Nghiên cứu xác định hàm lượng polyphosphat trong thực phẩm bằng phương pháp CE c4d

Phương pháp này với các kỹ thuật phân tích khác nhau như điện di mao quản vùng, điện di mao quản gel, điện di mao quản đẳng tốc độ… đã được sử dụng khá nhiều để xác định polyphoshat tron

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Liên

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHOSPHAT

D

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2018

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Liên

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHOSPHAT

D

Chuyên ngành: Hóa phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Thị Ánh Hường

Hà Nội – 2018

Lời cảm ơn

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn cô giáo, TS Nguyễn Thị Ánh Hường đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp em hoàn thành luận văn này

Em xin chân thành cảm ơn công ty 3Sanalysis (http://www.3sanalysis.vn/) đã cung cấp thiết bị CE-C4

D cũng như tư vấn kỹ thuật trong quá trình thực hiện nghiên cứu này

Em xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Hóa Phân tích nói riêng và trong khoa Hóa học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên em trong suốt thời gian em học tập tại trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội

Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, các bạn sinh viên, học viên của Bộ môn Hóa phân tích đã luôn động viên tinh thần, nhiệt tình hỗ trợ em trong thời gian học tập và thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2018

Học viên

Nguyễn Thị Liên

Mục lục

LỜI MỞ ĐẦU….……….1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Chất phụ gia thực phẩm 3

Giới thiệu chung về phụ gia thực phẩm 3

1.1.1 Phân loại phụ gia thực phẩm 3

1.1.2 1.1.2.1 Phân loại dựa trên sức khỏe người tiêu dùng 3

1.1.2.2 Phân loại theo chức năng 4

Vai trò của phụ gia thực phẩm 4

1.1.3 1.2 Tổng quan về polyphosphat 5

Cấu trúc 5

1.2.1 Phân loại 6

1.2.2 Tính chất 7

1.2.3 Vai trò của polyphosphat 8

1.2.4 Ảnh hưởng của polyphosphat đến sức khỏe 8

1.2.5 Giới thiệu chung về các chất phân tích của đề tài 9

1.2.6 1.3 Vấn đề sử dụng pyrophosphat, tripolyphosphat trên thế giới và ở Việt Nam 11

Trên thế giới 11

1.3.1 Tại Việt Nam 11

1.3.2 1.4 Tổng quan về các phương pháp phân tích 12

Phương pháp sắc ký ion 12

1.4.1 Phương pháp điện di mao quản 13

1.4.2 Một số phương pháp khác 14 1.4.3

1.5 Các phương pháp xử lý mẫu 15

1.6 Giới thiệu về phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-C4 D) 18

Cấu tạo của một hệ CE cơ bản 18

1.6.1 Các kỹ thuật bơm mẫu trong CE 20

1.6.2 CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 22

Mục tiêu nghiên cứu 22

2.1.1 Nội dung nghiên cứu 22

2.1.2 2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

Phương pháp lấy mẫu, bảo quản và xử lý mẫu phân tích 23

2.2.1 Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc 2.2.2 kết nối kiểu tụ điện (CE-C4 D) 24

Phương pháp khảo sát, tối ưu điều kiện phân tích điện di 24

2.2.3 Phương pháp khảo sát các điều kiện xử lý mẫu 25

2.2.4 Đánh giá phương pháp phân tích 26

2.2.5 2.2.5.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp phân tích 26

2.2.5.2 Độ lặp lại của phương pháp 26

2.2.5.3 Độ đúng của phương pháp 27

Tính toán kết quả và uớc lượng độ không đảm bảo đo 27

2.2.6 2.3 Hóa chất và thiết bị 29

Hóa chất 29

2.3.1 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất 30

2.3.2 Thiết bị dụng cụ 30 2.3.3

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

3.1 Nghiên cứu, khảo sát các điều kiện phân tích đồng thời tripolyphosphat và pyrophosphat bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-C4D) 32

Khảo sát thành phần, pH của dung dịch đệm điện di 32

3.1.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ đệm 38

3.1.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của thế tách 39

3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu và chiều cao bơm mẫu 41

3.1.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của các anion 43

3.1.5 3.2 Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu thực phẩm nhằm xác định TriP và PyroP trong mẫu dạng rắn 45

Khảo sát quy trình xử lý ảnh hưởng của lipid đến độ thu hồi của chất 3.2.1 phân tích 45

3.2.1.1 Tách chất béo bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng 45

3.2.1.2 Thủy phân chất béo bằng dung dịch NaOH 47

3.2.1.3 Đông tụ chất béo ở môi trường nhiệt độ thấp 49

Khảo sát xử lý ảnh hưởng của protein bằng cách sử dụng acid 3.2.2 tricloacetic (TCA) hoặc dùng nhiệt độ để đông tụ protein 50

3.2.2.1 Kết tủa protein bằng TCA 50

3.2.2.2 Đông tụ protein bằng nước nóng ở nhiệt độ 85 độ C 50

Nghiên cứu quy trình xử lý mẫu bằng cách kết hợp đông tụ chất béo và 3.2.3 protein bằng nhiệt độ 51

3.2.3.1 Khảo sát thời gian rung siêu âm 51

3.2.3.2 Khảo sát thời gian ngâm nước nóng 52

3.2.3.3 Khảo sát khối lượng mẫu 53

3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 56

Xây dựng đường chuẩn 56

3.3.1 Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 58

3.3.2 3.3.2.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị (IDL và IQL)58 3.3.2.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp (MDL và MQL) 58

Đánh giá độ lặp lại của thiết bị 59

3.3.3 Đánh giá độ chính xác của phương pháp 59

3.3.4 3.3.4.1 Độ lặp lại của phương pháp 59

3.3.4.2 Độ thu hồi của phương pháp 60

3.4 Phân tích mẫu thực tế 61

Phân tích mẫu dạng lỏng (mẫu sữa) 61

3.4.1 Phân tích một số mẫu thực phẩm dạng rắn 62

3.4.2 KẾT LUẬN 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên

viết tắt Tên đầy đủ tiếng Anh Tên đầy đủ tiếng Việt

C4D Capacitvely couple contacless

conductivity detector

Detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện

CE Capillary electrophoresis Phương pháp điện di mao quản

EOF Electroomostic flow Dòng điện di thẩm thấu

TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

Leff L-effective Chiều dài hiệu dụng của mao quản

LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng

IDL Instrument detection limit Giới hạn phát hiện của thiết bị

IQL Instrument quantitation limit Giới hạn định lượng của thiết bị

MDL Method detection limit Giới hạn phát hiện của phương pháp MQL Method quantitation limit Giới hạn định lượng của phương pháp ppm Part per million Parts per million: phần triệu

RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối

SD Standard deviation Độ lệch chuẩn

TriP Tripolyphosphate Tripolyphosphat

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Một số loại polyphosphat thường được sử dụng hiện nay 6

Bảng 1.2 Thông tin chung về pyrophosphat và tripolyphosphat 10

Bảng 1.3 Một số quy trình xử lý mẫu thực phẩm nhằm xác định polyphosphat 16

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của thành phần và pH dung dịch đệm đến tín hiệu phân tích 33 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát sự phụ thuộc của chiều cao pic vào nồng độ L-Arginin 39

Bảng 3.3 Điều kiện tối ưu đã khảo sát nhằm xác định đồng thời tripolyphosphat, pyrophosphat bằng phương pháp CE-C4 D 43

Bảng 3.4 Ảnh hưởng củaCl-, NO3-, SO42- đến tín hiệu chất phân tích 44

Bảng 3.5 Hiệu suất thu hồi của chất phân tích khi sử dụng phương pháp chiết lỏng – lỏng 46

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ thu hồi mẫu giò khi sử dụng nước nóng 51

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của khối lượng mẫu 54

Bảng 3.8 Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ tripolyphosphat, pyrophosphat 56 Bảng 3.9 Phương trình hồi quy đường chuẩn của tripolyphosphat, pyrophosphat 57 Bảng 3.10 Xác định giới hạn phát hiện của tripolyphosphat và pyrophosphat bằng phương pháp CE-C4 D 58

Bảng 3.11 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp 59

Bảng 3.12 Độ lặp lại của các TriP và PyroP tại nồng độ 40ppm, 80ppm, 100ppm 59 Bảng 3.13 Độ lặp lại của phương pháp trên nền mẫu giò và xúc xích Vissan 60

Bảng 3.14 Độ thu hồi chất phân tích trên nền mẫu giò lụa 60

Bảng 3.15 Kết quả phân tích mẫu sữa 62

Bảng 3.16 Kết quả phân tích một số mẫu thực phẩm 63

Bảng 3.17 Kết quả phân tích đối chứng 64

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc chung của polyphosphat 5

Hình 1.2 Cấu trúc của nhóm PO43- 6

Hình 1.3 Cấu trúc của natri tripolyphosphat 6

Hình 1.4 Sơ đồ cấu tạo của một hệ thiết bị phân tích điện di mao quản 18

Hình 1.5 Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản 19

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình phân tích mẫu dạng lỏng 23

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu được sử dụng để nghiên cứu 25

Hình 2.3 Sơ đồ các nguồn không đảm bảo đo 28

Hình 2.4 Hệ thiết bị điện di mao quản CE-C4D tự chế, bán tự động 31

Hình 3.1 Điện di đồ sự ảnh hưởng của dung dịch đệm điện di Arg/ace tại các pH khác nhau từ 4,0 đến 7,0 35

Hình 3.2 Điện di đồ sự ảnh hưởng của dung dịch đệm điện di Arg/asc tại các pH khác nhau từ 4,0 đến 7,0 35

Hình 3.3 Điện di đồ sự ảnh hưởng của dung dịch đệm điện di His/ace tại các pH khác nhau từ 4,0 đến 7,0 36

Hình 3.4 Điện di đồ sự ảnh hưởng của dung dịch đệm điện di His/asc tại các pH khác nhau từ 4,0 đến 7,0 36

Hình 3.5 Điện di đồ phân tích TriP và PyroP tại pH = 5,0 với các thành phần dung dịch đệm khác nhau 37

Hình 3.6 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ dung dịch L-Arginin đến tín hiệu phân tích TriP và PyroP (1:20mM, 2:15mM, 3:10mM, 4:7,0mM) 38

Hình 3.7 Điện di đồ ảnh hưởng của thế tách đến thời gian di chuyển và độ phân giải của hai chất phân tích 40

Hình 3.8 Sự phụ thuộc của thời gian di chuyển của TriP và PyroP vào thế tách 40

Hình 3.9 Ảnh hưởng của chiều cao bơm mẫu đến diện tích của chất phân tích 42

Hình 3.10 Ảnh hưởng của thời gian bơm mẫu đến diện tích pic của chất phân tích 42

Hình 3.11 Điện di đồ khảo sát ảnh hưởng của Cl-, NO3-, SO42- 44

Hình 3.12 Điện di đồ kết quả khảo sát dung môi chiết tách chất béo 47

Hình 3.13 Điện di đồ mẫu giò lụa xử lý bằng NaOH ở các nồng độ khác nhau 48

Hình 3.14 Điện di đồ mẫu giò xử lý bằng NaOH 0,5M 48

Hình 3.15 Điện di đồ mẫu giò xử lý làm đông chất béo bằng nhiệt độ thấp 49

Hình 3.16 Điện di đồ mẫu giò sử dụng TCA 0,2% để kết tủa protein 50

Hình 3.17 Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào thời gian rung siêu âm 52

Hình 3.18 Sự phụ thuộc của hiệu suất thu hồi vào thời gian ngâm nước nóng 53

Hình 3.19 Điện di đồ mẫu giò lụa với khối lượng cân khác nhau 54

Hình 3.20 Quy trình xử lý mẫu tối ưu 55

Hình 3.21 Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ TriP 56

Hình 3.22 Đường chuẩn biểu diễn sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ PyroP 57 Hình 3.23 Điện di đồ mẫu sữa Yomost vị dâu tây 61

Hình 3.24 Điện di đồ mẫu sữa Yomost vị cam 61

1

LỜI MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây, sự phát triển của nền kinh tế, khoa học kĩ thuật đã tạo tiền đề cho sự ra đời của nhiều sản phẩm mới phục vụ tốt hơn cho cuộc sống con người và vấn đề chất lượng cuộc sống nói chung cũng như sức khỏe con người nói riêng cũng ngày càng được quan tâm nhiều hơn Vì thế, vệ sinh an toàn thực phẩm luôn là vấn đề nhức nhối và nhận được sự quan tâm từ toàn thể xã hội Trong quá trình sản xuất ra sản phẩm đáp ứng nhu cầu đa dạng của người tiêu dùng thì các nhà sản xuất đã sử dụng nhiều loại phụ gia thực phẩm khác nhau, mà các loại phụ gia này có thể ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng nếu không thực hiện đúng quy định trong sử dụng Chính vì vậy, việc nghiên cứu, xây dựng, phát triển các quy trình phân tích, kiểm tra đánh giá việc sử dụng các loại hóa chất đặc biệt là phụ gia thực phẩm là vấn đề rất cần thiết, đáp ứng nhu cầu thực tế

Polyphosphat là một trong những loại phụ gia thực phẩm [2], [21] được sử dụng khá phổ biến với vai trò là chất bảo quản, chất điều chỉnh độ acid trong một số loại sữa và nước giải khát có hương vị, chất nhũ hóa, chất giữ ẩm và đặc biệt là được sử dụng thay thế hàn the (chất bị cấm) để tạo độ dai giòn cho sản phẩm chế biến từ thịt như xúc xích, giò chả Tuy nhiên, nếu sử dụng polyphosphat với hàm lượng vượt quá giới hạn cho phép của Bộ y tế có thể ảnh hưởng không tốt đến hoạt động của một số nội tiết tố trong cơ thể cũng như gây nguy cơ cao về bệnh tim mạch Do đó, việc xác định polyphosphat là vấn đề cấp thiết nhằm đảm bảo an toàn cho sức khỏe người tiêu dùng

Hiện nay, việc xác định polyphosphat được thực hiện bởi một số phương pháp như sắc ký ion, sắc ký lớp mỏng, điện di mao quản Trong đó, điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc [35] được biết đến là một phương pháp có nhiều ưu điểm như trang thiết bị nhỏ gọn, thao tác, vận hành đơn giản, chi

phí thấp Vì thế, luận văn thạc sỹ khoa học ―Nghiên cứu xác định hàm lượng polyphosphat trong thực phẩm bằng phương pháp CE-C 4 D‖ được thực hiện với

mục tiêu hướng đến phát triển một phương pháp đơn giản, hiệu quả, không chỉ phù

2

hợp cho việc phân tích hàm lượng polyphosphat trong phòng thí nghiệm mà còn có thể tối ưu hóa thiết bị cho mục đích phân tích hiện trường Đề tài hi vọng sẽ đóng góp một phần nhỏ bé vào việc kiểm soát việc sử dụng polyphosphat nói riêng, phụ gia thực phẩm nói chung cũng như đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng

Như vậy, PGTP không phải là thực phẩm mà nó được thêm vào nhằm đáp ứng yêu cầu nhất định của sản phẩm Việc sử dụng PGTP phải tuân theo quy định hiện hành của các cơ quan chức năng, ở đây là Bộ Y tế

Phân loại phụ gia thực phẩm

1.1.2.

1.1.2.1 Phân loại dựa trên sức khỏe người tiêu dùng

 Loại ―liều lượng sử dụng hàng ngày không hạn chế‖ được qui định đối với các chất mà tính độc hại đã được điều tra nghiên cứu một cách thích đáng, hoặc các tính chất sinh hóa và các giai đoạn chuyển hóa đã được biết một cách tường tận

 Loại ―liều lượng sử dụng hàng ngày có điều kiện‖ được qui định cho một số hóa chất cần thiết để chế biến một số thực phẩm đặc biệt

 Loại ―liều lượng dụng hàng ngày tạm thời‖ được qui định đối với các chất

mà tính chất độc hại chưa được chứng minh chắc chắn, với điều kiện các kết quả nghiên cứu phải được công bố trong một thời gian nhất định Nếu đến thời hạn mà các kết quả nghiên cứu không được trình bày rõ ràng, thì sẽ đình chỉ việc sử dụng các hóa chất này

4

1.1.2.2 Phân loại theo chức năng

Tùy thuộc vào chức năng mà PGTP được chia thành nhiều loại khác nhau: chất điều chỉnh độ chua, chất tạo ngọt, chất bảo quản, chất chống vón cục, chất chống tạo bọt, axit, chất chống oxy hóa, chất độn, chất tạo màu, chất giữ màu, chất tạo nhũ, chất làm cứng, chất xử lí bột, chất tăng hương vị, chất tạo bọt, chất làm ẩm, chất tạo keo, chất làm bóng, chất khí đẩy, chất tạo xốp, chất ổn định, chất làm đặc, [30]

Vai trò của phụ gia thực phẩm

 Giữ được chất lượng toàn vẹn của thực phẩm cho tới khi sử dụng

 Tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm và tăng giá trị thương phẩm trên thị trường

 Kéo dài thời gian sử dụng của thực phẩm

 Đáp ứng một số nhu cầu đặc biệt của người tiêu dùng, ví dụ đường hóa học tạo vị ngọt cho thực phẩm nhưng chúng không hoặc ít sinh năng lượng nên được sử dụng để thay thế đường cho bệnh nhân đái tháo đường và bệnh nhân béo phì

 Duy trì, cải thiện độ đặc, kết cấu và các đặc tính giác quan khác như màu sắc, mùi vị

 Hỗ trợ quá trình đóng gói, vận chuyển, bảo quản thực phẩm

Bên cạnh những lợi ích mà PGTP đem lại thì chúng cũng có những ảnh hưởng không tốt đối với người và súc vật ở một liều nhất định và với liều lượng cao hơn, ngay cả đối với những hóa chất được coi là không độc, chúng cũng gây ra những hậu quả đáng ngại với những triệu chứng không đặc hiệu như cản trở cơ học đường tiêu hóa dạ dày, ruột, thay đổi áp lực thẩm thấu và mất cân bằng dinh dưỡng [30] Vì vậy, các chất PGTP phải nằm trong danh mục cho phép sử dụng và đảm

Trong số các loại phụ gia hiện nay, polyphosphat là nhóm phụ gia được sử dụng khá rộng rãi với vai trò chất tạo phức kim loại, chất điều chỉnh độ acid, chất nhũ hóa, chất làm bóng, chất giữ ẩm, chất tạo xốp, chất ổn định, chất làm dày [2]

1.2 Tổng quan về polyphosphat

Cấu trúc

1.2.1.

Polyphosphat (polyPs) là một trong những loại phụ gia thực phẩm được phép

sử dụng với mã số INS là 452 (INS- International Numbering System - là hệ thống chỉ số đánh số cho mỗi chất phụ gia do CAC xây dựng trong quá trình chế biến, bảo quản thực phẩm)

Polyphosphat có công thức chung là M(n+2)PnO(3n+1) Nó là muối hoặc este hình thành từ các ion PO43- Khi một lượng nhất định các đơn phân tử phosphat đơn giản liên kết với nhau hình thành cấu trúc phức tạp hơn, được gọi là polyphosphat

Hình 1.1 Cấu trúc chung của polyphosphat

Thông thường, trong cấu trúc phân tử của polyPs có nhóm PO43- với cấu trúc

tứ diện; đây là nơi mà bốn nguyên tử oxy được liên kết với một nguyên tử photpho trung tâm (hình 1.2) Các nguyên tử còn lại liên quan đến cấu trúc tổng thể phụ thuộc vào loại phosphat Ví dụ, một phân tử orthophosphat có 3 nguyên tử hydro gắn với ba trong bốn nguyên tử oxy: một trong những nguyên tử oxy có liên kết đôi với photpho và do đó không thể liên kết với các nguyên tử khác Trong khi đó, natri

6

triphosphat gồm có 3 nhóm phosphat kết nối với nhau để tạo thành một chuỗi bằng cách chia sẻ một nguyên tử oxy giữa các nhóm phosphat khác nhau và có 5 nguyên

tử natri tham gia liên kết trong cấu trúc phân tử [21] (hình 1.3)

Hình 1.2 Cấu trúc của nhóm PO 4 3- Hình 1.3 Cấu trúc của natri

tripolyphosphat

Phân loại

1.2.2.

 Phân loại theo cấu trúc phân tử

Tùy thuộc vào độ dài chuỗi phosphat mà polyphosphat đƣợc chia thành nhiều loại khác nhau:

 Orthophosphat: 1 nhóm phosphat

 Pyrophosphat (diphosphat): 2 nhóm phosphat

 Tripolyphosphat: 3 nhóm phosphat

 Polyphosphat: từ 4 nhóm phosphat trở lên

Bảng 1.1 Một số loại polyphosphat thường được sử dụng hiện nay

7

 Phân loại theo cách thức sử dụng trong sản phẩm

 Phosphat đơn: chỉ dùng duy nhất một loại polyphosphat có trong sản phẩm

 Phosphat phối trộn: trong sản phẩm, các loại polyphosphat thường được sử

dụng kết hợp với nhau để tạo ra sản phẩm có chất lượng đồng nhất do mỗi loại polyphosphat có tác dụng, pH, thời gian tác động và khả năng hòa tan khác nhau Phosphat phối trộn thường được chia thành 3 loại: Superbind K70, Superbind P220 (hai loại này gồm tripolyphosphat E151 và polyphosphat E152) và Superbind P270 (là hỗn hợp của pyrophosphat E450, tripolyphosphat E451 và một số thành phần khác như natri erythobat E316, natri glutamat E621 và natri nitrit E250

Tính chất

1.2.3.

Các muối phosphat nói chung không có màu Tất cả muối kiềm của PolyPs đều tan trong nước Trong đó: Kali pyrophosphat tan rất nhiều, 100 g nước có thể hòa tan đến 187,4 g K4P2O7 Tuy nhiên, nhóm muối Kurrol và Maddrell (đại tinh thể phân tử natri polyphosphat) lại không tan trong nước, riêng nhóm muối Kurrol tan được trong dung dịch muối kiềm hóa trị I (trừ muối của K+

)

Các PolyPs tương đối ổn định trong dung dịch nước trung tính Sự thủy phân trong môi trường pH trung tính và nhiệt độ phòng diễn ra rất chậm với thời gian bán hủy của liên kết P-O-P lên tới vài năm [10] vì sự thủy phân của liên kết P-O-P trong chuỗi PolyPs đòi hỏi mức năng lượng đến 10 kcal/mol Khả năng thủy phân của hai loại hợp chất này sẽ tăng lên khi tăng nhiệt độ, giảm pH hoặc cho thêm các chất keo hay các chất điện ly trong dung dịch Các nghiên cứu chỉ ra rằng các hợp chất PolyPs thủy phân tuân theo quy luật nhiệt động, sản phẩm thường là một phân tử orthophosphat và một phosphat dạng vòng

Mỗi loại polyphosphat có ưu và nhược điểm riêng, ví dụ pyrophosphat có khả năng hydrat hóa tốt hơn so với các loại khác nhưng khả năng tạo phức cũng như hòa tan trong dung dịch muối như NaCl không cao bằng các loại polyphosphat mạch dài hơn Do đó, trong thực tế, người ta thường sử dụng hỗn hợp hai hay nhiều loại polyphosphat để thu được hiệu quả mong muốn

 Tác dụng của PolyPs đối với sản phẩm thực phẩm

- Tạo liên kết, thay đổi cấu trúc của protein,

- Tăng khả năng liên kết của lipid với nước tạo cấu trúc săn chắc và độ dai giòn cho thực phẩm

- Điều chỉnh môi trường pH

- Ngăn chặn quá trình oxi hóa giữ màu tươi của thực phẩm

- Làm giãn các sợi cơ qua đó làm thịt mềm hơn, dẻo hơn

- Tạo ra nhiều đạm protein hòa tan gia tăng độ kết dính của sản phẩm

- Tăng khả năng giữ nước của thịt

- Gia tăng hương vị thơm ngon tự nhiên của thực phẩm, ngăn ngừa hình thành các mùi vị lạ do quá trình oxi hóa tạo nên

- Ngăn ngừa vi khuẩn phát triển nên kéo dài thời gian bảo quản

 Một số ứng dụng của polyphosphat

PolyPs có thể được sử trong nhiều ngành công nghiệp chế biến, sản xuất thực phẩm như: chế biến thịt, thủy sản, mì ăn liền, sản xuất bơ sữa, kem, phomat… Tại Việt Nam, polyphosphat được sử dụng thay thế cho hàn the tạo độ dai giòn cho giò chả Ngoài ra, polyphosphat cũng được sử dụng để làm chất giữ ẩm, chất tạo độ acid, chất ổn định và bảo quản trong một số loại thực phẩm khác như: sữa, nem chua, bò viên, mỳ tôm đồng thời cũng được sử dụng trong công nghệ chế biến các loại thịt, thủy hải sản

Ảnh hưởng của polyphosphat đến sức khỏe

1.2.5.

Phosphor là một trong những nguyên tố của sự sống, không một loại tế bào nào có thể tồn tại mà không có nó PolyP là chất điều hòa nồng độ Pi tự do trong tế bào Cho dù tế bào có thể thu giữ nhiều Pi từ môi trường nhưng tất cả các Pi này sẽ được dự trữ ở dạng PolyP và nồng độ Pi trong tế bào luôn giữ ở mức thấp, phù hợp

9

với độ chuyển hóa của nó Khi tình trạng thiếu phosphat xảy ra, PolyP sẽ chuyển ngược lại thành Pi để duy trì nồng độ Pi thích hợp Nồng độ Pi là một yếu tố kiểm soát mạnh mẽ đến các quá trình sinh hóa của tế bào Sự thay đổi nồng độ Pi trong tế bào sẽ điều hòa áp suất thẩm thấu và pH trong tế bào và tế bào sẽ bị ngộ độc nếu lượng Pi tự do trong tế bào quá cao

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hàm lượng polyP quá cao trong tế bào sẽ gây ảnh hưởng xấu tới sức khỏe của con người, cụ thể như: Gây đau bụng, tiêu chảy, suy giảm trí nhớ, nguy cơ đau tim đột quỵ, và bệnh loãng xương do quá trình điều hòa canxi bị can thiệp, tăng sự lão hóa của da và cơ thể [26] Đối với bệnh nhân mắc bệnh thận, việc sử dụng thực phẩm có hàm lượng phosphat cao có nguy cơ đe dọa tính mạng Do đó, việc sử dụng thành phần thực phẩm chứa phosphor cũng như polyphosphat cần được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo sự ổn định của nồng độ Pitrong các tế bào của cơ thể

Vì vậy, việc xác định đồng thời một số loại polyphosphat trong mẫu thực phẩm là vô cùng cần thiết để đảm bảo sức khỏe cho người sử dụng

 Quy định của Bộ y tế [2] về hàm lượng tối đa cho phép của các loại polyphosphat nằm trong khoảng 10÷10000 (mg P/kg) tùy thuộc vào nhóm thực phẩm cụ thể

Giới thiệu chung về các chất phân tích của đề tài

10

Bảng 1.2 Thông tin chung về pyrophosphat và tripolyphosphat

Tên chất Natri pyrophosphat Natri tripolyphosphat

Tính chất: Pyrophosphat có khả năng thủy phân tạo thành orthophosphat, sau phản

ứng tạo ra ion H+ nên pH của dung dịch giảm Khi nhiệt độ tăng thì tốc độ thủy phân tăng, trong dung dịch kiềm tốc độ thủy phân chậm hơn nhiều so với môi trường axit Muối Na4P2O7 là muối thủy phân kém nhất nên nó là muối bền nhất Pyrophosphat tạo phức với ion kim loại, nên nó có khả năng làm mềm nước

cứng [6,8]

11

P2O74- + H2O → 2PO43- + 2H+ (1.1)

Na4P2O7+ Mg2+→ Na2(MgP2O7) + 2Na+ (1.2)

 Tripolyphosphat (E451), P3O105- là anion của axit H5P3O10

Tính chất: khả năng thủy phân tạo thành orthophosphat, pyrophosphat và ion

H+ làm giảm pH dung dịch, tuy nhiên quá trình thủy phân của tripolyphosphat chậm

hơn pyrophosphat [6,10]

2P3O105-+ 2H2O → 3P2O74- + 4H+ (1.3)

P3O105-+ 2H2O → 3PO43- + 4H+ (1.4) Khả năng tạo phức của tripolyphosphat cũng tương tự như pyrophosphat

1.3 Vấn đề sử dụng pyrophosphat, tripolyphosphat trên thế giới và ở Việt Nam

Trên thế giới

1.3.1.

Hiện tại, Ủy ban chuyên gia của FAO/WHO về phụ gia thực phẩm (JECFA)

chưa có nghiên cứu toàn diện về ảnh hưởng của pyrophosphat, tripolyphosphat

trong thực phẩm đối với sức khỏe con người Các chất này được các quốc gia và tổ chức quốc tế cho phép sử dụng với vai trò là chất phụ gia thực phẩm

Tại Việt Nam

1.3.2.

Theo Luật an toàn thực phẩm và Danh mục chất hỗ trợ chế biến thực phẩm ban hành kèm theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19/12/2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm, pyrophosphat, tripolyphosphat sử dụng trong thực phẩm phải đảm bảo độ tinh khiết, đảm bảo an toàn thực phẩm, không chứa các chất độc hại ảnh hưởng đến sức khỏe và đáp ứng các yêu cầu đối với chất hỗ trợ chế biến, phụ gia sử dụng trong chế biến thực phẩm:

(1) Sản phẩm phải được công bố hợp quy hoặc công bố phù hợp quy định về an toàn thực phẩm với cơ quan quản lý nhà nước có thẩm quyền

(2) Sản phẩm phải có nguồn gốc xuất xứ rõ ràng, còn hạn sử dụng

(3) Sử dụng chất hỗ trợ chế biến, phụ gia thực phẩm phải theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất (đúng danh mục, đúng liều lượng, đúng đối tượng thực phẩm…)

12

Cũng như hầu hết các quốc gia và tổ chức quốc tế, Việt Nam cho phép sử dụng pyrophosphat, tripolyphosphat như phụ gia thực phẩm với vai trò là chất tạo phức kim loại, chất điều chỉnh độ acid, chất nhũ hóa, chất làm bóng, chất giữ ẩm, chất tạo xốp, chất ổn định, chất làm dày

1.4 Tổng quan về các phương pháp phân tích

Hiện nay, có nhiều phương pháp khác nhau để định tính và định lượng polyphosphat như: sắc ký ion, sắc ký lớp mỏng, điện di mao quản

Phương pháp sắc ký ion

1.4.1.

Sắc ký ion là kỹ thuật tách và xác định các chất phân tích có tính chất ion dựa trên sự khác nhau về ái lực của chất phân tích với pha tĩnh và pha động

Douglas T Heitkemper cùng các cộng sự [25] đã sử dụng phương pháp này

để xác định đồng thời orthophosphat, pyrophosphat, tripolyphosphat trong mẫu tôm Trong nghiên cứu này, các tác giả đã sử dụng cột anionit Dionex IonPac AS7 với pha động là dung dịch acid nitric 70mM, tốc độ pha động 0,5 mL/phút để tách các chất phân tích Các chất phân tích trong mẫu được phát hiện, định lượng bằng detector UV ở bước sóng 330nm sau khi tiến hành phản ứng với thuốc thử sau cột Dung dịch thuốc thử là hỗn hợp dung dịch Fe(NO3)3 1g/L và HClO4 2% v/v Mẫu tôm được xử lý bằng cách cân 0,5g mẫu đã đồng nhất vào cốc 100mL, thêm 50mL nước cất siêu tinh khiết, lắc trong thời gian 30 phút, sau đó ly tâm và lọc dung dịch bằng màng lọc 0,45 µm trước khi tiến hành chiết pha rắn trên cột C18 Với quy trình phân tích này, giới hạn phát hiện đạt được của các chất orthophosphat, pyrophosphat và tripolyphosphat lần lượt là 0,5; 5,0; 5,0 µg/g, độ lặp lại trong khoảng 0,9÷1,2% và hiệu suất thu hồi từ 85 đến 105% với cả ba chất phân tích

Phương pháp trên cũng được nhóm nghiên cứu của Suparerk Tukkeeree [22] thực hiện trên hệ thiết bị của hãng Thermo với cột trao đổi ion Dionex IonPac AS7

để phân tích triphosphat và các sản phẩm thủy phân của nó Đề tài này có ưu điểm hơn nằm ở hệ thống xử lý mẫu online Sau khi xử lý sơ bộ (nghiền nhỏ, rung siêu

âm và lọc qua màng 0,45 µm), dung dịch mẫu được bơm vào hệ thống IC Mẫu phân tích được bơm vào vòng mẫu, sau đó chảy qua cột HRP Các thành phần mang

13

điện tích âm (anionic), bao gồm phosphat, citrat được đi qua cột, bẫy vào bộ phận làm giàu mẫu còn các thành phần chất béo, protein và các thành phần kỵ nước được giữ lại trên cột Như vậy, các thành phần tạp chất phức tạp trong nền mẫu đã được giữ lại trước khi vào cột phân tích IC, từ đó góp phần bảo vệ, tăng tuổi thọ cột, đồng thời giảm thời gian xử lý mẫu, giảm sai số và hạn chế nhiễm bẩn mẫu Hiệu suất thu hồi thu được nằm trong khoảng từ 96,7÷116 %

Ngoài ra, phương pháp này cũng được nhiều tác giả [15], [24], [ 32], [27] sử dụng trong các nghiên cứu khác của mình Giới hạn phát hiện đạt được tốt nhất là 2,07 μg/L; 16,4 μg/L; 43,6 μg/L lần lượt cho orthophosphat, pyrophosphat và tripolyphosphat

Phương pháp điện di mao quản

1.4.2.

Điện di mao quản là kỹ thuật tách các chất phân tích [3], [5], [4] là ion hoặc không ion nhưng có mối liên hệ chặt chẽ với các ion trong một ống mao quản hẹp đặt trong điện trường, do độ linh động điện di khác nhau, chúng di chuyển với tốc

độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

Phương pháp này với các kỹ thuật phân tích khác nhau như điện di mao quản vùng, điện di mao quản gel, điện di mao quản đẳng tốc độ… đã được sử dụng khá nhiều để xác định polyphoshat trong mẫu thực phẩm

Năm 2011, Aneta Jastrze ˛bska [17] đã nghiên cứu kỹ thuật điện di mao quản đẳng tốc độ (ITP) để xác định đồng thời orthophosphat, pyrophosphat, tripolyphosphat, nitrit và nitrat trong nhiều loại mẫu thực phẩm khác nhau (sản phẩm chế biến từ thịt như: thịt hun khói, thịt đóng hộp, giăm bông, phô mai và các sản phẩm chế biến từ hải sản khác) Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng hai hệ dung dịch chất điện ly: chất điện ly dẫn bao gồm acid clohidric 10 mM + hydroxyethylcellulose 0,02 % và glycerin (pH = 3,0); chất điện ly khóa đuôi là dung dịch acid phosphoric 10mM Giới hạn phát hiện đạt được đối với orthophosphat, pyrophosphat và tripolyphosphat tương ứng là 3,23; 1,11; 0,44 mg/L Kết quả phân tích cho thấy, trong hầu hết các sản phẩm từ thịt và hải sản mà đề tài nghiên cứu đều

cơ chế điện di mao quản vùng

Kỹ thuật điện di mao quản gel cũng được Andrew Lee và cộng sự [16] sử dụng để phân tích hỗn hợp polyphosphat (Pi)n với độ dài chuỗi n>5 Mẫu được xử

lý bằng cách hấp phụ trao đổi anion để loại bỏ loại bỏ các anion trong nền mẫu Dung dịch đệm sử dụng là hỗn hợp Tris 24mM, terephthalic axit 3mM, pH = 8,4 Phương pháp này có thể áp dụng xác định các polyphosphat (Pi)n với độ dài chuỗi lớn (n có thể lên đến 70) và có thể có phân tích đồng thời 20 polyphosphat khác nhau

Một số phương pháp khác

1.4.3.

Bên cạnh các phương pháp phân tích đã nêu trong mục 1.4.1 và 1.4.2, một số

phương pháp khác cũng được sử dụng để định tính và định lượng polyphosphat như phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) [29], phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân (31P-NMR ) [23], [18], phương pháp huỳnh quang phân tử [19], phương pháp pha loãng đồng vị [33] Tuy nhiên phương pháp TLC thì hầu hết chỉ sử dụng để định tính còn phương pháp NMR vẫn được coi là một phương pháp nghiên cứu mà chưa áp dụng thực tế Như vậy, có thể thấy, hiện nay các phương pháp phân tích polyphosphat trong mẫu thực phẩm chưa thực sự phát triển, các nghiên cứu hầu hết đều là phương pháp sắc ký ion và điện di mao quản Mặt khác, hiện nay, phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc đang ngày càng

15

phát triển với ưu điểm là hệ thiết bị nhỏ gọn, thao tác, vận hành đơn giản, chi phí thấp Vì thế, với mục tiêu hướng đến phát triển một phương pháp đơn giản, hiệu quả, không chỉ phù hợp cho việc phân tích hàm lượng polyphosphat trong phòng thí nghiệm mà còn có thể tối ưu hóa thiết bị cho mục đích phân tích hiện trường, phương pháp điện di mao quản với detector độ dẫn không tiếp xúc đã được lựa chọn trong nghiên cứu này

1.5 Các phương pháp xử lý mẫu

Xử lý mẫu là một khâu quan trọng, quyết định lớn đến khả năng chiết tách, thu hồi chất phân tích từ khỏi nền mẫu, từ đó ảnh hưởng đến kết quả cũng như độ chính xác của phương pháp phân tích Tùy thuộc vào nền mẫu và phương pháp phân tích khác nhau mà quy trình xử lý mẫu cũng cần nghiên cứu, khảo sát để có quy trình tối ưu riêng Bảng 1.3 thể hiện thông tin chi tiết của một số quy trình xử mẫu nhằm xác định polyPs trong một số nền mẫu thực phẩm khác nhau tương ứng với từng phương pháp phân tích cụ thể

Thông số đánh giá

Tác giả

LOD TriP (ppm)

LOD PyroP (ppm)

Hiệu suất thu hồi (%)

Cân chính xác 10g cá đông đá (đã đồng nhất) vào cốc 200mL

Thêm 50mL nước deion Chờ 10 phút cho tan hết đá Rung siêu

âm 10 phút, lọc qua màng Whatman Thêm 5mL TCA 20% lọc

kết tủa  Chỉnh pH> 8 bằng NaOH 2M  cho vào bình, định

mức 100mL

Cá tuyết,

Sò điệp

5 5 89,2÷100,2 He Cui

[27]

Cân 0,5g mẫu, thêm 60mL nước deion  Lắc trên máy lắc cơ học

30 phút  Ly tâm  Lọc qua màng 0,2 hoặc 0,45um cho dung

dịch qua cột C18, bỏ 2mL dung dịch đầu cột, thu dung dịch còn lại

(Cột C18 được hoạt hóa bằng 10mL MeOH 10mL H2O)

[25]

Cân 0,2g mẫu vào bình 100mL thêm 99,75 mL H20 deion

thêm 0,25mL KOH 8Mlắc, rung siêu âm 5plọc qua màng

0,45um

Chanita Chantarasukon [22] Cân 4 g mẫu đã đồng nhất; Thêm 40mL nước tinh khiết Lắc

vortex 1 phút ly tâm 5p ở tốc độ 250g, nhiệt độ phòng

Lấy 2mL dd phía trên lọc qua màng 0,2um

Các loại 11,2 14,0 87,9÷99,2

Marco Iammarino [32]

17

Thông tin bảng 1.3 cho thấy có rất nhiều quy trình xử lý mẫu khác nhau đã được áp dụng để xử lý các mẫu thực phẩm phục vụ cho mục đích xác định hàm lượng các polyPs Hầu hết các quy trình đều sử dụng phương pháp lắc hoặc rung siêu âm đễ hỗ trợ cho việc tách chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu Đây là một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, cho độ thu hồi tương đối cao Vì vậy, căn cứ trên các nghiên cứu đã có, phương pháp xử lý mẫu sẽ được nghiên cứu chi tiết trong đề tài này

IC

Cân 5g mẫu đã xay vào bình 100mL  thêm 95mL H20  Lắc

đều  đặt vào bể siêu âm 15p  Lọc qua màng 0,45µm

Cho dd chảy qua cột OnGuard®II RP cartridge (Dionex, P/N

057083) trước khi phân tích

Xúc xích 16,4 43,6 92÷110 Dionex [24]

TLC Cân mẫu đã đồng nhất  Siêu âm  Ly tâm  Thêm TCA để

kết tủa protein  Lọc bỏ kết tủa  Lọc qua màng 0,45um 20 20 -

Panunzio Krzynowek [29]

Đồng nhất với 50mL H20 cất trong bể siêu âm khoảng 30 phút

Làm mát dung dịch  định mức đến vạch  lọc thô  Lọc qua

màng 0,45um

Sản phẩm thịt

Cân 5g mẫu >> thêm 15mL NaOH (0,1 hoặc 1M)  lắc 30 phút

 ly tâm 20p ở tốc độ 15000rpm  chỉnh pH được ổn đinh trên

8 một chút bằng dd đệm (20,5mL HCl 1M + 4,77gNa2B4O7)

Dung dịch chiết được thu vào bình và định mức đến vạch, phân

tích trong vòng 2h sau khi xử lý mẫu

Thịt 0,8 2,69 97,4÷98,3 A Jastrzębska

[14]

để định tính các ion trong quá trình phân tích bằng điện di mao quản Việc phân tích định lượng sẽ dựa trên tín hiệu diện tích pic thu được sau quá trình điện di của các ion tương ứng có trong mẫu phân tích

Gần đây, phương pháp điện di mao quản ngày càng phát triển và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của khoa học, công nghệ, y dược và sinh học Đây là một phương pháp có nhiều ưu điểm như: khả năng tách cao, lượng mẫu và hóa chất tiêu tốn ít, trang thiết bị đơn giản, dễ vận hành, hiệu quả kinh tế cao

Cấu tạo của một hệ CE cơ bản

19

- Trong CE, mao quản thường có đường kính trong (ID) từ 25 đến 150 µm và

có thành dày từ 80÷120 µm còn chiều dài mao quản tùy thuộc vào hỗn hợp chất

mẫu cần phân tích [4]

Lớp điện kép trên thành mao quản và dòng điện di thẩm thấu (EOF):

Trong quá trình điện di, lớp điện kép sát thành mao quản và thế zeta của nó xuất hiện, chúng phụ thuộc vào bề mặt mao quản, thành phần, pH và lực ion của dung dịch pha động [4]

Hình 1.5 Lớp điện tích kép trên bề mặt mao quản

Dòng EOF di chuyển từ cực dương sang cực âm Dưới tác dụng của điện trường, các cation di chuyển cùng chiều với dòng EOF do đó di chuyển nhanh hơn, ngược lại các anion di chuyển ngược chiều với dòng EOF do đó di chuyển chậm hơn còn các phần tử trung hòa không chịu tác động của điện trường nên di chuyển cùng tốc độ với dòng EOF Như vậy, dòng EOF đóng vai trò quan trọng trong việc xác định thời gian tồn tại chất tan ở trong ống mao quản Do đó, phải lựa chọn các điều kiện điện di phù hợp nhất để có tốc độ dòng điện di phù hợp cho quá trình phân tách tín hiệu của hỗn hợp các chất phân tích

 Dung dịch đệm điện di:

Dùng để tạo môi trường cho quá trình điện di xảy ra khi áp thế cao vào hai đầu mao quản Bản chất, thành phần, độ nhớt và giá trị pH của pha động điện di có ảnh hưởng trực tiếp lên bề mặt mao quản từ đó ảnh hưởng đến kết quả của quá trình điện di Trong quá trình điện di, hai đầu mao quản được được đặt trong hai bình chứa dung dịch đệm điện di

 Nguồn điện thế cao:

Thường dao động từ 5 đến 30 kV, dùng để áp vào hai đầu mao quản nhằm sinh ra điện trường lớn cho quá trình điện di xảy ra Để phân tích các cation thì cực

Tùy thuộc vào tính chất hóa học, hóa lý hay vật lý của các chất phân tích sẽ

có các loại detector tương ứng, bao gồm: hấp thụ phân tử (UV-Vis), huỳnh quang phân tử, phát xạ hoặc hấp thụ nguyên tử, khối phổ, điện thế (đo dòng, đo thế, độ dẫn), độ dẫn nhiệt, chỉ số chiết suất của chất [4]

Trong đề tài này, detector được sử dụng là detector đo độ dẫn không tiếp xúc Nguyên tắc của detetor đo độ dẫn là đo liên tục điện trở (trở kháng) của dung dịch bằng một mạch điện sử dụng dòng xoay chiều (AC) Detector này ngoài ưu điểm là phân tích đa năng còn có ưu điểm là không nhất thiết phải có sự tiếp xúc trực tiếp của các điện cực với dung dịch đo nhờ lợi dụng tính chất kết nối tụ điện với dung dịch bên trong mao quản hoặc ống phản ứng Đây là một cách rất thông minh loại trừ ảnh hưởng của điện thế cao trong quá trình phân tách điện di đến hệ điện tử của detector và không làm nhiễm bẩn dung dịch phân tích

 Bộ phận điều khiển:

Thường là máy tính sử dụng phần mềm chuyên dụng phù hợp, để ghi nhận, hiển thị và xử lý kết quả phân tích Hiện nay, bộ phận này còn có thể thực hiện chức năng điều khiển tự động hoá quá trình phân tích từ khâu bơm mẫu đến khâu cho ra kết quả cuối cùng của quá trình phân tích điện di mao quản

Các kỹ thuật bơm mẫu trong CE

+ Kỹ thuật bơm mẫu điện động học:

Kỹ thuật bơm mẫu được sử dụng trong đề tài là thủy động lực học kiểu xiphông Kỹ thuật này có ưu điểm là thao tác đơn giản, không cần sử dụng thiết bị phức tạp, độ lặp lại tương đối tốt

Kết luận chung:

Polyphosphat có nhiều ưu điểm so với các chất phụ gia bảo quản khác và ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất thực phẩm Tuy nhiên việc sử dụng hàm lượng quá giới hạn cho phép sẽ gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người

Vì vậy việc nghiên cứu, phát triển quy trình phân tích polyphosphat là cần thiết Trong những năm gần đây, phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc được biết đến là một phương pháp đơn giản, hiệu quả, chi phí thấp,

có tiềm năng trong việc triển khai tại các cơ sở phân tích địa phương, phân tích tại hiện trường Vì vậy, đề tài này được thực hiện với hi vọng đóng góp một phần nhỏ vào việc phát triển các phương pháp thanh kiểm tra các chỉ tiêu liên quan đến thực phẩm, đặc biệt là polyphosphat nhằm mục tiêu đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm

và sức khỏe người tiêu dùng

22

2 CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

Mục tiêu nghiên cứu

2.1.1.

Luận văn được thực hiện nhằm mục tiêu nghiên cứu xác định hàm lượng polyphosphat (bao gồm pyrophosphat và tripolyphosphat) trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết nối kiểu tụ điện (CE-C4D)

Nội dung nghiên cứu

 Nghiên cứu, khảo sát các điều kiện tối ưu cho quy trình xác định đồng thời pyrophosphat và tripolyphosphat bằng phương pháp CE-C4D

- Khảo sát thành phần dung dịch đệm điện di: thành phần, pH ứng với các nồng độ đệm khác nhau

- Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị điện di: thế tách, thời gian bơm mẫu, chiều cao bơm mẫu,…

- Khảo sát một số chất có thể gây ảnh hưởng đến việc xác định các chất phân tích trong mẫu thực phẩm bằng phương pháp CE-C4D

 Khảo sát quy trình xử lý mẫu xác định polyphosphat trong thực phẩm

 Đánh giá phương pháp nghiên cứu

- Xác định khoảng tuyến tính, xây dựng đường chuẩn

- Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp

- Đánh giá độ chụm, độ đúng của phương pháp phân tích

 Áp dụng phân tích một số mẫu thực phẩm thực tế

23

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp lấy mẫu, bảo quản và xử lý mẫu phân tích

2.2.1.

 Thu thập mẫu

Các mẫu phân tích được thu thập ngẫu nhiên tại một số chợ và siêu thị trên địa bàn thành phố Hà Nội và Quy Nhơn

 Xử lý sơ bộ và bảo quản mẫu

Mẫu phân tích được đồng nhất bằng cách cắt nhỏ, xay nhuyễn bằng máy xay Mẫu sau khi đồng nhất được bảo quản trong trong túi đựng mẫu trong ngăn đá tủ lạnh (nhiệt độ < 0oC) cho đến khi phân tích Đối với các loại thực phẩm như đồ hộp, thực phẩm có độ ẩm thấp hay thực phẩm khó hư hỏng có thể bảo quản ở nhiệt độ phòng cho đến khi phân tích

 Xử lý mẫu trước khi phân tích

 Mẫu dạng lỏng (mẫu sữa)

Dựa trên cơ sở kết quả nghiên cứu trước đây, mẫu dạng lỏng, cụ thể là mẫu

sữa được phân tích theo quy trình xử lý mẫu Hình 2.1 dưới đây

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình phân tích mẫu dạng lỏng

Thêm 5,0 mL nước deion

24

Phương pháp điện di mao quản sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc kết 2.2.2.

nối kiểu tụ điện (CE-C 4 D)

Nguyên tắc: Hai chất phân tích tripolyphosphat và pyrophosphat, trong điều kiện môi trường pH> pKa, chúng tồn tại ở dạng anion do đó có khả năng di chuyển

từ đầu mao quản bơm mẫu (áp điện thế phân cực âm) đi qua vị trí đặt detector dưới tác dụng của lực điện trường và được ghi nhận tín hiệu phụ thuộc vào sự chênh lệch

độ dẫn của chất phân tích với dung dịch đệm (chất nền điện ly) Mỗi ion chất phân tích có điện tích và kích thước khác nhau dẫn tới độ linh động điện di khác nhau

Đó là cơ sở cho quá trình phân tách, định tính cũng như định lượng đồng thời hai ion chất phân tích trong cùng một hỗn hợp dung dịch

Chất phân tích được định tính bằng thời gian di chuyển và nguyên tắc của việc định lượng dựa trên cơ sở mối quan hệ tín hiệu đo của chất phân tích và nồng

độ Cx của nó theo biểu thức:

H = k Cx hoặc A = k Cx Trong đó: H là chiều cao, A là diện tích pic điện di của chất phân tích

Để xác định hàm lượng chất phân tích trong mẫu ta có thể sử dụng phương pháp đường chuẩn hoặc thêm chuẩn dựa trên cơ sở của sự phụ thuộc tuyến tính trên

Phương pháp khảo sát, tối ưu điều kiện phân tích điện di

2.2.3.

Trong phương pháp điện di mao quản, có nhiều yếu tố khác nhau ảnh hưởng đến kết quả của quá trình phân tích bao gồm: thành phần và pH của dung dịch đệm điện di; nồng độ dung dịch đệm, thời gian bơm mẫu, chiều cao bơm mẫu, thế tách, đường kính trong và chiều dài hiệu dụng của mao quản Các điều này sẽ được khảo sát một cách hệ thống, theo phương pháp đơn biến (biến thiên một yếu tố tại một thời điểm)

 Khảo sát ảnh hưởng của thành phần, pH và nồng độ đệm

Đây là các yếu tố quan trọng nhất, quyết định đến dạng tồn tại của chất phân tích và ảnh hưởng đến tính chất của các quá trình xảy ra trong mao quản, từ đó quyết định hiệu quả của quá trình phân tích điện di Để đạt được kết quả phân tích tốt nhất, các hệ dung dịch đệm bao gồm: L-Arginin/acetic, L-Arginin/ascorbic, L-

25

Histidin/acetic, L-Histidin/ascorbic được lựa chọn nghiên cứu với các giá trị pH cách nhau 0,5 đơn vị, nằm trong khoảng 4,0 đến 7,0 Sau khi lựa chọn được thành phần dung dịch và pH dung dịch đệm phù hợp nhất, nồng độ của hợp phần bazơ sẽ được khảo sát tai các giá trị: 7,0; 10,0; 15,0; 20,0 mM

 Khảo sát thế tách, thời gian bơm mẫu, chiều cao bơm mẫu

Cùng với dung dịch đệm, một số yếu tố khác cũng được nghiên cứu, khảo sát tại các giá trị khác nhau, cụ thể: chiều cao bơm mẫu (10cm, 15cm, 20cm); thời gian bơm mẫu (20s; 30s; 40s), thế tách (-10kV; -15kV; -18kV; -20kV)

Phương pháp khảo sát các điều kiện xử lý mẫu

2.2.4.

Mẫu thực phẩm (như giò, chả, xúc xích…) là một trong những nền mẫu tương đối phức tạp, có chứa nhiều thành phần khác nhau như: lipid, protein, các chất phụ gia…[1] Vì vậy, để đạt được hiệu quả phân tích tốt, một số kỹ thuật xử lý mẫu nhằm hạn chế ảnh hưởng của protein và lipid được nghiên cứu chi tiết trên cơ

sở các quy trình phân tích được mô tả trong sơ đồ Hình 2.2 dưới đây

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu được sử dụng để nghiên cứu

Tách loại chất béo bằng chiết lỏng lỏng hoặc thủy phân chất béo bằng NaOH trong thời gian 30 phút

Quy trình 2 Quy trình 1

Đánh giá phương pháp phân tích

2.2.5.

2.2.5.1 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của phương pháp phân tích

 Giới hạn phát hiện (LOD)

Giới hạn phát hiện được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích phát hiện được với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền Giới hạn phát hiện của TriP và PyroP được xác định bằng cách pha loãng dần dung dịch chuẩn có nồng độ 50 ppm, phân tích trên thiết bị điện di mao quản đến khi xác định được nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích trên nền nước deion hoặc trên nền mẫu mà cho tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu (S/N) bằng 3 Khi nồng độ nhỏ nhất đó được xác định trên nền nước deion thì thu được giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL) còn khi thí nghiệm tiến hành trên nền mẫu thì thu được giới hạn phát hiện của phương pháp (MDL)

 Giới hạn định lượng (LOQ)

Thông thường, giá trị LOQ được xác định theo tỉ số tín hiệu/nhiễu (S/N) bằng 10 Giới hạn định lượng của thiết bị (IQL) và giới hạn định lượng của phương pháp (MQL) cũng được phân biệt và xác định tương tự như IDL và MDL [6] Ngoài

ra, giá trị của LOQ còn có thể được xem bằng 10/3 LOD

2.2.5.2 Độ lặp lại của phương pháp

Độ lặp lại (độ chụm) của phương pháp được xác định qua độ lệch chuẩn (SD) và độ lệch chuẩn tương đối (RSD%) Công thức tính SD và RSD% như sau:

SD = √∑( ) (2.1) RSD(%) =

×100 (2.2)

Trong đó :

- Si là diện tích của pic điện di thứ i

- Stblà diện tích trung bình của n lần phân tích

27

- n là số lần phân tích lặp (n =6) Các đại lượng này có thể được tính toán trên phần mềm thống kê Minitab hoặc Origin

Độ lặp lại của phương pháp phân tích được xác định bằng cách tiến hành xử

lý mẫu và phân tích lặp lại một số mẫu thực tế

2.2.5.3 Độ đúng của phương pháp

Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu được chấp nhận Do đó, thước đo độ đúng thường đánh giá qua sai số tương đối hoặc giá trị hiệu suất thu hồi xác định được sau khi thêm chuẩn [6]

Độ thu hồi (H): H ═

× 100 (2.3) Trong đó:

- H là hiệu suất thu hồi (%)

- Ctt: Nồng độ thực tế của mỗi chất phân tích phân tích được

- Clt: Nồng độ lý thuyết của mỗi chất phân tích tính toán từ lượng chuẩn thêm vào

Nếu chất chuẩn thêm vào mẫu từ trước khi xử lý mẫu ta có độ đúng của phương pháp, còn nếu chất chuẩn được thêm vào trước khi bơm vào thiết bị ta có

độ thu hồi của thiết bị

Độ thu hồi của phương pháp phân tích TriP và PyroP được xác định bằng cách thêm chuẩn một lượng chính xác chất phân tích vào nền mẫu giò không chứa hai chất phân tích này

Tính toán kết quả và uớc lượng độ không đảm bảo đo

2.2.6.

 Tính toán kết quả

Hàm lượng chất phân tích trong mẫu được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn và được tính toán kết quả theo công thức 2.4 (với mẫu dạng lỏng), công thức 2.5 (với mẫu dạng rắn) dưới dây

28

Trong đó:

là hàm lượng chất phân tích trong mẫu dạng lỏng (mg/l);

là hàm lượng chất phân tích trong mẫu dạng rắn (µg/g);

là nồng độ thêm chuẩn (mg/l);

là diện tích pic của chất phân tích trong dung dịch đo;

là diện tích pic của chất phân tích trong dung dịch đo sau khi thêm chuẩn một lượng chính xác đã biết ;

K là hệ số pha loãng mẫu (hoặc dung dịch phân tích);

H là hiệu suất thu hồi của quy trình xử lý mẫu (%);

m là khối lượng mẫu (g)

 Ước lượng độ không đảm bảo đo

Độ không đảm bảo đo được xác định theo nguyên tắc của ISO GUM và EURACHEM [12]

 Xác định nguồn không đảm bảo đo

Các nguồn có liên quan đến độ không đảm bảo đo thành phần (còn gọi là độ không đảm bảo chuẩn) được xác định và thể hiện trong hình 2.3

Hình 2.3 Sơ đồ các nguồn không đảm bảo đo

 Xác định độ không đảm bảo thành phần

- Trong nghiên cứu này, với bình định mức cấp A 10 mL có dung sai

±0,2 mL (từ thông tin kỹ thuật được cung cấp), các giá trị phân bố

Thể tích nước Khối lượng mẫu

- Khi độ tinh khiết của chất chuẩn được chứng nhận có độ chính xác ±a, giả định phân bố hình chữ nhật, độ không đảm bảo

 Tính toán độ không đảm bảo chuẩn tổng hợp

Độ không đảm bảo đo chuẩn tổng hợp được ước lượng từ độ không đảm bảo chuẩn thành phần theo lan truyền độ không đảm bảo và được tính theo công thức 2.6

√( ) ( ) ( ) (

) ( )

 Báo cáo kết quả với độ không đảm bảo đo mở rộng

Kết quả hàm lượng chất phân tích trong mẫu (Cmẫu) được báo cáo dưới dạng: