Phân tích đa dạng di truyền một số dòng ngô có hàm lượng protein cao (QPM) bằng chỉ thị SSR

Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn tạo giống ngô .... Trong chọn tạo giống ngô lai nói chung và ngô QPM nói riêng thì việc phân tích đa dạng di truyền tập đoàn dò

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực phấn đấu của bản thân, tôi còn nhận được rất nhiều được sự quan tâm, giúp đỡ và dìu dắt tận tình của các Thầy Cô giáo, cán bộ tại phòng thí nghiệm của Viện Nghiên cứu Ngô

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ths Nguyễn Văn Trường đã dành nhiều thời gian, tâm huyết chỉ bảo, giúp tôi có thêm niềm đam mê với nghiên cứu khoa học

Tôi xin chân thành cản ơn các thầy giáo, cô giáo, cán bộ trong Bộ môn Sinh học, Khoa Sinh - KTNN - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp vừa qua

Tôi cũng xin cảm ơn các cán bộ phòng Công nghệ sinh học thuộc Viện nghiên cứu Ngô đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi có thể hoàn thành khoá luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người luôn bên cạnh động viên, quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận này

Mặc dù đã có nhiều cố gắng để thực hiện khóa luận một cách hoàn chỉnh nhất Song do buổi đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học nên không tránh khỏi những thiếu sót mà bản thân tôi chưa thấy được Tôi rất mong được sự góp ý của quý Thầy, Cô giáo và các bạn để khóa luận được hoàn chỉnh hơn

Tôi xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Ngọc Diệp

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận này hoàn toàn được thực hiện bằng sự nghiên cứu của bản thân dưới sự hướng dẫn của Ths Nguyễn Văn Trường, cán bộ phòng Công nghệ sinh học của Viện nghiên cứu Ngô Trung ương Các hình ảnh, số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực, đã thu được trong quá trình nghiên cứu của mình và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Ngọc Diệp

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC 3

1.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam 3

1.1.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới 3

1.1.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam 3

1.2 Tổng quan về ngô chất lượng protein cao – QPM 5

1.2.1 Khái niệm và hiệu quả sử dụng ngô QPM 5

1.2.2 Tình hình nghiên cứu giống ngô QPM 7

1.3 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn tạo giống ngô 9

1.3.1 Các loại chỉ thị phân tử 9

1.3.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong phân tích di truyền và chọn tạo giống ngô 13

1.3.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống ngô QPM 16

Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Vật liệu 17

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Tách DNA tổng số 20

2.3.2 Chạy phản ứng PCR 21

2.3.3 Điện di sản phẩm PCR 22

2.3.4 Đọc và phân tích số liệu 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 25

3.2 Kết quả khảo sát các chỉ thị SSR trên 30 dòng ngô QPM 26

3.3 Kết quả đánh giá độ thuần di truyền của các dòng ngô nghiên cứu 32

3.4 Kết quả phân tích đa dạng di truyền giữa các dòng ngô 34

3.5 Lựa chọn sơ đồ lai tạo giữa các dòng có thể cho ưu thế lai cao phục vụ công tác chọn tạo giống trên đồng ruộng 38

Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

4.1 Kết luận 40

4.2 Đề nghị 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

PHỤ LỤC 45

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1: Diện tích, năng suất, sản lượng ngô ở Việt Nam giai đoạn 2007 -

2013 5

Bảng 2.1: Dang sách 30 dòng ngô QPM sử dụng trong nghiên cứu 17

Bảng 2.2: Danh sách 29 chỉ thị SSR sử dụng trong nghiên cứu 18

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR 21

Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 22

Bảng 3.1 Kết quả tách chiết DNA của 30 dòng ngô nghiên cứu 25

Bảng 3.2: Hệ số PIC, số băng DNA, số allen xuất hiện trên 29 mồi 27

Bảng 3.3 Tỉ lệ khuyết số liệu (M%) của 29 mồi SSR nghiên cứu 31

Bảng 3.4 Tỉ lệ dị hợp tử (H%) và tỉ lệ khuyết số liệu (M%) của các dòng ngô đánh giá dựa trên 29 chỉ thị SSR 33

Bảng 3.5 Hệ số tương đồng (Jacard) của 30 dòng ngô nghiên cứu dựa trên 29 chỉ thị SSR 36

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 3.1 Ảnh điện di kiểm DNA tổng số của 30 dòng ngô trên gel agarose 0,8% 26 Hình 3.2 Kết quả di sản phẩm PCR mồi umc1304 của 30 dòng ngô trên gel polyacrylamide 4,5% 29 Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR mồi phi101049 của 30 dòng ngô trên gel polyacrylamide 4,5% 29 Hình 3.4 Kết quả điện di sản phẩm PCR mồi phi029 của 30 dòng ngô trên gel polyacrylamide 4,5% 30 Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR mồi phi109188 của 30 dòng ngô trên gel polyacrylamide 4,5% 30 Hình 3.6 Sơ đồ phả hệ của 30 dòng ngô nghiên cứu dựa trên 29 chỉ thị SSR phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 theo phương pháp UPGMA 37

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism

bp Baso pair

cs cộng sự

CTAB Cetyltrimethyl amoniumbromide

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTP Deoxynucleosid triphosphat

PCR Polymerase chain reaction

PIC Polymorphism Imformation Content

QPM High Quality Protein Maize

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

SSR Simple Sequence Repeat

UPGMA Unweighted Pair Group Method using arithmetic

Averages ƢTL Ƣu thế lai

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Ở Việt Nam, ngô được coi là cây trồng quan trọng thứ hai sau cây lúa

và là cây màu quan trọng nhất được trồng ở nhiều vùng sinh thái khác nhau,

đa dạng về mùa vụ gieo trồng và hệ thống canh tác Trong khoảng hai thập niên gần đây, do áp dụng các giống ngô lai vào canh tác nên sản xuất ngô ở nước ta phát triển mạnh cả về diện tích, năng suất và sản lượng Theo số liệu thống kê năm 2013 của Tổng cục Thống kê [35] thì diện tích ngô cả nước là 1172,5 nghìn ha bằng 101,37% so với năm 2012 (1156,6 nghìn ha), năng suất bình quân đạt 44,3 tạ/ha và sản lượng ngô là 5193,5 nghìn tấn, tăng 3,02% về năng suất và 4,42% về sản lượng so với năm 2012

Công tác chọn tạo giống ngô lai của các nhà chọn tạo giống đã đóng góp một phần rất lớn cho sự phát triển của nền sản xuất ngô trong việc tạo ra các giống ngô lai mới có khả năng chống chịu với điều kiện ngoại cảnh bất thuận và sâu bệnh và đặc biệt là có năng suất cao, chất lượng tốt Ngô chất lượng protein cao (QPM - High Quality Protein Maize) nhờ có ưu điểm là hàm lượng và chất lượng protein cao nên chọn tạo giống ngô lai QPM cũng được xác định là một trong những xu hướng mới trong công tác chọn tạo giống ngô của thế giới và Việt Nam Ngô QPM hiện được sử dụng trực tiếp làm lương thực cho người tại các vùng có truyền thống ăn ngô, tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc

Trong chọn tạo giống ngô lai nói chung và ngô QPM nói riêng thì việc phân tích đa dạng di truyền tập đoàn dòng bằng các chỉ thị sinh học phân tử (molecular markers) được coi là phương tiện quan trọng khắc phục các vấn đề khó khăn trong công đoạn đánh giá dòng bằng các phương pháp hình thái và phương pháp phả hệ truyền thống Các nhà chọn tạo giống dựa trên thông tin

đa dạng di truyền có thể nhanh chóng xác định được mối quan hệ di truyền của tập đoàn nguyên liệu, hỗ trợ đắc lực cho việc lai tạo giống trên đồng

ruộng

Ứng dụng chỉ thị phân tử trong trong nghiên cứu và chọn tạo giống ngô tại Viện Nghiên cứu Ngô trong những năm gần đây cũng không ngừng được khai thác và phát triển giúp các nhà tạo giống định hướng cho việc khai thác,

sử dụng các nguồn vật liệu Trong số các chỉ thị sinh học phân tử như RFLP, AFLP, RAPD, SSR… thì chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat) được coi là một trong những chỉ thị có độ tin cậy cao, đánh giá chính xác và đầy đủ các thông tin phả hệ của tập đoàn nghiên cứu Xuất phát từ những lý do trên,

chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân tích đa dạng di truyền một số

dòng ngô có hàm lượng protein cao (QPM) bằng chỉ thị SSR”

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

3.1 Ý nghĩa khoa học

Đánh giá đa dạng di truyền của các nguồn vật liệu ngô QPM, giúp cung cấp số liệu, thông tin khoa học và tạo cơ sở lý luận cho công tác nghiên cứu chọn tạo giống ngô QPM

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả phân tích của đề tài sẽ rút ngắn thời gian đánh giá dòng, giảm bớt khối lượng công việc lai tạo trên đồng ruộng Dựa trên cơ sở đa dạng di truyền của các dòng ngô, các nhà chọn tạo giống có thể chọn ra các dòng ưu

tú phục vụ cho công tác chọn tạo giống ngô có chất lượng protein cao

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC 1.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và Việt Nam

1.1.1 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới

Trong ba loại cây ngũ cốc phổ biến nhất là ngô, lúa mì và lúa nước thì

cây ngô (Zea mays L.) đang đứng đầu về năng suất và sản lượng, đứng thứ hai

về diện tích Nhờ vai trò quan trọng trong nền kinh tế nên sản xuất ngô trên thế giới luôn được quan tâm và ngày càng phát triển Ngô được trồng trên toàn thế giới vào khoảng 155,57 triệu hecta hàng năm với sản lượng 803,69 triệu tấn Ngô chiếm một vị trí quan trọng trong nền kinh tế thế giới và thương mại thực phẩm, thức ăn chăn nuôi và công nghiệp Hàng triệu người trên thế giới đang sử dụng ngô như một thực phẩm chủ yếu và quan trọng do ngô có hàm lượng protein và calo cao (Vasal, 1999) [30]

Mặc dù trong những năm gần đây diện tích trồng ngô trên toàn cầu không tăng mạnh như cuối thế kỷ XX do diện tích canh tác có giới hạn nhưng sản lượng ngô trên thế giới vẫn liên tục tăng trưởng Nguyên nhân chính là do năng suất ngô ngày càng được cải thiện nhờ áp dụng các giống ngô lai và các biện pháp kỹ thuật canh tác tiên tiến vào sản xuất (Vũ Ngọc Quý, 2004) [11] Năm 2001, diện tích trồng ngô trên toàn thế giới là 140,2 triệu hecta với năng suất bình quân là 4,3 tấn/ha đạt tổng sản lượng trên 600 triệu tấn, tỷ lệ diện tích trồng ngô chiếm 20% trong tổng diện tích trồng cây ngũ cốc (Ngô Hữu Tình, 2002) [13] Mức tăng trưởng bình quân hàng năm trong sản xuất ngô trên toàn thế giới giai đoạn 2000 - 2010 về diện tích là 1,8%, năng suất là 2,1% và sản lượng là 4,3% Đến năm 2012, diện tích gieo trồng ngô trên toàn thế giới là 176,9 triệu hecta với năng suất trung bình là 4,94 tấn/ha (giảm so với năm 2011 là 0,4 tấn/ha) và sản lượng đạt trên 875 triệu tấn (Vũ Ngọc Quý, 2014) [11]

1.1.2 Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam

Cùng với sự phát triển của thế giới, việc phát triển sản xuất ngô ở Việt

Nam trong vài thập kỷ gần đây cũng đã thu được những kết quả quan trọng do

có những chính sách khuyến khích của Nhà nước và việc áp dụng thành công những tiến bộ khoa học kỹ thuật về giống, kỹ thuật canh tác vào sản xuất nên cây ngô đã có những bước tiến mạnh về diện tích, năng suất và sản lượng

Năng suất ngô Việt Nam đến cuối những năm 1970 chỉ đạt 10 tạ/ha do trồng các giống ngô địa phương với kỹ thuật canh tác lạc hậu Từ giữa những năm 1980, nhờ hợp tác với CIMMYT, nhiều giống ngô cải tiến đã được trồng

ở nước ta, góp phần đưa năng suất lên gần 15 tạ/ha vào đầu những năm 1990 (Nguyễn Văn Ba, 2013) [1] Tuy nhiên, ngành sản xuất ngô nước ta thực sự

có những bước tiến nhảy vọt là từ đầu những năm 1990 đến nay, gắn liền với việc mở rộng giống lai và cải thiện các biện pháp kỹ thuật canh tác Năm

1991, diện tích trồng giống lai chưa đến 1% trên hơn 400 nghìn hecta trồng ngô thì đến năm 2007 giống lai đã chiếm khoảng 95% trong số hơn 1 triệu hecta Năm 1994, sản lượng ngô Việt Nam vượt ngưỡng 1 triệu tấn, năm 2000 vượt ngưỡng 2 triệu tấn và năm 2007 có diện tích, năng suất, sản lượng đạt cao: diện tích 1.096,1 nghìn ha, năng suất 39,3 tạ/ha, sản lượng vượt ngưỡng

4 triệu tấn và đến năm 2013, với diện tích trồng ngô 1172,5 nghìn ha, năng suất đạt 44,3 tạ/ha và sản lượng vượt ngưỡng 5 triệu tấn (bảng 1) Các giống ngô lai như LVN10, LVN4, LVN99 đã trở thành giống ngô chủ lực trong sản xuất ngô của Việt Nam Những thành công của chương trình ngô lai đã góp phần quan trọng trong việc đưa năng suất ngô trung bình cả nước năm

2013 đạt cao nhất từ trước tới nay 44,3 tạ/ha, rút ngắn khoảng cách với năng suất ngô trung bình của thế giới là 55,2 tạ/ha (FAOSTART, 2015) [34]

Bảng 1.1: Diện tích, năng suất, sản lượng ngô ở Việt Nam giai đoạn 2007 -

2013

Năm 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 Diện tích

(nghìn ha) 1.096,1 1.140,2 1.089,2 1.125,7 1.121,3 1.156,6 1.172,5 Năng suất

(tạ/ha) 39,3 40,1 40,1 41,1 43,1 43,0 44,3 Sản lượng

(nghìn tấn) 4.303,2 4.573,1 4.371,7 4.625,7 4.835,6 4.973,6 5.193,5

Nguồn: Tổng cục thống kê [36]

Mặc dù sản xuất ngô trong nước liên tục tăng trưởng về năng suất và sản lượng nhưng hàng năm Việt Nam vẫn phải nhập khẩu một lượng ngô khá lớn nhằm đáp ứng cho nhu cầu ngành công nghiệp thức ăn gia súc Điều đó cho thấy nhu cầu ngô cho tiêu dùng ở nước ta là rất lớn, đòi hỏi các nhà quản

lý phải có chiến lược phát triển sản suất và các nhà tạo giống trong nước nhanh chóng chọn tạo ra các giống ngô lai mới nhằm khai thác triệt để những lợi thế tự nhiên, giúp sản xuất ngô trong nước phát triển đáp ứng nhu cầu tiêu dùng ngày càng tăng

Tuy diện tích và sản lượng ngô tăng liên tục trong những năm qua, nhưng chúng ta vẫn phải nhập khẩu hàng triệu tấn ngô mỗi năm Nếu như năm 2013, cả nước nhập khẩu 2,26 triệu tấn ngô hạt, thì chỉ tính riêng sáu tháng đầu năm 2014 cả nước đã nhập khẩu hơn 2,33 triệu tấn, cao hơn cả năm trước [2]

1.2 Tổng quan về ngô chất lượng protein cao – QPM

1.2.1 Khái niệm và hiệu quả sử dụng ngô QPM

Ngô mang gen opaque-2 là dạng đột biến tự nhiên, đầu tiên phát hiện chưa được coi là QPM (Châu Ngọc Lý, 2012) [8] Thể đột biến ở dạng đồng hợp tử lặn cho kết quả chất lượng lizin và trytophan cao Trong khi ở ngô

không mang gen opaque-2, hàm lượng lizin và tryptophan rất thấp Qua nghiên cứu sinh hóa, các nhà khoa kết luận, dạng đột biến opaque-2 là do sinh tổng hợp Zein bị ức chế Đồng thời ngô mang gen opaque lại tăng cường sinh tổng hợp một số protein trong nhóm không Zein, đặc biệt là các protein có chứa lizin (Châu Ngọc Lý, 2012) [8] Tuy nhiên ngô QPM lại bộc lộ một số nhược điểm như khả năng chịu các bệnh kém, tỉ lệ hạt thấp, năng suất chưa vượt trội so với các giống ngô thường, do vậy phạm vi ứng dụng không được

mở rộng Để khắc phục những hạn chế trên, một chương trình cải tạo dòng QPM thế hệ mới được đề cập trên cơ sở chuyển gen opaque-2 từ các dòng ngô thường Giá trị dinh dưỡng thấp của nội nhũ và chất lượng nông học kém của ngô có gen opaque-2 đã được sửa chữa thành ngô có chất lượng protein cao với nội nhũ cứng được nghiên cứu bởi các nhà khoa học của Trung tâm nghiên cứu ngô và lúa mì Quốc tế (CIMMYT) qua chương trình tạo giống (Vasal và cộng sự, 1993; Vasal, 2002; Vivek và cộng sự, 2008) [31], [32], [33] Các nghiên cứu của các nhà khoa học làm tăng hàm lượng gamma Zein trong ngô QPM, góp phần tăng tỉ lệ nội nhũ cứng, trong khi hàm lượng lizin

và tryptophan vẫn tăng gấp đôi so với ngô thường Chất lượng protein của ngô có gen opaque-2 cao hơn ngô thường 43% và giá trị casein là 95% (Mertz, 1964, 1992) [25], [24]

Như vậy, QPM là ngô mang gen lặn o2o2 nhưng đã được sửa chữa một

số đặc tính như: nội nhũ mềm, chống chịu sâu bệnh và các điều kiện bất thuận như hạn, đổ, úng, bị sâu mọt phá hoại nhiều khi bảo quản, nhanh mất sức nảy mầm và năng suất thấp Nhờ sử dụng hệ gen sửa chữa trong quá trình lai truyền gen o2o2 thành công mà các đặc tính trên đã có được như nội nhũ cứng, chống chịu với sâu bệnh và các điều kiện bất thuận tốt hơn, chất lượng hạt ngô thương phẩm tốt, ít bị sâu mọt phá hoại hơn khi bảo quản và nảy mầm tốt như ngô tẻ thường Như vậy, ngô QPM có ưu điểm như ngô tẻ thường về năng suất, khả năng chống chịu nhưng hàm lượng và chất lượng protein cao

hơn, đặc biệt là hàm lượng lizin và tryptophan cao gấp đôi ngô thường

Graham và cộng sự (1989) đã kết luận ngô QPM khi được sử dụng là nguồn protein duy nhất cung cấp 60% năng lượng trong khẩu phần ăn của trẻ

em [20] Clark và cộng sự (1977) chứng minh rằng ngô mang cặp allen o2o2 cũng cung cấp protein chất lượng trong khẩu phần ăn của thanh niên [18]

Ngoài việc sử dụng làm lương thực cho người, khi dùng ngô QPM làm thức ăn cho gia súc, gia cầm cũng có những tác dụng rõ rệt Nghiên cứu của Gevers đã chỉ ra rằng khi sử dụng ngô có hàm lượng lizin cao trong các thí nghiệm về khẩu phần thức ăn cho lợn có thể tiết kiệm được 22% bột cá Hiệu quả sử dụng của ngô QPM đối với chăn nuôi được thể hiện ở tốc độ tăng trọng của lợn khi dùng ngô QPM cao gấp 2 lần so với dùng ngô thường đơn thuần (không bổ sung bất cứ loại đạm nào) Chỉ cần dùng ngô QPM chăn nuôi lợn đã đủ lượng axit amin cần thiết cho lợn, không cần thêm lượng lizin tổng hợp (trích theo Châu Ngọc Lý, 2012) [8]

Tại Việt Nam, những nghiên cứu của Đỗ Thị Lan Phương (2003) [10]

và Phạm Công Thiếu và cộng sự (2003) [12] đã kết luận ngô HQ2000 (QPM)

có hàm lượng nước và chất khoáng tương đương với ngô tẻ thường, hàm lượng protein cao hơn ngô thường từ 2,46 – 2,66%, đặc biệt trong thành phần nội nhũ ở ngô HQ2000 có axit amin tổng số là 4,07%, riêng tryptophan là 0,86%, trong khi ở ngô thường có tỷ lệ tương ứng là 2,9% và 0,5%

1.2.2 Tình hình nghiên cứu giống ngô QPM

Chọn tạo giống ngô lai chất lượng protein cao (QPM - High Quality Protein Maize) là một trong những xu hướng mới trong công tác chọn tạo giống ngô không những của thế giới mà còn là xu hướng của Việt Nam Nhờ

ưu điểm có hàm lượng và chất lượng protein cao, ngô QPM hiện được sử dụng trực tiếp làm lương thực cho người tại các vùng có truyền thống ăn ngô, tăng giá trị dinh dưỡng của thức ăn gia súc Ngô QPM hiện đang được hơn 20 quốc gia trên thế giới gieo trồng Ở châu Á một số nước có chương trình tạo

giống ngô QPM phát triển như Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam, Indonesia

Tại Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp Ấn Độ (Indian Center for Agricultural Research - ICAR), chọn giống bằng chỉ thị phân tử đã được áp dụng để cải tiến phẩm chất protein của giống Vivek Hybrid 9 Vivek Hybrid 9

đã được phát triển và cho thấy năng suất vượt trội hơn giống bố mẹ ở các bang thuộc vùng Himalayan (58 tạ/ha), ở vùng bán đảo Ấn Độ (54 tạ/ha) Hơn nữa, giống Vivek Hybrid 9 có phẩm chất tốt hơn với hàm lượng lysine cao hơn 30% và hàm lượng tryptophan cao hơn 44%

Chương trình chọn tạo giống ngô QPM ở Trung Quốc là một trong những chương trình mạnh nhất ở châu Á, một số giống thụ phấn tự do và giống lai đã được tạo ra như Zhongdan 206, Zhongdan 3850, Zhongdan 3710 đang được trồng ở phía Bắc Cho đến nay diện tích ngô QPM tại Trung Quốc

đã mở rộng đến hàng trăng ngàn hecta Kế hoạch sẽ mở rộng diện tích ngô QPM đến 30% diện tích ngô của Trung Quốc vào năm 2020 (Gill, 2008) [19]

Chương trình nghiên cứu chọn tạo giống và phát triển ngô QPM của Việt Nam đã được triển khai có hiệu quả từ năm 1999 khi Viện Nghiên cứu Ngô hợp tác với CIMMYT và nhập nội một số nguyên liệu QPM và lai tạo thành công giống lai đơn HQ2000 và đưa vào thử nghiệm sản xuất Giống HQ2000 mang nhiều đặc điểm nông học quý như chống đổ tốt, sạch sâu bệnh, tiềm năng năng suất cao, đặc biệt có hàm lượng protein cao

Diện tích ngô lai HQ2000 nhanh chóng phát triển khi đưa giống vào sản xuất, năm 2001 đạt 1.200 ha trên toàn quốc và trên 6.500 ha năm 2003 Tuy nhiên, thực tế sản xuất cho thấy bên cạnh những đặc tính tốt của giống thì HQ2000 vẫn tồn tại một số yếu điểm như tỷ lệ thối bắp cao, chín chậm trong

vụ đông, tỷ lệ hạt/bắp thấp, nhanh bị sâu mọt trong quá trình bảo quản Để khắc phục nhược điểm của giống ngô QPM nói chung và giống HQ2000 nói riêng, một chương trình tạo dòng QPM thế hệ mới đã được các nhà khoa học Viện Nghiên cứu Ngô khởi động và cho đến nay đã tạo mới được hơn 50

dòng QPM mới bổ sung vào chương trình tạo giống ngô có hàm lượng và chất lượng protein cao tại Việt Nam (Châu Ngọc Lý, 2008) [9]

Kết quả khảo nghiệm 6 giống QPM với 2 đối chứng Q2 (giống ngô thường) và HQ2000 (giống QPM) tại Thái Nguyên trong vụ Xuân và Thu Đông (2004 - 2005) đã chọn được giống QP4 khá đồng đều và ổn định qua 4

vụ thí nghiệm, có thời gian sinh trưởng trung bình, thấp cây, chống chịu sâu bệnh khá, cho năng suất ổn định và cao tương đương đối chứng Q2 và HQ2000 (đạt 53,7 tạ/ha trong vụ Xuân và 63,3 tạ/ha trong vụ Thu Đông) Đặc biệt, hàm lượng protein đạt 11,06% tương đương HQ2000 (11,05%) và cao hơn hẳn Q2 (8,65%) Hàm lượng lysine trong protein đạt 3,98% cao hơn so với Q2 và tương đương HQ2000 (2,50 và 3,98%); methionine trong protein đạt 3% cao hơn so với Q2 và tương đương HQ2000 (1,92 và 3,01%) (Trần Trung Kiên, 2009) [7]

1.3 Chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền và chọn tạo giống ngô

1.3.1 Các loại chỉ thị phân tử

Đa dạng di truyền là sự đa dạng về thành phần kiểu gen giữa các cá thể trong cùng một loài và giữa các loài khác nhau, sự đa dạng về gen có thể di truyền được trong một quần thể hoặc giữa các quần thể với nhau Nghiên cứu

đa dạng di truyền cho biết mức độ đa dạng của các tập đoàn cây trồng Đặc biệt nghiên cứu đa dạng di truyền có thể dự đoán khả năng cho ưu thế lai giữa các cặp bố mẹ bằng cách cho lai các cặp bố mẹ có khoảng cách di truyền xa nhau

Đa dạng di truyền giữa các nguồn vật liệu có thể được đánh giá thông qua việc xác định khoảng cách di truyền giữa chúng và dựa trên cơ sở dữ liệu phả hệ, chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử hay chỉ thị DNA

Các chỉ thị phân tử DNA có thể chia làm hai nhóm:

+ Chỉ thị phân tử dựa trên cơ sở lai DNA hay chỉ thị RFLP

+ Các chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kĩ thuật PCR như RAPD, AFLP, SSR, STS…

1.3.1.1 Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)

Kỹ thuật sử dụng chỉ thị RFLP là kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên điểm cắt các enzym giới hạn (Restriction Enzyme, RE) Khi ủ DNA với enzym giới hạn trong dung dịch đệm ở pH, nhiệt độ thích hợp sẽ tạo ra những phân đoạn DNA với kích thước khác nhau, từ đó lập nên các bản đồ gen Kỹ thuật này được sử dụng phổ biến từ thập niên 80 đến nay

Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên độ đặc hiệu của các enzym cắt giới hạn đối với vị trí nhận biết của chúng trên DNA bộ gen Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau

Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng hợp trội, nghĩa là có khả năng biển hiện tất

cả các allen của cùng một locus gen Do vậy có thể phân biệt được các cá thể đồng hợp tử và các cá thể dị hợp tử Đây là ưu điểm của loại chỉ thị này Hạn chế của phương pháp này là tốn nhiều thời gian và công sức, đòi hỏi trang thiết bị phòng thí nghiệm, đặc biệt là tiêu hao một lượng lớn DNA mà số lượng đa hình thu được rất ít, thậm chí một số loài còn khó nhận được đa hình

1.3.1.2 Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kĩ thuật PCR

Phản ứng PCR được Kary phát minh ra năm 1985 Phản ứng chuỗi polymerase thường được viết tắt là PCR (Polymerase Chain Reaction) Nhờ vào việc phát hiện ra loại enzym chịu nhiệt (Taq polymerase) được tách từ

loài vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước nóng mà kĩ thuật PCR mới

thật sự được ứng dụng và trở nên phổ biến

Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzym Taq polymerase để khuếch đại một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotide (primer) tương hợp với hai đầu 3’ ở cả hai mạch của DNA mục tiêu (target sequence) Để

primer được gắn vào DNA mục tiêu, trước tiên hai mạch của chuỗi xoắn kép phải được tách ra nhờ nhiệt độ cao, sau đó nhiệt độ giảm xuống để cho primer liên kết vào các mạch DNA mục tiêu theo nguyên tắc bổ sung, cuối cùng phản ứng polymer hoá được thực hiện nhờ DNA polymerase để kéo dài mạch bổ sung ra Đó là một chu kỳ của PCR Phương pháp PCR tạo nên ALP (Amplicon Length Polymorphism) phản ánh DNA có tính đa hình giữa các cá thể, các dòng lai và các giống trên cơ sở điện di Ưu điểm của ALP so với RFLP là kết quả nhanh, giá thành thấp, số lượng DNA ít Tuy nhiên, khuyết điểm của phương pháp này đòi hỏi phải tổng hợp primer và Taq polymerase

 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Kỹ thuật sử dụng chỉ thị RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những đoạn mồi ngắn (khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer Theo nguyên tắc, hai cá thể hoàn toàn giống nhau thì sau khi thực hiện phản ứng RAPD ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn DNA bằng nhau và chiều dài các đoạn DNA tương ứng bằng nhau Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra số lượng

và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD

có thể phát hiện đột biến Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân

tử (marker) trội (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999) [3]

Ưu điểm của kỹ thuật RAPD là đánh giá toàn bộ hệ gen của sinh vật, đem lại tính đa hình cao Phương pháp tiến hành đơn giản, ít tốn kém Tuy nhiên, RAPD cũng có những nhược điểm do mồi không đặc hiệu nên có rất nhiều băng khó phân tích, dẫn đến khi phân tích kết quả rất dễ sai lầm do cách đánh giá khách quan của từng người Nhưng vì ưu điểm dễ tiến hành nên phương pháp này hiện được dùng rất phổ biến trong nghiên cứu cây trồng ở nước ta

 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragments Length Polymorphism)

Kỹ thuật AFLP được hiểu là sự đa dạng của các đoạn DNA được nhân lên có định hướng sau khi bị cắt bởi 2 enzym giới hạn, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR Vos và cộng sự đã phát triển kỹ thuật AFLP vào năm 1995 Kỹ thuật này là một công cụ hữu ích để xác nhận nhiều locus của đa hình DNA mà không cần biết trước thông tin về trình tự DNA của chúng (Michelmore và Meyers, 1998) [26] Phương pháp này có thể đưa ra nhanh chóng một ước lượng độ đa dạng di truyền trong và giữa những quần thể với nhau

Ưu điểm của phương pháp AFLP là tốn ít thời gian, không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen Các mồi sử dụng cũng không cần đặc hiệu loài Vì AFLP tạo ra một lượng lớn thông tin cần phải được phân tích tự động nên cần sự trợ giúp của kĩ thuật máy tính cao Tuy nhiên thì AFLP là một chỉ thị trội, vì vậy không thể phân biệt được cá thể đồng hợp và dị hợp

 Chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats)

Trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân chuẩn có những đoạn DNA bao gồm những đoạn trình tự giống nhau và lặp đi lặp lại nhiều lần gọi là các đoạn trình tự lặp lại Trình tự trong cấu trúc các đoạn lặp lại gọi là đơn vị lặp lại

Có hai loại trình tự lặp lại là: 1) Trình tự lặp lại phân tán và 2) Trình tự lặp lại liền kề (tendem repeat)

Số nucleotide trong một đơn vị lặp lại có thể từ hai đến hàng trăm base Dựa vào số nucleotide trong một đơn vị lặp lại chia ra thành các đoạn chỉ thị sau:

+ Số nucleotide trong một đơn vị lặp lại nhỏ hơn 5 gọi là chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats)

+ Số nucleotide trong một đơn vị lặp lại từ 5 đến 25 gọi là chỉ thị STR

(Short Tendem Repeats)

+ Số nucleotide trong một đơn vị lặp lại lớn hơn 25 gọi là chỉ thị VNTR (Variable Number Tendem Repeats)

Dựa vào hai đầu (vùng sườn) của các đoạn lặp lại có trình tự rất đặc biệt và thống nhất chung cho cùng một đoạn DNA trên gen không phân biệt cá thể trong cùng một loài, nhưng giữa các cá thể trong cùng một loài số lần lặp lại của đơn vị lặp lại là khác nhau Từ đó, thiết kế các cặp mồi đặc hiệu để nhân bản các cặp DNA trên gen chứa các trình tự lặp lại Điện di sản phẩm PCR cho phép phân biệt được sự giống và khác nhau giữa các cá thể trong cùng loài

SSR là công cụ hữu ích trong phân tích hệ gen vì đây là chỉ thị đồng trội có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao SSR được sử dụng nghiên cứu một số tính trạng liên quan đến năng suất, bệnh hại, xác định giới tính, phân tích quan hệ di truyền, lập bản đồ gen Chỉ thị SSR là chỉ thị chính xác và hữu hiệu trong xác định quan hệ di truyền, phân loại thực vật, xây dựng bản

đồ liên kết và chẩn đoán cặp lai cho ưu thế lai Các chỉ thị SSR là chỉ thị tương đối đơn giản, dễ thực hiện và cho kết quả chính xác Tuy nhiên thì chỉ thị SSR có một số nhược điểm như cần nhiều thao tác khi tiến hành, thiết kế mồi cho phản ứng nhân các đoạn SSR phức tạp và thực hiện chỉ thị SSR cũng tương đối tốn kém

1.3.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong phân tích di truyền và chọn tạo giống ngô

Cây ngô là cây giao phấn điển hình, quần thể rất đa dạng và cá thể dị hợp tử về kiểu gen (Prasad và cộng sự, 1998) [28] Sự đa dạng của cây ngô được biểu hiện ở tất cả các tính trạng của cây, bông cờ và bắp Các nghiên cứu cho thấy ngô có mức độ sai khác về mặt di truyền rất lớn trong cùng một quần thể hoặc các quần thể chéo nhau Các nghiên cứu ở mức độ phân tử cũng cho thấy mức độ đa dạng của ngô cao hơn 3 -10 lần so với

những loài thân thảo khác (Buckler và cs, 2001) [17] Các nhà chọn giống đã dựa vào sự đa dạng tự nhiên để lựa chọn các giống loài tốt, từ đó cải tiến nhằm nâng cao chỉ tiêu về số lượng và chất lượng của giống Ở ngô, năng suất hiện tại cao gấp 55 lần so với năng suất của các giống ngô tổ tiên (Buckler và

cs, 2001) [17]

Xây dựng tập đoàn dòng thuần có khả năng kết hợp cao về năng suất,

ổn định chống chịu tốt với điều kiện bất thuận là một trong những mục tiêu của chương trình tạo giống ngô lai Ở ngô, nghiên cứu tính đa hình tập đoàn dòng thuần và đánh giá khả năng chịu hạn là hai hướng được tập trung nhiều nhất Để nghiên cứu tính đa hình di truyền ở ngô, một trong những chỉ thị di truyền được sử dụng rộng rãi là chỉ thị SSR Chỉ thị SSR có khả năng cung cấp đầy đủ thông tin về phả hệ, mức đa hình di truyền, phân nhóm ưu thế lai, khả năng áp dụng tiện lợi và hữu ích (Bùi Mạnh Cường, 2007) [4]

Năm 2003, Bantte và Prasanna [16] sử dụng 43 chỉ thị SSR nằm trên toàn bộ 10 nhiễm sắc thể, với ít nhất ba chỉ thị trên mỗi nhiễm sắc thể, ngoại trừ trong trường hợp nhiễm sắc thể 6 và 10 cho nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn dòng ngô thuần Tổng cộng 117 allen đã được phát hiện trong 36 locus SSR, trung bình 3,25 allen mỗi locus Các giá trị trung bình PIC ước tính trên tất cả các locus SSR đa hình là 0,54 Bảy locus SSR cho giá trị PIC

là 0,70 Giá trị PIC có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố khác nhau như số dòng thuần phân tích, các locus SSR sử dụng và phương pháp sử dụng để phát hiện allen

Năm 2006, Li và cộng sự [22] đã nghiên cứu 46 dòng ngô, trong đó có

22 dòng QPM từ CIMMYT và 24 dòng của Trung Quốc với chỉ thị SSR Mục tiêu của nghiên cứu này là nghiên cứu sự đa dạng di truyền giữa các 46 dòng thuần, đánh giá khoảng cách di truyền giữa các dòng ngô thuần QPM ở vùng cận nhiệt đới và Trung Quốc và ước tính các mối quan hệ di truyền giữa QPM cận nhiệt đới và dòng thuần bình thường Trung Quốc Tác giả sử dụng 64 mồi

SSR để đánh giá đa dạng 46 dòng ngô Giá trị trung bình (0,66) của chỉ số đa hình của mồi (PIC) đối với các locus SSR cung cấp đủ khả năng đánh giá tính

đa dạng di truyền giữa các dòng thuần Hệ số tương đồng di truyền trung bình (GS) của 18 dòng ngô thường của Trung Quốc (0,344) và trong số 6 dòng QPM Trung Quốc (0,486) cao hơn đáng kể (P < 0,01) so với giá trị trung bình

GS trong số 22 dòng QPM của CIMMYT (0,310) Dòng ngô thường Trung Quốc và dòng QPM được coi là có một sự đa dạng di truyền hẹp hơn so với dòng QPM từ CIMMYT

Năm 2012, Krishna và cộng sự [21] đã dùng 48 chỉ thị phân tử để đánh giá sự đa dạng di truyền của 63 dòng QPM phổ biến Trong số 48 dòng thì có

37 dòng cho thấy sự đa hình Tổng cộng có 151 allen đã được xác định từ 37 chỉ thị SSR trong 63 dòng ngô QPM Số lượng trung bình của mỗi allen locus

là 4,08 Số allen biến thiên từ 2 đến 6 Các giá trị PIC dao động từ 0 - 0,75, giá trị trung bình 0,48 Trong nghiên cứu này, tác giả cũng đã chia các dòng thành 2 nhóm lớn để thiết kể tổ hợp lai thích hợp

Năm 2015, Pandey và Hossain [27] đã dùng 75 chỉ thị phân tử SSR để dánh giá đa dạng di truyền ngô QPM Trong nghiên cứu này có tổng số 256 allen đã được phát hiện trên 75 SSR locus Số allen mỗi locus biến thiên từ 2 đến 7, với trung bình là 3,41 allen mỗi locus Các giá trị PIC dao động từ 0,11 đến 0,79 với trung bình là 0,50 Các dị hợp tử quan sát trong số các dấu SSR dao 0,00 - 0,17, với giá trị trung bình là 0,03

Nguyễn Thị Phương Đoài (2003) đã sử dụng chỉ thị SSR để nghiên cứu

đa dạng di truyền và dự đoán ưu thế lai của 30 dòng ngô có nguồn gốc khác nhau Kết quả xác định được khoảng cách di truyền của các dòng ngô nghiên cứu biến động từ 0,47 - 0,86 và được phân thành 3 nhóm ưu thế lai [5]

Phan Xuân Hào và cộng sự (2004) [6] đã sử dụng 41 mồi SSR để phân tích đa dạng di truyền của 88 dòng ngô (51 dòng có nguồn gốc Việt Nam, 1 dòng từ Mỹ và 36 dòng từ CIMMYT) Trong đó có 16 dòng QPM, 6 dòng

tham khảo từ AMBIONET Kết quả xác định được sơ đồ phả hệ giữa các dòng ngô nghiên cứu, phân chia bộ dòng thành 2 nhóm lớn Nghiên cứu cũng kết luận những dòng rút ra từ cùng một nguồn thì đứng gần nhau trong sơ đồ phả hệ, các dòng QPM đứng gần nhau trong nhóm thứ cấp

1.3.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống ngô QPM

Các bản sao và đặc tính của các gen opaque-2 tiếp theo được phát hiện bởi ba mồi SSR (phi057, phi112 và umc1066) trong gen (Lin và cộng sự, 1997) [23], dẫn đến sự khác biệt hiệu quả của gen trội O2 và gen lặn o2 (Bantte và Prasanna, 2003) [16] Mỗi một chỉ thị phân tử đánh dấu có một đặc điểm khác nhau: các chỉ thị umc1066 và phi057 phát hiện được sự có mặt của gen o2 (QPM) và O2 (ngô thường); chỉ thị phi112 chỉ phát hiện được sự có mặt của gen O2 (ngô thường) Nếu nguồn ngô đó là QPM thì sẽ không xuất hiện băng, do đó chỉ thị phi112 phù hợp với các kiểu hình kiểm tra của QPM (Babu và Prasanna, 2014) [15]

Dựa trên cơ sở các chỉ thị sinh học trên, Vergara và Cordova đã áp dụng phương pháp biến đổi ngô thường thành ngô QPM từ năm 2008 tại CIMMYT bằng cách kết hợp phương pháp lai trở lại (backcross) truyền thống

và phương pháp chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử (MAS - Marker Assisted Selection) Phương pháp này giúp các nhà tạo giống không cần định kỹ phân tích sinh hóa đảm bảo lysin và tryptophan ở mỗi thế hệ vì sự có mặt của gen opaque-2 đã được khẳng định bằng các chỉ thị, giúp rút ngắn thời gian cải tạo dòng và tránh sai số khi chọn gen mục tiêu [33] Vì vậy ứng dụng MAS dựa trên chỉ thị SSR để biến đổi ngô thường thành QPM trở nên đơn giản, chính xác và hiệu quả

Chương 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

Vật liệu nghiên cứu là 30 dòng ngô QPM được trồng tại Viện Nghiên cứu Ngô - Đan Phượng - Hà Nội ( bảng 2.1)

Bảng 2.1: Dang sách 30 dòng ngô QPM sử dụng trong nghiên cứu

Nghiên cứu này đã sử dụng 29 cặp mồi SSR (bảng 2.2) do AMBIONET cung cấp các loại hoá chất thiết bị cần thiết khác trong sinh học phân tử

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Tách chiết ADN tổng số của các dòng ngô

- Khảo sát 29 chỉ thị SSR trên 30 dòng ngô QPM, đánh giá hệ số PIC của các mồi

- Đánh giá độ thuần của các dòng ngô

- Phân tích đa dạng di truyền giữa các nguồn vật liệu

- Lựa chọn sơ đồ lai tạo giữa các dòng có thể cho ưu thế lai cao phục vụ công tác chọn tạo giống trên đồng ruộng

STT Tên

dòng

Mã kí hiệu STT

Tên dòng

Mã kí hiệu STT

Tên dòng

Mã kí hiệu

Bảng 2.2: Danh sách 29 chỉ thị SSR sử dụng trong nghiên cứu

Trình

tự lặp lại

Kích thước