nuôi cấy tế bào động vật thụ tinh trong ống nghiệm ( in vitro fertilization IVF)

TỔNG QUAN Cơ sở lí thuyết: Máu trong tủy xương có ba loại tế bào chính: tế bào gốc tạo máuMSC,tế bào máu trưởng thành và MSC..  Cấy chuyền tăng sinh • Khi mật độ tế bào MSC trong bình

BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH

CÔNG NGHỆ SINH HỌC Y DƯỢC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN – ĐHQG TP.HCM

KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

1

PHẦN 1 NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

I TỔNG QUAN

 Cơ sở lí thuyết:

Máu trong tủy xương có ba loại tế bào chính: tế bào gốc tạo máu(MSC),tế bào máu trưởng thành và MSC Trong nuôi cấy, các MSC sẽ bám dính vào bề mặt (giá thể) nuôi cấy, trong khi đó tế bào còn lại không có khả năng này

Đặc điểm môi trường DMEM/F12 có bổ xung 10% FBS và 1% kháng sinh

Nồng độ amino axit, vitamin cao thuật lợi cho nuôi tế bào mật độ cao

Huyết thanh: duy trì khả năng tăng sinh và biệt hóa tế bào ngoài ra còn tăng tính bám dính của tế bào

 Mẫu thu nhận từ tủy xương, nơi chứa nguồn tế bào gốc trung

mô dồi dào

 Cấy chuyền tăng sinh

• Khi mật độ tế bào MSC trong bình nuôi cấy đạt từ khoảng 70-80% diện tích bình nuôi,

• Nhằm cung cấp không gian và chất dinh dưỡng cho MSC, đồng thời tránh hiện tượng ức chế ngược gây chết tế bào

 Bảo quản đông lạnh

• Giảm sự thay đổi hay mất các đặc tính của tế bào và giảm chi phí nuôi cấy

• Với phương pháp bảo quản lạnh -80⁰C tế bào có thể được bảo quản khoảng 1 tuần

• Giải đông

Nhằm đưa tế bào về trạng thái hoạt động bình thường Cần môi trường dinh dưỡng cao và phải giải đông nhanh

II Vật liệu và phương pháp

A: Thu nhận quần thể tế bào tủy xương, nuôi cấy sơ cấp

 Xác định mật độ của tế bào

 Quy trình:

B Thay môi trường

Mục tiêu: loại chất thải và cung cấp dinh dưỡng mới cho tế bào phát triển

Quy trình:

C Cấy truyền và đông lạnh

D Qui trình giải đông

Hình 1: Trước nuôi sơ cấp

III Kết quả và giải thích

Nhuộm tế bào bằng trypan blue tỉ lệ 1:1 (10ul:10ul)

30 tế bào 29 tế bào

36 tế bào

Độ pha loãng: 10 lần

Mật độ tế bào:

• Quần thể tế bào tủy xương thu được gồm

hai loại tế bào kích thước khác nhau

 có thể dự đoán đó là các tế bào bạch cầu đơn

nhân,hồng cầu hay tiểu cầu

Kết quả nuôi sơ cấp:

• Có thu được tế bào gốc trung mô

glucose và tạo ra acid

 Mật độ tế bào đếm cao nhưng lượng tế bào gốc trung mô thu

được thấp do lúc đếm mật độ có cả tế bào máu trưởng thành

Hình 2: kết quả sau 3 ngày nuôi sơ cấp

B Kết quả thay môi trường

Hình 3: kết quả sau khi thay môi trường

- Dự đoán có thể thu nhận được tế bào gốc trung mô

• Tế bào mọc bám dính

• Hình dạng giống nguyên bào

sợi -Không bị nhiễm

3 Kết quả cấy truyền

Hình 5: kết quả sau khi cấy cấy truyền

Hình 4: mẫu trước cấy chuyền

(nhóm 8, ca 2)

 Mật độ tế bào cấy chuyền thấp và phân bố không đều

do: lự cào craper yếu và huyền phù mẫu không đều

 hiệu suất đông lạnh là 36.14%

 Tỉ lệ tế bào chết cao có thể do sự hình thành tinh thể đá,

phá hủy cấu trúc tế bào lúc đông lạnh

Hình 6: kết quả sau khi giải đông

D Kết quả sau giải đông

C: tế bào chếtS: tế bào sống

Tài liệu tham khảo:

• Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc(2010) Chương 3: Nuôi cấy tế bào động vật Công

nghệ sinh học trên Người và Động vật, Nhà xuất bản Giáo dục Việt Nam trang 127-207

• Strecker S, Liu Y, Wang L, Rowe D, Maye P(2012) Mouse bone marrow derived

mesenchymal stem cells Stem cells and Cancer stem cells Vol 6:231-245

• Nadri S, Soleimani M, Hosseni RH, Massumi M, Atashi A, Izadpanah R (2007) An

efficient method for isolation ò murine bone mesenchymal stem cells The

international journal of development biology, 51(8): 723-9

• I Muller, S Kordowich, C Holzwarth, C Spano, G Isensee, A Staiber, S Viebahn, F

Gieseke, H Langer, MP Gawaz, EM Horwitz, P Conte, R Handgretinger and M

Dominici(2006) Animal serum-free culture conditions for isolation and expansion of multipotent mesenchymal stromal cells from human BM

• Phần mềm Axio version

PHẦN 2:

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

( In vitro fertilization-IVF)

Nội dung:

1 Thu nhận giao tử đực và cái

2 Thụ tinh trong ống nghiệm

3 Đánh giá sự phát triển của

phôi

Chuột nhắt trắng từ 6-8 tuần tuổi do:

• Chuột nhắt trưởng thành từ 35-42 ngày

• Con cái thì động dục khoảng 4-6 tuần, đực thì từ tuần 5-7

LỌC DẦU KHOÁNG

1 Mục đích: loại bỏ vi sinh vật gây nhiễm

Dầu khoáng dung để:

• Lọc trong môi trường vô trùng

• Hút dầu lên chậm tránh bị văng dầu và lúc nhả xuống thì dùng lực ép mạnh để lọc

• Không được chạm vào đầu màng lọc

• Không tạo bọt trong vi giọt

Kéo pipette pasteur

Mục đích: hút và chuyển trứng, phôi

Nguyên tắc:

Tùy mục đích có 2 loại : đầu lớn và đầu nhỏ

Kéo kim trên ngọn đèn cồn

Khi kéo thì đầu pipette tạo với thân 1 góc > 90⁰Phải kéo nhanh dứt khoát

 Bơm tiêm và các dụng cụ khác phải đảm bảo vô khuẩn.

 Khi chích cho chuột dùng cồn sát trùng vùng đùi, vuốt

ngược lên để lộ phần bắp

 Khi hút thuốc xong chưa tiêm ngay thì phải đậy đầu kim lại

 Tiêm đúng liều và đúng thời điểm

 Khi chích nghiêng mũi kim 45 độ chích khoảng 1/3 mũi kim tránh tổn thương cơ quan bên trong của chuột

NGUYÊN TẮC LỰA CHON GIAO TỬ

Chọn trứng: trứng đã chín:

• Cụm cumulus xung quanh

Trứng trưởng thành lớp cumulus sẽ mờ và tách thành nhiều tế bào

Nguyên tắc chọn tinh trùng bằng phương pháp swim-up và nhuộm

Nguyên tắc đánh giá phôi

• Thụ tinh thành công khi có 2 tiền nhân và 2 thể cực

• Màng ZP dày

• Nguyên sinh chất sạch và thường có ít hạt

Kết quả

1 Thu nhận tinh trùng

• Thu được ống dẫn tinh nhưng ít tinh dịch

• Sau swim-up, đếm tế bào nhưng không có tinh trùng

• Thu được buồng trứng và ống dẫn trứng

• Không thu được trứng

Giải thích:

Khi thu đã làm đứt ống dẫn trứng nên có thể mất trứng Cả 2 nhóm 15, 16 đều không thu được trứng có thể trứng chưa chín và rụng

Kết quả thụ tinh:

1 Đánh giá qua kính hiển vi:

• Trứng không quan sát xuất hiện tiền nhân

• Không có thể cực

• Màng mờ, mỏng

thụ tinh không thành công

Giải thích: do trứng thụ đem thụ tinh chưa

trưởng thành nên không thụ tinh được Hình 2: Trứng và tinh trúng trước thụ tinh

Hình 3: trứng sau 18 giờ thụ tinh

2 Đánh giá phôi sống chết

• Phôi bắt màu xanh với thuốc nhuộm Hoechst và

màu đỏ với thuộc nhuộm PI cho thấy phôi chết

do màng tế bào không hoạt động

Giải thích

• Thuốc nhuộm Hoechst liên kết với rãnh nhỏ DNA

vùng giàu adenine và thymine Kết quả cho màu

xanh chứng tỏ có DNA hay tế bào

• Thuốc nhuộm IP liên kết DNA qua gắn giữa các

base và không thể đi xuyên màng và thường bị

loại bởi tế bào sống Kết quả cho màu đỏ cho

thấy màng không hoạt động hay phôi chết

Hình 4: phôi nhuôm với Hoechst

Hình 5: phôi nhuôm với PI