Nghiên cứu di truyền hàm lượng protein cao ở lúa

Tuy nhiên ,về chất lượng gạo nói chung vẫn chưa được cải thiện rõ rệt .Để đánh giá về chất lượng dinh dưỡng của lúa gạo có rất nhiều chỉ tiêu khác nhau, một trong những chỉ tiêu quan trọ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN HÀM LƯỢNG PROTEIN CAO Ở LÚA

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

NGUYỄN THỊ THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN

HÀM LƯỢNG PROTEIN CAO Ở LÚA

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÃ TUẤN NGHĨA

Hà Nội - 2011

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LỆU

1.1 Chất lượng lúa gạo và thị trường lúa gạo

1.1.1 Phẩm chất xay chà

1.1.2 Phẩm chất cơm

1.1.3 Lúa gạo là thực phẩm của toàn cầu

1.1.4 Các loại lúa gạo trên thị trường

1.2 Chất lượng dinh dưỡng của lúa gạo

1.2.1 Hàm lượng Protein trong lúa gạo

1.2.2 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến hàm lượng Protein

1.2.3 Ảnh hưởng của phân bón đến hàm lượng Protein

1.2.4 Ảnh hưởng của các điều kiện ngoại cảnh đến đời sống cây lúa

1.3 Nghiên cứu di truyền số lượng liên quan đến hàm lượng Protein trong hạt lúa

1.3.1 Gen qui định hàm lượng Protein ở lúa

1.3.2 Hiệu quả gen qui định tính trạng hàm lượng Protein ở lúa

1.3.3 Tính trạng GPC ( Grain Protein Conten) ở lúa

1.4 Chỉ thị phân tử và ứng dụng trong nghiên cứu về di truyền hàm lượng

1.4.2.3 Bản đồ di truyền hàm lượng protein

1.4.2.4 Bản đồ di truyền tính trạng mùi thơm

1.5.Một số kết quả nghiên cứu về di truyền hàm lượng protein

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Xác định hàm lượng Protein và thành phần các acid amine trong hạt gạo

2.2.2 Đánh giá sự liện quan ở mức độ phân tử giữa bố, mẹ và con lai

2.2.3 Phương pháp nghiên cứu di truyền số lượng liên quan đến hàm lượng

Protein ở lúa

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Acid amine trong Protein của bố mẹ và con lai

3.2 Sự liên quan di truyền ở mức độ phân tử giữa bố, mẹ và con lai

3.3 Nghiên cứu di truyền số lượng liên quan đến hàm lượng Protein cao ở lúa

3.3.1 Phân tích hiệu quả gen tham gia qui định hàm lượng Protein ở lúa

3.3.2 Phân tích các tham số di truyền tính trạng GPC

3.3.3 Các kiểu tác động của gen lên hàm lượng Protein trong hạt lúa

3 4 Tương quan giữa một số biểu hiện hình thái với hàm lượng Protein ở hạt lúa

3.5 Tương quan giữa một số tính trạng chất lượng khác với hàm lượng Protein ở

TÀI LIỆU THAM KHẢO

A Tài liệu Tiếng Việt

B Tài liệu Tiếng Anh

DANH MỤC HÌNH ẢNH, BẢNG BIỂU

2 1 Hình ảnh nhận dạng ADN bằng mồi SSR.

2.2 Cấu trúc hình cây thể hiện tương đồng di truyền giữa các giống lúa

3.1 Hình ảnh ADN của bố mẹ và các con lai sử dụng chỉ thị SSR(locus RM 5625)

3.2 Hình ảnh ADN của cây bố mẹ và các con lai sử dụng chỉ thị SSR (locus

2.2 Mô ̣t số đă ̣c tính nông ho ̣c của các giống lúa sử du ̣ng trong nghiên cứu

2 3 Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống lúa bố mẹ

2 4 Các tổ hợp lai giữa các giống lúa sử dụng trong nghiên cứu

3.1 Thành phần và hàm lượng acid amine trong protein của giống bố, mẹ và

hạt F2 (% so với protein)

3.2 Ma trận tương đồng của các giống lúa đem phân tích khi sử dụng SSR

3.3 Hàm lượng protein và sự biến động qua các thế hệ của các tố hợp lai

3.4 Mức độ trội của gen qui định hàm lượng Protein cao ở các giống lúa

3.5 Phương sai thành phần của quần thể bố, mẹ và F2

3.6 Phương sai chung của quần thể bố, mẹ và F2

3.7 Phân tích phương sai một nhân tố

3.8 Phương sai hai nhân tố ( chiều cao cây, thời gian sinh trưởng) ảnh

hưởng tới hàm lượng Protein

3.9 Bảng phân tích phương sai ba nhân tố (chiều cao, thời gian sinh

trưởng, trọng lương 1000 hạt) ảnh hưởng tới hàm lượng Protein

3.10 Hàm lượng Protein và sự biến động di truyền trên các thế hệ

3.11 Thiết lập hệ số di truyền trên các tổ hợp lai

3.12 Một vài tính trạng nông học của các cây lúa F2 và bố, mẹ

3.13 Hệ số tương quan giữa Protein và một vài đặc điểm hình thái

3.14 Hàm lượng Protein tổng số của một vài dòng/giống lúa đang nghiên cứu

3.15 Hệ số tương quan giữa hàm lượng Protein và Amylose tổng số của bố, mẹ

3.16 Hệ số tương quan giữa hàm lượng Protein và Amylose tổng số của con lai F1

3.17 Hệ số tương quan giữa hàm lượng Protein và Amylose tổng số của

con lai F2

3.18 Hệ số tương quan giữa hàm lượng Protein và Amylose tổng số của

con lai BC1 F1

3.19 Tiêu chuẩn chọn lọc, tính trạng của các giống tham gia thí nghiệm

3.20 Tiêu chuẩn chọn lọc, tính trạng của các giống tham gia thí nghiệm

3.21.Chỉ số chọn lọc các giống phù hợp với mục tiêu chọn lọc

3.22 Chỉ số chọn lọc các giống phù hợp với mục tiêu chọn lọc

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

GPC : Grain Protein Content

MAS : (Marker Assitsed Selection): Chọn lọc có sự trợ giúp của chỉ thị

phân tử QTLs : (Quantitative Trait Loci) : Locut kiểm soát tính trạng số lƣợng RAPD : (Random Amplyfied polymorphic DNA): Đa hình chiều dài các

đoạn ADN đƣợc nhân bản ngẫu nhiên RFLP : (Restriction Fragment Length Polymorphism): đa hình chiều dài

các đoạn phân cắt

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tính cấp thiết và ý nghĩa của đề tài:

Lúa gạo là loại cây lương thực quan trọng trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng Lúa gạo được trồng rộng khắp ở 112 nước trên thế giới; là nguồn cung cấp lương thực chủ yếu của hơn 54% dân số thế giới (Nguyễn Minh Công và cs., 2004) Ở một số nước như Ấn Độ, Trung Quốc, Indonesia, Nhật Bản, Việt Nam, lúa gạo là cây lương thực chính

Về mặt diện tích gieo trồng, lúa gạo là cây lương thực có diện tích lớn thứ hai đứng sau lúa mì; Về sản lượng hàng năm, lúa gạo đứng thứ ba sau lúa mì và ngô (Nguyễn Minh Công và cs., 2004) Về giá trị kinh tế, lúa gạo là nguồn thu nhập chính của nông dân nhiều nơi trên thế giới và là một trong những mặt hàng xuất khẩu quan trọng của một số quốc gia trong đó có Việt Nam (hàng năm Việt Nam xuất khẩu khoảng 4,5 triệu tấn gạo sang các thị trường khác nhau trên thế giới) Vì vậy việc đầu tư nghiên cứu nhằm nâng cao năng suất,chất lượng lúa gạo tại Việt Nam luôn được Chính phủ quan tâm,đặc biệt là chất lượng gạo xuất khẩu luôn là vấn đề thách thức đối với các nhà chọn giống trong nhiều năm qua

Ở Việt Nam trong những năm gần đây,việc chọn tạo giống lúa đã được đẩy mạnh, nhiều giống lúa mới năng suất, chất lượng đã được tạo ra và chuyển giao vào sản xuất Tuy nhiên ,về chất lượng gạo nói chung vẫn chưa được cải thiện rõ rệt Để đánh giá về chất lượng dinh dưỡng của lúa gạo có rất nhiều chỉ tiêu khác nhau, một trong những chỉ tiêu quan trọng là hàm lượng Protein trong hạt gạo.Protein là nguồn cung cấp dinh dưỡng và năng lượng chủ yếu hàng ngày ; Là một trong những loại hợp chất hữu cơ rất quan trọng và không thể thiếu đối với mỗi cơ thể sống ; nó cung cấp từ 10 đến 15% năng lượng sống giúp cơ thể sinh trưởng và phát triển tốt Theo tính toán, đối với một

cơ thể trưởng thành là nam giới lượng protein thiết yếu mỗi ngày cần khoảng 55,5g và phụ nữ là 45g So với những loại cây trồng khác nuôi sống con người, cây lúa là một trong những loại cây trồng có hàm lượng protein thấp hơn cả (6-12%) Ở Việt Nam , hiện nay các giống lúa đang được trồng và sử du ̣ng phổ biến là Khang dân 18, Q5, CR203.v.v lại đều là các giống lúa có hàm lươ ̣ng protein ở mức khá thấp , trung bình chỉ đạt khoảng 7% (các giống được cho là có hàm lượng protein cao có hàm lượng

trung bình đạt từ 9 đến 10%) (Vũ Tuyên Hoàng và cs., 2005).Vì vậy việc “Nghiên cứu di truyền hàm lượng protein cao ở lúa” là việc làm cần thiết góp phần cung cấp

thông tin,cơ sở dữ liệu phục vụ cho việc tuyển chọn vật liệu lai tạo nhằm chọn giống lúa chất lượng cao phục vụ sản xuất

Mục tiêu nghiên cứu:

-Phân tích và xác định được sự di truyền hàm lượng protein trong hạt lúa

- Phân tích hiệu quả gen tham gia qui định hàm lượng protein ở lúa

-Phân tích các tham số di truyền tính trạng GPC ở một số giống lúa đang trồng tại Việt Nam

-Xác định chỉ số chọn lọc trong chọn giống lúa có hàm lượng protein caonhằm

định hướng chọn giống lúa chất lượng gạo tốt phục vụ sản xuất

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

Nội dung 1: Phân tích thành phần và hàm lượng acid amin trong protein ở bố mẹ và con lai Nội dung 2 : Đánh giá sự liên quan di truyền ở mức đô ̣ phân tử giữa bố me ̣ và con lai Nội dung 3 : Nghiên cứu di truyền số lượng liên quan đến hàm lượng protein cao ở lúa

Nội dung 4 : Nghiên cứu tương quan giữa một số biểu hiện hinh thái với hàm lượng

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CHẤT LƯỢNG LÚA GẠO VÀ THỊ TRƯỜNG LÚA GẠO

Lúa gạo (Oryza sativa L.) là lương thực quan trọng trong bữa ăn hàng ngày của

nhiều dân tộc trên thế giới Ở Châu Á, lúa gạo là nguồn cung cấp calor chủ yếu, đóng góp 56,2% năng lượng và 42,9% lượng protein hàng ngày của cơ thể sống Đối với người nghèo, lúa gạo còn đặc biệt quan trọng khi 70% năng lượng và lượng protein của cơ thể hàng ngày lấy từ những bữa ăn (Flinn và cs., 1985)

Chất lượng lúa gạo là một khái niệm quan trọng và còn gây nhiều tranh cãi

về nội dung và các tiêu chuẩn đánh giá cụ thể Do khái niệm về chất lượng liên quan đến rất nhiều yếu tố: độ ẩm, độ trong của hạt, tỷ lệ gạo gẫy, hình dạng hạt, chiều dài hạt, chiều rộng hạt, Mỗi quốc gia khác nhau lại có những tiêu chuẩn đánh giá và hệ thống kiểm tra chất lượng riêng biệt và hệ thống đánh giá Các tiêu chuẩn đánh giá này thường không thống nhất giữa các quốc gia (Vũ Tuyên Hoàng

và cs., 2005)

Tuy nhiên, tùy theo truyền thống ẩm thực và thu nhập của các quốc gia, bộ phận dân cư khác nhau mà yêu cầu về chất lượng lúa gạo cũng rất khác nhau (Vũ Tuyên Hoàng và cs., 2005)

Theo các nghiên cứu của Kaosa và Juliano (1990) cho thấy: tại thị trường Hồng Kông các loại gạo hạt dài, tỉ lệ gạo nguyên cao, cơm mềm luôn được bán với giá cao

Tại Rome (Italia) các loại gạo Japonica lại được ưa chuộng Trái lại các khách hàng ở

khu vực Tây Á lại ưa chuộng gạo đục và cứng cơm Người Nhật Bản lại ưa chuộng hạt gạo tròn, mềm ướt, thật trắng và không có mùi thơm; người Thái Lan lại thích hạt gạo dài và cơm khô

Những nơi mà gạo đóng vai trò là nguồn lương thực thứ yếu như Châu Âu, thì nhu cầu lại chủ yếu là những loại gạo có chất lượng cao: gạo 5-10% tấm được tiêu thụ

ở Tây Âu, gạo 10-13% tấm được tiêu thụ nhiều ở các nước Đông Âu

Các loại gạo hạt dài, chất lượng trung bình chủ yếu được xuất khẩu từ các nước Thái Lan, Miến Điện, Trung Quốc và Việt Nam; loại gạo này thường có tỷ lệ tấm từ

20-25% Các và thị trường chủ yếu loại gạo này thường là Indonesia, Malaysia, Đông

Âu, Trung Đông và Tây Phi,

Các loại gạo thơm, do có hương vị đặc biệt nên thường có giá trị rất cao Đây là loại gạo rất được ưa chuộng trên các thị trường như: Nam Á, Trung Đông và Thái Lan Một số loại gạo thơm nổi tiếng trên thị trường thế giới như Basmati (Ấn Độ); KhaoDawh Mali, Jasmine 85 (của Thái Lan) luôn có giá trị cao gấp hai lần so với các loại gạo khác

Hàng năm, thị trường gạo toàn cầu tiêu thụ khoảng 23 triệu tấn gạo, trong đó các quốc gia Châu Á nhập khẩu nhiều nhất (chiếm 49% tổng nhập khẩu của toàn thế giới) đặc biệt là Philipines và Indonesia (FAO, 2005)

Hiện nay, nước ta đã và đang xuất khẩu gạo sang trên 85 quốc gia khác nhau trên thế giới, trong đó khu vực Châu Á và Châu Mỹ là hai thị trường chủ yếu Là một

“cường quốc” về xuất khẩu gạo Tuy nhiên, chất lượng gạo của Việt Nam lại rất kém về: độ bạc bụng, dài trung bình, hương vị kém, Nguyên nhân chính của tình trạng này là do Việt Nam chưa tìm và đưa vào sản xuất được những giống lúa có chất lượng cao đáp ứng được các tiêu chuẩn khắt khe của thị trường Trong khi đó, xu hướng về yêu cầu gạo phẩm chất cao trên thị trường Châu Á và Châu Mỹ ngày càng tăng lên

Hiện nay, ở nước ta cùng với nhiều giống lúa đặc sản truyền thống các giống có phẩm chất cao cũng đã và đang được nhập nội và lai tạo mới đang dần đáp ứng được nhu cầu thị trường xuất khẩu và nâng cao giá trị hàng hóa của cây lúa, tăng thu nhập cho nông dân trồng lúa như P6, P4, P209, (Vũ Tuyên Hoàng và cs., 199; 2000; Lã Tuấn Nghĩa và cs., 2010; )

Chất lượng gạo là một trong bốn mục tiêu mà công tác cải tạo giống đặt ra (Năng suất, chất lượng, chống chịu và thích ứng với điều kiện bất thuận) Chất lượng của lúa gạo được đánh giá thông qua các chỉ tiêu: màu sắc vỏ hạt, kích thước hạt, hình dạng hạt, tỷ lệ gạo xát, tỷ lệ gạo nguyên hạt, độ đồng đều của hạt, tỷ lệ hạt bạc bụng, chất thử nếm và đặc điểm trong quá trình chế biến (Vũ Tuyên Hoàng và cs., 2005)

1.1.1 Phẩm chất xay chà

Phẩm chất xay chà bao gồm tỉ lệ gạo nguyên, gạo lứt và gạo trắng Theo một số nghiên cứu, mùa vụ có ảnh hưởng rất lớn đến tỉ lệ xay chà (vụ Đông Xuân tỉ lệ xay chà tốt và cao hơn vụ Hè Thu), ngoài ra tỉ lệ xay chà còn chịu sự tác động rất lớn từ công nghệ sau thu hoạch

Tỉ lệ vỏ trấu có thể thay đổi từ 18-26% và trung bình từ đạt từ 20-22%; cám và phôi hạt chiếm 8-10%, do đó tỉ lệ gạo trắng thường vào khoảng 70% (Khush và cs., 1979)

Tỉ lệ gạo trắng và gạo lứt ít biến động và nó cũng phụ thuộc vào môi trường (Bùi chí Bửu và cs., 1997) Tỉ lệ gạo nguyên biến động rất lớn và chịu ảnh hưởng rất mạnh mẽ của môi trường, đặc biệt là nhiệt độ và ẩm độ trong suốt thời gian chín, kéo dài đến lúc sau thu hoạch, đặc biệt là điều kiện phơi sấy, bảo quản Sự rạn nứt thường

do nắng, sự thay đổi nhanh của độ ẩm không khí, những điều kiện không thuận lợi của môi trường trong suốt quá trình chín của hạt, thu hoạch chậm trong mùa khô cũng làm hạt có độ ẩm thấp Theo Bùi Chí Bửu (Bùi Chí Bửu và cs., 1996; 1997) tỉ lệ hạt nguyên đạt cao nhất khi lúa được thu hoạch vào lúc chín 28 đến 30 ngày và thu sớm

sau khi lúa trổ 20 ngày; còn thu muộn sau 35 ngày thì tỉ lệ gạo nguyên thấp Sau khi

thu hoạch xong mà không tuốt ngay, để đống cũng là một trong những nguyên nhân dẫn tới làm giảm tỉ lệ hạt gạo nguyên (tỉ lệ hạt ẩm vàng sẽ tăng lên do hô hấp của các

vi sinh vật) Dạng hình hạt gạo cũng là một trong những nguyên nhân ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng xay chà Với những hạt có dạng hình mảnh, dài và độ bạc bụng càng cao thì tỉ lệ hạt nguyên càng thấp; những hạt đã khô nếu bị hút ẩm đột ngột cũng

có thể tạo ra những vết rạn trong hạt và gây ra các mảnh vỡ nhỏ khi xay

1.1.2 Phẩm chất cơm

Trong các tính trạng về phẩm chất cơm, amylose được xem là tính trạng có ý nghĩa quyết định đến sự mềm cơm và ngược lại Hàm lượng amylose cao có tính trội không hoàn toàn so với hàm lượng amylose thấp, nó do một gen điều khiển kèm theo một số gen phụ có tính chất cải tiến (Seetharaman, 1959; Kahlon, 1965; Kumar và cs., 1986; )

Các yếu tố về hàm lượng amylose cao, độ bền gel cứng và độ trở hồ cao là các yếu tố

chính ảnh hưởng đến chất lượng lúa gạo Trong đó hàm lượng amylose là một trong những yếu tố quan trọng nhất

Môi trường gây ra sự biến động rất lớn đến hàm lượng amylose trong hạt gạo của cùng một giống lúa, đặc biệt là nhiệt độ trong giai đoạn vào chắc của hạt (Juliano, 1990)

Hàm lượng amylose trong lúa được kiểm soát trực tiếp bởi hoạt động gen cộng (additive effect: A) và ảnh hưởng tương tác cộng tính (additive interaction effect: AE) Ảnh hưởng của

AE có tính chất rất quan trọng đến hàm lượng amylose của giống lúa

Các thể đột biến về amylose cũng đã được nghiên cứu trên các giống lúa thuộc

loài phụ Japonica với hai dạng hình 2064 và EM16 tương tác theo kiểu “allelic” Các

thể đột biến này có thể chuyển sang giống lúa Indica nhờ lai với IR36 hai lần Do đó gen điều khiển sự co giãn hàm lượng amylose (Amylose extender) được xác định trên nhiễm sắc thể số 2 (Chr 2) (Kaushik and Khush., 1991)

1.1.3 Lúa gạo là thực phẩm của toàn cầu

Theo thống kê của Cơ quan Thực phẩm Liên Hiệp Quốc, trên thế giới có khoảng 147.5 triệu ha đất dùng cho việc trồng lúa, và 90% diện tích này là thuộc các nước Á Châu Các nước Á Châu cũng sản xuất khoảng 92% tổng sản lượng lúa gạo trên thế giới Sản xuất gạo toàn cầu đã tăng lên từ khoảng 200 triệu tấn vào năm 1960 tới hơn 600 triệu tấn vào năm 2007 Ba quốc gia sản xuất lúa gạo hàng đầu là Trung Quốc (31% sản lượng thế giới), Ấn Ðộ (20%) và Indonesia (9%) Ba nước xuất khẩu gạo lớn nhất thế giới là Thái Lan (26% sản lượng gạo xuất khẩu), Việt Nam (15%) và Hoa Kỳ (11%), trong khi ba nhà nhập khẩu gạo lớn nhất là Indonesia (14%), Bangladesh (4%) và Brasil (3%) Theo FAO

(Food and Agriculture Organisation), hàng năm có khoảng trên 20 triệu tấn gạo được

dùng làm hàng hóa trao đổi trên toàn thế giới

1.1.4 Các loại lúa gạo trên thị trường

Các giống lúa thông thường cũng được phân loại theo cấu trúc, màu sắc và hình dạng hạt gạo của chúng Ví dụ theo kích thước hạt lúa: Loại hạt lúa dài (có chiều dài gấp 3 lần chiều rộng, chiều dài hạt hơn 6 mm) khi nấu hạt cơm không dính, cũng có gạo dài mà dính ở Lào, Thái Loại hạt lúa có kích thước trung bình khoảng 5-6mm và loại gạo ngắn có 4-5mm chiều dài va 2.5mm chiều rộng

Về màu sắc có những loại khác nhau như hạt gạo màu nâu, hạt gạo màu trắng, hạt gạo màu đỏ và hạt gạo màu đen

Một giống lúa thơm của Thái Lan cho loại gạo hạt dài và tương đối ít dính, do gạo hạt dài chứa ít amylopectin hơn so với các giống hạt ngắn Các loại gạo nếp là gạo hạt ngắn Gạo Nhật Bản là loại gạo hạt ngắn và dính

Các giống lúa Ấn Ðộ bao gồm gạo hạt dài và gạo thơm Basmati, gạo hạt dài và trung bình là gạo Patna và loại gạo hạt ngắn Masoori

Các giống gạo thơm có hương vị thơm đặc biệt; các giống đáng chú ý nhất bao gồm các loại Basmati, gạo Patna kể trên cũng như các giống lai từ Mỹ được bán dưới tên gọi thương phẩm Texmati Nó là giống lai giữa Basmati và giống gạo hạt dài Hoa

Kỳ Cả Basmati và Texmati có hương vị tương tự như bỏng ngô Tại Indonesia có nhiều các giống gạo đỏ và đen

Hai nước xuất khẩu gạo lớn nhất thế giới là Thái và Việt Nam có các sản phẩm gạo như: Gạo xuất khẩu ở Thái gồm: các loại gạo thơm và gạo trắng hạt dài Việt Nam xuất khẩu các loại gạo: gạo 5% tấm đánh bóng 1 lần, gạo 5% tấm đánh bóng 2 lần, gạo 10%, 15%, 25% và 100% tấm Ngoài ra có gạo nếp (dẻo, dính) và gạo tẻ, gạo sắt, gạo

đồ, gạo thơm

Ðặc tính mùi thơm ở các loại gạo được tạo thành bởi hàng trăm loại chất thơm

dễ bay hơi như hydrocarbons, alcohols, aldehydes, ketones, acides, phenols, pyridine, 2-acetyl-1-prroline

1.2 CHẤT LƯỢNG DINH DƯỠNG CỦA LÚA GẠO

1.2.1 Hàm lượng protein trong lúa gạo

Lúa gạo là một trong những loại ngũ cốc quan trọng nhất thế giới và là nguồn thực phẩm quan trọng trong bữa ăn hàng ngày của nhiều dân tộc trên thế giới, nó cung cấp tới 70% năng lượng (đối với cư dân nghèo của một số nước châu Á) cho sự vận động của con người thông quan bữa ăn hàng ngày (Filn & Unnevehr, 1985)

Hàm lượng protein trong lúa gạo là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng dinh dưỡng của lúa gạo So với những cây trồng được coi là cây lương thực nuôi sống con người,

cây lúa có hàm lượng protein chứa trong hạt ít hơn cả biến động từ 6-12% (Vũ Tuyên Hoàng và cs., 2005; Nguyễn Thị Lang và cs., 2005; Lã Tuấn Nghĩa và cs., 2010; )

Protein trong gạo gồm các tiểu phần chính như: albumine, glubuline, probaline

và gluteline, trong đó gluteline chiếm tới 93,7% Các acid amine tự do trong protein được phân phối như sau: trong cám và bột 30%, trong phôi 53%, trong gạo xát 17% (Moryzzi và cs, 1964);

Trong thời gian qua, các nhà chọn tạo giống đã và đang tập trung vào việc duy trì chất lượng đạm, việc cải tiến về chất lượng đạm vẫn chưa được quan tâm đúng mức (Vũ Tuyên Hoàng và cs., 2005) Chất lượng ding dưỡng của các giống lúa có hàm lượng đạm cao sẽ cao hơn so với các giống lúa có hàm lượng đạm thấp vì nó chứa một lượng acid amine thay thế lớn hơn tất cả (Blaekwell và cs., 1966)

Hàm lượng protein không chỉ ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng của lúa mà còn liên quan đến khả năng tiêu thụ protein và sức khỏe của con người Theo thống kê đầy

đủ thì bữa ăn hàng ngày của người dân Trung Quốc lượng protein tiêu thụ là 67gram, thấp hơn nhiều so với mức trung bình 100 gram ở các nước đang phát triển

(http://wwww.agriviet.com/nd/1483-lai-tao-thanh-cong-giong-lua-co-ham luong.httm)

Vì thế, lai tạo ra các giống lúa có hàm lượng protein cao là rất quan trọng cho việc cải thiện sức khỏe người dân Sự việc này luôn được quan tâm theo sau khoa học

và kỹ thuật ở trong nước cũng như quốc tế

1.2.2 Ảnh hưởng của yếu tố giống đến hàm lượng protein

Giống là một trong những yếu tố quyết định đến phẩm chất hạt gạo Nhiều kết quả nghiên cứu (từ IRRI) đã cho thấy, khoảng 25% những thay đổi hàm lượng protein

là do yếu tố di truyền qui định Ngoài ra, các kết quả nghiên cứu còn cho biết: loài phụ

indica có hàm lượng protein cao hơn loài phụ japonica (IRRI, 1970); lúa nếp có hàm lượng protein cao hơn lúa tẻ (Taira, 1971); Những giống lúa ngắn ngày có hàm lượng cao hơn giống dài ngày, những gống lúa trồng ở vùng đồng bằng có hàm lượng protein cao hơn trồng ở vùng đồi núi (Swaminathan, 1971); trong cùng một giống lúa, những hạt nhỏ có hàm lượng protein cao hơn những hạt to hơn (Nagato, 1972)

Hàm lượng protein bị ảnh hưởng khá nhiều của giống và môi trường nhưng thành phần axit amin của lúa rất cân đối, ví dụ lysin luôn chiếm trung bình 3,5-4,0 %

Di truyền tính trạng hàm lượng protein trong hạt rất phức tạp và bị ảnh hưởng mạnh

mẽ của môi trường, giống có hàm lượng protein cao thường liên kết với đặc tính thời gian sinh trưởng ngắn và khối lượng hạt nhẹ (Lamber và cs., 1973) Có một sự khác biệt rất cơ bản giữa giống lúa có hàm lượng protein tổng số cao và trung bình là khả năng chuyển vị đạm từ lá vào hạt nhiều hơn, đồng thời theo ghi nhận cuả IRRI thì lúa thu hoạch từ các lô ruộng thí nghiệm thường có hàm lượng protein cao hơn lúa thu từ các ruộng của nông dân (Jennings và cs.,1979)

1.2.3 Ảnh hưởng của phân bón đến hàm lượng protein

Nhu cầu dinh dưỡng của cây lúa hay nói cách khác là các chất dinh dưỡng cần thiết, không thể thiếu được đối với sự sinh trưởng và phát triển của cây lúa bao gồm: đạm (N), lân (P), kali (K), vôi, sắt, kẽm, đồng, magiê, mangan, mô-líp-đen, bo, silic, lưu huỳnh và các-bon, ô-xy, hyđrô Tất cả các chất trên đây (trừ các-bon, ô-xy, hyđrô) phân bón đều có thể cung cấp được Có nhiều chất dinh dưỡng khoáng mà cây lúa cần, nhưng 3 yếu tố dinh dưỡng mà cây lúa cần với lượng lớn là: đạm, lân và kali là những chất cần thiết cho những quá trình sống diễn ra trong cây lúa Các nguyên tố khoáng còn lại, cây lúa cần với lượng rất ít và hầu như đã có sẵn ở trong đất, nếu thiếu thì tuỳ theo điều kiện cụ thể mà bón bổ sung

Phân bón có vai trò tối quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển của cây lúa, nó cần thiết cho suốt quá trình phát triển, từ giai đoạn mạ cho đến lúc thu hoạch Cùng với các yếu tố năng lượng khác, phân bón cung cấp cho cây là nguồn nguyên liệu để tái tạo ra các chất dinh dưỡng như: tinh bột, chất đường, chất béo, prôtêin… Ngoài ra chúng còn giữ vai trò duy trì sự sống của toàn bộ cây lúa, không có nguồn dinh dưỡng thì cây lúa sẽ chết, không thể tồn tại

Đạm là một trong những cơ sở cấu tạo nên protein, thúc đẩy quá trình quang hợp tích lũy các chất hữu cơ Nhiều thí nghiệm tại các vùng trồng lúa ở Liên Xô cũ với các liều lượng phân bón khác nhau đặc biệt là đạm cho thấy: đạm có thể làm tăng hàm lượng đạm (protein) trong hạt thêm 2-3%; các trị số này thay đổi tùy thuộc điều kiện gieo trồng cụ thể Liều lượng và thời gian bón đạm giữ vai trò quan trọng trong việc

nâng cao hàm lượng protein trong hạt Tuy nhiên, nếu bón tăng đạm quá nhiều sẽ làm mức độ tăng hàm lượng giảm đi (Vũ Tuyên Hoàng và cs., 2005)

Các nhà nghiên cứu khoa học tại IRRI thống nhất: hàm lượng tinh bột có mối tương quan nghịch biến với hàm lượng đạm Nếu hàm lượng đạm trong hạt tăng lên thì hàm lượng tinh bột sẽ có sự thay đổi Trong điều kiện thuận lợi của sự trao đổi gluxit, liều lượng phân bón thích hợp có thể làm tăng hàm lượng đạm và tinh bột

Theo kết quả nghiên cứu của Eruwghin và Suranova ở 70 giống lúa loài phụ

Sino-Japonica có hàm lượng đạm dao động từ 7,6% đến 12,6% Dưới ảnh hưởng của

liều lượng phân bón cao: 180N – 120P2O5 – 90K2O (kg) thì hàm lượng đạm trong hạt tăng lên trung bình từ 10 đến 11,3% ở 15 giống lúa (Eruwghin và cs., 1968)

Theo Ahmod khi nghiên cứu về ảnh hưởng của chế độ tưới và bón phân lên hàm lượng đạm (protein) ở Bangladesh cho kết quả: hàm lượng protein trong hạt và rơm rạ tăng lên khi bón tăng đạm vào trong đất hoặc tăng độ sâu của lớp nước tưới (Ahmod, 1969)

Trong nghiên cứu của Chanvan khi nghiên cứu về hai giống lúa Jaza và Padma lại cho kết quả: hàm lượng protein trong hạt đều tăng khi tăng lượng phân bón dù trồng trong điều kiện có nước hay cạn (Chanvan và cs., 1971)

1.2.4 Ảnh hưởng của các điều kiện ngoại cảnh khác đến đời sống cây lúa

Ảnh hưởng của chế độ nước: Theo các kết quả nghiên cứu ở trong và ngoài nước đều thống nhất rằng: lúa được trồng trong điều kiện không có nước (lúa cạn) có hàm lượng protein cao hơn lúa được gieo trồng trong điều kiện có nước Các giống lúa gieo trên cạn có hàm lượng protein trong hạt gạo lật chênh lệch tới 39% so với lúa trồng trong điều kiện có nước tưới (Yoshida, 1981; Taira, 1970; Juliano, 1966; )

Kido, lại kết luận những giống lúa chín sớm có hàm lượng protein cao hơn những giống lúa chín muộn khi trồng ở ruộng nước

Ảnh hưởng của nhiệt độ, ánh sáng: khi nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ không khí và nhiệt độ nước trong ruộng đến hàm lượng protein trong hạt, Honjyo nhận thấy khi nhiệt độ không khí hoặc nhiệt độ nước trong ruộng cao sau khi lúa trỗ sẽ làm tăng hàm lượng protein trong gạo Các chế độ nhiệt độ và ánh sánh còn ảnh hưởng

nhiều đến tỷ lệ hạt chắc, do ảnh hưởng đến năng suất hạt và năng suất protein trên cùng một đơn vị diện tích (Honjyo, 1971)

Khi nghiên cứu về sự ảnh hưởng của nhiệt độ cao và ánh sáng đến hàm lượng protein, Sato đã nhận thấy: nhiệt độ cao, cường độ ánh sáng yếu và ẩm độ không khí cao vào thời gian hạt chín có tác dụng thúc đẩy sự tích lũy nhiều protein vào hạt của hai giống lúa IR8 và Norin 17 (Sato, 1974)

Trong tất cả các trường hợp đều cho thấy, tương quan nghịch chặt chẽ giữa hàm lượng protein và khối lượng nghìn hạt (P1000) Ngoài ra, hàm lượng protein trong hạt còn thay đổi dần qua các năm và mức độ thay đổi này của từng giống là khác nhau Điều này chứng tỏ, thời tiết có ảnh hưởng lớn tới sự tích lũy hàm lượng protein trong hạt (Honjyo, 1971)

1.3 NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN SỐ LƯỢNG LIÊN QUAN ĐẾN HÀM LƯỢNG PROTEIN TRONG HẠT LÚA

Phân tích di truyền số lượng là nhằm xác định những locus trong genom chứa gen tham gia qui định đặc tính và hiệu quả đóng góp của mỗi locus đó lên đặc tính là bao nhiêu Những phân tích như vậy gọi là phân tích di truyền số lượng Mỗi locus có thể chứa một hoặc nhiều gen khác nhau Trong hầu hết các trường hợp, phân tích di truyền đều cho thấy đặc tính số lượng được qui định bởi nhiều gen khác nhau Tuy nhiên, trong một số trường hợp đã cho thấy di truyền đặc tính số lượng chỉ do một gen qui định

1.3.1 Gen qui định hàm lượng protein ở lúa

Trong thực tế, các tính trạng qui định hàm lượng protein ở lúa phụ thuộc rất nhiều vào sự tác động của các nhân tố bên ngoài và sự tương tác của các gen bên trong

Sự biến dị liên tục có được là do những yếu tố có tính chất di truyền cũng như yếu tố có tính không di truyền.Sự biến dị có tính di truyền phần lớn do tính chất của gen trong nhân.Sự tương tác không alen trong biến dị liên tục thường có quan hệ đến

một nhóm, theo mô tả tổng quát đó là hiện tượng epistasis

Sự tham gia của bào chất đối với di truyền một tính trạng đã được ghi nhận Áp

dụng phương pháp lai đảo (reciprocal) để phân tích ảnh hưởng của dòng mẹ nói đúng

hơn là ảnh hưởng của tế bào chất - ảnh hưởng của môi trường đối với nhân

Giả sử các tính trạng được điều khiển bởi đa gen- tính trạng có tính biến thiên liên tục (continuously variable), nó không thường xuyên như trong trường hợp tính trạng có tính biến thiên không liên tục (discontinuously variable) Do

đó cả hai bố mẹ cùng tham gia một cách cân đối vào kiểu gen của con lai về phương diện di truyền do nhân (nuclear heredity), và một cách không cân đối về phương diện di truyền do tế bào chất

Các đặc tính phẩm chất hạt do yếu tố di truyền và môi trường quyết định, tuỳ theo tính trạng sự thể hiện có thể do yếu tố di truyền, yếu tố kỹ thuật trước

và sau thu hoạch, hay do tương tác kiểu gen x môi trường (Genotypes x Environment interaction) quyết định Điều khó khăn cho phân tích là phần lớn

những tính trạng phẩm chất hạt có tương tác kiểu gen x môi trường không tuyến tính ,khó giải thích trong những phân tích đơn giản (Bùi Chí Bửu và cs., 1996)

Đặc điểm di truyền về hàm lượng protein do đa gen kiểm soát và chịu sự tác động của môi trường Giống có hàm lượng protein cao thường liên kết với đặc tính thời gian sinh trưởng ngắn và khối lượng hạt nhẹ Hàm lượng protein tổng số bị ảnh hưởng của sự tăng giảm protein thành phần Tính trạng hàm lượng protein có hệ số di truyền khá thấp,bị ảnh hưởng mạnh mẽ tương tác giữa kiểu gen và môi trường (Chang và cs., 1979)

1.3.2 Hiệu quả gen tham gia qui định hàm lượng protein

Hiệu quả của gen: được xác định hiệu quả giữa giá trị kiểu gen đó và trung bình quần thể, gồm có:

- Hiệu quả cộng tính: là kết quả tác động đồng thời (một cách độc lập) của các alen trong cùng một locus (ký hiệu là d hay D) Với mô hình cộng tính thì phương sai kiểu gen chỉ có cộng tính tức là không có tương tác và các biểu thức kiểu hình của giá trị kiểu hình phản ánh sát nhất (xấp xỉ) các biểu thức của gen, Nhờ hiệu quả cộng tính

việc chọn giống theo kiểu hình cho phép chọn những kiểu gen tương ứng mà độ chính xác chỉ còn phụ thuộc vào độ đồng đều (thuần nhất) của môi trường;

- Hiệu quả trội: là kết quả của tương tác giữa các alen trong cùng một locus (được ký hiệu là h hay H) Trong đó có các kiểu trội: trội hoàn toàn (các alen trong các locus không có cùng hiệu quả như nhau; nếu kết hợp kiểu gen AABB với aabb thì F2

có tỷ lệ phân ly 9:3:3:1 trong đó có 9 kiểu gen có cùng giá trị với AABB, 3 kiểu gen cùng giá trị và thiên về AABB, 3 kiểu gen cùng giá trị và ít thiên về AABB, 1 kiểu gen

có cùng giá trị với aabb);

- Hiệu quả siêu trội: trong trường hợp này giá trị của Aa lớn hơn AA;

- Hiệu quả trội chệch: hiệu quả này được sinh ra do bởi tương tác không alen của các gen phân bố ở những locus khác nhau Tương tác này có thể xuất hiện ở giữa các locus mà tại đó:

+ Chỉ có hiệu quả cộng tính (cộng tính x cộng tính), ký hiệu i;

+ Tại locus này có hiệu quả trội, locus kia có hiệu quả cộng (cộng x trội), ký hiệu là j;

+ Cả 2 locus đề xuất hiện hiệu quả trội (trôi x trội), ký hiệu là l;

Tương tác giữa các locus có 5 kiểu trội chệch là: trội chệch bù, trội chệch bội, trội chệch lặn, trội chệch trội, trội chệch lặn áp đảo,

- Hiệu quả tác động đồng thời: là tác động của nhiều kiểu hiệu quả gen,

Để xem xét giá trị kiểu gen, ta xét một locus với 2 allen Pr1 (qui định hàm lượng protein thấp) và Pr2 (qui đinh hàm lượng protein cao) và các giá trị +a, -a và d theo sơ đồ:

Pr1Pr1 Pr1Pr2 Pr2Pr2

Kiểu gen

Giá trị kiểu gen -a 0 d +a

Trong đó: - Pr2 làm tăng hàm lượng Pr2Pr2 có giá trị là +a (tăng hàm lượng Protein

trong hạt), giá trị của d tùy thuộc vào mức độ trội của Pr1 và Pr2;

- d là tính trội (dominance) - Biểu hiện tính trội, lặn giữa hàm lượng

protein cao và hàm lượng protein thấp;

- a là tính cộng (additive) biểu hiện % hàm lượng protein trong hạt;

+) d<a: Trội từng phần (prtial dominance);

+) d = a: Trội hoàn toàn (complete dominance);

+) d>a: Siêu trội (over dominance);

+) d = 0: Không có tính trội (no dominance)

Mức độ trội có thể được biểu thị bằng tỷ số d/a

Protein là hợp chất hữu cơ rất quan trọng, không thể thiếu đối với mỗi cơ thể sống;

nó cung cấp từ 10 đến 15% năng lượng sống giúp cơ thể sinh trưởng và phát triển

Theo Osborne, 1924 thì protein dự trữ trong nội nhũ hạt lúa bao gồm 4 loại: Albumin, Globulin, Glutelin, và Prolamin, Protein được dự trữ trong hạt ở hai dạng (protein body – PB) PBI - gọi là prolamin và PBII - gọi là glutelin Về mặt dinh dưỡng, prolamin được xem là loại protein khó tiêu hóa cho con người và động vật; trong khi đó glutelin là thành phần dự trữ quan trọng nhất trong nội nhũ hạt lúa lên tới 75% lượng protein tổng số (Hoai T T., Kumamaru T., 2008) Do prolamin và glutelin

có mối tương quan nghịch nên các nhà chọn giống lúa muốn tăng hàm lượng glutelin bằng cách giảm hàm lượng prolamin trong hạt gạo (Ogawa và cs, 1987)

Vì vậy, nghiên cứu quy luật di truyền hay gen tham gia qui định hiệu quả của các tiểu đơn vị glutelin và prolamin là vấn đề cần thiết trong công tác chọn giống lúa

có hàm lượng protein cao

Hàm lượng protein cao trong gạo là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng dinh dưỡng của lúa gạo So với những cây trồng được coi là cây lượng thực nuôi sống con người thì cây lúa có hàm lượng protein chứa trong hạt ít hơn cả, vào khoảng 6-8% Protein trong hạt gồm các tiểu phần chính như: albumine, globuline, probaline và gluteline Trong đó glutelin đóng vai trò chính trong sự tạo thành và dự trữ protein trong hạt gạo, nó chiếm tới 80% lượng protein tổng số Chúng được tạo thành từ cùng

số amino acid và bao hàm cả 24 loại amino acid chứa liên kết peptide, 282 loại amino acid có tính chất axit và 193 loại amino acid có tính chất bazơ (Takaiwa vá cs., 1987)

Sự di truyền tính trạng hàm lượng protein khá phức tạp, do đa gen điều khiển,

có hệ số di truyền khá thấp,bị ảnh hưởng mạnh mẽ tương tác giữa kiểu gen và môi trường (Chang và cs., 1979) Hàm lượng protein tổng số bị ảnh hưởng của sự tăng giảm lượng protein thành phần Có nhiều gen qui định hàm lượng acid amine thành phần, di truyền của từng acid amine đó lại chịu ảnh hưởng của cả hai nhóm cộng tính

(additive) và tính trội (dominance)

1.3.3 Tính trạng GPC (Grain Protein Content) ở lúa

Tính trạng GPC (Grain Protein Content): là tính trạng qui định sức chứa, thành

phần các chất hình thành lên protein trong hạt GPC là một trong những tính trạng chất lượng quan trọng nhất để đánh giá phẩm chất ngũ cốc (Blanco, A.,và cs., 2002)

Hàm lượng protein (protein content) có mối quan hệ rất lớn đến chất lượng nấu nướng (cooking quality), với tý lệ phức hợp với các yếu tố khác trong nội nhũ của hạt, với

hệ thống di truyền (genetic system), tương tác với môi trường cũng như các yếu tố canh

tác khác (Blanco và cs., 2002)

Protein trong lúa gạo gồm các tiều phần chính như: albumine, globulin, probalin và glutelin, trong đó glutelin chiếm tới trên 80% lượng protein trong hạt, protein được hình thành từ các α-aminoacid (Aspartic, Glutamic acid, Serine, Histidine, Glycine, Thereonine, Alanine, )

Hiện nay, hầu hết các gen qui định hàm lượng các acid amine trong hạt lúa đã được làm rõ:

- Gcw 1 (Chr, No 3) và Gcw2, Gcwa (Chr, No10): các gen qui định hàm lượng (tổng hợp) glycine;

- Glu1, Glu2 (Chr, No1), Glu3, Glu4, Glu5 (Chr, No2): Các gen qui định hàm lượng (tổng hợp glutamine;

- Ala1, ala2 (Chr, No6): Các gen qui định hàm lượng (tổng hợp) alamine;

- Met1, (Chr, No3), met6 (Chr No10): Các gen qui định hàm lượng (tổng hợp) methionine;

- Glup1, Glup2 (Chr, No9), Glup3 (Chr, No4) và Glup4 (Chr, No12): Các gen qui định hàm lượng (tổng hợp) glutelin (www,shigen,nig,ac,jp/rice/rgn/vol20/b17,html)

Trong cơ thể của tế bào sinh vật, protein chiếm tỉ lệ nhỏ so với các hợp chất hữu cơ khác như: glucid, lipid, nhưng cùng với nucleic acid, protein đã giữ vai trò quyết định trong tất cả các quá trình sinh trưởng và phát triển Protein là hợp chất hữu

cơ rất quan trọng và không thể thiếu đối với mỗi cơ thể sống ; nó cung cấp (từ 10 đến 15%) năng lượng sống và giú p cơ thể sinh trưởng và phát triển, có thể nói rằng nếu không có protein sự sống không thể diễn ra được (Ngô Xuân Mạnh, Vũ Kim Bảng,

Protein có những đặc tính mà không thể có được ở bất kỳ một hợp chất hữu cơ nào khác, nhờ vậy mà đảm bảo được chức năng mạng sự sống và mang thông tin di truyền Đó là đa dạng trong cấu trúc, tính đặc hiệu cao về loài, có nhiêu biến đổi lí hóa khác nhau, có khả năng tương tác nội phân tử, có khả năng thích ứng với những thay đổi có quy luật của cấu hình phân tử khi có những tác động từ bên ngoài,

Protein có khối lượng phân tử lớn, từ hàng nghì đến hàng trăm triệu Tùy theo các loài khác nhau (động, thực vật khác nhau) tùy theo điều kiện môi trường khác nhau mà thành phần và hàm lượng protein có trong cơ thể sẽ rất khác nhau, protein được hình thành từ các α-aminoacid

Hàm lượng protein là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng dinh dưỡng của lúa gạo So với những cây trồng khác được coi là cây lương thực nuôi sống con người, cây lúa là cây có hàm lượng protein thấp hơn cả (từ 6-12%) Protein trong lúa gạo gồm các tiều phần chính như: albumine, globulin, probalin

và glutelin, trong đó glutelin chiếm tới trên 80% lượng protein trong hạt

Thành phần các loại acid amine trong protein của hạt có vai trò quan trọng, quyết định hàm lượng protein tổng số và chất lượng của các loại protein Theo Vũ

Tuyên Hoàng, 2005, thành phần acid amine trong bố mẹ và con cái là tương tự nhau, nhưng có sự khác nhau về số lượng (%) của chúng chiếm trong chất khô và trong protein Điều này dẫn tới hàm lượng protein của chúng là khác nhau

1.4 CHỈ THỊ PHÂN TỬ VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU VỀ DI TRUYỀN HÀM LƯỢNG PROTEIN Ở LÚA

tổng hợp ADN (Taq), MgCl2 và đệm PCR (PCR buffer) Kỹ thuật PCR hiện đã

được hoàn thiện tới mức tự động hóa trên cơ sở tìm ra enzyme tổng hợp ADN có

khả năng chịu nhiệt cao từ vi khuẩn Thermus aquaticus (Enzyme taq) và việc chế

tạo thành công máy chu kỳ nhiệt

Kỹ thuật PCR đóng vai trò quan trọng trong việc nhân bản các đoạn ADN đích

Do vậy, nó trở thành một khâu quan trọng nhiều kỹ thuật nghiên cứu phân tử mà đặc biệt là trong kỹ thuật về chỉ thị phân tử Số lượng chỉ thị phân tử phụ thuộc vào phản

ứng PCR ngày càng nhiều

1.4.1.1 Chỉ thị RAPD

RAPD (Radom Amplified Polymorphic DNA) nghĩa là đa hình các đoạn ADN được

nhân bản ngẫu nhiên RAPD là một kỹ thuật được xây dựng dựa trên kỹ thuật PCR, với những mồi được thiết kế ngẫu nhiên có chiều dài khoảng 10 nucleotide (Williams

bất kỳ vị trí nào mà có trình tự bổ sung với nó Phản ứng sau đó xảy ra với sự tham gia

của enzim Taq, dNTP và các thành phần khác

Về cơ bản chỉ thị RAPD là một chỉ thị trội nên không phân biệt được giữa những cá thể đồng hợp tử và dị hợp tử trong quần thể F2 Tuy nhiên đây lại là một kỹ thuật đơn giản, dễ thực hiện, không mất nhiều thời gian, ít tốn kém Do vậy, kỹ thuật

này được ứng dụng trong việc lập bản đồ di truyền, phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các thứ cây trồng hay giữa các cá thể, nhằm phục vụ công tác lai tạo hoặc phân loại Chúng cũng được sử dụng như những chỉ thị phân tử để xác định những gen kiểm soát hoặc có liên quan đến một tính trạng nào đó ở cây trồng Ví dụ như tính trạng chất lượng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virus ở cà chua

Hạn chế lớn nhất của kỹ thuật này đó là rất nhạy cảm với các yếu tố tham gia phản ứng, đặc biệt là nhiệt độ gắn mồi Để hạn chế nhược điểm này cần phải tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiện thí nghiệm và tiến hành các thí nghiệm một cách đồng bộ (Lã Tuấn Nghĩa và cs., 2004, )

1.4.1.2 Chỉ thị AFLP

AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) nghĩa là đa hình chiều dài

các đoạn ADN được nhân bản chọn lọc Kỹ thuật AFLP là sự kết hợp giữa sử dụng enzym giới hạn với khuếch đại PCR và phát hiện đa hình AFLP được phát minh bởi Zabeau và Vos (1993)

Về nguyên tắc của kỹ thuật: đầu tiên ADN tổng số được cắt đồng thời bởi hai loại enzym giới hạn thường là MseI (enzym nhận biết 6 nucleotit) và EcoRI (enzym nhận biết 4 nucleotit) Khi xử lý với enzim giới hạn, ADN bị cắt thành vô số mảnh có kích thước khác nhau, mỗi mảnh đều biết trước trình tự nucleotit ở hai đầu cắt Tiếp đó dựa vào trình tự ở đầu cắt, thiết kế các đoạn gắn (adapter) và gắn chúng vào mỗi đầu Cuối cùng dựa vào trình tự adapter để thiết kế mồi PCR Mồi được thiết kế gồm hai phần: một phần có trình tự bổ sung với adapter và phần kia là những nucleotit được gắn thêm vào tuỳ ý (thông thường từ 1 đến 3 nucleotit) Với mồi thiết kế như vậy thì chỉ có những đoạn ADN có trình tự ở hai đầu bổ sung với trình tự mồi mới được nhân lên

Kỹ thuật AFLP đã kết hợp được đặc điểm của RFLP và RAPD nên có nhiều ưu điểm như: đơn giản, ổn định, khả năng ứng dụng rộng do có thể chủ động trong việc thiết kế mồi AFLP cũng được đánh giá là nhanh và hiệu quả trong việc xác định tính đa dạng ở cây trồng, tách dòng và lập bản đồ phân tử Tuy nhiên, AFLP là chỉ thị trội và vị trí nhiễm sắc thể của chúng chưa xác định, do đó không nên dùng để lập bản đồ gen các quần thể F2 Trong

trường hợp phải dùng thì cần kết hợp với các chỉ thị khác đã biết trước vị trí nhiễm sắc thể như RFLP hoặc SSR (Lê Duy Thành, 2000; Nguyen Duy Bay, và cs., 2001)

1.4.1.3 Chỉ thị phân tử SSR

Khi nghiên cứu hệ gen của một số sinh vật người ta đã phát hiện ra những đoạn ADN có chiều dài khác nhau, phân bố một cách ngẫu nhiên, chứa những trình tự lặp Mỗi đơn vị lặp thường có số lượng không vượt quá 5 nucleotit (Nguyễn Bá Ngọc, 2004) Ví dụ về trình tự lặp như (TG)n, (AAT)n (n là số lần lặp lại và có sự biến thiên giữa các alen) Số lần lặp lại của mỗi đơn vị có thể từ

10 đến 100 lần Những trình tự lặp như vậy được gọi là các trình tự lặp đơn giản

SSRs (Simple Sequence Repeats) hay microsatellites (các vi vệ tinh)

Hệ gen của động vật và thực vật đều chứa các vi vệ tinh Ở thực vật, trình

tự AT/TA được nhắc lại nhiều nhất, sau đó là GA/CT, trong khi đó thì trình tự CA/GT lại phổ biến ở động vật Ở lúa người ta đã phát hiện ra các kiểu trình tự lặp như: GA, GT, CAT, CTT

Các đoạn ADN nhắc lại có trình tự hai đầu rất đặc trưng Bởi vậy trình tự đặc trưng ở hai đầu của đoạn nhắc lại được sử dụng để thiết kế mồi cho phản ứng PCR Do có sự khác nhau về chiều dài giữa các đoạn nhắc lại mà kỹ thuật này rất phù hợp trong nghiên cứu đa hình, lập bản đồ và phân lập gen Cũng giống như kỹ thuật RAPD, kỹ thuật SSR đơn giản, thuận tiện, không tốn kém Mặt khác, SSR là chỉ thị đồng trội nên nó được sử dụng để phát hiện cá thể dị hợp tử và lập bản đồ gen sử dụng quần thể F2

1.4.2 Ứng dụng chị thị phân tử trong nghiên cứu về tính trạng chất lượng

Ứng dụng công nghệ sinh học trong lĩnh vực nông nghiệp được coi là giải

pháp đột phá xây dựng và phát triển nền nông nghiệp bền vững Nhờ những tiến

bộ của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ ADN (DNA technology) đã

giúp cho các quá trình nghiên cứu về các tính trạng nông học nói chung và tính trạng chất lượng nói riêng hiệu quả hơn Nếu chỉ đơn thuần sử dụng các phương pháp truyền thống như lai tạo và chọn lọc thông qua sự biểu hiện kiểu hình, không những tốn kém tiền của, thời gian mà kết quả chọn lựa còn phụ thuộc rất

nhiều vào điều kiện môi trường và kinh nghiệm của nhà chọn giống Trong khi

đó các kết quả ghi nhận sẽ có độ chính xác không cao chưa hẳn đã đáp ứng yêu cầu thực tế

Nhiều nghiên cứu đã cho thấy gieo trồng các giống lúa có hàm lượng protein cao là hướng đem lại hiệu quả kinh tế Công tác chọn tạo giống lúa có hàm lượng protein cao có thể được tiến hành theo phương pháp chọn lọc có sự trợ giúp của chỉ thị phân tử

Năm 2002, Blanco đã sử dụng 203 chỉ thị RFLP để nghiên cứu, đánh giá 65

dòng nội phối (Recombinant Inbred Lines-RILs) trên lúa mì, kết quả đã xác định được

7 QTLs liên quan đến tính trạng GPC (Grain Protein Content)

McCouch đã thiết lập bản đồ di truyền cây lúa nhờ marker phân tử (RFLP) gồm

135 loci Bản đồ phủ trên 12 nhiễm sắc thể với tổng cộng 1389 cM trên genome cây

lúa từ cặp lai IR34583 (Indica) và Bulu Dalam (Japonica) Các chỉ thị phân tử được

sử dụng để nghiên cứu mối liên kết của chúng với những gen qui định đặc tính ở cây như: chịu hạn, kháng sâu, bệnh, phẩm chất gạo, Khi chỉ thị phân tử đã được xác định liên kết chặt với gen qui định đặc tính, nó sẽ được sử dụng trong chọn tạo giống (McCouch et al., 1988; 1991; Tanksley và cs., 1990)

Chiều dài hạt là một trong những chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng cũng như độ cảm quanh của một giống lúa, đồng thời nó cũng là một đặc tính rất quan trọng trong chọn tạo giống lúa chất lượng (Luo và cs., 2004)

Wan (2005) đã sử dụng 116 chỉ thị RFLP để tiến hành lập bản đồ chiều dài hạt trên các giống/dòng lúa nghiên cứu (sử dụng quần thể RILs, CSSLs, BC4F2 và BC4F3), kết quả tác giả đã tiến hành lập được 6 bản đồ QTL (qGL-2; qGL-3a; qGL-3b; qGL-5 , qGL-7 và qGL-9) Trong đó, QTL qGL-3 nằm trên nhiễm sắc thể số 3 có chỉ số LOD đóng góp vào cao nhất (27.79) quyết định đến di truyền tính trạng chiều dài hạt gạo (Wan và cs., 2006)

1.4.2.1 Bản đồ di truyền tính trở hồ

Một vài nghiên cứu cho thấy độ trở hồ có liên quan đến hàm lượng amylose và

do các gen alk và qASS-6 qui định, trong đó alk là gen kiểm soát giá trị làm nhòe hạt

gạo bằng chất kiềm (alkali) Gen alk và qASS-6 có sự liên kết với gen wx (McKenzie

và cs., 1983) và thực tế về kiểu hình thì độ trở hồ quyết định rất lớn đến hàm lượng amylose (Jennings và cs., 1979)

He (1998; 1999), đã thiết lập bản đồ di truyền quần thể đơn bội kép (double haploid) dùng cây lai F1 ZY Q8 (O indica) và JX17 (O japonica) để nghiên cứu hệ di

truyền độ trở hồ và tìm thấy cả gen chính và gen phụ của độ trở hồ đều nằm trên nhiễm sắc thể số 6 liên kết chặt với marker CT201-RZ450 (He và cs., 1998;1999)

1.4.2.2 Bản đồ di truyền hàm lượng amylose

Hàm lượng amylose trong phôi nhũ của gạo là chìa khóa quyết định chất lượng gạo Gen điều khiển hàm lượng amylose của lúa mạch nằm trên đoạn ngắn của nhiễm sắc thể số 1 (Kleinho và cs., 1993) Trên cây lúa (Oryza sativa L.), vị trí gen điều

khiển amylopectin nằm trên nhiễm sắc thể số 6 (Chr 6) Các thể đôt biến về amylose

được nghiên cứu trên giống lúa Japonica với hai dạng hình 204 và EM16 Gen điều

khiển sự tăng giảm hàm lượng amylose được xác định trên nhiễm sắc thể số 2

đã phân loại được các nhóm amylose (genWx) nằm trong hệ genome của cây lúa

truyền phân tử về phẩm chất cơm đã được ghi nhận qua công trình nghiên cứu của Harrington năm 1997 của bản đồ liên kết gen với hệ enzym III của tinh bột trong hạt gạo của trên nhiễm sắc thể số 2 (Chr 2) sử dụng hai chỉ thị biên là CDO718 và RG157

1.4.2.3 Bản đồ di truyền của hàm lượng protein

Đặc tính di truyền hàm lượng protein là do đa gen kiểm soát và phân bố trên các nhiễm sắc thể số 1, 2, 4, 6, 9, 12 (liên quan đến các thành phần của glutelin), 7, 11 (liên quan đến protein dự trữ trong nội nhũ), 5, 7 và 12 (liên quan đến các thành phần của prolamin) ( http://www.ricegenome.org)

Theo Nguyễn Thị Lang (2004), hàm lượng protein có sự biến động mạnh

mẽ là do có sự tương tác giữa kiểu gen quy định hàm lượng protein với môi trường (GxE) Từ kết quả của nhiều năm nghiên cứu tác giả đã đi đến kết luận,

hệ số tương quan giữa kiểu gen và với môi trường biến động từ 1,30 đến 0,372 (Nguyễn Thị Lang và cs., 2004)

Shenoy khi nghiên cứu về hệ số di truyền của hàm lượng protein đã đưa ra kết luận, hệ số di truyền hàm lượng protein đạt 71% (Shenoy và cs., 1991)

Khi nghiên cứu về sự biến động hệ số di truyền của các cặp lai khác nhau, Nguyễn Thị Lang đã nhận thấy ở một số cặp lai cho kết quả hệ số di truyền hàm lượng protein rất thấp chỉ đạt 11,1% (Nguyễn Thị Lang và cs., 2004) Từ những biến động trên cần phải phân nhóm di truyền trên các nhóm khác nhau của các giống lúa địa phương, xem như là vật liệu lai tốt phục vụ cho chương trình chọn giống lúa tốt hơn Tuy nhiên khi đánh giá kiểu hình tính trạng protein cũng sẽ ảnh hưởng với môi trường rất lớn Do đó, kết hợp giữa đánh giá kiểu hình với chỉ thị phân tử để đánh giá và phân nhóm mức độ tương đồng của các giống sẽ cho kết quả cao nhất

1.4.2.4 Bản đồ di truyền tính trạng mùi thơm

Năm 1992, Ahn đã tiến hành sử dụng chỉ thị SSR-PCR để tiến hành nghiên cứu về gen điều khiển mùi thơm trên hai giống lúa Della và Basmati 370

Kết quả tác giả đã xác định được chỉ thị RG28 liên kết với gen fgr nằm trên

nhiễm sắc thể số 8 điều khiển tính trạng mùi thơm của hai giống lúa Della và Basmati 370 (Ahn và cs., 1992)

Thông qua sử dụng chỉ thị RFLP để nghiên cứu tính đa hình của các quần thể

dòng đẳng gen (NILs-population), là các dòng tạo được do hồi giao giữa con lai với

một trong hai bố mẹ của nó, nên nó chỉ khác nhau ở vài đoạn mã di truyền của bố mẹ

do gen (Singh và cs., 2000) Phân tích bản đồ liên kết thông qua sử dụng chỉ thị

RFLP cho thấy có sự liên kết rất chặt giữa đơn gen lặn fgr với chỉ thị RG28 trên

nhiễm sắc thể số 8 (Chr 8) với khoảng cách di truyền là 4,5 cM

Ngày nay, các chỉ thị phân tử được coi là công cụ quan trọng để xác định

từ sự đa dạng hóa đến phân lập gen trong chọn giống cây trồng Theo Lorieux (1995) có 4 loại chỉ thị phân tử cho gen điều khiển mùi thơm, kết quả xác định

có nhiều chỉ thị trên nhiễm sắc thể số 8 liên kết rất chặt với gen điều khiển sự

hiện diện của AP (2-acetyl-1-pyrroline)-hợp chất chính tạo mùi thơm ở lúa

thông qua một gen chính và hai loci tính trạng số lượng điều khiển tính trạng mùi thơm cây lúa Gen chính điều khiển mùi thơm được định vị và liên kết với hai chỉ thị biên RG1 và RG28 ở khoảng cách <5 cM Hai loci điều khiển tính trạng số lượng có tác động đén mức độ thơm của các giống lúa Kết quả còn chứng minh rằng nồng độ AP trong cây xảy ra ít nhất ở 2 vùng nhiễm sắc thể khi đánh giá đoạn tái tổ hợp trên nhiễm sắc thể số 8 (Lorieux và cs., 1995)

Jin (1996) dùng 300 chỉ thị RAPD để tiến hành đánh giá đa hình tính trạng mùi thơm của con lai từ giống bố/mẹ Khao Dawk Mali 105 (thơm) và CT9993 (không thơm) Số chỉ thị RAPD cho đa hình giữa 2 giống Khao Dawk Mali 105 và CT9993 đạt 64,1% Bên cạnh đó, tác giả cũng đã xác định được chỉ thị Jas 1.5 chỉ cho xuất hiện băng ở vị trí 1,5 kb trên các cá thể lúa thơm Dự a vào sự hiện diện tính trội của alen không thơm để loại trừ các cá thể không có

mùi thơm tác giả đã kết luận chỉ thị Jas 1.5 liên kết chặt với gen (fgr) quy định tính

trạng hương thơm nằm trên nhiễm sắc thể số 8 với khoảng cách di truyền là 3,9 cM

Nó không những rất hữu dụng cho việc xác định gen thơm mà còn phát hiện ra khối liên kết tại vị trí chuyển dần các gen thơm thông qua backcross (Jin và cs., 1996)

Yoshihashi (2000) đã thành công khi dùng chỉ thị SSR với mồi RM17 để

xá định giống gạo thơm Khao Dawk Mali 105 với các giống khác cũng mang cùng tên thị trường thông qua ADN được li trích từ hạt gạo xay chà

Bergman (2002) phân tích trên quần thể con lai từ ba tổ hợp lai giống lúa giống thơm và không thơm của mỹ cho kết quả xác định được 9 chỉ thị SSR liên kết locus RG28 Trong đó chỉ

thị RM223 liên kết với locus RG28 tại vị trí của gen fgr với khoảng cách liên kết là < 5cM

(Bergman và cs., 2002)

Khi tiến hành nghiên cứu ứng dụng SSR đánh dấu, Nguyễn Thị Lang (2002) đã tiến hành lập bản đồ tính trạng mùi thơm trên nhiễm sắc thể số 8 và kết luận RM223 liên kết chặt

với gen mùi thơm frg với khoảng cách di truyền là 1,6 cM Tác giả còn chuyển đổi RFLP thành

STS để đánh giá mùi thơm thông qua chỉ thị phân tử RG28 trên quần thể F2 Khao Dawk Mali

105/ OM1490 cho đa hình giữa hai nhóm thơm và không thơm; bản đồ liên kết gen mùi thơm

được thiết lập cho khoảng cách di truyền RG28 với gen fgr là 1,8cM

Neelu Jain và cs., (2003) sử dụng 15 chỉ thị SSR đã được sắp xếp trên nhiễm sắc thể số

8 (Garland và cs., 2000) để phân tích sự đa dạng về chất lượng gạo của 12 giống lúa Basmati trên thị trường Tác giả đã kết luận có 3 alen được xác định tại vị trí SCUrice-SSR1 với các chỉ thị RM342, RM42, RM195, RM223, RM284 nằm trong vùng RG1-RG28 đều cho đa hình cao giữa các giống Basmati thơm và không thơm

Sự kết hợp giữa các phương pháp truyền thống và công nghệ ADN đã hình thành hướng chọn tạo giống mới là chọn tạo giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker Assitsed Selection-MAS) thông qua việc ứng dụng các kết quả về lập bản đồ gen và QTLs qui định các tính về năng suất, chất lượng, kháng và chống với các điều kiện bất lợi và sâu bệnh hại

1.5 MỘT SỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN HÀM LƯỢNG PROTEIN Ở LÚA

Viện Cây lương thực và cây thực phẩm (Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn) nghiên cứu thành công giống lúa mới P6 và P290 trên cơ sở phát triển giống P4 Viện sĩ Vũ Tuyên Hoàng với lời nhắn nhủ: “Sau P4 sẽ là P6, vừa ngon mắt, vừa ngon miệng dành cho bà con ta…”

Thạc sĩ Nguyễn Trọng Khanh cho biết, lúa P6 có nhiều ưu điểm nổi bật so với các giống lúa khác Đầu tiên là hàm lượng đạm của P6 đạt 10,5% dẫn đến năng suất

Prôtêin cao Nếu tính năng suất lúa là 6 tấn/ha thì các giống khác chỉ đạt 400-420 kg prôtêin/ha trong khi giống P6 đạt 550-600 kg prôtêin/ha Theo thông lệ trên thế giới nếu gạo có lượng đạm cao thì năng suất thấp, nhưng P6 có năng suất cao (5,5 tấn/ha) đồng thời với chất lượng cao Thóc thường trên thị trường có giá 5.500-6.000 đồng/kg nhưng thóc của lúa P6 có giá 7.000 đồng/kg Nổi bật nhất là khả năng chịu rét, hiện P6

là giống lúa chịu rét tốt nhất trên miền Bắc Giống lúa mới có chất lượng gạo cao: gạo trong, không bạc bụng, hạt thon dài, cơm mềm với hàm lượng amylose trung bình Theo các nhà khoa học, thức ăn động vật có lượng đạm rất cao, nhưng đạm động vật thường gây ra bệnh tim mạch và nhiều bệnh tật nguy hiểm khác, trong khi đạm thực vật rất an toàn cho người Chính vì thế, gạo từ lúa P4, P6, P290 sẽ là nguồn cung cấp đạm cho nông dân giá rẻ, an toàn, dễ kiếm, là thực phẩm hữu ích trong thời

kì phát triển mới của đất nước (Theo Báo Người Cao Tuổi)

Phát hiện các gen điều chỉnh Glutelin ở lúa: GS WAN Jianmin và các đồng nghiệp tại trường Đại học Nông nghiệp Nanjing (Trung Quốc) vừa công bố những khám phá mới của họ về quá trình xử lý glutelin trong gạo trên Tạp chí Plant Journal

số ra mới đây với tựa đề "Enzym OsVPE1 xử lý không bào là cần thiết cho xử lý glutelin" Theo cách phân loại protein dự trữ thì protein dự trữ trong nội nhũ hạt lúa bao gồm 4 loại protein: Albumin, Globulin, Glutelin, và Prolamin Protein dự trữ ở hai thể protein (protein body, được viết tắt là PB) bao gồm PBI và PBII PBI hay prolamin tan trong cồn, kích thước nhỏ (1-2 nm), hình cầu và cấu trúc đồng tâm trong khi PBII hay glutelin không hòa tan được trong dung dịch muối hoặc cồn nhưng hòa tan được trong dung dịch 0.1M acid hoặc kiềm, kích thước lớn hơn (2-3 nm) Nghiên cứu quy luật di truyền của các tiểu đơn vị glutelin là vấn đề cần thiết trong công tác chọn giống lúa có chất lượng dinh dưỡng cao

Nghiên cứu, đã phân tích sinh sản vô tính và các chức năng của một OsVPE1, chuỗi Nucleotide biến thể của glutelin ở loại lúa mới Nghiên cứu cũng tiết lộ một biến thể có thể làm thay đổi Cys269 thành Gly Những phân tích di truyền cũng cho thấy rằng phenotip W379 được kiểm soát bởi một gen hạt nhân lặn đơn Những thí nghiệm cho thấy rằng hoạt động phân chia ASN (trong chuỗi HIS, LYS, ASN, LEU) đặc trưng của vật đột biến không lớn hơn 10% so với điều tương tự ở giống lúa

OsVPE1 lại không như vậy, có vẻ như có sự phân chia không hợp lý ở OsVPE1 và điều này do hoạt động enzym của OsVPE1 ở vật đột biến gần như bị loại bỏ

nhiều trọng trách trong tế bào Một bộ prôtêin hoàn chỉnh gọi là proteome, phụ trách nghiên cứu cấu trúc prôtêin, chức năng hoặc bất cứ hoạt động nào của prôtêin trong tế bào gọi là proteomics.Gen sao bản kích hoạt rất năng nổ, thay đổi liên tục với mỗi kích thích của môi trường Mục tiêu của nghiên cứu prôtêin và chức năng prôtêin là để tìm hiểu cơ chế cho phép cấu trúc và chức năng của prôtêin thực hiện nhiệm vụ của mình,

nó tương tác với cái gì, và làm thế nào góp phần vào chu kỳ sống.Một ứng dụng của khoa học nghiên cứu prôtêin và chức năng prôtêin được biết tới là bản chụp nghiêng biểu hiện prôtêin, nơi prôtêin được nhận diện trong cơ thể sinh vật dưới kích thích của môi trường Khoa học nghiên cứu prôtêin và chức năng prôtêin còn để phát triển một biểu đồ mạng prôtêin nơi mỗi tương tác của prôtêin được xác định cho một hệ sống nhất định.Khoa học nghiên cứu prôtêin và chức năng prôtêin cũng được ứng dụng để

vẽ sơ đồ biến đổi prôtêin nhận biết sự khác biệt giữa cơ thể sinh vật hoang dã và cơ thể sinh vật biến đổi gen Ngành khoa học này cũng được ứng dụng nghiên cứu tương tác giữa prôtêin và prôtêin trong mỗi phản ứng bảo vệ của thực vật.Vi dụ, nghiên cứu prôtêin và chức năng prôtêin tại đại học Iowa kết luận:

• Một thí nghiệm về thay đổi prôtêin trong bản sao gen kích hoạt của ngô dưới nhiệt độ thấp là tác động chính giúp ngô con nảy mầm

• Phân tích những khác biệt xảy ra trong thể hiện hệ gen đậu nành trồng ở nhiệt độ cao

• Nhận biết thể hiện prôtêin phản ứng trước các loại bệnh như giun tròn nang ở cây đậu nành

Khoa học nghiên cứu hóa chỉ tế bào(Metabolomics):Nghiên cứu hóa chỉ tế bào là ngành khoa học “omics” mới nhất Hóa chỉ tế bào là một bộ hoàn chỉnh các tổ hợp trọng lượng phân tử thấp trong một mẫu Các tổ hợp phân tử là các chất nền hoặc sản phẩm phụ của các phản ứng enzim, trực tiếp tác dụng lên kiểu hình của tế bào Vì thế, mục đích của nghiên cứu hóa chỉ tế bào là xác định các mẫu sao chụp của các tổ hợp này tại một thời điểm xác định dưới tác động của các điều kiện môi trường nhất định Nghiên cứu gen và chức năng gen, nghiên cứu prôtêin và chức năng prôtêin giúp mở rộng thông tin về kiểu di truyền nhưng vẫn bị hạn chế thông tin về kiểu hình Các tổ

hợp trọng lượng phân tử thấp các là các liên kết gần nhất đến kiểu hình.Nghiên cứu hóa chỉ tế bào được ứng dụng để xác định sự khác nhau trong hàm lượng hàng nghìn phân tử giữa một cơ thể thực vật khỏe và một cơ thể có bệnh Công nghệ này đồng thời cũng được sử dụng để xác định khác biệt dinh dưỡng giữa cây trồng bình thường

và cây trồng biến đổi gen, và khác biệt trong khi nhận biết chất chuyển hóa bảo vệ thực vật

Tại Hội nghị quốc gia về chọn tạo giống lúa tại Viện Lúa Đồng Bằng sông Cửu long - tháng 7/2004, một số kết quả nghiên cứu về ứng dụng kỹ thuật điện di Protein SDS-Page trong việc chọn tạo giống lúa chất lượng cao đã được trình bày:Kỹ thuật điện di là một công cụ phân tích cho phép đánh giá gián tiếp dò tìm bộ gen thông qua

kỹ thuật phân tích tính biến dị cấu trúc của các enzym và protein Kết quả so sánh với phương pháp phân tích điện di bằng kỹ thuật điện di isoenzyme cho thấy kỹ thuật điện

di protein phát hiện được mức độ đa dạng của protein gấp nhiều lần hơn Hơn nữa, kỹ thuật điện di protein xác định nhanh, tương đối rẻ tiền, không cần phải trồng cây chờ đến thời điểm thu hoạch và không bị ảnh hưởng do môi trường Các nhà chọn giống sử dụng kỹ thuật điện di trên hạt giống với mục đích như sau:Phân tích các protein tinh khiết Đánh giá được nồng độ protein.Phát hiện được quá trình phân giải protein.Xác định được các protein miễn nhiễm trầm tủa.Kiểm tra sự hiệu chỉnh protein Phân lập

và xác định nồng độ các kháng nguyên do protein để sản xuất kháng thể Phân lập protein đánh dấu bằng bức xạ

Ứng dụng phương pháp điện di protein, các nhà khoa học Viện Lúa ĐBSCL từ tháng 10/2000 đã tuyển chọn dòng thuần của giống lúa Nếp bè Tiền giang đang được trồng trong sản xuất Từ 5 hạt ưu tú được chọn ra, tiến hành nhân lên trong nhà lưới và đến khi thu hoạch tiếp tục được kiểm tra lại độ thuần, hàm lượng protein và hàm lượng amylose Từ đó đã chọn ra được dòng Nếp Bè 1-2 có chiều dài hạt dài hơn giống đối chứng, năng suất cao hơn 15% và hàm lượng protein trên 10% Kết quả này cho thấy,

kỹ thuật điện di protein sẽ giúp cho nhà chọn giống chọn ra được giống lúa Nếp thuần thep yêu cầu chất lượng hàng hoá, giảm quy mô trồng ngoài đồng để tuyển chọn và thời gian tuyển chọn Hướng ứng dụng này có thể tiếp tục áp dụng cho các giống lúa nếp khác đang trồng ở vùng Đồng bằng sông Cửu long như Nếp Móng chim, Nếp Mù

u, Nếp Sáp… Việc chọn lọc dòng thuần đối với giống lúa thơm VD 20 ( Việt Đài 20 )

du nhập vào Việt Nam năm 1996 cũng đã được tiến hành Từ 4 dòng thuần chọn lọc

ra, đã tuyển chọn ra dòng C3 có đặc tính là năng suất cao, đạt 7,1 tấn/ha vụ Đông Xuân, có cơm ngon, mềm và thơm hơn đối chứng

Trong một nghiên cứu được công bố trên Kỷ yếu của Viện Hàn lâm Khoa học Quốc gia, Hoa Kỳ, các nhà nghiên cứu mô tả các hạt gạo có thể sản xuất số lượng lớn

một protein máu gọi là albumin huyết thanh, hoặc HSA1 Ở Trung Quốc, ý tưởng sử

dụng lúa, một cây trồng phong phú, để bổ sung hoặc thậm chí thay thế các nguồn cung cấp albumin hiện tại nhằm đáp ứng nhu cầu về HSA và làm giảm nguy cơ lây lan virus trong huyết tương tiềm ẩn đã được Daichang Yang, nhà công nghệ sinh học thực vật tại Đại học Vũ Hán, Trung Quốc và các đồng nghiệp thực hiện bằng cách chèn gene

mã hóa HSA vào các cây lúa Gene này được kích hoạt trong quá trình tạo hạt và

protein tạo ra được lưu trữ trong hạt gạo cùng với các chất dinh dưỡng khác Kết quả cho thấy HSA chiếm hơn 10% protein hòa tan tổng số của hạt gạo, một trong những sản lượng cao nhất của protein tái tổ hợp từ cây trồng tính đến thời điểm hiện nay.Các kết quả phân tích cho thấy protein có nguồn gốc từ gạo có các đặc điểm hóa học và vật

lý và biểu hiện chức năng tương đương với protein huyết tương máu người trong các thử nghiệm y tế và phản ứng miễn dịch

Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

- Các giống lúa có hàm lượng protein thấp: Khang dân 18, Q5

- Các giống lúa có hàm lượng protein cao: P290, P6, P4, P1, AC5, và các quần thể con lai F1, F2, BC1(150-200 hạt/dòng)

- Các vật tư hóa chất phục vụ công tác nghiên cứu

Bảng 2.1: Danh sách mồi SSR

Một số đặc điểm của giống bố mẹ

Theo các nghiên cứu trước đây , đă ̣c biê ̣t là báo cáo kết quả thực hiê ̣n đề tài “Nghiên

cứu cho ̣n ta ̣o giống lúa có hàm lượng protein cao trong ga ̣o cho vùng thâm canh và

vùng khô hạn” giai đoạn 2002-2005 đã cho thấy:

- Giống Khang dân 18: là giống lúa thuần nhập nội từ Trung Quốc Giống lúa này có

nhiều đặc tính nông học tốt như: khả năng thích ứng rộng, hiện đang được trồng phổ biến ở miền Bắc và miền Trung Giống lúa này có thời gian sinh trưởng là 130 - 135 ngày vào vụ Xuân, 105 - 110 ngày vào vụ mùa, chiều cao cây 95 - 100cm, năng suất từ

1 RM8069 5' AAA CCT CTC GCT GTA ATT AG 3' 5' TGA ACA TTT ATT GAT ATG GTA AA 3'

2 RM8133 5' AAA ACT GAC TGT TTG TTT AAATGAAAT3' 5' GTT ACT GCT GTA ATG TGA ATT GCT 3'

3 RM8084 5' TGC GTT TCG ATT TCT TTT TA 3' 5' GGA AAG TTG TGT TCT TTG GC 3'

4 RM4355 5' GGG ATG AGA GTA GAA GGC A 3' 5' TAT ATG GCA AGC CTA GCG 3'

5 RM6911 5' GGT GAT TGC TAT TTA ACT TC 3' 5' ACT TTT TCC AAA TTA TGC T 3'

6 RM4499 5' AGC AAC TTG CAA GCT TTA AT 3' 5' GCT GAA CCC TGA GAA TAT GT 3'

7 RM2634 5' GAT TGA AAA TTA GAG TTT GCA C 3' 5' TGC CGA GAT TTA GTC AAC TA 3'

8 RM3515 5' ACG CTT GTG GTG TTT AAT AC 3' 5' CAC TGT GAA TAC ACA GGA AC 3'

9 RM1367 5' GCA TCG TTC ATG TAC ACT GG 3' 5' CTG CTA CGC TGC TAC TCC TAG 3'

10 RM5303 5' GCC ATT TCT GCT CTT TCT TA 3' 5' GTT TGC ATG GAG AAG AAG AA 3'

11 RM5626 5' GAT CAG TCG GTC ATA AAC G 3' 5' CAC CTT CCT CTT CTG CTG 3'

12 RM1359 5' CCA AAG GTC AAC GAA TTC TA 3' 5' CGG CTG GTT AAT TAA TCA AA 3'

13 RM6909 5"AAGTACTCTCCCGTTTCAAA3" CCTCCCATAAAAATCTTGTC

14 RM5579 5' CAA ATA TTG GCA AAT AAA CT 3' 5' ATA TTG CCT CAT GGT AAT AA 3'

15 RM4710 5"AACTGGTTACAAAGACATGG3" TCATCTACATATGGGGACAC

16 RM6836 5' TTG TTG TAT ACC TCA TCG AC 3' 5' AGG GTA AGA CGT TTA ACT TG 3'

17 RM2229 5' AGC ACC TAA GCA TCT AGC AC 3' 5' CAT GTC ACC CAA AAC AAT TA 3'

18 RM3827 5' CAC CAG CTT CAC TTC ATC TC 3' 5' CCT TTC TTC AAT CTG CAT TC 3'

19 RM5314 5' AAT AAC CCT TGC ATA CAC AT 3' 5' CAT TTT GGT TGA GAG GTT TG 3'

20 RM5509 GATGATCCATGCTTTGGCC TTCCAGCAGAAAGAAGACGC

55 - 60tạ/ha Khang dân 18 là giống lúa có hàm lươ ̣n protein thấp , khoảng 7% (bảng 2.2)

- Giống Q5: là giống lúa thuần nhập nội từ Trung Quốc, được trồng phổ biến ở miền Bắc nước ta Thời gian sinh trưởng ở trà Xuân muô ̣n là 135 - 140 ngày, ở trà mùa sớm

là 110 - 115 ngày; chiều cao cây từ 90 - 95cm; chất lượng ga ̣o trung bình ; năng suất trung bình 45 - 50ta/ha Giống lúa này có hàm lượng protein thấp khoảng 6,8% (bảng 2.2)

- Giống lu ́ a P1: Có thời gian sinh trưởng từ 170 - 175 ngày ở vụ Xuân; 120 - 125 ngày

ở vụ Mùa Giống có chiều cao cây 100 - 105cm; năng suất trung bình 55 - 67 tạ/ha Giống có chất lượng ga ̣o tốt ; hàm lượng protein khá cao chiếm khoảng 10,5% (bảng

2.2)

- Giống lu ́ a P4: Có thời gian sinh trưởng từ 165 - 180 ngày ở trà Xuân chính vụ ; 135 -

140 ngày ở vụ mùa Giống có chiêu cao cây 95 - 100cm; năng suất trung bình 40 - 45 tạ/ha Giống có chất lượng ga ̣o tốt ; cơm dẻo, đâ ̣m; đă ̣c biê ̣t hàm lượng protein khá cao

chiếm khoảng 11% (bảng 2.2)

- Giống P6: Có thời gian sinh trưởng từ 115 - 120 ngày ở vụ Mùa ; 160 - 175 ngày ở

vụ Đông xuân ở đồng bằng sông Hồng còn ở từ Nghệ An đến Huế từ 130 - 140 ngày Giống có chiều cao cây 80 - 90cm; năng suất trung bình 55 - 65t a ̣/ha Giống có chất

lươ ̣ng ga ̣o tốt; cơm mềm; hàm lượng protein cao chiếm khoảng 10,5% (bảng 2.2)

- Giống AC5: Có thời gian sinh trưởng 160 - 170 ngày vào vụ Xuân và 120 ngày vào

vụ Mùa Chiều cao cây 90 - 95cm Năng suất đa ̣t 65 tạ/ha vào vu ̣ Xuân và 60 tạ vào vụ

Mùa Giống này có chất lượng ga ̣o tốt và hàm lượng protein khoảng 9,5% (bảng 2.2)

- Giống P290: Thờ i gian sinh trưởng 180 - 185 ngày vào vụ Xuân , 135 ngày vào vụ Mùa Chiều cao cây 90 - 95cm Năng suất 65 - 70 tạ/ha vào vu ̣ Xuân, 55 - 60 tạ/ha vào

vụ Mùa Giống có chất lượng gạo tốt, cơm ngon, mềm, đâ ̣m và hàm lượng protein là 10% (bảng 2.2)

Bảng 2.2 Một số đặc tính nông học của các giống lúa sử dụng trong nghiên cứu

TT Giống

lúa

Đặc tính

TGST (ngày)

Cao cây (cm)

Năng suất (tạ/ha)

Hàm lượng protein (%)

- 60 (vụ Mùa)

10

Đa hình ADN giữa các giống bố mẹ

Đa hình ADN của các giống đã được xác định bằng cách phân tích nhận dạng ADN sử dụng các mồi SSR Phản ứng PCR của các giống lúa: KD18, Q5, P1, P4, P6 và P290

đã tiến hành với các mồi SSR; hình ảnh nhận dang ADN (hình 1) được ghi nhận dưới dạng 0 và 1, sau đó sử dụng phần mềm NTSYS để xây dựng ma trân tương đồng (bảng 2.3) và sơ đồ hình cây (hình 2.2)

Hình 2 1 Hình ảnh nhận dạng ADN bằng mồi SSR, 1: Thang marker chuẩn,

2 - 8: các giống lúa thí nghiệm

Qua kết quả phân tích đa dạng di truyền giữa các giống cho thấy các giống hoàn toàn

khác nhau về di truyền; sự tương đồng giữa các giống từ khoảng 0,49 - 8,7 Phần lớn các giống lúa có hệ số tập trung trong phạm vi từ 0,6 - 0,7; mức độ tương đồng di truyền này rất thích hợp cho việc chọn cặp lai, tạo ra ưu thế lai cao đồng thời cũng dễ dàng trong các phân tích di truyền tiếp theo về bản chất di truyền cũng như là hiệu quả gen tới các tính trạng nông học

Bảng 2 3 Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống lúa bố mẹ

Hình 2.2 Cấu trúc hình cây thể hiện tương đồng di truyền giữa các giống lúa

Căn cứ vào hệ số tương đồng di truyền để thiết lập các tổ hợp lai.Các tổ hợp lai giữa các giống lúa đã được tiến hành để tạo hạt lai F1, bằng cách các giống Khang dân

18, giống Q5 được sử dung làm mẹ; các giống P1, P4, P6, P290 và AC5 sử dụng làm

bố (bảng 2.4) Các giống lúa Khang dân 18, Q5 được khử đực sau đó được thụ phấn với phấn của các giống P1, P4, P6, P290 và AC5 Chọn hạt lai F1 của mỗi tổ hợp lai

để tạo quần thể F2