Vi khuẩn nốt sần ở lạc và ảnh hưởng của chúng đối với sự nảy mầm của lạc

Vi sinh vật cố định nitơ còn góp phần quan trọng trong việc tăng năngsuất những cây trồng thuộc bộ đậu nh cây lạc, đậu tơng, đậu xanh… trong đó trong đócây lạc là một trong những cây côn

Lời cảm ơn

Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo Nguyễn Dơng Tuệ đã quan tâm hớng dẫn tận tình và giúp đỡ em trong suốt thời gian xây dựng và hoàn thành luận văn này.

Em xin chân thành cảm ơn cán bộ phòng thí nghiệm Di truyền – Vi Vi sinh, các thầy cô giáo trong khoa đã hết sức giúp đỡ, tạo điều kiện để em hoàn thành luận văn này Cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ, động viên của tất cả bạn bè

đồng nghiệp trong suốt thời gian qua.

Vinh, ngày 21 tháng 4 năm 2005

Sinh viên

Lê Thị Linh

Phần I Đặt vấn đề

Nitơ là nguyên tố dinh dỡng quan trọng đối với sinh vật trên trái đất Dựtrữ nitơ trong tự nhiên rất lớn Nitơ phân tử chiếm 78,16% thể tích của khôngkhí Trong bầu khí quyển bao la của trái đất có tới khoảng 4x1015 tấn nitơ Nếucây trồng có khả năng đồng hoá nó, lợng nitơ này có thể cung cấp cho câytrồng tới hàng chục triệu năm Trong cơ thể các loại sinh vật trên trái đất cũng

Cây trồng không đồng hoá đợc trực tiếp nitơ hữu cơ Nhờ quá trình phângiải của vi sinh vật, từ các hợp chất chứa nitơ giải phóng ra NH3, một nguồndinh dỡng nitơ rất tốt đối với thực vật Quá trình phân giải này gọi là quá trìnhamôn hoá.

Nếu trong đất có đầy đủ oxy thì NH3 sinh ra sẽ tiếp tục đợc vi sinh vậtchuyển hoá thành nitrat Quá trình này đợc gọi là quá trình nitrat hoá Nitrat làhợp chất nitơ đợc thực vật hấp thu rất dễ dàng nhng cũng rất dễ bị rửa trôixuống các lớp đất sâu hơn Ngợc lại với quá trình nitrat hoá là quá trình phảnnitrat hoá do vi sinh vật gây nên Sau quá trình khử nitrat, nitrat sẽ chuyểnthành nitơ phân tử bay vào không khí

Sự mất nitơ do quá trình phản nitrat hoá gây nên đợc bù đắp lại nhờ quátrình cố định nitơ, tức là quá trình chuyển hoá nitơ phân tử thành các hợp chấtchứa nitơ Các vi sinh vật có khả năng thực hiện quá trình này gọi là vi sinhvật cố định nitơ (Đờng Hồng Dật, Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đờng, Nguyễn

Thị Thanh Phụng, Trần Thị Cẩm Vân, Hoàng Lơng Việt, Vi sinh trồng trọt,

đất ngày càng suy thoái, gần 50% diện tích đất đang trong tình trạng suy thoáinghiêm trọng Để đối phó với thực trạng trên việc đa những cây trồng thuộc bộ

đậu trồng ở những vùng đất thoái hoá bạc màu là cần thiết góp phần vào côngcuộc cải tạo đất nông nghiệp hiện nay

Vi sinh vật cố định nitơ còn góp phần quan trọng trong việc tăng năngsuất những cây trồng thuộc bộ đậu nh cây lạc, đậu tơng, đậu xanh… trong đó trong đócây lạc là một trong những cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao đối với nớcta

Lạc là cây lấy dầu quan trọng nhất Hạt lạc chứa trung bình 50% chấtlipít, 22 – Vi 25% Prôtêin Lạc còn cung cấp một số vitamin và khoáng chất.Dầu lạc là một loại lipít dễ tiêu do chứa nhiều axit béo không no nh axitLinoic,Linoleic, Arachidonic, Olêic Đây là những axit tạo nên vitaminF

Lạc là nguyên liệu quan trọng dùng trong ngành công nghiệp thựcphẩm, đặc biệt là chế biến dầu, từ dầu sẽ thúc đẩy các ngành công nghiệpkhác nh công nghiệp xà phòng, mỹ phẩm, hoá học… trong đó

Lạc sau khi thu hoạch để lại cho đất một lợng đạm lớn do nốt sần của

bộ rễ và do thân lá để lại, cho nên các cây trồng sau lạc đều sinh trởng tốt vàcho năng xuất cao

Từ những dẫn liệu trên ta có thể thấy tầm quan trọng về kinh tế củacây lạc và việc nghiên cứu vi sinh vật cố định nitơ trên cây lạc là việc làm cần

thiết (Nguyễn Danh Đông, Giáo trình cây lạc, 1984 ) [7].

Theo Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1981) có nhiều phơng pháp để sửdụng vi khuẩn nốt sần nhng phơng pháp tốt nhất là nhiễm vi sinh vật cho hạtgiống vì nếu phun cho cây trồng thì cứ 100m2 phải 10 lít nớc và 1ha phải10.000 lít nớc (10 tấn nớc) Nhng xử lý hạt giống ngay lúc thúc mầm thì hầu

nh (với 30 lít thúc mầm/ha) không tốn kém gì mà lại có ngay vi khuẩn cố

định nitơ ở hạt lạc, vì trong thực tế có vùng đất không có vi khuẩn cố định nitơnên lạc là cây bộ đậu nhng vẫn phải bón phân đạm

Do thấy đợc vai trò to lớn của vi khuẩn nốt sần trong việc làm giàu dinhdỡng nitơ trong đất cho cây trồng và ảnh hởng đến sự sinh trởng, phát triểncủa cây đặc biệt là cây lạc, cây công nghiệp có giá trị xuất khẩu lớn Chúng tôithực hiện đề tài này nhằm mục tiêu sau:

1 Phân lập đợc vi khuẩn nốt sần Rhizobium vigna ở lạc.

2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn nốt sần

Rhizobium vigna.

3 Thử nghiệm vi khuẩn nốt sần đã phân lập đợc xử lý hạt giống trớckhi đem gieo, theo dõi sự nảy mầm và quá trình hình thành nốt sần ở thínghiệm nhiễm vi khuẩn nốt sần và đối chứng

4 Rèn luyện cho bản thân một số kỹ năng, thực hành, thí nhiệm, làmquen với phơng pháp nghiên cứu khoa học

Phần II

Tổng luận

I Sơ lợc về vi khuẩn nốt sần ở cây bộ đậu.

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn cố định nitơ cộng sinhvới cây bộ đậu Năm 1886 hai nhà khoa học Đức là H.Hellriegel và H.Wilfarthlần đầu tiên dùng thực nghiệm để chứng minh đợc rằng cây bộ đậu khác thựcvật khác ở chỗ chúng có khả năng sử dụng nitơ trong không khí Hai năm sau

1888 nhà khoa học Hà Lan M W.Beijerinck đã phân lập đợc loại vi khuẩnsống cộng sinh trong nốt sần ở rễ cây thuộc bộ đậu (đậu Hoà Lan, đậu tằm,

đậu thiên lý, đậu cô ve, đậu chân lùn… trong đó) Ông đặt tên cho loại vi khuẩn này

Bacillus radicicola Năm 1889 vi khuẩn này xếp vào một chi riêng là chi Rhizobium (B.Frank - 1889) Từ phát hiện này đã 108 năm Trong hơn một

thế kỷ qua ngời ta đã nghiên cứu khá kỹ về các loài vi khuẩn đặc biệt này cũng

nh mối quan hệ cộng sinh giữa chúng và cây bộ đậu

Ngời ta đã miêu tả đợc 11.000 loài thuộc bộ đậu những chỉ mới điều tra

về khả năng tạo thành nốt sần ở 1200 loài trong số này Có khoảng 133 loài đ

-ợc chứng minh là không có khả năng tạo thành nốt sần (12/134 ở họ trinh nữ,67/97 ở muồng và 57/969 ở họ đậu)

Căn cứ vào các tài liệu hiện có thì vi khuẩn nốt sần khi còn non có tếbào hình que, kích thớc vào khoảng 0,5 – Vi 0,9 x 1,2 – Vi 3,0 m, bắt màu đồng

đều và có khả năng di động nhờ tiêm mao Vi khuẩn nốt sần có loại đơn mao,

có loại chu mao và cũng có loại tiêm mao mọc thành chùm ở gần đầu Khi vềgià vi khuẩn nốt sần trở nên bất động Trên môi trờng nhân tạo cũng nh trongnốt sần ngời ta thờng gặp những tế bào là thể giả khuẩn (bacteroides) So với tếbào hình que bình thờng thì thể giả khuẩn có kích thớc lớn hơn, thờng phânnhánh và chứa nhiều glicogen, votutin và lipoprotein hơn (Hình 1)

Hình 1: Các vi khuẩn nốt sần

1- Các vi khuẩn từ những nốt sần còn non2- Các vi khuẩn từ những nốt sần già

(Theo Nguyễn Quang Hào, Vơng Trọng Hào, Thực hành VSVH, 1980) [9].

Khi theo dõi sự phát triển của vi khuẩn nốt sần trên các môi trờng dinh ỡng nhân tạo ngời ta chia chúng thành hai nhóm:

d Nhóm mọc nhanh (vi khuẩn nốt sần ở ba lá, đậu Hà Lan, đậu Côve,mục túc… trong đó) Nhóm này thuộc Rhizobium

- Nhóm mọc chậm (vi khuẩn nốt sần đậu tơng, lạc, đậu đũa… trong đó) Nhóm

này thuộc chi Bradryrhizobium.

Trên môi trờng thạch đặc, vi khuẩn nốt sần thờng có khuẩn lạc trơnbóng, nhầy, vô màu Chất nhầy do vi khuẩn nốt sần gây ra thuộc một loạipolisacarit cấu tạo bởi Hexoza, pentoza và axit uronic

1 Quá trình xâm nhập của vi khuẩn nốt sần vào rễ cây bộ đậu

Theo Nguyễn Thành Đạt (2000) Dới ảnh hởng của vi khuẩn nốt sần rễcây bộ đậu sẽ tiết ra enzim poligalacturonaza, enzim này phân huỷ thành lônghút và giúp cho vi khuẩn nốt sần có điều kiện xâm nhập vào rễ Trong lônghút, vi khuẩn nốt sần sẽ tạo thành một cái gọi là dây xâm nhập, đó là một khốichất nhầy dạng sợi bên trong chứa đầy các vi khuẩn hình que ở trạng thái phát

triển nhanh chóng Dây xâm nhập di dần vào bên trong vào bên trong rễ vớivận tốc khoảng 5 – Vi 8 /h.Sự vận động của dây xâm nhập đợc sinh ra do sựphát triển của vi khuẩn bên trong dây Một số dây sẽ tiếp tục phát triển và lọtvào đến lớp nhu mô, ở đây vi khuẩn nốt sần sẽ kích thích các tế bào thực vật bịchúng xâm nhiễm cũng nh các tế bào lân cận Kết quả làm cho chúng phânchia nhanh chóng thành nhiều tế bào mới Vi khuẩn nốt sần thoát khỏi dâyxâm nhập và đi vào tế bào chất

Cũng theo Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1981) khi vi khuẩn xâm nhậpvào rễ, chúng trao đổi hệ gen vi khuẩn vào genom tế bào từ đó tạo nên độtbiến đa bội và phân chia mạnh tạo nên nốt sần

2 Cấu tạo của nốt sần.

Nghiên cứu cấu tạo tế bào nốt sần ngời ta thấy rõ các vùng sau đây:

- Vỏ nốt sần: Gồm vài lớp tế bào không bị vi khuẩn xâm nhiễm Những

tế bào này thờng có kích thớc nhỏ hơn tế bào vỏ rễ Sau khi hình thành vỏ nốtsần vỏ rễ bị nát đi, một ít còn lại sẽ dính vào bên ngoài phần vỏ của nốt sần

- Vùng phân cách mạnh mẽ: Vùng này gồm những tế bào không bị xâmnhiễm, nằm trên dới lớp vỏ nốt sần.Từ các tế bào của vùng này về sau sẽ phânhoá và tạo thành các tế bào vỏ nốt sần,các tế bào chứa vi khuẩn và các tế bàomạch dẫn

- Vùng mô bị xâm nhiễm: Trong vùng này các tế bào chứa vi khuẩnnằm xen lẫn với tế bào không chứa vi khuẩn Thể tích mỗi tế bào chứa vikhuẩn có thể lớn hơn gấp 8 lần so với tế bào không chứa vi khuẩn

- Hệ thống mạch dẫn của nốt sần: Khi nốt sần phát triển một số tế bàonằm giữa phần vỏ nốt sần và phần mô bị xâm nhiễm sẽ phân hoá và phân cắtthành các tế bào mạch dẫn của nốt sần Về sau các mạch dẫn sẽ liên kết vớimạch dẫn của rễ cây Số bó mạch trong mỗi nốt sần thay đổi trong khoảng 1– Vi 12 bó tuỳ loại cây [3]

II Một số đặc điểm của cây lạc.

Cây lạc thuộc bộ đậu Leguminoseae Ngày nay căn cứ trên các tài liệu

đối nhẹ, có đủ độ ẩm và trong thời gian sinh trởng của lạc có đủ nhiệt độ và ợng ma cần thiết (Nguyễn Danh Đông,1984) [7].

l-ở lạc có những đặc điểm sau:

- Rễ cây lạc thuộc loại rễ cọc và gồm có ba phần là cổ rễ, rễ chính và rễphụ Sau khi hạt mọc cổ rễ vơn dài 2 – Vi 4cm đa lá mầm vơn khỏi mặt đất Rễchính có trớc, rễ phụ có sau, khi lạc có hoa nhiều rễ phụ mới mọc ra từ cổ rễ

Từ lúc bắt đầu mọc đến khi có 5 lá, rễ mọc nhanh hơn thân lá Lúc cây có 3 – Vi

4 lá, trọng lợng rễ bằng 50% trọng lợng cả cây Từ khi có 8 lá trở đi thân lámọc nhanh hơn rễ, lúc cây có 8 lá trọng lợng rễ bằng 60% và lúc ra hoa thìbằng 10% trọng lợng cả cây Rễ lạc có đặc điểm không có biểu bì, không cólông hút thật Nớc và chất dinh dỡng vào trong cây trực tiếp qua nhu mô vỏnhng ở một số hoàn cảnh, rễ cây lạc cũng có lông hút

- Thân lạc mềm, lúc còn non thì tròn lúc già có cạnh và ruột rỗng Thânchính có hai thời kỳ sinh trởng mạnh và nhanh là lúc cây bắt đầu ra hoa và lúc

có nhiều tia Cây lạc phân cành ngay từ gốc cây

- Lá lạc thuộc lá kép hình lông chim Mỗi lá thờng có 4 cũng có 3 hoặc

6 lá chét Mỗi giống đều có những đặc điểm riêng của hình lá, mũi lá, màu lá,

cỡ lá, hình lá kèm, tỷ lệ giữa chiều dài với chiều rộng lá và tỷ lệ giữa cuống lávới trụ lá

- Hoa lạc gồm những bộ phận chính nh đài hoa, tràng hoa, nhị đực vànhụy cái Đài có 5 thuỳ, tràng hoa có 5 cánh Nhuỵ cái phần dới là bầu, phầntrên là nuốm hơi cong, phần giữa là vòi nhuỵ khá dài luồn suốt dọc ống dàigiữa các nhị đực Nhị đực có 10 nhng teo đi không túi phấn còn lại 8 xen kẽvới nhau Cây lạc là cây tự thụ phấn nghiêm ngặt nhng tỉ lệ ngoại phấn cũngtới 0,25%

- Quả lạc hình kén, dài từ 1 – Vi 8cm, rộng từ 0,5 – Vi 2cm, một đầu có vếtdính với tia, một đầu là mỏ quả

Thực nghiệm về nhiễm vi khuẩn nốt sần cho hạt giống cây lạc cũng đã

đợc chú ý Năm 1958 thí nghiệm đầu tiên về nhiễm vi khuẩn nốt sần cho lạcgiống đỏ 4 tháng trên đất cát khô bạc màu ở xã Đồng Xuân – Vi Kim Anh – ViVĩnh Phúc đã thu đợc những kết quả khả quan Nhờ biện pháp này mà năngsuất đã tăng từ 13 – Vi 26% [11]

Theo Bùi Huy Đáp (1975) cấy vi sinh vật khi gieo ở đất rừng, đất bãi,

đất cỏ tranh thấy rằng những cây lạc cấy vi sinh vật nốt sần hình thành sớmhơn 5 ngày, số lợng cũng nhiều hơn, cây mọc tốt hơn, lá xanh, hoa quả nhiềuhơn rõ rệt so với đất cha trồng lạc Nếu cấy vi sinh vật có bón vôi năng suất

tăng 40% trong khi không bón vôi chỉ tăng 26% Trong sản xuất, cấy vi sinhvật tăng năng suất 10 – Vi 20%, có trờng hợp tăng gấp rỡi.

Do đó, sử dụng vi khuẩn nốt sần ở lạc nhiễm cho hạt lạc giống khôngchỉ có ý nghĩa về khoa học mà còn có ý nghĩa thực tiễn rất lớn

Phần III:

Đối tợng địa điểm và phơng pháp nghiên cứu.

I Đối tợng nghiên cứu.

Đối tợng nghiên cứu ở đây là nốt sần Rhizobium vigna ở cây lạc Arachis hypogeaeL.

1 Cây lạc nguồn thu nhận vi khuẩn nốt sần.

Cây lạc thuộc bộ đậu Leguminoseae Cây lạc hút các nguyên tố khoáng

trong dung dịch đất nhờ rễ và tia lạc Cây lạc cũng có thể hút một vài nguyên

tố dinh dỡng qua bộ lá Những nguyên tố dinh dỡng chính của cây lạc gồm:

đạm, lân, kali, magiê, lu huỳnh

- Đạm: cây lạc chứa một lợng nitơ khá lớn trong lá và trong hạt Phầnlớn nitơ đợc nằm trong hạt dới dạng prôtêin Lạc là cây bộ đậu nên lấy đợc

một lợng đạm nào đó trong khí quyển thông qua hoạt động của Rhizobium.

Những cây không có nốt sần chứa một lợng đạm rất thấp và bộ rễ rất nhỏ,xanh nhợt do quá trình hình thành diệp lục bị kìm hãm

- Lân: Lân ảnh hởng tới sự phát triển của rễ và nốt sần của cây lạc, thúc

đẩy sự ra hoa quả và làm giảm tỷ lệ óp lép

- Kali: Lợng chứa kali trong cây có thể thay đổi nhiều, cây phải hútnhiều kali nếu sống trong môi trờng giàu kali ở nơi có lợng lân cao, cây cóthể có triệu chứng thiếu kali Thiếu kali xuất hiện nhiều quả 1 hạt Đối với câylạc không có bằng chứng cho thấy kali làm tăng tính chống hạn của cây

- Canxi, magiê và lu huỳnh: Chúng hoạt động với hai chức năng điềuchỉnh pH đất và là những nguyên tố dinh dỡng chính cho cây.

Ngoài những nguyên tố đa lợng trên sự sinh trởng và phát triển của câylạc còn cần một số nguyên tố vi lợng nh Bo, Môlip đen, Mangan, Đồng, Kẽm,Sắt… trong đó

2 Vi khuẩn nốt sần ở cây lạc Rhizobium vigna.

Vi khuẩn nốt sần Rhizobium vigna ở lạc thuộc chi Bradyrhizobium,

nhóm mọc chậm

2.1 Hình thái cấu tạo.

Theo Nguyễn Lân Dũng, Phạm Đình Quyến và cộng sự (1978) vi khuẩnnốt sần có nhiều loại và giữa chúng còn những đặc điểm không giống nhau về

hình dạng, kích thớc, đặc điểm sinh lý Nhng nói chung Rhizobium lúc còn

non có hình que, có loại chùm mao, có loại chu mao Đến một giai đoạn pháttriển nhất định có thể xuất hiện dạng giả khuẩn thể phân nhánh và đó chính làgiai đoạn vi khuẩn nốt sần cố định nitơ nhiều nhất

2.2 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn nốt sần.

Vi khuẩn nốt sần thuộc loại hô hấp hiếu khí a pH trung tính hơi kiềm,nhiệt độ cần cho phát triển 28 – Vi 300C, độ ẩm thích hợp 60 – Vi 80% Nguồncacbon cần cho sự sống của chúng là các axit hữu cơ, đờng và rợu Đối vớinguồn nitơ chúng yêu cầu khá đặc biệt Khi sống cộng sinh trong nốt sần cây

bộ đậu chúng có khả năng sử dụng nitơ phân tử còn khi sống trong đất haytrên môi trờng nhân tạo thì chúng sử dụng các hợp chất nitơ hữu cơ và vô cơ

có sẵn Vi khuẩn nốt sần cần photpho, kali và một số nguyên tố vi lợng đặcbiệt là Co, Mo… trong đó

Nhân tố quyết định tính đặc hiệu là thành phần AND trong tế bào vikhuẩn Có ý kiến cho rằng một số chất gọi là bacterioxin do vi khuẩn sinh ramang ý nghĩa quyết định trong quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn nốt sần vào

rễ cây bộ đậu

Khi ở nốt sần vi khuẩn Rhizobium nhận các chất dinh dỡng do cây bộ

đậu cung cấp còn khi sống trong đất chúng sẽ đồng hoá chất dinh dỡng từ môitrờng nh các vi sinh vật khác Dĩ nhiên sự thay đổi điều kiện dinh dỡng củamôi trờng cũng ảnh hởng đến vi khuẩn nốt sần Hàm lợng nitơ trong đất đạt

đến một mức độ nhất định sẽ ức chế sự tạo thành nốt sần Thiếu photpho vikhuẩn nốt sần xâm nhập đợc vào rễ nhng không tạo thành đợc nốt sần,photpho làm tăng tác dụng của molip đen Cây bộ đậu hút kali mạnh hơnnhững cây khác Theo tài liệu của Pronin thì cây bộ đậu có khả năng cố định

nitơ mạnh nhất và cho năng suất cao nhất khi cung cấp chất dinh dỡng NPKtheo tỷ lệ 0,5 : 1 : 2 Thiếu canxi hàm lợng sắc tố Leghmoglobin trong nốt sầnrất ít (Đờng Hồng Dật, Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đờng, Trần Thị Cẩm Vân,Hoàng Lơng Việt, 1979) [2].

2.3 Quá trình xâm nhập của vi khuẩn nốt sần Rhizobium vigna vào

rễ cây lạc.

Trong phần lớn cây bộ đậu vi khuẩn xâm nhập theo đờng lông hút “dây

nhiễm” (Dart 1974) Tuy nhiên ở cây lạc Rhizobium nhiễm theo cách khác

những lông hút ở rễ thông thờng không có ở lạc ở cây này, những chùm haynhững “hoa thị” lông hút thờng đợc tìm thấy ở chỗ trục rễ gặp nhau và chỗ gặp

nhau này nơi rễ ngang mọc ra các nốt sần phát sinh Rhizobium xâm nhập vào

rễ ở chỗ này, chiếm chỗ giữa vách lông hút và những tế bào biểu bì vỏ kế cận

Rhizobium làm cho “lông hút của rễ” cong lên và biến dạng nhng ngời ta

không quan sát đợc thấy những “lông rễ” bị nhiễm Allen (1981) gọi ý là

“lông rễ” không tham gia trực tiếp vào quá trình xâm nhiễm Bhuvanesvari(1981) cho biết sự hình thành nốt sần có liên quan tới một giai đoạn phát dục

đặc biệt của “lông rễ” Nốt sần chỉ hình thành ở những chỗ “lông rễ” mọc ra

sau khi Rhizobium xâm nhập vào Nambiar (1983) đã quan sát thấy những

đ-ờng trên đó không có “lông rễ” thì không có nốt sần và chứng minh “lông rễ”

quan trọng đối với Rhizobium vào cây lạc (Vũ Công Hậu, 1995) [10].

II Địa điểm nghiên cứu.

- Phòng thí nghiệm Di truyền - Vi sinh Trờng Đại Học Vinh từ tháng9/2004 – Vi 4/2005

- Nhà lới khu thí nghiệm

III Phơng pháp nghiên cứu.

- Bỏ nốt sần vào hộp Petri có dung dịch HgCl2 0,1% trong 5 phút

- Chuyển sang hộp Petri có đựng nớc vô trùng để rửa

- Chuyển nốt sần vào cồn 960 trong 1 phút

- Rửa lại bằng nớc cất vô trùng

- Dùng kẹp chuyển hai nốt sần vào hộp Petri có giọt nớc vô trùng rồi épnốt sần bằng chiếc kẹp đó

- Dùng que cấy lấy 0,1ml dịch cấy vào đĩa Petri có môi trờng đặc trngcho vi khuẩn nốt sần.

Thành phần môi trờng cho vi khuẩn nốt sần bao gồm:

Dùng trang thuỷ tinh phân phối đều giọt dịch ép đó khắp mặt thạch Sau

đó đặt vào tủ ấm và nuôi ở nhiệt độ 25 – Vi 280C Đến ngày thứ 8 thứ 9 khuẩnlạc xuất hiện

4 Phơng pháp xác định số lợng vi sinh vật.

4.1 Phơng pháp nuôi cấy trên môi trờng thạch đĩa.

Dùng môi trờng đặc trng cho vi khuẩn nốt sần với các thành phần nh ởmục 2 Khử trùng ở 1 atm,trong 45 phút

Cách chế nớc đậu:

Lấy 50g đậu nành cho vào bình đựng 1 lít nớc máy và ninh trong nồikhử trùng ở áp suất 0,5atm trong 20 phút lọc và điều chỉnh môi trờng đến phảnứng kiềm yếu pH = 7,5 – Vi 8,0 Sau đó dùng nớc đậu để điều chế môi trờng

Tất cả các ống nghiệm và đĩa Petri đều đã đựơc khử trùng Các thao tác

đợc tiến hành trong buồng cấy đã đợc vô trùng bằng tia tử ngoại (Vũ Minh

- Cấy vào môi trờng đặc trng (0,1ml)

- Nuôi cấy ở 28 – Vi 300 trong 96giờ

- Xác định số khuẩn lạc

- Tính số lợng tế bào theo công thức:

vf n

vf n

N

i i 1



Trong đó:

N: Tổng số khuẩn lạc đếm đợc

ni : Số đĩa khuẩn lạc đếm ở mỗi độ pha loãng

v : Thể tích mẫu lấy vào mỗi đĩa

fi: Độ pha loãng có số khuẩn lạc đợc chọn

R: Tỷ lệ khẳng định

4.3 Phơng pháp xác định tốc độc sinh trởng theo Blachman.

- Số lần phân bào: n =

2 lg

N lg N

lg  0

Trong đó N: Số tế bào sau n lần phân bào

N0: Số tế bào ban đầu

t: Thời gian giữa lần đo

- Tốc độ phân bào:

V(Phân bào) =

t n

- Tốc độ sinh trởng tơng đối:

t W

W W V

0

0 t

) p (

r 

Trong đó:

0

t W

n

) mầm y

ả n lệ tỷ

Trong đó:

ni : Số hạt nảy mầm sau một đơn vị thời gian (5 ngày, mộttuần… trong đó)

N: Tổng số hạt.

5.3 Năng lực nảy mầm.

(%) 100 x gieo t

ạ h số Tổng

sống còn cay Số

X : Trị số trung bình cộngXi: Giá trị thứ i của dãy biến sốn: Số lần xuất hiện dãy biến số

6.2 Xác định độ lệch chuẩn

1 n

) X xi (

7 Thiết bị vật t nghiên cứu

- Dụng cụ trồng cây kích thớc 40 x 60cm, h = 40cm

- Các thiết cần cho nghiên cứu của phòng thí nghiệm

- Các hoá chất cho nuôi cấy, phân lập, phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật

Phần VI Kết quả nghiên cứu

Ch ơng I :

Đặc điểm của vi khuẩn nốt sần ở cây lạc.

I Mục tiêu.

Tuy đã có những tài liệu nói về vi khuẩn nốt sần ở cây lạc thì nhữnghiểu biết về nó còn rất ít Do vậy, việc nghiên cứu đặc điểm của vi khuẩn làviệc làm cần thiết trớc khi đa vào ứng dụng đối với bất kỳ một loài vi khuẩnnào Từ đặc điểm đó để có thể so sánh với kết quả nghiên cứu trớc đó và rút rakết luận đúng về loài mà mình đang nghiên cứu

II Quy trình phân lập và nuôi cấy.

Nớc đậu 20/10 27/10

(sau 7 ngày)

- Tròn hoặcbầu dục

- Dày

- Mặt nhẵnbóng

+ Đờng kính trung bình khuẩn lạc   1 mm

- Về màu sắc khuẩn lạc có màu trắng đục

Và đây là những đặc điểm chủ yếu của vi khuẩn nốt sần ở cây lạc

Rhizobium vigna

Ch ơng II :

Thử nghiệm sinh hoá vi khuẩn nốt sần

I Mục tiêu.

Bằng phơng pháp hoá sinh ta có thể xác dịnh các vi sinh vật khá chínhxác Vì ở vi sinh vật cũng nh sinh vật khác mỗi men cho một enzim và enzimxúc tác cho một phản ứng đặc hiệu cho nên bằng phơng pháp hoá sinh có thểxác định loại vi sinh vật và bản đồ gen của vi sinh vật Thấy đợc ý nghĩa đóthử nghiệm sinh hoá vi sinh vật ở đây nhằm một lần nữa khẳng định đó là

Rhizobium vigna ở cây lạc.

II Phơng pháp tiến hành:

Thí nghiệm gồm 4 đĩa Petri có môi trờng Trong đó 2 đĩa là môi trờng

Lấy 0,5ml dịch ép nốt sần cho vào đĩa petri môi trờng trang đều, nuôi ở

28 – Vi 300C Theo dõi và thu đợc kết quả

III Kết quả

Với phơng pháp đã nêu chúng tôi thu đợc kết quả ở bảng 2

Bảng 2: Kết quả thử nghiệm hoá sinh vi sinh vật

Thời gian (giờ) MôI trờng nớc đậu Các môi trờng Môi trờng tinh bột

tr-Nh vậy đó chính là vi khuẩn Rhizobium vigna của cây lạc Điều đó cho

thấy rằng vi khuẩn này không có hệ enzim chuyển hoá tinh bột thành các hợpchất có đạm (nitơ) mà phải nuôi trong môi trờng có đạm Kết quả này phù hợpvới nhận định của Bergey (1957) cũng nh các nhà nghiên cứu trong nớcNguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Nguyên, Nguyễn BìnhQuyền, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1981) và từ đây ta có thể có

chủng vi khuẩn Rhizobium vigna thuần khiết cần cho những nghiên cứu tiếp

theo

Ch ơng III:

Sinh trởng và phát triển của vi khuẩn

Rhizobium vigna.

I Đặc điểm

Sinh trởng và phát triển là thuộc tính cơ sở của sinh vật Cũng nh độngvật và thực vật vi sinh vật cũng sinh trởng và phát triển Theo Blachman, sinhtrởng là sự phát triển về khối lợng, thể tích, kích thớc Còn phát triển đó lànhững biến đổi đặc tính sinh lý, sinh hoá qua các giai đoạn sinh trởng

Khi nói đến sinh trởng và phát triển của vi khuẩn tức là đề cập đến sinhtrởng và phát triển của một số lợng lớn tế bào của cùng một loại Rõ ràng việcnghiên cứu ở một cá thể tế bào vi khuẩn quá nhỏ và rất khó và trong khi nói

đến sinh trởng của vi sinh vật là nói đến sự sinh trởng của cả quần thể Quátrình sinh trởng khi đạt đến một mức độ nhất định sẽ hình thành sự sinh sản.Khi đó số lợng cá thể tăng lên

Việc xác định tốc độ sinh trởng của vi khuẩn là rất cần thiết Vì biết

đ-ợc tốc độ sinh trởng ta có thể tính đđ-ợc số thế hệ và dự đoán đđ-ợc số lợng tế bàosau một thời gian nuôi cấy nhất định từ đó đa vào ứng dụng trong sản xuất

Từ kết quả bảng 3 cho thấy:

* Số khuẩn lạc là:

) ng

ã lo pha ( V

) cấy i

ô nu ( V x X )

ml / CFU (

Số khuẩn lạc trong 1ml dung dịch nuôi cấy sau 72 giờ là 165,4 x 103

* Tốc độ sinh trởng là:

(%) 100 x t W

W Wt V

0

0 p





* Tốc độ sinh trởng sau 72 giờ là 16% /phút Tốc độ sinh trởng này tơng

đối chậm Điều này phù hợp với những tác giả đã công bố nh Nguyễn LânDũng và cộng sự (1981)

No lg N

này là 0,13 thế hệ/ 1 giờ Kết quả này một lần nữa cho thấy vi khuẩn

Rhizobium vigna sinh trởng chậm trong khi các vi khuẩn khác nh Vibrio

cholerae chỉ 20 phút/ 1 thế hệ

Tuy nhiên kết quả này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng vì khi cần sửdụng vi khuẩn ,cần nuôi trong thời gian phù hợp để có số lợng tế bào đủtrong sản xuất

Ch ơng IV:

Vi khuẩn nốt sần đối với sự nảy mầm ở lạc.

I Tỷ lệ nảy mầm

1 Đặc điểm

Sự nảy mầm của hạt lạc là giai đoạn đầu tiên của đời sống cây lạc Đây

là quá trình lạc chuyển từ dạng tiềm sinh sang trạng thái sống Hạt lạc màthành phần chủ yếu Prôtit và Prôtêin ở dạng dự trữ, trong quá trình nảy mầm đãtrải qua một loạt biến đổi sâu sắc dới ảnh hởng của điều kiện ngoại cảnh Cácquá trình chủ yếu của sự nảy mầm gồm 3 giai đoạn:

Giai đoạn 1: Sự hút nớc của hạt

Theo Bouffil hạt phải hút lợng nớc bằng 35 – Vi 40% trọng lợng của hạt,

nh vậy lợng nớc hạt lạc cần để nảy mầm rất lớn

Giai đoạn 2: Hoạt động của các men phân giải.