NUÔI cấy tế bào ĐỘNG vật IVF

NỘI DUNG THỰC HIỆNPHẦN 1 NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 1 Mục tiêu: loại bỏ những tế bào không mong muốnNuôi cấy sơ cấp 2 Thay môi trường Mục tiêu: Tạo điều kiện tốt nhất cho tế bào tăng tr

MỤC TIÊU VÀ CƠ SỞ LÝ THUYẾT

NỘI DUNG THỰC HIỆN

PHẦN 1 NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG

NỘI DUNG THỰC HIỆN

PHẦN 1 NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG

VẬT

1 (Mục tiêu: loại bỏ những tế bào không mong muốn)Nuôi cấy sơ cấp

2

Thay môi trường

(Mục tiêu: Tạo điều kiện tốt nhất cho tế bào tăng

trưởng)

3 (Mục tiêu: Tăng sinh một lượng lớn tế bào)Nuôi cấy thứ cấp

PHẦN 1 NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG

• Chứa 800-900ml mước cất 2 lần trong

erlen, đặt lên khoấy từ.

3

• Cân các chất theo thứ tự: NaCl : 8,035g,

Na 2 HPO 4 : 2,9461g, KCL : 0,2132g, KH 2 PO 4 : 0,2064g

Chuột Thu đùi Falcon dd 5X Falcon dd 2X - Đĩa petri dd 1X- Loại bỏ mô thịt

Thu xương đùi

và cẳng chân

Thu tuỷ xương vào

becher (kim tiêm + 3ml

Epp 1 giọt microL Trypan BluePha loãng + 10 Buồng đếm

- Trong phòng giết chuột ( thao tác vô

QUÁ TRÌNH THU HỖN HỢP TẾ BÀO

TỪ TUỶ XƯƠNG CHUỘT

NUÔI CẤY SƠ CẤP

• Pha loãng: (đơn vị µl)

Thu 10 vào buồng

KẾT QUẢ ĐẾM TẾ BÀO

NUÔI CẤY SƠ CẤP

Vì nhóm thu tuỷ xương chuột từ 2 đùi, do đó số lượng tế bào khá dày đặc, cần pha loãng 40 lần để thực hiện đếm

tế bào

Số lượng tế bào từng ô đếm như sau:

=> Trung bình cho 5 ô đếm: 33 tế bào

Tế bào tiểu cầu

Tế bào hồng cầu

2709 Hồng cầu

15-20 μm Hình tròn hoặc bầu dục Không đếm được Bạch cầu( Chọn tế bào

lympho) 2–3 µm Không có nhân tế bào, đĩa

2 mặt lồi, 158 Tiểu cầu25-200 µm( Mỡ trắng)

60 µm

(Mỡ nâu)

Giống chiếc nhẫn( mỡ

trắng) Tròn được bao gói nhiều hạt mỡ và ty thể( Mỡ nâu)

TRƯỚC VÀ SAU THAY MÔI TRƯỜNG

THAY MÔI TRƯỜNG

TRƯỚC THAY MÔI

Việc rửa môi trường chưa được sạch, do đó sau thay môi trường vẫn còn nhiều tế bào không bám dính.

TRƯỚC VÀ SAU THAY MÔI TRƯỜNG

THAY MÔI TRƯỜNG

• Màu môi trường trước khi thay môi trường: Hồng

• Màu môi trường sau khi thay môi trường: Cam

Có sự thay đổi màu trong môi trường là do tế bào trong quá trình tăng trưởng, sử dụng các chất trong môi

trường và thải ra các chất thải, làm thay đổi thành phần các chất trong môi trường so với ban đầu nên dẫn tới thay đổi màu môi trường

Hút bỏ mt

cũ

Rửa với PBS

Hút bỏ PBS

Thêm Trypsin (1ml) Ủ 3-5p

Thêm mt nuôi (1ml)

Hút ra falcon, ly tâm

Thu cặn

TẾ BÀO UNG THƯ

NUÔI CẤY THỨ CẤP & BẢO QUẢN

-80 0 C

-37 0 C lắc nhẹ 2-3p Tủ

cấy falcon

1ml mt giải đông

Huyền phù đều

Ly tâm 1100 -

1300 rpm/ 5 phút

Thu cặn

1ml mt nuôi

Epp 3 giọt Bình nuôi thêm

KẾT QUẢ ĐẾM TẾ BÀO

GIẢI ĐÔNG

Dịch nuôi cấy tế bào sau khi giải đông, được đem đi đếm tế bào để xác định hiệu suất giải đông.

Kết quả đếm tế bào sau khi pha loãng 2 lần:

Kết quả: vì số lượng tế bào ở ô đếm thứ 5 tăng đột biến so với 4 ô

còn lại, do đó, nhóm chỉ tính kết quả dựa trên 4 ô tương tự nhau.

- Trung bình tổng số tế bào 1 ô: 25 tế bào

- Trung bình số tế bào chết trong 1 ô: 3 tế bào

Suy ra, hiệu suất giải đông bằng: (1-3/25) x 100% = 88%

*về việc tăng ở ô đếm thứ 5, có thể do thao tác nạp mẫu vào buồng đếm có vấn đề, dẫn tới không đồng đều mật độ giữa các ô.

Tế bào bình thường

Tế bào bị vỡ

TẾ BÀO UNG THƯ

ĐÔNG LẠNH VÀ GIẢI ĐÔNG

Chất đông lạnh sử dụng trong thí nghiệm này là DMSO 1% DMSO có khả năng lấy nước ra khỏi tế bào và đi vào tế bào theo

cơ chế cân bằng nồng độ trong và ngoài tế bào DMSO là chất độc, có khả năng gây vỡ tế bào, do đó trong quá trình thao tác cần cho vào từ từ, tránh gây tổn thương tế bào.

Đồng thời, việc giảm nhiệt độ theo trình tự và theo thời gian cụ thể đã được nghiên cứu từ các nhà khoa học trước đó cần được thực hiện nghiêm ngặt để tránh sốc nhiệt tế bào.

Từ 2 điều trên, chúng ta có thể dự đoán được có 2 lý do làm cho hiệu suất của đông lạnh và giải đông không thế được 100%:

- Quá trình cho chất giải đông vào tế bào

- Quá trình thực hiện quy trình chuyển nhiệt khi bảo quản.

Ngoài ra, sự vỡ tế bào cũng có thể do thao tác thực hiện hút nhả quá mạnh.

ĐỀ XUẤT KIẾN NGHỊ

NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Vì giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy sơ cấp, tế bào gốc trung mô tăng sinh rất chậm, do phải bám vào được bình roux Do đó, nhóm đề xuất tăng thêm thời gian thay môi trường khi mật độ tế bào chưa đủ để cấy chuyền Từ

đó, có thể quan sát được kết quả từ đầu đến cuối của thực tập chuyên ngành

Đặt trứng vào vi giọt thụ tinh

50ul

đi đếm

Ủ ở

37 0

GÂY MÊ CHO CHUỘT

IVF

Hút sẵn thuốc mê vào

kim tiêm với lượng 0.1ml

Giữ chuột trên tay, lau cồn tại

vị trí cần tiêm là cơ đùi

Xác định vị trí tiêm là mạch (có màu xanh) tại vị trí cơ đùi

và tiêm cho chuột

Dầu khoáng được dùng để giảm sự thay đổi nồng độ các chất và bảo vệ môi trường khỏi các tác nhân xâm nhiễm

từ bên ngoài Ngoài ra dầu khoáng còn giúp nâng đỡ vi giọt, cố định vi giọt

Dầu khoáng được thu từ nguồn dầu mỏ, lẫn với nhiều tạp chất nên cần được lọc lại nhiều lần

Nguyên tắc lọc trong thí nghiệm này:

1/ Pha dầu khoáng : nước cất theo tỉ lệ thể tích 1:1, lắc đều trong 15 phút vì dầu có khối lượng riêng nhẹ hơn nước và không tan trong nước nên sẽ ở lớp trên

2/ Sau đó dùng xi lanh và màng lọc 0.2µm để lọc

LỌC DẦU KHOÁNG

IVF

Có 2 loại vi giọt: vi giọt nuôi phôi và vi giọt thụ tinh.

Khi tạo vi giọt, phải đảm bảo vi giọt đứng, không bị lan

Sau khi tạo xong vi giọt, cần đem đi ủ ấm để cân bằng hoá lý

TẠO VI GIỌT

IVF

Tinh trùng khi thu từ ống dẫn tinh thì được cho vào dung dịch swim up Theo nguyên tắc, tinh trùng luôn bơi hướng lên, do đó sau khi swim up sẽ thu được lượng tinh trùng tốt ở lớp trên cùng

Tinh trùng sau swim up, ly tâm và hoà vào FertiMed, sẽ hút ra 50µl để đếm tinh trùng

QUÁ TRÌNH SWIM UP VÀ LỰA CHỌN TINH TRÙNG

IVF

Số tinh trùng di động ít, có thể do 2 nguyên nhân sau:

- Quá trình hút nhả tinh trùng mạnh, làm cho tinh trùng bị yếu đi

tới sức sống của tinh trùng

•  

MẬT ĐỘ TINH TRÙNG

IVF

Mật độ tinh trùng cần chuẩn hoá để đảm bảo thụ tinh tốt nhất: 2.5 x 106 tinh trùng/ml

Mật độ tinh trùng đang có: 4.6 x 106 tinh trùng/ml

Hơ pipette trên lửa và kéo nhanh, xiên 1 góc khoảng 45

độ Tạo ống nhỏ, hẹp đủ kích thước 1 tế bào, dài từ 3cm (quá dài sẽ dễ gãy khi thao tác) Dùng đá mài làm nhẵn vị trí bẻ ngắn ống

2-CHUẨN BỊ PIPETTE PASTEUR

IVF

Giao tử cái: Chọn trứng tròn đều, không vỡ, có thể có

cumulus bao quanh, trứng có thể cực rõ ràng

QUÁ TRÌNH THU TRỨNG

IVF

HÌNH ẢNH BUỒNG TRỨNG THU ĐƯỢC

QUÁ TRÌNH THU TRỨNG

IVF

HÌNH ẢNH TÁCH TRỨNG TỪ BUỒNG TRỨNG

TINH TRÙNG VÀ TRỨNG

TRONG VI GIỌT THỤ TINH

IVF

TRỨN G

TINH TRÙNG

HÌNH ẢNH TRỨNG BỊ PHÂN MẢNH KHI THỤ TINH

KHÔNG THÀNH CÔNG

KẾT THÚC QUÁ TRÌNH THỤ TINH

IVF

NHUỘM TẾ BÀO XÁC ĐỊNH SỐNG/CHẾT

IVF

HÌNH ẢNH NHUỘM PI

PI là chất nhuộm dùng để nhận diện tế bào chết PI có kích thước phân

tử lớn, khoảng 668,4 Da, do đó không thể dễ dàng đi qua màng tế bào Đối với tế bào sống, có cơ chế ngăn chặn các chất lạ đi vào màng

tế bào, do đó giúp phân biệt tế bào sống và chết

PI có khả năng liên kết với DNA bằng cách chèn vào giữa

2 base

Nhìn vào hình bên cạnh, ta thấy tế bào bị nhuộm bởi PI, chứng tỏ thụ tinh không thành công Đồng thời, không đều màu trên toàn bộ tế bào, cho thấy rằng có thể nhân tế bào

đã bị phân mảnh.

CHUỘT SAU KHI PHẪU THUẬT

IVF

- Thu được tế bào tuỷ xương chuột

- Thực hiện được các thao tác: nuôi cấy

sơ cấp, thứ cấp, bảo quản

trình thụ tinh không thành công

IVF

KẾT LUẬN

THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH

ĐỀ XUẤT CHUNG

THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH

Mong thầy cô sẽ báo trước cho sinh viên thời gian thực tập chuyên ngành cùng lúc với Văn phòng khoa để sinh viên có sự chủ động sắp xếp thời gian học các môn khác

Do trong lịch của VP khoa gửi về, tụi em được báo học thực tập chuyên ngành vào thời gian 4 – 12/12/2016, do

đó đã đăng ký các môn học khác kết thúc sớm để tránh trùng thực tập và để đảm bảo tiêu chí từng loại môn học khi tốt nghiệp, tuy nhiên lịch vẫn trùng và tụi em phải nghỉ nhiều buổi học khác

Cảm ơn thầy cô

Thank You for your attention!

40