hồ tiêu 29

2.3.5.2 Đánh giá hiệu lực phòng tuyến trùng Meloidogyne sp hại cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus 29

2.4.Phương pháp xử lý số liệu 34

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

3.1.Đặc điểm hình thái của các chủng nấm P1 phân lập được 35

3.2.Khảo sát sự ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất đến mực độ bào tử nấm Paecilomyces lilacinus trong quá trình nhân nuôi 36

3.3 Kết quả mật độ chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus khi bảo quản với các chất mang 38

3.4 Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus 40

3.4.1 Trong điều kiện phòng thí nghiệm 41

3.5 Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus ngoài đồng ruộng 44

3.5.1 Mật số tuyến trùng trong đất 44

3.5.2 Mức độ bị hại và sự phát triển của cây hồ tiêu sau khi xử lý nấm 46

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

4.1.Kết luận 51

4.2.Kiến nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 52

TÀI LIỆU TIẾNG ANH 52

TÀI LIỆU INTERNET 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Bảng Hiệu quả phòng trừ của các chủng nấm Paecilomyces spp.

đối với tuyến trùng hại thực vật 15

Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Paecilomyces

lilacinus

30

Bảng 3.1 Đánh giá ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất 37

Bảng 3.2 Mật độ bào tử chế phẩm P.lilacinus sau 2 tháng tồn trữ khi được

phối trộn với chất mang 39

Bảng 3.3 Tỷ lệ (%) tuyến trùng cái Meloidogyne sp bị nấm Paecilomyces

lilacinus ký sinh 41 Bảng 3.4 Tỉ lệ trứng tuyến trùng cái bị nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh 44

Bảng 3.5 Mật số tuyến trùng di động trong đất ở vùng rễ cây hồ tiêu của các

ciing thức 45

Bảng 3.6 Hiệu lực phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp của nấm

Paecilomyces lilacinus 46

Bảng 3.7 Kết quả sử dụng nấm trừ tuyến trùng hại cây hồ tiêu tại xã Ea

Nam, huyện Ea H’leo 47

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Đại thể nấm Paecilomyces spp 5

Hình 1.2 Đặc điểm vi thể của nấm Paecilomyces lilacinus 6

Hình 1.3 Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces lilacinus 7

Hình 1.4 Vòng đời của tuyến trùng hại rễ 14

Hình 2.1 Phòng ẩm 25

Hình 3.1 Nấm Paecilomyces lilacinus trên môi trường PDA 35

Hình 3.2 Sợi nấm, cành mang bào tử và bào tử của nấm Paecilomyces lilacinus sau khi tái nhiễm và phân lập lại 36

Hình 3.3 Nấm P.lilacinus phát triển trên cơ chất có độ ẩm 40%,80% và 60% (A: độ ẩm 40%, B: độ ẩm 80%, C: độ ẩm 60%) 38

Hình 3.4 Chế phẩm sau khi được phối trộn với chất mang 40

Hình 3.5 Nấm Paecilomyces lilacinus tấn công con cái và trứng tuyến trùng Meloidogyne sp.; (A, B: con cái tuyến trùng trước khi lây nhiễm nấm; C, E: con cái tuyến trùng bị lây nhiễm nấm được soi dưới kính hiển vi; D, F: con cái và con cái mang túi trứng của tuyến trùng bị nhiễm nấm Paecilomyces lilacinus soi dưới kính hiển vi sau khi nhuộm Methylene blue) 42

Hình 3.6 Trứng tuyến trùng Meloidogyne spp bị nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh (mẫu được soi dưới kinh hiển vi khi nhuộm với Cottonblue) 43

Hình 3.7 Sinh viên pha chế phẩm P.lilacinus tưới vào gốc cây hồ tiêu 48

Hình 3.8 Trước và sau khi phun chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus 15 ngày 49

Hình 3.9 Sinh viên xem rễ và lấy mẫu đất của cây hồ tiêu để quan sát tuyến trùng 50

Hình3.10 Quan sát trứng Tuyến trùng Meloidogyne spp bị nấm Paecilomyces lilacinus kí sinh trong đất cây hồ tiêu được xử lí với chế phẩm 50

MỞ ĐẦU

Hồ tiêu là một trong những cây trồng công nghiệp xuất khẩu chủ lực của ViệtNam Do giá trị xuất khẩu cao nên diện tích hồ tiêu ngày càng tăng Tuy nhiên, hiệnnay hồ tiêu bị gây hại nặng bởi nhiều loài dịch hại Trong đó, đáng kể nhất là tuyến

trùng Meloidogyne sp.

Biện pháp hóa học đã và đang được áp dụng để quản lý các loài dịch hại nàynhưng hiệu quả không cao và nguy cơ tồn lưu hóa chất trong sản phẩm cũng là vấn

đề đáng quan tâm

Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu ở các nước trên thế giới đã cho thấy

việc sử dụng các loại nấm Paecilomyces lilacinus cho hiệu quả cao trong phòng trừ

tuyến trùng gây hại (Burges H D., 1998; Butt T M và Copping L., 2000) Tuy nhiên, ở Việt Nam, những nghiên cứu và ứng dụng về loài nấm có ích này vẫn còn khá hạn chế Tại trường đại học công nghệ thành phố Hồ Chí Minh, Phùng Lê Kim

Yến (2014) đã phân lập được chủng nấm Paecilomyces lilacinus có khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne gây hại hồ tiêu và bước đầu đã đánh giá được những

điểm sinh học của loài tuyến trùng này (Lê Trần Quang Huy, 2015, Phan Ánh

Ngân, 2016) Tuy nhiên, vẫn còn nhiều vấn đề về nhân sinh khối chủng nấm này và đánh giá khả năng ký sinh của chế phẩm trên đồng ruộng vẫn chưa tiến hành

được.Xuất phát từ tình hình trên, sinh viên tiếp tục với đề tài “Sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp gây hại trên cây

hồ tiêu”

Tính cấp thiết của đề tài

Hồ tiêu được xem là một trong những cây trồng chủ lực chính của Việt Nam

Hồ tiêu (piper nigrumL.) được xem là “vua của các loại gia vị” và trở thành sảnphẩm nông nghiệp quan trọng nhất của Việt Nam Hiện nay, diện tích trồng hồ tiêucủa Việt Nam đã hơn 100.000 ha (theo Hiệp hội hồ tiêu, 2016), tập trung ở các tỉnhĐắc Lắc, Gia Lai, Bình Phước, Đồng Nai và Bà Rịa, Vũng Tàu Tuy nhiên, sản xuất

hồ tiêu tại tất cả các vùng trồng tiêu chính trong cả nước đang chịu tổn thất đáng kể

do bệnh vàng lá chết chậm mà một trong những nguyên nhân gây bệnh chủ yếu là

tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne incognita ( Đào Thị Lan Hoa và ctv, 2003;

Trình, 2010)

Ngoài gây hại trực tiếp đến sinh trưởng, phát triển của cây trồng, tuyến trùng

còn tạo điều kiện cho các loài nấm như Pythium, Fusảium, Phytopthora … xâm

nhiễm và gây hại cho cây trồng

Biện pháp phòng trừ tuyến trùng hiện nay là sử dụng các loại thuốc hóa họcđặc hiệu như Marshal, Oncol, Nokaph, Tervigo và Vimoca (Đỗ Thị Kiều An và ctv,2015) Tuy thuốc hóa học có làm mật số tuyến trùng nhưng các loại thuốc hóa họclại gây ra tác động xấu đối với môi trường, để lại tồn dư trong nông sản, tăng tínhkháng của sâu bệnh làm cho việc phòng trừ trở nên khó khăn hơn Vì vậy, hiện nay,các tác nhân sinh học là một trong những hướng tiềm năng trong việc phòng trừtuyến trùng trên cây hồ tiêu

Trên thế giới hiện nay có rất nhiều nghiên cứu sử dụng tác nhân sinh học để

phòng trừ tuyến trùng Đặc biệt, nấm Paecilomyces lilacinus được xem là một trong

những tác nhân có khả năng phòng trừ tuyến trùng hiệu quả cao nhất (Burges H D.,1998; Butt T M và Copping L., 2000) Tuy nhiên ở Việt Nam, các công trình

nghiên cứu về nấm Paecilomyces spp vẫn còn hạn chế Xuất phát từ tình hình trên,

sinh viên chọn đề tài: “Sản xuất chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp gây hại trên cây hồ tiêu”

Mục đích nghiên cứu

Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm phòng trừ tuyến trùng hại cây hồ tiêu từ

nấm Paecilomyces lilacinus và xác định hiệu quả phòng trừ tuyến trùng

Meloidogyne sp của chế phẩm Paecilomyces lilacinus.

Nội dung đề tài

Khảo sát độ ẩm thích hợp để nhân sinh khối chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus.

Khảo sát chất mang phối trộn phù hợp để bảo quản chế phẩm từ nấm

Paecilomyces lilacinus.

Đánh giá khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne của chế phẩm Paecilomyces lilacinus trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Đánh giá khả năng trừ tuyến trùng hại hồ tiêu của chế phẩm nấm

Paecilomyces lilacinus trên đồng ruộng.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về nấm thuộc chi Paecilomyces

1.1.1 Phân loại khoa học

Loài: Paecilomyces lilacinus

Chi Paecilomyces do Bainier mô tả vào 1907, sau đó được nhiều tác giả chấp

nhận chi mới này và bổ sung nhiều loài mới Chuyên luận về chi nấm này củaSamson (1974) chấp nhận 16 loài đã mô tả, đồng thời tổ hợp mới 9 loài và đề nghị 6loài mới, tất cả tập hợp trong 2 nhóm loài Nhóm loài thứ nhất là nhóm loài

Paecilomyces có các giai đoạn bào tử túi thuộc các chi Byssochlamys Westling, Talaromyces C.R.Benjamin và Thermoascus Miehe, gồm các loài ưa nhiệt ôn hòa

(mesophile), chịu nhiệt và ưa nhiệt, có khuẩn lạc màu nâu vàng hay các màu nâu

khác Nhóm loài thứ hai là nhóm loài Isarioides gồm các loài không có giai đoạn

bào tử túi, ưa nhiệt ôn hòa và có khuẩn lạc màu tím hồng, màu lục và màu vàng.Nhiều loài trong nhóm hai này ký sinh gây bệnh côn trùng

Theo điều tra của bộ Nông nghiệp Ấn Độ, chủng nấm Paecilomyces sp an

toàn với động vật máu nóng, không gây ngộ độc qua đường hô hấp, không gây độckhi nuốt phải

Paecilomyces lilacinus:

Được tìm thấy đầu tiên trong trứng tuyến trùng vào năm 1966 và sau này được

phát hiện ký sinh trên trứng của tuyến trùng Meloidogyne incognita ở Peru Hiện

tại, có thể phân lập loài nấm này ở trong đất và thỉnh thoảng là ở cả trong côn trùng.Đường kính khuẩn lạc dao động trong khoảng 5 - 7cm trong 14 ngày ủ ở nhiệt

độ phòng 270C ± 20C Sợi nấm ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu hồngkhi sinh bào tử Sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể hình bình cổ hẹp với số lượnglớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài Các thể bình phình ra ở phầngốc và thon nhỏ lại ở cổ Bào tử trần hình elip đến hình thoi (Samson, 1975)

1.1.2 Đặc điểm sinh thái

Khuẩn lạc của nấm Paecilomyces lilacinus có thể ở dạng thảm nhung, dạng

bó sợi, có màu trắng, hồng nhạt, màu tím đinh hương (nên còn được gọi là nấmtím), màu nâu vàng, màu nâu xám, thỉnh thoảng có màu lục nhạt (tùy loài)

Hình 1.1 Đại thể nấm Paecilomyces spp.

(Nguồn: www.p f chi b a -u.ac.jp)

Cuống bào tử phân sinh phân nhánh, gốc cuống dạnh bình phình to, phía trênnhỏ và uốn cong Cuống bình thường sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều Bào

tử phân sinh đơn bào, không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc

có gai (Trần Văn Mão, 2002)

Hình 1.2 Đặc điểm vi thể của nấm Paecilomyces lilacinus

(Nguồn: h t tp:// w ww.c h ungvisi n h c o m /pa e cil om y c e s -lilac i nu s -nb r c- 3 2861.h t m l /)

Được tìm thấy đầu tiên trong trứng tuyến trùng vào năm 1966 và sau này

được phát hiện ký sinh trên trứng của tuyến trùng Meloidogyne incognita ở Peru.

Hiện tại, có thể phân lập loài nấm này ở trong đất và thỉnh thoảng là ở cả trong côntrùng Đường kính khuẩn lạc dao động trong khoảng 5 - 7cm trong 14 ngày ủ ởnhiệt độ phòng 27oC Sợi nấm ban đầu có màu trắng sau đó chuyển sang màu hồngkhi sinh bào tử Sợi nấm trong suốt và sinh ra các thể hình bình cổ hẹp với số lượnglớn các bào tử gắn lỏng lẻo tạo thành hình chuỗi dài Các thể bình phình ra ở phầngốc và thon nhỏ lại ở cổ Bào tử trần hình elip đến hình thoi (Samson, 1975)

Hình 1.3 Đặc điểm vi thể nấm Paecilomyces lilacinus 1.1.3 Các nghiên cứu về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces lilacinus

trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng

Nấm gây bệnh cho tuyến trùng và tuyến trùng là một tác nhân sinh học quantrọng trong việc khống chế tuyến trùng và tuyến trùng gây hại Vai trò trấn ápnhững trận dịch lớn do tuyến trùng gây hại của các chủng nấm ký sinh được trìnhbày rất rõ trong nhiều công trình của các tác giả trên thế giới: V.P Paspelop (1932-1940), Dusky S.R (1959), Tanada I (1959 -1964), Hall I M (1964) (dẫn theoNguyễn Ngọc Tú, 1997) Đây là một nhân tố hữu dụng trong hệ thống quản lý sâuhại tổng hợp IPM (Gillespie; Rombach và CS., 1986)

Trên thế giới, việc sử dụng nấm ký sinh gây bệnh để phòng trừ sinh học đốivới các loài tuyến trùng và tuyến trùng đã được quan tâm nghiên cứu từ đầu thế kỷ

19 Nhiều loài nấm có khả năng nhiễm và tiêu diệt trứng tuyến trùng Hầu hết cácloài nấm này có cơ chế hoạt động là hoại sinh và xâm nhập vào trứng gây chết Các

loài nấm ký sinh trứng tuyến trùng bao gồm Paecilomyces, Pochonia và Verticilium Paecilomyces lilacinus và Pochonia chlamydosporiaare cho hiệu quả

ký sinh trứng tuyến trùng tốt nhất Paecilomyces lilacinus được chứng minh kiểm soát thành công tuyến trùng sần rễ, M javanica và M incognita trên cà chua, cà

tím và các loài rau khác (Cayrol et al, 1989; Verdejo – Lucas et al, 2003; Goswami

và Mittal, 2004; Van Damme et al, 2005; Goswami et al., 2006; Haseeb và Kumar,2006)

Huma Abbas , Nazir Javed , Sajid Aleem Khan , Muhammad Kamran ,

Muhammad Atiq (2016) thực hiện nghiên cứu sử dụng nấm Paecilomyces lilacinus

phòng trừ tuyến trùng sần rễ trên cây cà tím Thí nghiệm này được thực hiện trong

điều kiện nhà lưới vào 7 ngày đã chứng minh được rằng, Paecilomyces lilacinus có

khả năng làm giảm số lượng lớn tuyến trùng và có khả năng thay thế cho các loàithuốc hóa học phòng trừ tuyến trùng

Trong những thập kỷ 60 đến 80 của thể kỷ trước, việc nghiên cứu nuôi cấy cácnấm ký sinh gây bệnh cho tuyến trùng và tuyến trùng hại đã được phát triển rất

mạnh mẽ nhưng chủ yếu là nấm Metarhizium và Beauveria Trong đó phải kể đến

các công trình nghiên cứu của Muller Cogler E (1961), Hall I M (1963- 1964),Camera J W., Mac Bain (1963 - 1967), Madelin M F (1965 - 1966), Ignoffo C M.(1977), H.D Burges và CS (1982), N K Maniania và CS (1984) (theo NguyễnNgọc Tú và CS.,1997), Ferron P (1978) Các công trình đã tập trung nghiên cứu rất

tỉ mỉ về phương pháp để nhân giống, các môi trường dinh dưỡng, các thiết bị nuôicấy, phương pháp thu bào tử từ sinh khối nấm, tạo chế phẩm sinh học và sử dụngchúng để phòng trừ sâu hại và tuyến trùng trên đồng ruộng

Trong những năm gần đây, một số các công trình nghiên cứu sản xuất và ứngdụng chế phẩm sinh học từ các nguồn nấm kí sinh tuyến trùng Các chế phẩm sinhhọc từ các nguồn nấm ký sinh có một vai trò quan trọng trong việc phòng chống sâuhại cây trồng, đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe con người (Noris và CS.,2002)

Alamgir Khan, Kleith L Williams, Helena K.M Nevalainen (2004) thực hiện

nghiên cứu về ảnh hưởng của enzyme protease và chitinase từ nấm Paecilomyces

lilacinus trên cấu trúc vỏ và sự nở của tuyến trùng Meloidogyne javanica Một

serine protease và một enzyme được chuẩn bị từ 6 chitinase, được tách chiết và tinh

sạch từ môi trường nuôi cấy lỏng chủng nấm Paecilomyces lilacinus 251, tấn công vào các trứng tuyến trùng Meloidogyne javanica để nghiên cứu hiệu quả của các

loại enzyme đến cấu trúc vỏ trứng Quan sát bằng kính hiển vi điện tử chứng minhrằng enzyme protease và chitinase đã làm thay đổi lớn cấu trúc của vỏ trứng khichúng tấn công riêng lẻ hoặc kết hợp với nhau Dưới tác động protease lên vỏ trứng,lớp lipid biến mất và lớp chitin mỏng hơn Khi sử dụng chitinase có lớp không bàolớn, lớp viteline bị chia ra và mất đi tính toàn vẹn của nó Những thay đổi lớn trênlớp vỏ trứng xảy ra do ảnh hưởng khi kết hợp enzyme protease và chitinase của nấm

Paecilomyces lilacinus Lớp chitin bị thủy phân và lớp vitelline mất đi tính vẹn toàn Hiệu lực của enzyme chitinase và protease từ nấm Paecilomyces lilacinus khi

sử dụng riêng rẻ hoặc kết hợp cũng cho kết quả làm giảm sự nở của con cái tuyến

trùng M javanica Nghiên cứu chỉ ra rằng một số tuyến trùng đã nở khi được tiếp

xúc với enzyme của nấm sẽ có sự hiện diện của enzyme chitinase từ nấm

Paecilomyces lilacinus giữ lại hoạt động của chúng dưới sự hiện diện của protease

nội sinh

Mendoza A.R.,R.A.Sikora,vàS.Kiewnick (2007) đã thực hiện nghiên cứu về

sự ảnh hưởng của Paecilomyces lilacinus chủng 251 lên kiểm soát sinh học tuyến trùng Radopholus similis ở cây chuối Khả năng nâng cao hiệu quả diệt tuyến trùng

của chủng nấm đã được chứng minh Sự tương quan đáng kể giữa liều dùng và nồng

độ để kiềm hãm R similis đã được xác định Ở nồng độ 6 × 106 cfu/g đất khô được

xem là liều dùng tối ưu của P lilacinus Tác giả chứng minh rằng P lilacinus là tác nhân kiểm soát sinh học hiệu quả chống lại R similis và cũng là nhân tố quan trọng

trong việc kiểm soát tuyến trùng trên cây chuối

Năm 2006, M Nasr Esfahani và B Ansari Pour nghiên cứu hiệu quả của nấm

Paecilomyceslilacinus trong kiểm soát tuyến trùng Meloidogyne javanica và ảnh

hưởng của nấm đến sự phát triển của cây cà chua trong điều kiện nhà kính Kết quả

chứng minh rằng P lilacinus cải thiện sự phát triển cây trồng và làm giảm đáng kể

số lượng tuyến trùng và trứng tuyến trùng khi bị nhiễm M Javanica như tác nhân

gây bệnh làm rễ sần to Nấm sẽ đạt hiệu quả cao nhất khi nấm và tuyến trùng đượcnhiễm đồng thời hoặc nấm được nhiễm trước và tuyến trùng nhiễm sau Tuyếntrùng đã trưởng thành bị tấn công hoặc bị chết đều có sự hiện diện của sợi nấm trên

cơ thể chúng

Cheu Guan Pau và cộng sự (2012) đã phân lập được 10 chủng nấm

Paecilomyces lilacinus từ đất vườn trồng 2 loại tiêu đen ở Sarawark có thể phòng

trừ tuyến trùng gây sần rễ Sau quá trình nghiên cứu, thí nghiệm đã chỉ ra rằng cả 10chủng nấm nêu trên đều có khả năng phòng trừ tuyến trùng với mật độ bào tử 105bào tử / ml

Hiện nay, có rất nhiều nơi trên thế giới đã nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm

từ nấm Paecilomyces vào trong thực tiễn đời sống Một số sản phẩm phòng trừ

tuyến trùng đã được thương mại hóa như nemaxxion biol do công ty

Greencorp,2014 sản xuất lên men lỏng, bao gồm các loại vi khuẩn và nấm (Bacillus subtilis, Trichoderma spp và Paecilomyces spp.) hay REM G cũng là một sản phẩm phòng trừ tuyến trùng bao gồm các chủng nấm Arthrobotrys spp., Mycorrhia (Glomus spp.), Dactyllela spp., Paecilomyces lilacinus, và các loại vi khuẩn (B spp) và (Pseudomonas spp.), sản phẩm được bổ sung enzyme chitinolytic, protease

và enzyme lipolytic nhằm phá vỏ thành tế bào của tuyến trùng Các sản phẩm này

có hiệu lực cao trên cây cà chua ở vùng Souss – Massa Draa ở Morocco

1.1.4 Nghiên cứu về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự sản xuất và

bảo quản chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus

Nấm phát triển thích hợp ở ẩm độ cao (Trần Văn Mão, 2002) Ẩm độ cao sẽrất có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, tuy nhiên ẩm độ thấp sẽ

có lợi cho duy trì sự sống của nấm Bào tử phân sinh của nấm Paecilomyces sp có

khả năng sống lâu trong điều kiện ẩm độ từ 0 – 34% hơn là khi ẩm độ 75%

Theo M Nagesh và cộng sự (2007), thí nghiệm về sự tương quan giữa lượngnước bổ sung vào khối lượng hạt lúa mì (cơ chất rắn ban đầu) với tỉ lệ 1,0 :1,0 ;

1,5 :1,0 ; 2,0 :1,0 (v/w) ảnh hưởng đến phát triển sợi nấm và sản xuất bào tử của

nấm kí sinh tuyến trùng Paecilomyces lilacinus PDBC PL55 và Pochonia chlamydosporia PDBC PC57 Sự bổ sung nước vào cơ chất sẽ làm tăng độ ẩm cơ

chất, sẽ gây ảnh hưởng đến thời gian hình thành sợi nấm và số lượng bào tử thuhoạch được trong 1 chu kỳ sản xuất Độ ẩm cơ chất ban đầu càng cao ( 74-76%)

sẽ khiến cho thời gian để sấy khô cơ chất kéo dài tới 8-9 ngày để hạn chế sựnhiễm khuẩn tới độ ẩm thích hợp (15-18%) Lượng nước tối ưu bổ sung vào cơ

chất ban đầu cho sự sản xuất bào tử cho 2 chủng nấm P.lilacinus và P.chlamydosporia là 1:1.

1.2 Tổng quan về tuyến trùng

Tuyến trùng ký sinh thực vật có thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những vết

thương nhỏ đến toàn bộ vật chất của thực vật (Sharman và et al., 1997) Tổn hại về

mặt kinh tế từ 40%- 50% hay thậm chí tổn hại còn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấncông bởi những loài tuyến trùng có khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry,1997) Bởi vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra không biểu hiện rõ ràng, nêncác nhà nông thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra

Thiệt hại do tuyến trùng gây ra đặc biệt leo thang vào những mùa mưa, trong

đó những thành viên thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua là bị ảnh hưởngnhiều Ở vùng Botswana, những cây thương mại thuộc họ cà được trồng suốt nămtrong nhà kính Những rối loạn sinh lý ở cây do tuyến trùng gây ra thường đượcquan sát trên cây họ cà (Nilsson, 1972)

Tuyến trùng hại rễ là một loài sống ký sinh thực vật, thuộc chi Meloidogyne Người ta ước tính rằng tuyến trùng hại rễ Meloidogyne spp gây tổn hại 20% - 50%

sản lượng cà chua (Nilsson, 1972) Chúng tồn tại trong đất ở những vùng có khí hậunóng bức hay có mùa đông ngắn Có khoảng 2000 loài thực vật có thể bị nhiễmtuyến trùng hại rễ và chúng gây mất mát 5% sản lượng thực vật trên toàn cầu mỗinăm Ấu trùng của chúng xâm nhiễm vào rễ cây, hình thành những nốt sần ở rễ,đồng thời chúng làm mất khoáng chất của cây và khả năng quang hợp Khi chúng

xâm nhiễm vào cây con thì kết quả chắc rằng cây đó sẽ chết, còn nếu nhiễm vào cây

đã trường thành thì chỉ làm giảm năng suất của cây đó

1.2.1 Đặc điểm sinh thái

Meloidogyne thuộc nhóm động vật kí sinh cây trồng, chúng phân bố khắp thế

giới và gần như kí sinh ở tất cả thực vật bậc cao Chúng sống và sinh sản trong các

tế bào sống bị biến đổi của rễ thực vật Vì tạo nên những vết sưng trên rễ nên người

ta gọi chúng là tuyến trùng sần rễ Chúng có khả năng sinh sản và phát triển rấtnhanh làm cho cây trồng bị thiệt hại nặng nề

Theo phân loại của Goldi (1887, có chỉnh sửa vào năm 2000), Meloidogyne

spp có các đặc điểm như sau:

Đối với con cái trưởng thành thì có hình tròn hay quả lê, màu trắng, ít vậnđộng, không có giai đoạn u nang Có kim chích nhỏ và mảnh, thường dài từ 12 - 15

µm Lỗ bài tiết nằm trước tới khoảng giữa khối tròn, thường chỉ sau kim chích Sáu tuyến trực tràng lớn tiết các chấ đặc sệt để bảo quản trứng và đẻ trứng ra ngoài.Con đực trưởng thành có hình giống con giun, dài đến 2 mm, đuôi xoắn vàtròn, phát triển qua các lần biến thái trong rễ Có kim chích nhỏ nhưng mảnh, dài 18– 25µm Tuyến hầu nằm ở phần bụng đến ruột Gai nhỏ và mảnh, thường dài 25 –33µm, ống dẫn dài từ 7 – 11µm Có một tinh hoàn

Ấu trùng: Trứng của tuyến trùng sần rễ được con cái đẻ ra ngoài trong một bọcgelatine (gọi là bọc trứng) nằm trên bề mặt hay bên trong của nốt sần rễ

Tuyến ký sinh thực vật có thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những vết

thương nhỏ đến toàn bộ vật chất của thực vật (Sharman et al., 1997) Tổn hại về mặt

kinh tế từ 40% - 50% hay thậm chí tổn hại còn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấncông bởi những loài tuyến trùng có khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry,1997) Bởi vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra không biểu hiện rõ ràng, nên các nhà nông thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra Thiệt

hại do tuyến trùng gây ra đặc biệt leo thang vào những mùa mưa, trong đó những thành viên thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua là bị ảnh hưởng nhiều.

Ở vùng Botswana, những cây thương mại thuộc họ cà được trồng suốt nămtrong nhà kính Những rối loạn sinh lý ở cây do tuyến trùng gây ra thường đượcquan sát trên cây họ cà (Nilsson, 1972) Người ta ước tính rằng tuyến trùng hại rễ

Meloidogyne spp.gây tổn hại 20%- 50% sản lượng cà chua (Nilsson, 1972)

Trong khi ở Việt Nam thì tiêu có lượng xuất khẩu tiêu lớn nhất thế giới Do

đó, cây tiêu đóng một vai trò quan trọng trong nền kinh tế của đất nước Nhưng hiệnnay, có nhiều loại bệnh hại làm giảm năng suất của tiêu đó là bệnh sần rễ do tuyến

trùng Meloidogyne gây ra Chúng phá hoại bộ rễ, tạo nhiều vết thương làm cho các

loài vi nấm, vi khuẩn có hại xâm nhập và gây bệnh dễ dàng hơn Do đó, việc tìmhiểu và phòng trừ bệnh hại cho tiêu rất quan trọng

Khi bị tuyến trùng gây hại, cây ngừng sinh trưởng, lá vàng, ra hoa và đậu quảkém Đặc biệt, khi quan sát dưới rễ sẽ thấy có những nốt sần xuất hiện, nếu bệnhquá nặng cây sẽ chết Bệnh sần rễ không chỉ biểu hiện ở những cây lá vàng mà còn

cả những cây xanh tươi do bệnh mới phát triển ở giai đoạn đầu, rễ vẫn vận chuyểnnước và khoáng chất được

Sự phát triển của bệnh trải qua 3 giai đoạn:

 Giai đoạn 1: tuyến trùng mới xâm nhập vào rễ và tạo nốt sần, lúc này rễ chưa bị ảnh hưởng nhiều, rễ vẫn còn màu sáng

 Giai đoạn 2: rễ bị đổi màu, chức năng vận chuyển nước và chất dinh dưỡng

bị ảnh hưởng Rễ bị tổn thương và tạo cơ hội cho các vi sinh vật tấn công gâynhiều bệnh khác cho cây

 Giai đoạn 3: rễ bị đổi màu đen và chức năng vận chuyển đã không còn

Có 29 loài thuộc các họ khác nhau có mặt trên các vùng trồng tiêu của Việt

Nam Trong đó, chủ yếu và phổ biến nhất là chi Meloidogyne.(Trịnh Thị Thu Thủy

và cộng sự, 2007)

Hình 1.4 Vòng đời của tuyến trùng hại rễ

(Nguồn: ww.apw s net. o r g )

Trước đây, việc kiểm soát tuyến trùng hại thực vật chủ yếu dựa vào các hóachất diệt tuyến trùng, sức đề kháng của kí chủ thực vật và luân canh cây trồng Mặc

dù có nhiều thành công trong nghiên cứu kiểm soát tuyến trùng bằng phương phápsinh học trong suốt 20 năm qua, đến nay nó vẫn ít được áp dụng Hầu hết các sảnphẩm có chứa độc tố được ly trích từ vi sinh vật và chỉ một vài sản phẩm có chứa visinh vật hữu hiệu (Dong và Zhang, 2006)

Dưới đây là một số nghiên cứu về hiệu quả phòng trừ tuyến trùng của nấm kísinh trứng trong những năm 1991 - 1996:

Bảng 1.1 Bảng Hiệu quả phòng trừ của các chủng nấm Paecilomyces spp đối

với tuyến trùng hại thực vật.

Theo R.P Esser và N.E.El-Gholl(1998) thì Paecilomyces spp có khả năng gây

ảnh hưởng và kí sinh trên con cái và trứng tuyến trùng Nấm này cũng là tác nhânkiểm soát sinh học đáng kể theo nhiều khám phá trước đây vào năm 1979 và hiện

nó đang được chú ý vì là "tác nhân kiểm soát sinh học có tiềm năng tuyệt vời trongđất nông nghiệp ở vùng cận nhiệt đới và nhiệt đới"

Loài Paecilomyces spp ký sinh tuyến trùng sẽ tiếp cận với kí chủ thông qua

một số con đường như: sợi nấm sẽ bám váo lớp vỏ keo của tuyến trùng hoặc thâmnhập thông qua phần hậu môn và cổ tử cung của tuyến trùng Mặt khác, sợi nấmcũng có thể phân nhánh và bám vào bề mặt của trứng tuyến trùng

Theo một báo cáo gần đây của Gortari et al (2008) thì Paecilomyces lilacinus

là một loài vi nấm có khả năng ký sinh trứng của tuyến trùng trong điều kiện in

vitro Hai chủng ngoài tự nhiên P lilacinus LPSC # 876 và P Lilacinus LPSC # 44

được phân lập từ đất trong tại công viên trung tâm của thành phố La Plata và trên

một cánh đồng nông nghiệp ở Argentina cho thấy, các chủng nấm Paecilomyces sp.

có khả năng ký sinh trên trứng của T cannis Theo kết quả thực nghiệm của tác giả thì tỷ lệ ký sinh trứng T cannis của 2 chủng nấm P lilacinus LPSC 876 và P lilacinus LPSC 44 lần lượt là 65,6% và 63,2%.

Còn theo Claire Vidal et al (1998), điều kiện thích hợp cho sự xâm nhiễm của Paecilomyces fumosoroseus với ký chủ tối ưu ở điều kiện nhiệt độ từ 22-330C và độ

ẩm từ 68% - 100% (với tỷ lệ ký sinh là trên 70% sau một tuần gây nhiễm)

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài được tiến hành tại phòng thí nghiệm của trường từ tháng 2/2017 đến tháng 7/2017

2.2 Thiết bị - hóa chất - vật liệu nghiên cứu

2.2.2 Vật liệu nghiên cứu:

Chủng nấm Paecilomyces lilacinus P1 được phân lập và lưu trữ tại phòng thí

nghiệm trường Đại học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh Hutech

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomycse lilacinus.

Chuẩn bị môi trường PDA có bổ sung 0,1 g / l chloramphenicol, hấp khửtrùng rồi phân phối đều ra các đĩa Petri vô trùng Cấy nấm vào giữa đĩa Petri môitrường, dùng kim hút đặt 8 tuyến trùng cái (trứng) xung quanh vị trí cấy nấm, cáchtâm đĩa 2cm Đặt đĩa Petri trong tủ ủ với nhiệt độ 25 ± 2 0C Theo dõi sự xâm nhiễmcủa nấm vào cơ thể tuyến trùng sau 2, 4, 6, ngày cấy nấm, tiến hành thu con cái

tuyến trùng chết trong đĩa nấm nghi nhiễm Paecilomyces lilacinus.

Phân lập lại: Dùng đũa thủy tinh vô trùng nghiền mẫu với 10 ml nước cất vôtrùng Pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 và 10-6 Dùngpipet vô trùng hút 0,1 ml dịch mẫu pha loãng ở nồng độ 10-6 và tiến hành trãi đĩatrên môi trường PDA

Làm thuần: dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó làm

nguội và chấm nhẹ vào điểm có bào tử đặc trưng của nấm Paecilomyces sp và

không bị nhiễm tạp sau đó cấy 3 điểm nhẹ lên bền mặt môi trường Để đĩa môitrường cấy phân lập trong phòng thí nghiệm 2 – 3 ngày, thấy khuẩn lạc đặc trưngcủa nấm xuất hiện thì tiến hành cấy tách ra các đĩa môi trường khác nhau để làmthuần chủng

2.3.2 Quan sát đặc điểm hình thái nấm sợi (Agrios, 2005)

a) Quan sát hình thái khuẩn lạc

Quan sát hình thái đại thể các chủng nấm bằng việc mô tả đặc điểm tản nấm củachúng khi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng Các chủng nấm phân lập được sẽđược cấy điểm trên tâm đĩa môi trường PDA và được ủ 2 tuần

Quan sát mô tả các đặc điểm: Kích thước tản nấm để biết tốc độ phát triển; dạngsợi nấm, màu sắc tản nấm mặt trước và mặt sau; màu sắc của môi trường do sắc tốnấm sợi tạo ra; thời gian hình thành bào tử…trong thời gian nuôi ủ.

b) Quan sát hình thái vi thể nấm sợi dưới kính hiển vi (phương pháp phòng ẩm)

Phương pháp làm phòng ẩm:

Chuẩn bị một đĩa môi trường PDA và một đĩa petri vô trùng nuôi cấy chứa:mảnh giấy lọc, hai thanh đũa tre đặt trên giấy lọc, lame và lamelle đặt lên trên haithanh đũa tre

Sử dụng dao mổ vô trùng cắt một khối thạch (1cm x 1cm) từ đĩa môi trườngPDA chuyển sang đặt lên lame đã chuẩn bị trong đĩa nuôi cấy Dùng dây cấy đã khử

trùng, lấy sinh khối nấm Paecilomyces sp cấy vào 4 mặt bên của khối thạch Sau đó

đậy lamelle lên trên khối thạch Nhỏ nước cất vô trùng cho ướt toàn bộ giấy thấmtrong đĩa Ủ đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi sợi nấm mọc đều và hình thành bào tửxảy ra (thường là 2 – 3 ngày)

Hình 2.1 Phòng ẩm

Mẫu quan sát được chuẩn bị bằng cách lấy lamelle ra khỏi khối thạch đặt lênmột lame sạch có sẵn một giọt Methylene blue Quan sát mẫu dưới kính hiển vi ở

độ phóng đại 400 lần và mô tả đặc điểm: Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh

và vách ngăn; hình dạng cuống bào tử; đặc điểm hình dạng, màu sắc, kích thướcbào tử…

2.3.3 Hoàn thiện quy trình nhân nuôi sản xuất chế phẩm từ nấm Paecilomyces

trên môi trường PDA Sau khi xác định được mật độ bào tử nấm, dịch huyền phù bào tử nấm được hiệu chỉnh về nồng độ 107 bào tử / ml.

Lấy 100 g gạo tấm đem sấy khô ở 105oC trong 24 giờ để xác định hàm lượngnước ban đầu của gạo Sau khi đã xác định được độ ẩm ban đầu của cơ chất, cân

200 gr gạo vào mỗi bịch PE, bổ sung lượng nước theo các công thức mang hấp khử trùng bằng nồi hấp Autoclave (1210C , 1 atm, 20 phút), để nguội

Hút 20ml dịch huyền phù bào tử nấm có mật độ 107 bào tử / ml, cấy vào 200g

cơ chất gạo, sao cho mật độ cấy giống ban đầu là 106 bào tử / g cơ chất

Ủ nấm trong điều kiện nhiệt độ phòng để nấm phát triển, thời gian lên men 14ngày

 Chỉ tiêu theo dõi:

Mật độ bào tử/ g cơ chất sau 14 ngày nuôi cấy

 Xác định mật độ bào tử sau khi nuôi cấy

Sử dụng phương pháp cấy trang để xác định được mật độ bào tử nấm pháttriển trong mỗi nghiệm thức Cân 10 gr ngẫu nhiên chứa sinh khối đã phát triển của

nấm P.lilacinus, nghiền nhuyễn, sau đó cho vào 90 ml nước cất đã hấp tiệt trùng

chứa trong erlen và lắc đều 15 phút Hút 1 ml dung dịch đã lắc vào 9 ml nước muốisinh lý đã hấp tiệt trùng, tiếp tục hút 1 ml sang các ống còn lại cho đến nồng độ phaloãng 10-10 Hút 1 μl vào đĩa petri chứa môi trường PDA và tiến hành cấy trang.Đĩa đã được cấy được đem đi ủ ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 2 ngày ủ

2.3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của chất mang đến thời gian tồn trữ chế phẩm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, gồm 2 công thức, sử dụng 2 loạichất mang thường dung trong bảo quản chế phẩm bào tử nấm

Công thức 1: Phối trộn với cao lanh

Công thức 2: Phối trộn với bột bắp

Mỗi công thức sẽ được lặp lại 3 lần, mỗi lần nhắc là một túi chứa 100 g sảnphẩm, bao gồm chế phẩm thô phối trộn với chất mang, sao cho mật độ trong chếphẩm ban đầu đạt ít nhất 1x109 bào tử/g.

Chỉ tiêu theo dõi:

Sau mốc 60 ngày sẽ xác định mật độ bào tử ở mỗi công thức bằng phươngpháp cấy trang trên môi trường PDA

2.3.4 Khảo sát khả năng ký sinh tuyến trùng Meloidogyne sp của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus trong điều kiện phòng thí nghiệm

2.3.4.1 Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014)

Trứng và con cái Meloidogyne spp được tách ra từ rễ cây tiêu thu ở tỉnh Đăk

Lăk và Bình Phước Mẫu rễ lấy về được rửa sạch dưới vòi nước chảy, để trên giấythắm khô tự nhiên Sau đó, dùng dao cấy nhọn tách từ từ phần rễ dưới ánh đèn sáng

và bắt con cái, túi trứng trong nốt sần Con cái có màu trắng đục, hình quả lê, kíchthước tùy vào con to nhỏ khác nhau, thường dài khoảng 0,6 – 0,7 mm, rộng 0,4 –0,5 mm Túi trứng có màu hơi vàng nâu, hình bầu dục với kích thước tương đương với kích thước con cái

2.3.4.2 Phương pháp khảo sát khả năng ký sinh của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus

Tiến hành nuôi cấy huyền phù bào tử nấm Paecilomyces lilacinus trên các đĩa Petri môi trường PDA Sau 5 ngày nuôi cấy nấm Paecilomyces lilacinus trên môi trường PDA tiến hành cấy tuyến trùng cái Meloidogyne sp (8 tuyến trùng cái/ 1 đĩa) vào mép khuẩn lạc nấm Paecilomyces lilacinus Tiến hành thí nghiệm trong thời

gian 5 ngày Bố trí thí nghiệm gồm 1 đĩa lặp lại 6 lần

Sau mỗi ngày, thu kết quả thí nghiệm bằng cách dùng nước cất vô trùng chovào các đĩa Petri rồi dùng kim mũi mác thu tuyến trùng cái Quan sát sự lây nhiễm

nấm Paecilomyces lilacinus trên tuyến trùng cái bằng cách làm tiêu bản nhuộm với

cotton blue và soi dưới kính hiển vi

2.3.5 Đánh giá hiệu quả phòng trừ tuyến trùng Meloidogyne sp hại cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus ở phạm vi đồng ruộng

 Mục đích: xác định hiệu quả phòng trị tuyến trùng hại hồ tiêu trên đồng ruộng

của chủng nấm Paecilomyces lilacinus.

 Thí nghiệm được thực hiện tại xã Ea nam huyện Ea H'leo, tỉnh Đắc Lắc

Khảo nghiệm được bố trí trên những khu vực trồng cây tiêu đang có biểu hiện

bị tuyến trùng gây hại ở cấp 2 (>1/3-<2/3 số rễ bị hại hoặc diện tích tán cây bị vàng,cành bị khô) Các điều kiện trồng trọt như đất đai, phân bón, mật độ cây, chế độchăm sóc… được tiến hành đồng đều ở trên mọi ô khảo nghiệm và phù hợp với tậpquán canh tác của địa phương

2.3.5.1 Điều tra mức độ tuyến trùng gây hại cây hồ tiêu

Cách lấy mẫu đất:

Mỗi công thức chọn cố định 3 cây để lấy mẫu đất bằng cách đào xung quanhvùng gốc cây 50 cm, sâu 15 cm Mỗi cây lấy 3 điểm theo hình tam giác đều mà gốccây là trung tâm Trộn tất cả các mẫu của 3 cây trong cùng 1 công thức lại cùng vớinhau, sau đó lấy ra 1 mẫu đựng trong bao nilon dán nhãn để phân tích

Phương pháp xác định tuyến trùng trong đất: Cân 10 gam đất hòa tan trong 100

ml nước sau đó dùng phương pháp lọc rây và lọc tinh

2.3.5.2 Đánh giá hiệu lực phòng tuyến trùng Meloidogyne sp hại cây hồ tiêu của chế phẩm nấm Paecilomyces lilacinus

Phương pháp bố trí: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 2 côngthức, mỗi công thức chọn 12 cây có tỷ lệ bị hại ở cấp 2 (Theo QCVN 01 - 172 :2014/BNNPTNT) để tiến hành thí nghiệm