báo cáo thực tập chuyên ngành cnsh y dược phần, nuôi cấy tế bào động vật phần, thụ tinh trong ống nghiệm

Cấy chuyền và nuôi cấy thứ cấp • Cấy chuyền cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho các dòng tế bào phát triển liên tục.. Kết luận – Kiến nghị Kết luận Nuôi cấy được 1 dòng tế bào từ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHOA SINH HỌC – CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH CNSH Y DƯỢC

PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

PHẦN 2: THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Nuôi cấy

tế bào động vật

Mô hình thử nghiệm và chẩn đoán bệnh

Sản xuất các hợp chất sinh

học

Nguyên liệu cấy ghép

Tạo cơ quan

Sản xuất virus diệt côn trùng

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 Nuôi cấy tế bào

• Nuôi cấy tế bào là quá trình mà các tế bào

được nuôi trong điều kiện có kiểm soát về:

2 Nuôi cấy sơ cấp

- Sử dụng các tế bào sau khi được

tách từ các mảnh mô và trước lần

cấy chuyền đầu tiên.

- Thu nhận các mảnh sinh phẩm, mô

sống  loại bỏ các thành phần không

mong muốn và các thành phần gây

hại cho mô  tách để tạo huyền phù

tế bào đơn trước khi nuôi cấy.

 Nuôi cấy sơ cấp thường được sử dụng

để khai thác các tế bào ban đầu trong

những mảnh mô, nhằm tạo ra các

dòng tế bào mới.

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

5

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3 Cấy chuyền và nuôi cấy thứ cấp

• Cấy chuyền cung cấp chất dinh dưỡng và không gian cho các dòng tế bào phát triển liên tục

• Tần số (độ thường xuyên cấy chuyền) và tỉ lệ pha loãng, hay nồng độ tế bào phụ thuộc vào đặc tính của mỗi dòng Nếu dòng được cấy chuyền quá thường xuyên hay nồng độ tế bào quá thấp, chúng có thể bị mất.

• Nuôi cấy thứ cấp được tính từ sau lần cấy chuyền đầu tiên từ nuôi cấy sơ cấp.

4 Đông lạnh và giải đông tế bào

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

7

Đông lạnh Giải đông

Giữ tế bào ở trạng thái ngủ (Lưu trữ tế bào sống trong thời gian dài) Đưa tế bào về trạng thái sinh lý bình thường (Hoạt hóa tế bào) Cần chất bảo quản đông lạnh (DMSO,

glycerol, PEG, ) Cần môi trường dinh dưỡngĐông lạnh chậm: 4 0 C  (-20) 0 C  (-80) 0 C  (-196)

0 C

Giải đông nhanh (37 0 C)

Hạn chế nhiễm Lưu trữ tế bào phục vụ mục đích nghiên cứu Tiết kiệm môi trường nuôi cấy

Hạn chế nhiễm Lưu trữ tế bào phục vụ mục đích nghiên cứu Tiết kiệm môi trường nuôi cấy

III VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu:

1.1 Mẫu vật:

Chuột nhắt trắng Swiss Albino, 6-8 tuần

tuổi, nặng 18-22g, được cung cấp bởi Viện

 Kẹp thẳng, kẹp cong; kéo thẳng, kéo cong.

 Đĩa petri đường kính 9-10cm.

 Ống ly tâm loại 15ml.

 Buồng đếm hồng cầu, lamelle.

 Đầu tip 1ml, 0.1ml; micropipette

 Bình Flask 25cm 2

 Khay rác.

 Kim tiêm 1ml.

III VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp:

+ Thu nhận xương đùi và xương cẳng chân chuột

+ Thu nhận quần thể tế bào trong tủy xương

+ Xác nhận tỷ lệ sống chết của tế bào

+ Thay môi trường và cấy chuyền

+ Đông lạnh – Giải đông

9

Tế bào MCF7

Thay môi

IV KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

1 Nuôi cấy sơ cấp

Hình 1 Các tế bào thu được từ tủy xương chuột.

 Hỗn hợp tế bào có trong

tủy xương bao gồm tế bào

gốc tạo máu, tế bào máu

• ~6,33 µm, tròn đều,

không nhân, lõm  Tế bào hồng cầu.

11

20X

IV KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

1 Nuôi cấy sơ cấp

Kết quả nuôi cấy sơ cấp sau 3 ngày

Biện luận: Xương lớn không chọc đúng lỗ tủy  thu được số lượng tế bào tủy xương ít

• Xuất hiện quần thể nhiều loại tế bào (tròn, hình thoi, hình que dài), trải và không trải.

• Số lượng tế bào bám trải ít (dưới 70-90%), không đủ để cấy chuyền.

1 Nuôi cấy sơ cấp

13

2 Thay môi trường

Hình 2 Tế bào tủy xương TRƯỚC và SAU thay môi trường ở các vật kính X10, X20

Các tế bào không bám dính bị loại bỏ, quan sát được các tế bào bám dính rõ ràng hơn.

Hình 3 Tế bào tủy xương ngày 21/10/2016Mật độ các tế bào bám thấp hơn 70%  Không thể cấy chuyền

10X

Theo dõi đĩa nuôi cấy ngày thứ 6 của nuôi cấy

15

3 Đông lạnh – Giải đông

Tỉ lệ tế bào chết cao  Trong quá trình đông lạnh một số tế bào chết do hình thành tinh thể đá, do stress, do sốc nhiệt hoặc do thao tác.

4 Kết luận – Kiến nghị

 Kết luận

Nuôi cấy được 1 dòng tế bào từ tủy xương, không bị nhiễm

Nắm được các kiến thức và thao tác cơ bản trong nuôi cấy tế bào động vật

Nắm được các kỹ năng cơ bản trong quan sát, đánh giá tế bào nuôi cấy

 Kết luận

Nuôi cấy được 1 dòng tế bào từ tủy xương, không bị nhiễm

Nắm được các kiến thức và thao tác cơ bản trong nuôi cấy tế bào động vật

Nắm được các kỹ năng cơ bản trong quan sát, đánh giá tế bào nuôi cấy

 Kiến nghị

Nuôi cấy tế bào động vật là một kỹ thuật khó và cần nhiều thời gian thực tập để

thao tác thành thạo hơn.

 Kiến nghị

Nuôi cấy tế bào động vật là một kỹ thuật khó và cần nhiều thời gian thực tập để

thao tác thành thạo hơn.

17

PHẦN 2: THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

1 NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP

- GÂY SIÊU BÀI NOÃN

- TIÊM THUỐC MÊ CHO CHUỘT

- THỤ TINH (ĐÁNH GIÁ HÌNH THÁI

VÀ NHUỘM HUỲNH QUANG)+ SAU 4 GIỜ

+ SAU 1,5 NGÀY

3 MỘT SỐ LƯU Ý

4 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ

1 NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP

GÂY SIÊU BÀI NOÃN CHUỘT

 Cố định chuột trên tay

 Sát trùng vùng bụng chuột

 Tiến hành tiêm hCG vào vùng

bụng chuột sau khi tiêm PMSG

khoảng 46 – 48 giờ

TIÊM THUỐC MÊ CHUỘT

 Cố định chuột trên tay

 Sát trùng bắp chân chuột

 Tiêm thuốc mê vào cơ bắp chân

bên trong của chuột

Lưu ý: thuốc mê chỉ có tác dụng trong vòng 30 phút

LỌC DẦU KHOÁNG

 Nguyên tắc: phải đảm bảo

vô trùng trong khi lọc dầu

khoáng

 Phương pháp:

• Tiến hành lọc dầu khoáng trong tủ an toàn

sinh học

• Dùng kim tiêm vô trùng hút dầu khoáng

• Gắn đầu màng lọc vào đầu gắn kim syringe

• Đặt đâu lọc lên miệng ống falcon

• Đẩy piton để dầu khoáng chảy qua màng lọc

xuống falcon Màng lọc milipore

• Vi giọt phải tròn, đều, không có bọt khí

• Ngập trong dầu khoáng

• Vi giọt không được chạm vào thành đĩa và không được chạm vào

nhau

• Nên đánh số vào đĩa trước khi tạo để tránh quên thứ tự

PHƯƠNG PHÁP TẠO VI GIỌT

• Dài khoảng 3 – 4 cm

• Thao tác: góc kéo khoảng 135 độ, vừa đưa kim

ra ngoài vừa kéo

₋ Kim đầu to: kéo chậm hơn, nhẹ hơn, đoạn

được hơ lửa dài hơn

₋ Kim đầu nhỏ: kéo nhanh hơn, mạnh hơn,

đoạn được hơ lửa ngắn hơn

PHƯƠNG PHÁP KÉO PIPETTE PASTEUR

Pipette Pasteur

23

THU TRỨNG

Gây mê Cố định chuột Sát trùng Cạo lông chuột

Sát trùng

Mổ ổ bụng chuột Tìm tử cung

bóng

Thu nhận cụm trứng

THU TINH

Giết chuột (kéo

giãn đốt sống cổ)

Thu nhận mào tinh và ống dẫn

tinh

Đặt lên tờ giấy thấm (đã hấp khử

trùng) Tách mỡ

Dồn tinh dịch (từ

ống dẫn tinh)

Dùng kim tiêm đâm vào đầu mào

tinh

Dùng đầu kim thu giọt tinh dịch

Cho vào eppendorf có môi trường SWM

Hút bỏ dịch nổi Hòa cặn vào

FertiMed Mật độ tối ưu: 2.5 x 10 6 tt/ml

Thu được 5 trứng, nhưng trong quá trình thao tác chuyển trứng

đã làm mất 2 trứng, nên chỉ còn lại 3 trứng

2 KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH

THU TRỨNG

Đánh giá chất lượng trứng:

Cả 3 trứng đều bị mất màng: tế bào chất không mịn, các cấu trúc

bên trong co cụm lại với nhau, không phân bố đều

27

• Tuy nhiên mật độ ban đầu hơi thấp do

có thể trong lúc thao tác thu tinh, chưa

thu hết được tinh dịch

THỤ TINH TRONG VI GIỌT THỤ TINH (MỚI CHUYỂN TINH TRÙNG VÀO)

Hình 1: Hình ảnh thụ tinh trong vi giọt thụ tinh của 3 trứng

29

KẾT QUẢ SAU KHI THỤ TINH 4 GIỜ

Hình 2: Hình ảnh thụ tinh trong vi giọt thụ tinh của 2 trứng sau 4 giờ

1

2

2 trứng sau khi thụ tinh 4 giờ đều đã chết (mất màng, tế bào chất tràn ra)

KẾT QUẢ THỤ TINH SAU 1,5 NGÀY

Hình 3: Hình ảnh thụ tinh trong vi giọt thụ tinh của 3 trứng sau 1,5 ngày

3 1

Hình 4: Hình ảnh thụ tinh trong vi giọt thụ tinh của trứng 1 sau 1,5 ngày theo thứ tự

hình không nhuộm, nhuộm Hoeschst, nhuộm Propidium iodide (PI)

ĐÁNH GIÁ SỐNG CHẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HUỲNH QUANG

Nhuộm Hoechst sáng và nhuộm PI không sáng  tế bào còn sống

Tuy nhiên, kết hợp với kết quả đánh giá hình thái thì không thể kết luận tế bào này còn sống, có thể đã xảy ra sai sót trong quá trình nhuộm

 Trứng 1 chết

1

32

Hình 5: Hình ảnh thụ tinh trong vi giọt thụ tinh của trứng 2 sau 1,5 ngày theo thứ tự

hình không nhuộm, nhuộm Hoeschst, nhuộm Propidium iodide (PI)

Nhuộm Hoechst sáng và nhuộm PI sáng  tế bào chết

Kết hợp với kết quả đánh giá hình thái

 Trứng 2 chết

2

ĐÁNH GIÁ SỐNG CHẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HUỲNH QUANG

33

Hình 6: Hình ảnh thụ tinh trong vi giọt thụ tinh của trứng 3 sau 1,5 ngày theo thứ tự

hình không nhuộm, nhuộm Hoeschst, nhuộm Propidium iodide (PI)

Nhuộm Hoechst sáng và nhuộm PI sáng  tế bào chết

Kết hợp với đánh giá hình thái

 Trứng 3 chết

3

ĐÁNH GIÁ SỐNG CHẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HUỲNH QUANG

3 MỘT SỐ LƯU Ý

- Trứng rất dễ chết  thao tác nhanh

- Thu trứng đã rụng vào ống dẫn trứng (buồng trứng có bề mặt như bị chảy máu và lành lại)

- Trứng còn túi mầm (màng nhân) là trứng chưa chín  không thu

- Trứng bị vỡ, mất màng: tế bào chất không mịn, tràn ra ngoài, cấu trúc bên trong co cụm lại, không đều

- Có thể đánh giá trứng dựa vào hình thái: trứng co lại  mất màng  chết

Đánh giá trứng dựa vào giai đoạn: sau 2 ngày mà vẫn chưa phân chia  chết

- Kính hiển vi phải có gắn kính ổn nhiệt khi thao tác với trứng vì trứng rất nhạy nhiệt

- Đoạn bóng: 1 khối nhiều trứng tập trung lại làm cho ống phình to, trong hơn (do trứng chuột màu trắng)

- Trước khi chuyển trứng sang 1 môi trường mới thì phải rửa trứng với môi trường đó ít nhất 2 lần

- Trứng có lớp tế bào cumulus thường có tỉ lệ thụ tinh cao hơn, giúp tinh trùng dễ chui vào trứng hơn

- Thu tinh trùng ở mào tinh hoặc ống dẫn tinh

- Tinh trùng chuột: đuôi rất dài, đầu móc 35

4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ

Kết luận:

- Gây siêu bài noãn và thu thành công tế bào trứng và tinh trùng

- Nắm được các thao tác cơ bản của kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)

- Thụ tinh chưa thành công do chất lượng trứng kém và thao tác chưa thành thạo

Kiến nghị:

- Đánh giá chất lượng trứng bằng hình thái trước khi thụ tinh

- IVF là một kỹ thuật khó và cần nhiều thời gian học thêm để thao tác thành thạo hơn

YOU

37