Công nghệ nuôi cấy tế bào động vật invitro thử hoạt tính sinh học của một số chế phẩm tự nhiên và tổng hợp

Mục đích và nội dung nghiên cứu Mục đích: Triển khai nuôi cấy tế bào động vật in vitro mang tính công nghệ để thử nhanh hoạt tính sinh học của các chế phẩm tự nhiên và tổng hợp.. • Thu

I Đ Ạ I HỌC QUÓC G IA H À N Ộ I

E 3

-CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TÉ BÀO ĐỘNG VẬT

IN VITRO Ĩ H ừ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT SỐ■ ■ ■

M Ã SỐ: Q T-05-22

C H Ủ T R Ì Đ È TÀI: P G S TS N G U Y Ễ N TH Ị Q U Ỳ CÁC CÁN B ộ THAM GIA:

f ) T / ' ỹ ỉ : l ~

HÀ NỘI - 2006

CN Bùi Thị Vân Khánh

4 Mục đích và nội dung nghiên cứu

Mục đích:

Triển khai nuôi cấy tế bào động vật in vitro mang tính công nghệ

để thử nhanh hoạt tính sinh học của các chế phẩm tự nhiên và tổng hợp

Nội dung nghiên cứu:

• Phân lập, tách và nhân nuôi tế bào từ mô bệnh ung thư.

• Thu thập, bảo quản một số dòng tế bào trong đông lạnh

• Xác định môỉ trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy thích hợp một số dòng tế bào trong chai nuôi cấy T25 và tấm 96 giếng,

• Xác lập chỉ tiêu và đánh giá hoạt tính sinh học của một số ché phẩm thử có nguồn gốc tự nhiên và tồng hợp

5 Các kết quả đạt được

về m ặt khoa học:

• Đã phân lập được tế bào từ mô ung thư đại trực tràng và duy trì

trong điều kiện in vitro 48h,

• Thu thập, nhân nuôi và bảo quản đông lạnh 6 dòng tế bảo: HeLa, Hep3B, RD, Hep-2, Vero và Sarcoma 180.

• Nuôi cấy tế bào ung thư dòng Sarcoma 180 trong chai T25 và thử hoạt tính kháng u của cisplatin DLTW.I tổng hợp tại Việt nam đã chỉ ra với liều 2(ig/ml ức chế tăng sinh tế bào71,2%

• Nuôi cấy in vitro một số dòng tế bào trong tấm 96 giếng và bằng

phương pháp so màu (colorimetric assay) đã thử hoạt tính sinh học của 8 chế phẩm chiết từ thảo dược của việt nam Trong số đó chế phẩm s c và QK ở liều thấp có tác dụng kích thích sự tăng sinh, còn ờ liều cao lại gây độc cho tế bào dòng RD, Đồng thời

QN có tác dụng ức chế tế bào Hep-2, QK ức chế tế bào Vero và

M6 ức chế tế bào HeLa và Hep3B tăng sinh

• Các kết quả nghiên cứu trên là cơ sờ để nói rằng có thể triển khai

nuôi cấy in vitro các dòng tế bào động vật để thử nhanh hoạt tính

sinh học với một lượng lớn các chất có nguồn gốc tự nhiên và tổng hợp ở Phòng Thí Nghiệm của chúng tôi

Sàn phẩm của đề tài:

• Báo cáo tổng kết đề tài

• 02 bài báo khoa học {Đặc san Ung thư học Quý II-2006, nội dung còn lại sẽ đươc công bố trong 01 bài báo khác

• Các kết quả khác là cơ sở để phát triển công nghệ nuôi cẩy tế bào

động vật in vitro để thử nhanh hoạt tính sinh học của các chế

phẩm tự nhiên và tổng hợp của Việt nam

6 Tình hình kinh phí của đề tài

íS ọ n g kinh p h ilíã chi và thanh quyết tóán : 20.000.000-ýNEỊ.

Phó chủ nhiệm

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

SUBJECT SUMMARY

1 The title o f subject

“Animal cell culture Technology in vitro for estimating

bioactivities of some Natural and synthetic products"

2 Numerical code: QT- 05-22

3 The grant holder: Assoc Prof Dr Nguyen Thi Quy

4 The subject participants:

Assoc Prof Dr Tran Cong Yen

Dr Le Hung MSc Hoang Thi My Nhung BSc Bui Thi Van Khanh

5 The objectives and research contents of the subject

a The objectives

Implementing animal cell culture technologically for quick assay bioactivities of synthetic and natural compounds

b The research contents

Detaching, isolating cell from a cancer tissueCollecting and cryo-reservating somes cell lines for long-termcultivation

To set up an appropriate condition and medium for cultivation of some cell lines in vessels T25 and in 96-well plates

Establishing evaluated parameters and estimating bioactivities

of somes products extracted from medicinal herbs

6 Main results

The cells from the rectal tumor tissue were isolated and

maintained in in vitro condition for 48h.

Six cell lines were collected and preseved in liquid Nitrogen for subject using are H e la , Hep3B, RD, Hep-2, Vero and Sarcoma180

The medium RPMI that is suitated for HeLa, Hep3B and Sarcoma 180, and the MEM that for RD, Hep-2 and Vero cell lines were shown.

Applying the cell-count method directly and using the suspension cell line Sarcoma 180 to estimate anticancer activity of cisplatin DLTW.I, we obtained the result that with the dose o f2 |jg /m l, the cell proliferation was inhibited of 71,2%.Five monolayer cell tines were incubated and grown well in 96- well plates for colorimetric assay to make study bioactivity of eight compounds that extracted from medicinal herbs Among the compounds, s c and QK increased proliferation of RD cell line in low concetration, but these were toxic in high concetration In addition, QN, QK and M6 inhibited proliferation

of Hep-2, N/ero and HeLa and Hep3B respectively

Assoc Prof Dr.Phan Tuan N g h ia , Assoc Prof, Dr NguyenThi Quy

Hanoi University of Science

LỜI CẢM ƠN

Hoàn thành đề tài này chúng tôi xin chân thành cảm ơn Đại học Quốc gia Hà nội đã cấp kinh phí, Ban giám hiệu trường Đại học khoa học Tự nhiên, Ban Khoa học Công nghệ đại học Quốc gia, Phòng Khoa học Công nghệ, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học đã hỗ trợ, tạo mọi điều kiện thuận iợi cho việc thực hiện đề tài

Chúng tôi cũng xin cảm ơn TS Hwan Mook Kim - Viện Nghiên cứu KRIBB (Hàn Quốc), PGS.TS Nguyễn Thị Hiền Thanh - Vệ Sinh dịch tễ Trung Ương đã hỗ trợ cung cấp một số dòng tế bào ung thư và giúp đỡ về

kĩ thuật nuôi cấy, cảm ơn Ban giám đốc Trung tâm Sinh học Phân tử và

Công nghệ tế bào cũng như tập thể cán bộ Phòng Công nghệ tế bào động vật thuộc Trung tâm đã giúp đỡ tạo điều kiện để thực hiện các nghiên cứu quan sát hình ảnh tế bào

Để có đựợc các mẫu chế phẩm sử dụng trong đề tài, chúng tôi đã được Hội đồng Khoa học Sự sống hỗ trợ một phần kinh phí để thu mẫu, tách chiết, phân đoạn và nghiên cứu tính chất hoá lí của chúng Ngoài ra, trong quá trình thực hiện đề tài chúng tôi cũng nhận được sự giúp đỡ của nhiều cán bộ khoa học trong và ngoài Khoa Sinh học, chúng tôi xin chân thành cảm ơn tất cà sự giúp đỡ quý báu đỏ

TẬP THÊ ĐÊ TÀI

Phần báo cáo chính

Các chữ viết tắt:

CNSH Viện Công nghệ Sinh học

DLTW.I Công ty Dược liệu trung ương !

DMEM Dubecco's Modification of Eagle's Medium

KRIBB Korean research Institute of Biosciences and BiotechnologyMEM Eagle’s Minimal Essential Medium

NCI National Cancer Institute

OD Mật độ quang học (optical density)

QN Quả Nhàu (Morinda citrifolia L )

QK Dịch chiết tổng số từ 11 thảo dược khác nhau

RPMI Rosewell Park Memorial Institute

s c Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn)

VSDT Viện Vệ Sinh Dịch tễ Trung ương

5-flu 5- Fluorouracil

1

MỤC LỤC

Mờ đ ầ u 3

Nội dung c h ín h 5

1 N hững nội dung nghiên c ứ u 5

2 Đối tư ợ ng, vật liệu và phương pháp nghiên c ử u 5

2.1 Đ ố i tượng, vật liệu và thiết b ị 5

2.2 P hư ơ ng pháp nghiên c ứ u 6

3 Kết quả nghiên c ứ u 8

3.1 T hu thập, phân lập , tách và nhân nuôi tế b à o 8

3.2 T h ử hoạt tính của các chế phẩm đổi với các dòng tế bào nuôi cấy in v itr o 11

Kết lu ậ n 21

Đề n g h ị 22

Tài liệu tham kh ả o 22

M Ở Đ Ầ U

Nuôi cấy tế bào động vật in vitro đã từ lâu nhằm phục vụ các nghiên

cứu cơ bản, phát hiện nhanh các tip (types) virut gây bệnh, sản xuất vắcxin, tạo mô và cơ quan để điều trị thay thế mô và nội tạng, cũng như thử hoạt tính sinh học của các hợp chất Đặc biệt gần đây, nuôi cấy tế bào động vật không thể thiếu được trong các phòng nghiên cứu sinh học hiện đại nhằm chuyển gen và phát triền một liệu pháp điều trị mới là liệu pháp gen

Việt nam là nước có nguồn tài nguyên động thực vật đa dạng và phong phú, phân bố khắp mọi nơi trên rừng và dưới biển Ần chứa trong W nguồn tài nguyên này rất nhiều hợp chát có hoạt tính sinh học với giá trị sử dụng cao trong đời sống và trong Y Dược chưa được phát hịên và bản chất của chúng còn chưa được làm sáng tỏ

Từ lâu các nhà khoa học Việt nam và cả trên thế giới tập trung nghiên cứu nhằm phát hiện, đánh giá hiệu quả và sàng lọc các chất có hoạt tính sinh học, đặc biệt là các chất có hoạt tính chống ung thư Quy trình phát triển một hợp chất thành dược phẩm theo quan niệm hiện đại cần phải qua

một số giai đoạn: Giai đoạn thử sàng lọc in vitro, thử in vivolcận lâm sàng

và thử lâm sàng Khi có kết quả mới được bào chế thành dược phẩm thương phẩm Trong đó giai đoạn đầu có ý nghĩa rất quan trọng trong định hướng phát triển một chế phẩm thành sàn phầm cụ thể ứng dụng trong thực tiễn Do đỏ nuôi cấy tế bào phục vụ việc thử sàng lọc chế phẩm là rất cần thiết và mang tính thực tiễn cao

Trên thế giới việc ứng dụng nuôi cấy tế bào để thử sàng lọc nhanh các chế phẩm được triển khai từ cuối những năm 1980 và phát triển mạnh trong những năm 1990 [1], Chỉ tính riêng việc sàng lọc thuốc chống ung thư

ở Mỹ, theo Michel Page, hàng năm viện nghiên cứu Ung thư Quốc gia Hoa

kỳ (NCI) đã giành nhiều triệu USD tiến hành sàng lọc tới hơn 10.000 hợp /c h ấ t thử hiệu ứng của mỗi hợp chất với ít nhất 5 liều, trên 60 loại tế bào

ị ung thư khác nhau [6], Một khối lượng công việc đồ sộ như thế không thể nào thực hiện được nếu thiếu công nghệ nuôi cấy tế bào [ 4],

ở Việt nam, nuôi cấy tế bào được thực hiện khá sớm cho nhiều muc đích khác nhau (phát hiện nhanh và phân lập các tip virut, thụ tinh nhân tạo,

sản xuất vacxin ở một số viện nghiên cứu (Viện CNSH, Viện VSDT, Học

3

viện Quân y, bệnh viện Từ Dũ ) ứ ng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thử

hoạt tính sinh học của các chế phẩm, theo chúng tôi được biết trong mươi

năm gần đây, mới triển khai ơ một - hai cơ sở nghiên cứu như Viện Hoá hợp chất tự nhiên [12 ], viện CNSH [13]

Để góp phần phát triển một phương pháp đánh giá nhanh hoạt tính sinh học của các chế phẩm tự nhiên và tồng họp mang tính công nghệ, chúng tôi nhận nhiệm vụ thực hiện đề tài cấp Đại học Quốc gia Hà nội

mang mã số QT 05-22 với tiêu đề "Công nghệ nuôi cấy tế bào động vậ t

irt vitro thử hoạt tính sinh học của một số chế phẩm tự nhiên và tổng

hợp".

NỘI DUNG CHÍNH

1 Những nội dung nghiên cứu

• Phân lập, tách và nhân nuôi tế bào từ mô bệnh ung thư.

• Thu thập, bảo quản một số dòng tế bào trong đông lạnh

• Xác định môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy thích hợp cho một số dòng tế bào trong chai nuôi cấy T25 và tấm 96 giếng

• Xác íập chỉ tiêu và đánh giá hoạt tính sinh học của một số chế phẩm thử có nguồn gốc tự nhiên và tổng hợp

2 Đối tượng, vật liệu và Phương pháp nghiên cứu

2.1 Đối tượng, vật liệu và thiết bị

- Mô bệnh phẩm: Mô ung thư đại trực tràng được Khoa phẫu thuật bệnh viện K cung cấp;

gan ở người

tim người

(có xuất xứ từ PTN chuẩn thức khu vực Tây Thái Bình Dương / TCYTTG) do PTN

Virut đường ruột, Viện VSDT i

TW cung cảp

thanh quản người

- Các, chế phẩm đã thử:

• Cis-pỉatin DLTW.I tổng hợp tại Việt nam do Công ty Dược liệu Trung ương I cung cấp

• s c - là dịch chiết toàn phần từ rễ của cây Sâm Cau (Curculigo

• 05 phân đoạn M3, M5và M6, phân tách từ polyphenol tống

số được chiết từ cây seo gà (Pteris ensiformis Burrn F.)

Ngoài ra, 5-fluorouracil là thuốc điều trị ung thư bán trên thị trường được dùng !àm đối chứng so sánh với các chế phẩm thử

- Môi trường nuôi cấy: RPMI 1640, DMEM, MEM, FBS, dung dịch Hank

và 0,4% Suỉforhodamin B (SRB) của hãng Sigma cung cấp 10mM tris-base và dung dịch 50% TCA mà chúng tôi sử dụng có nguồn gốc

- Máy Microplate reader MultiSkan Therm oLabSystem s của Phần lan

được sử dụng để xác định giá trị mật độ quang học ở bước sóng

540nm trong các giếng nuôi cấy của tấm 96 giếng

2.2 Phương pháp nghiên cứu

- Phân lập, tách rời tế bào bằng phương pháp trypsin hoá theo lanFreshney protocol No 11.5 warm tripsin [7] gồm các bưó'c tóm lượcnhư sau:

• Một mẩu khối mô tươi sau phẫu thuật được cho ngay vào dung dịch Hank Chuyển về PTN trong phích nước đá

• Tiến hành rửa lại nhiều lần trong dd Hank, cắt thành các mẩu nhỏ 2-3mm sau đó chuyển vào ống falcon có chứa 5ml môi trường nuôi cấy chưa bổ sung huyết thanh FBS

• Đẻ cho lắng, gạn đổ môi trư’ờng đi Làm như vậy 2-3 lần

• Chuyển các mẩu mô vào bình tam giác thuỷ tinh đã khử trùng Thêm 20ml trypsin 2,5% và cho viên từ đã khử trùng vảo bình Đậy nắp và đặt bình tam giác lên máy khuấy từ cho khuấy

100v/phút trong 30 phút Thu tế bào rời.

• Lặp lại bước trên vài lần cho đến khi mẩu mô tan hết.

• Dùng buồng đếm tế bào xác định lượng tế bào thu được cũng như kiềm tra tỷ lệ tế bào sống bằng thuốc nhuộm xanh trypan

• Pha loãng huyền dịch tế bào sao cho có mật độ 1Q6TB/ml trong môi trường nuôi cấy đầy đủ, cho 5ml/1 chai T25 rồi nuôi trong tủ

ấm 37 °c , 5% C 0 2 Hai ngày thay môi trường 1 lần, quan sát hình thái, tốc độ m ọc của tế bào

- Bảo quản các dòng tế bào nuôi cấy trong đông lạnh được tiến hành theo các bước thường quy như mô tả chi tiết trong tài liệu chúng tôi

đã công bố [10]

- Phương pháp so màu (colorimetric assay) đánh giá hoạt tính tăng sinh của các dòng tế bào theo Skehan và Monks [ 4, 5 ] và đã được chúng tôi trình bày chi tiết trong công trình [8] Một cách tóm tắt phương pháp này được tiến hành qua các bước sau:

• Nạp tể bào vào tấm nuôi cẩy, ủ 24h cho tế bào ổn định

• Cố định tế bào trong tấm nuôi cấy bằng dd 10% TCA - Tấm này dùng làm đối chứng không thử với thuốc ở vào thời điểm bắt đầu thử chế phẩm (tấm Tz)

• ủ chế phẩm thử với tế bào trong các tấm nuôi cấy thí nghiệm (tấm T), nuôi tiếp 48h, sau đó cố định tế bào như đã làm với tấm Tz

• Nhuộm màu enzym protein của tế bào với dd 0,4% SRB

• Thôi màu thuốc nhuộm bằng dd 10mM tris base

• Đo mật độ quang học

• Tính toán số liệu và đánh giá kết quả

Dựa vào giá trị mật độ quang hoc xác định % tỷ số tăng sinh (A%) của tế bào theo công thức:

7

rjn rp

A% = (xioo%) Vh-Tz

Tz - giá trị mật độ quang học trung bình của các giếng trong tấm Tz

T - giá trị mật độ quang học trung bình của các giếng trong tấm thí nghiệm T

Vh - giá trị mật độ quang học trung bình của các giếng thử với dung môi

dùng để pha loãng chế phầm (đối chứng âm)

Dựa vào A có thề nhận xét về tác dụng sinh học của chế phẩm:

+ Khi A > 100%, chế phẩm kích thích tế bào tăng sinh

+ A = 100%, chế phẩm không ảnh hưởng tới khả năng tăng sinh của tế bào

+ 0 < A < 100%, chế phẩm có tác dụng ức chế tăng sinh Khi A= 50%

có nghĩa là tế bào tăng sinh 50% và cũng đồng nghĩa tế bào bị ức chế tăng sinh 50% và được kí hiệu G l50

+ A = 0, chế phẩm ức chế hoàn toàn khả năng tăng sinh và được kí hiệu TGI

+ A < 0, chế phẩm độc, gây chết tế bào Khi A = - 50% thì có nghĩa là chế phẩm độc, làm chết 50% tế bào so với đối chứng

3 Kết quả nghiên cứu

3.1 Thu thập, phân iập , tách và nhân nuôi tế bào

Để có được nguồn tế bào bảo quản trong đông lạnh và nuôi cấy để thử thuốc chúng tôi đã thực hiện 2 nhiệm vụ:

* Phân lâp tách và nhân nuôi tế bào từ mô ung thư đai - trưc tràng:

Mô ung thư đại trực tràng của hai bệnh nhân nam, 64 tuổi và 46 tuổi được xác định là ưng thư giai đoạn T4 được chuyển từ phòng phẫu thuật của bệnh viện về phòng thí nghiệm để tách tế bào Dung dịch 2.5% Trypsin được dùng để trypsin hoá mô ung thư theo các bước đã mô tả trong phần phương pháp

Sau khi trypsin hoá, tế bào thu được có dạng tròn, khá đều về khích thước, được kiềm tra tỷ lệ sống bằng cách nhuộm màu với xanh trypan, kết quả cho thấy tỷ lệ tế bào sổng trung binh đạt 83% Tế bào được phản tán với mật độ 5.104 tb/ ml vào các chai nuôi cấy T25 ( hỉnh 1), mỗi chai 5ml môi

ụg/ml) Đề chai nuôi cấy trong tủ ấm 37°c, 5% C 0 2 Sau 24h quan sát

dưới kính hiển vi soi ngược thấy 1 số tế bào đâ bám đáy chai Sau 48h,

thay môi trường mới và quan sát thấy những tế bào bám đáy đã bò lan ra

xung quanh (hình 2) Như vậy bằng phương pháp trypsin hóa mô chúng tôi

đã phân lập được tế bảo từ mô ung thư đại trực tràng.

Hình 1 Tế bào tách từ mô ung thư đại trực tràng lúc vừa phân tán vào môi

trường nuôi cấy (x200).

3V- * *

Hình 2 Tế bào tách từ mô ung thư đại trực tràng sau 48h nuôi cấy invitro

trong môi trường DMEM +10% FBS (x 200)

Tuy nhiên, theo dõi tiếp 48h sau nữa, chúng tôi thấy các tế bào bị bong ra khỏi bề mặt đáy chai nuôi cấy và chết Trong giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy, tỷ lệ nhiễm mycoplasma cũng khá cao (80%) Lý do của việc

lây nhiễm và chưa duy tri nuôi cấy in vitro lâu dài (continious) và lặp lại

(passage) được có thể là do chưa kiểm soát được sự nhiễm khuẩn ờ giai đoạn phẫu thuật và khâu chuyển mẫu về PTN Thêm nữa, có thể là do môi trường nuôi cấy chưa thích hựp Để có kết luận chắc chắn, cần có thêm thời gian, kinh phí lặp lại các thí nghiệm

9

* Thu thập nhân nuôi và bảo quản các dòng tế bào trong đông lanh:

HeLa, Hep-2, Hep3B, RD, và Sarcoma 180 là các dòng tế bào ung thư và Vero - tế bào thận khỉ xanh ờ Châu Phi được hỗ trợ cung cấp bởi các phòng thí nghiệm trong nước và quốc tế ở dạng đã bảo quản trong đông lạnh Các dòng tế bào này được " đánh thức" và nuôi cấy phục hồi lại

trong điều kiện in vitro để nhân lên đến một số lượng đủ để thực hiện các

thí nghiệm thử thuốc và lưu trữ, lập bộ sưu tập các dòng tế bào Đồng thời chỉ ra môi trường nào nuôi cấy thích hợp nhất đối với từng loại tế bào

Với 3 loại môi trường DMEM, RPMI và MEM có bổ sung 10% huyết thanh, chúng tôi đã nuôi cấy các dòng tế bào trong chai T25 với cùng mật độ ban đầu 5.1 o4 tb/ml Quan sát và xác định những môi trường có các dòng tế bào phủ kín > 50% bề mặt chai nuôi cấy sau 72h đối với HeLa, Hep-2, Hep3B, RD và Vero Riêng đối với Sarcoma 180 là dòng trôi nổi, sống phân tán trong môi trường (suspension), sau 72h nuôi cấy chúng tôi xác đinh mật độ tế bào bằng buồng đếm, môi trường nào có mật độ tế bào lớn nhất

được xem là phù hợp nhất (bảng 1) Kết quả ghi nhận được cho thấy các

dòng Hep-2, Vero, Sarcoma đều phát triển tốt trong cả ba môi trường : dòng Hep-2 và Vero sau 72h nuôi cấy írong tủ ấm đã phủ gần kín bề mặt chai; dòng Sarcoma phát triển trong môi trường thành cụm, mật độ tế bào được xác định sau 48h ủ 37° c cho thấy giá trị này trong môi trường RPMI là cao

nhất (4,45.106TB/ml) Dòng tế bào HeLa và Hep 3B chậm phủ kin bề mặt

chai nuôi cấy trong môi trường MEM, và RD - trong môi trường RPMI, hơn

so với hai môi trường còn lại

Bảng 1: Dòng các tế bào đơn lớp phủ kín > 50% bề mặt sau 12 giờ nuôi

cấy trong ba loại m ồi trường

Từ kết quả ờ bảng 1 chúng tôi nhận thấy môi trường thích hợp cho mỗi dòng tế bào như sau:

1 MEM / DMEM cho Hep-2 , RD và Vero (thường

chọn MEM vì cỏ giả thành rẻ hơn)

2 DMEM / RPMI cho Hep 3B và HeLa (chọn RPMI)

Theo dõi thời gian trypsin hóa các dòng tế bào chúng tôi thấy: Hep-2

và RD là hai dòng dễ bị trypsin hóa Có thẻ tiến hành phản ứng trypsin lớp

tế bào đơn, bám đáy ở nhiệt độ phòng trong 1-1,5 phút; còn các dòng HeLa, Hep3B và Vero cần thời gian trypsin hóa lâu hơn, khỏang 3-4 phút trong điều kiện ủ ấm ở nhiệt độ 37°c

Từ kết quà nuôi cấy trong chai, chúng tôi thu hoạch tế bào để nuôi trong tấm 96 giếng, số còn lại bảo quản tâu dải cho các lần nuôi cấy sau trong mỏi trường 20% serum + 10% DMSO và cất vào Nitơ lỏng

Kết quả nuôi cấy tế bào trong các giếng của đĩa 96 cho thấy tế bào phát triẻn tốt, khoẻ (hình 3) đảm bảo cho việc tiến hành các thí nghiệm thử các chế phầm của chúng tôi sau này

Hình 3: Các tế bào ( lấy dòng Hep-2 làm đại diện) phát triển trong giếng

nuôi cấy sau 24h để chuẩn bị thử thuốc (x200).

3.2 Thử hoạt tinh của các chế phầm đối với các dòng tế bào nuôi cấy

in vitro

Định lượng giá trị tăng sinh các dòng tế bào trong nuôi cấy in vitro là

phương pháp thường dùng để đánh giá ảnh hưởng của điều kiện môi

11

trường cũng như tác động của các chế phẩm đến đặc tính sinh học của tế bào Có thể có nhiều cách lượng giá sự tăng sinh, như trực tiếp xác định số lượng tế bào bằng cách đếm trong buồng đếm (Hematocytometer) hoặc gián tiếp thông qua sản phẩm của quá trình trao đỗi chất mà chỉ các tế bào sống mới có.

Phương pháp xác định trực tiếp thường được áp dụng đối với các tế bào sống phân tán trong môi trường nuôi cấy, có trợ giúp của thuốc nhuộm xanh trypan để phân biệt tế bào sống với tế bào đã chết Dựa vào số lượng

tế bào, tính được tỷ số phần trăm tăng sinh (% proliferation) của tế bào có

xử lí thí nghiệm so với đối chửng không xử lí Thông qua tỷ số % tăng sinh

có thể đánh giá yếu tố tác động/chế phẩm có tác dụng kích thích, ừc chế hay gảy đốc cho tế bào

Trong sổ các chế phẩm chúng tôi thử, cis-platin DLTW.I là chế phẩm được tổng hợp bằng con đường hoá học, những chế phẩm còn lại là các hợp chất tự nhiên có nguồn gốc từ thực vật Việt nam Trong số 6 dòng tế

bào nuôi cấy in vitro để thử tác dụng của các chế phẩm thì Sarcoma 180 lả

dòng sống phân tán (suspension) trong môi trường, 5 dòng còn lại là loại tế bào đơn lớp, bám đáy (adjacent) Chúng tôi sử dụng dòng Sarcoma 180

nuôi cấy in vitro trong chai T25 đề thử tác dụng của cis-ptatin DLTW.I ở các liều 2, 4, 8 và 16 |jg/mL Kết quả đếm trực tiếp tế bào ở các lô thí nghiệm

cho thấy cis-platin DLTW.I có tác động mạnh đến dòng tế bào này, gây ức chế tăng sinh >70% so với đối chứng ngay ờ liều 2|ag/ml, và gần 90% ở liều

16f.ig/ml1 sau 48 giờ (Bàng 2, Hình 4 , 5 và 6).

Bảng 2: Tác dụng của cisplatin DLTW I đến tỷ số tăng sinh của dòng tế bào

sarcoma 180 trong nuôi cấy in vitro sau 48h