BÁO cáo THỰC tập NUÔI cấy tế bào ĐỘNG vật

 Mục tiêu:  Làm quen với kĩ thuật nuôi cấy tế bào từ tuỷ xương chuột với các thao tác thu nhận mô, phân lập, quan sát và đánh giá tế bào.. Trong bài thực tập tế bào nuôi cấy là tế bà

BÁO CÁO THỰC TẬP NUÔI

CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

1

MỤC TIÊU

 Nuôi cấy tế bào động vật là một trong những kĩ thuật cơ

bản được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Y, Sinh, Dược.

 Mục tiêu:

 Làm quen với kĩ thuật nuôi cấy tế bào từ tuỷ xương

chuột với các thao tác thu nhận mô, phân lập, quan sát

và đánh giá tế bào.

 Biết được các dụng cụ, các bước chuẩn bị cho nuôi

cấy tế bào.

3

CƠ SỞ LÍ THUYẾT

Nuôi cấy sơ cấp: là quá trình nuôi cấy tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy

chuyền đầu tiên Trong nuôi cấy sơ cấp, các tế bào ban đầu thường là hỗn hợp các dòng tế bào khác nhau hoặc chứa dòng trội nhất, trong đó có những tế bào quan tâm.

Trong bài thực tập tế bào nuôi cấy là tế bào tuỷ xương chuột, tế bào quan tâm

là các tế hình thoi, có tính bám.

Quy trình nuôi sơ cấp:

• Bước 1: thu nhận mô có chứa tế bào sống

• Bước 2: phẫu tích hay tách rời tế bào, xác định mật độ tế

bào.

• Bước 3: nuôi cấy (passage 0)

Nuôi cấy thứ cấp: là việc nuôi cấy sau lần cấy chuyền đầu tiên để được

Passage 1

4

PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp:

Ngày 1: (4/10/2016)

o Gói dụng cụ hấp khử trùng

o Pha chế môi trườngPBS

-o Làm quen với thiết bị phòng thí nghiệm

Ngày 2: (7/10/2016)

Chiếu tủ ( tủ an toàn cấp 2):

Quy trình chiếu tủ: mặc áo blouse, đeo bao tay, khẩu trang

Dùng khăn sạch thấm cồn 70 lau túi

Ngày 2: (7/10/2016)

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

Thu nhận xương đùi và tuỷ

6

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

Đếm tế bào:

‾ Đếm ít nhất 3 lần.

‾ Nếu giữa các ô đếm quá chênh lệch thì phải đếm buồng đếm khác

‾ Đếm các tế bào đơn, chọn các tế tròn sáng, đồng nhất về kích thước.

7

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

Ngày 3 (11/10/2016)

Thay môi trường cho tế bào tuỷ xương chuột:

Lấy bình nuôi cấy ra khỏi tủ nuôi Chụp hình

trường cũRửa 2 lần PBS Cho môi trường mới

Ngày 4 (14/10/2016)

Cấy trải: do mật độ tế bào phân bố không đều nên cần cấy trải để dàn đều tế bào trước khi nuôi cấy thư cấp

Lấy bình nuôi cấy ra khỏi tủ nuôi Chụp hình

tế bàoHút vào Fancon Ly tâm Thu cặn tế bào Cho môi trường mới vào Huyền phù

KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

Ngày 1: (4/10/2016)

Cách gói dụng cụ để hấp khử trùng

Cách pha chế dung dịch: để kiểm tra dung dịch tan hết hay chưa bằng cách kiểm tra pH Nếu như pH ổn định thì dung dịch tan hoàn toàn.

Lưu ý: với dung dịch là môi trường nuôi cấy thì không hấp mà sẽ lọc

9

Ngày 2: (7/10/2016)

KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

Kết quả quan sát: trong mẫu thu có các tế bào quan tâm như tế bào tròn, sáng, kích thước đều

Tuy nhiên có các tế bào nhỏ sáng có thể là tiểu cầu, có tế bào lõm là hồng cầu và các tế bào bị vỡ

không còn hình dạng ban đầu của nó

Hình chụp môi trường trước khi nuôi cấy Hình chụp môi trường thu tế bào từ tủy xương

Tế bào không bám hình tròn 11

KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

Ngày 3 (11/10/2016)

Trước khi thay môi trường, môi trường nuôi có màu cam, đục

=> Tế bào phát triển bình thường

Hình chụp có nhìn thấy những tế bào quan tâm là hình thoi bám ở đáy bình, ngoài ra còn có các tế bào không bám hay tế bào bám có dạng hình tròn Môi trường không bị nhiễm

Hình chụp môi trường sau khi nuôi cấy Hình chụp tế bào sau khi nuôi cấy 12

KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

Ngày 3 (11/10/2016)

Sau khi thay môi trường, môi

trường trong suốt, có màu hồng

Tế bào lơ lững, không bám dính

bị loại bỏ

Hình chụp sau khi thay môi

trường thấy rõ các tế bào bám

• Hình chụp tế bào cho thấy có các tế bào bám và tế bào không bám

• Môi trường không bị nhiễm, mật độ tế bào phân bố không đều

=> Mật độ chưa đạt yêu cầu, do đó thực hiện cấy trải

• Nguyên nhân mật độ phân bố không đều do bước huyền phù chưa tách hoàn toàn tế bào đơn khi thu bào tuỷ xương

Hình chụp tế bào trước khi cấy trải

Tế bào bám dính hình thoi

Tế bào bám dính hình tròn

Cụm tế bào bám dính

15

Ngày 4 (14/10/2016)

KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

Hình chụp tế bào sau khi cấy trải

Mật độ tế bào đồng đều hơn, tuy nhiên

vẫn còn một số cụm tế bào chưa phân

tách

Nguyên nhân: Do sử dụng phương pháp

tách cơ học bằng Cell Crapper nên không

thể phân tách hoàn toàn các cụm tế bào

dính nhau thành từng tế bào đơn lẻ như

khi sử dụng phương pháp dùng trypsin

Hình chụp tế bào sau khi cấy trải

Tế bào không bám dính

Cụm tế bào không phân tách

16

Hình chụp tế bào sau khi nuôi cấy cấy trải

Sau khi nuôi cấy trải, môi trường có màu đỏ

Có khuẩn lạc mọc trong môi trường nuôi cấy

Do thao pha loãng môi trường sau li tâm

KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

17

KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN

Hình chụp tế bào sau khi giải đông

Qui trình đông lạnh và giải đông:

• Làm theo quy trình đông lạnh chậm

• Kết quả sau khi giải đông:

QUY TRÌNH IVF

19

MỤC TIÊU

CƠ SỞ LÍ THUYẾT

21

• Tập thu nhận và chuyển trứng heo

=>Thu nhận được trứng từ các nang lớn

Năng trứng heo (Hình minh họa)

Tạo vi giọt

Đĩa tập chuyển trứng 4 giọt 50 ul PBS

Đĩa loại cumulus 1 giọt 10ul FertiMed 3 giọt 50ul FertiMed

Đĩa thụ tinh 2 giọt 10ul FertiMed 2 giọt 10+40ul FertiMed (vi giọt treo)

Đĩa nuôi phôi 4 giọt 10+40ul Embryos (vi giọt treo)

Tập chuyển trứng

=>Chuyển được, tuy nhiên vẫn bị mất bị mất trứng

23

• Gây siêu bài noãn cho chuột

• Tiêm 10IU PMSG (0.1 ml, 100IU/ml)

• 46-48 giờ sau tiên PMSG, tiêm 0.1 mlhCG 100IU/ml.

• 13-14 giờ sau tiêm hCG tiến hành thu nhận trứng

Quy trình thu nhận trứng

24

Thu nhận đoạn bóng

Quy tình mổ chuột thu đoạn bóng

25

=> vết khâu sai, bị bung chỉ nên

Trứng Cụm trứng

Kết quả

28

Thu nhận tinh trùng

• Quan sát , phân biệt và thu nhận mào tinh và ống dẫn tinh (cắt phần giữa mào tinh và tinh hoàn, và cắt sao cho thu đoạn chứa đoạn gấp ngược) từ chuột đã mổ của nhóm 3

• Lăn đoạn ống dẫn tinh và mào tinh thu được trên giấy để loại mỡ

• Dùng kẹp giữ chặt 2 đầu đoạn gấp ngược, dùng kẹp đẩy phần tinh

dịch dồn về đoạn gấp ngược (đoạn gấp ngược phải căng phồng lên).

• Dùng kim tiêm chọc thủng đoạn gấp ngược

 KẾT QUẢ: thu giọt tinh dịch bằng đầu kim tiêm, sau đó cho vào dung dịch swim-up.

30

• Ủ dung dịch swim-up chứa tinh dịch trong tủ ấm 37ºC, 5% CO2 ,30 phút, đặt nghiêng 45º.

• Hút khoảng 400µl dung dịch gần bề mặt đã swim-up rồi

Kiểm tra mức độ sống chết và độ di động của tinh trùng

• Nhuộm trypan blue (20ul)

• pha loãng mẫu với Trypan blue (1:1)

32

33

Sau khi thụ tinh

Giải thích kết quả

• Độ di động: độ di động 5.63% quá thấp so với điều kiện thụ tinh là

80-90%

động của mẫu 20µl đem xem dưới kính hiển vi

Chuẩn bị tinh trùng để thụ tinh

tinh trùng/ml => pha loãng đi 2 lần để mật độ xấp xỉ

2.5x106 tinh trùng/ml

trước khi đem thụ tinh

• Pha loãng 2 lần 30µl dung dịch chứa tinh trùng để đạt mật độ trên.

30µl FertiMed huyền phù cho 40µl vào vi giọt thụ tinh

36

Thụ tinh

• Trứng xin từ nhóm 1 (trứng đã được

loại bỏ cumulus nhờ enzyme

hyaluronidase) đã được chuẩn bị trên

vi giọt 10ul.

• Tiêm 40ul dung dịch chứa tinh trùng

để đạt mật độ 2.5x106 tinh trùng/ml

vào vi giọt này.

• Chuyển thêm 3 trứng thu được từ

nang chuột vào vi giọt này Tổng cộng

có 4 trứng đem thu tinh

• Cho đĩa nuôi chứa vi giọt vào tủ nuôi

Nuôi trong 5 giờ

Trứng thu nhận được từ nuồng trứng chuột

Trứng thu được 37

Sau khi nuôi phôi

Biện luận:

• Độ di động của tinh trùng thấp (chỉ 5.6%)

 hiệu quả thụ tinh kém

• Điều kiện môi trường đĩa thụ tinh và nuôi phôi bị thay đổi liên tục

Ảnh hưởng đến sự hiệu suất

• Mật độ tinh trùng trong đĩa thụ tinh chết nhiều

=> Ảnh hưởng đến môi trường thụ tinh và phát triển của phôi

• Thao tác chuyển trứng làm ảnh hưởng cơ học đến trứng

=> Ảnh hưởng đến sức sống của trứng

Sau khi nuôi phôi

39

Chuột sau khi thực hiện phẫu thuật