báo cáo kết quả thực tập chuyên ngành công nghệ sinh học y dược nuôi cấy mô tế bào động vật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF)

- Bài thực tập này cung cấp những kiến thức và kỹ năng cơ bản trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào từ tủy xương chuột, bao gồm các thao tác cụ thể về thu nhận xương, mô tủy, phân lập, nuôi c

PHAN 1: NUOI CAY TE BAO DONG VAT

Tổng quan tài liệu Vật liệu và phương pháp

Kết quả và biện luận

1 TONG QUAN TAI LIEU

- Nudi cay té bào động vật là một kỹ thuật cơ bản, không

thể thiếu và được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và

ứng dụng y, sinh

- Bài thực tập này cung cấp những kiến thức và kỹ năng cơ bản trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào từ tủy xương chuột,

bao gồm các thao tác cụ thể về thu nhận xương, mô tủy,

phân lập, nuôi cấy, bảo quản, quan sát, đánh giá tế bào tủy xương.

2 VAT LIEU VA PHUONG PHAP

Kẹp thẳng, kẹp cong; kéo thẳng, kéo cong

Đĩa petri đường kính 9-10cm

Ống ly tâm loại 15ml

Buồng đếm hồng cầu, lamelle

Đầu tip 1ml, 0.1ml; micropipette

2 VAT LIEU VA PHUONG PHAP

2.2 PHUONG PHAP

2.2.1 Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất

- Gói dụng cụ:

Y Becher 50ml: bọc giấy bạc bên trong và giấy thường bên ngoài miệng becher

* Kẹp cong và kẹp thẳng, kéo to, kéo nhỏ: gói giấy bạc ở mũi kẹp và mũi kéo > gộp chung và gói trong giấy A4

*« Duran: gói đầu hút trước, gói đầu còn lại sau, gói không quá chặt hay quá lỏng

* Đĩa petri: gói bằng giấy thường, úp đĩa xuống trước khi gói

Y Pau tip 1 ml va 0.1 mI bo vao becher > bọc giấy bạc bên trong và giấy thường bên ngoài miệng

becher

- Hấp khử trùng đồ nhiệt độ ẩm: 120°C trong 30 phút, 1 atm

- Pha mồi trường PBS, V = 1l, pH=7,4:

Y KCI:0.2g

VY NaCl: 8g

Vv Na,HPO,.12H,0: 2,9384g

Vv KH,PO;: 0.2g

TONG QUAT QUY TRÌNH

1

`——

TT

Thay moi trường lần

2 VAT LIEU VA PHUONG PHAP

2 VAT LIEU VA PHUONG PHAP

2.2 PHUONG PHAP

2.2.3 Thu nhận quần thể tế bào tủy xương

e Rửa 2 chân bằng dung dịch PBS 2-3 lần

e Loại bỏ hoàn toàn phần cơ còn sót lại

e Cắt rời đoạn xương đùi và xương cằng chân

e Hút 3ml môi trường nuôi tế bào vào becher

e Dùng kim tiêm 1ml hút và bơm môi trường nuôi tế bào vào tủy xương để dội rửa thu tế bào tủy xương

e Thực hiện đến khi ống xương chuyển sang màu trắng

se Dung dịch huyền phù tế bào được chia làm 2 phần:

e Phần 1: 1 giọt dung dịch cho vào eppendorf để xác định tỉ lệ sống chết

e Phan 2: dung dịch huyền phù tế bào còn lại cho vào bình Roux, đem đi chụp hình ở vật kính 5X, 10X và 20X, sau đó nuôi cấy ở 379C, 5% CO 8

2 VAT LIEU VA PHUONG PHAP

bang 3 P PS pipet oo ¬ le Tinh mat do te bao: „ ¬

- Phu buong dém với lamelle va su dung pipet nap mau vao Số tế bào đếm đươc

- Đặt buồng đếm lên kính hiển vi quang học

- Chỉnh vật kính nhỏ nhất định vị buồng đếm trên thị trường

2 VAT LIEU VA PHUONG PHAP

2.2 PHUONG PHAP

2.2.5 Thao tac thay moi trudng

Hut bo toan bo mồi trường cũ

2 VAT LIEU VA PHUONG PHAP

2 VAT LIEU VA PHUONG PHAP

2 VAT LIEU VA PHUONG PHAP

2.2 PHUONG PHAP

2.2.8 Giải đông tế bao

se Lấy các ống đồng lạnh tế bào ra khỏi bình nitơ lỏng

e« Kiểm tra nhãn và nắp

se Giữ ống đông lạnh ngoài không khí khoảng 30 giây

maa se Tái huyền phù tế bào trong môi trường mới

e Trải tế bào vào đĩa nuôi với mật độ cao từ 2-3x10 tế bào/cm2

hư s Theo dõi sức sống, sự tăng sinh của tế bào sau giải đông 3

3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1 NGÀY 1: CHUAN BI DUNG CU VA HÓA CHẤT

» Gói hấp đầy đủ dụng cụ cho khóa thực tập

s*Pha được 1Ì dung dịch PBS

* Hiểu được một số quy trình an toàn phòng thí nghiệm và nguyên tắc

sử dụng một số thiết bị cơ bản

3 KẾT QUẢ VÀ BIỆNLUẬN |

3.2 NGAY 2: NUOI CAY SO CAP

Sau khi tách từ tủy xương, ta quan sát được các loại tế bào:

-Hồng cầu: tròn, nhỏ, lõm ở giữa,

kích thước khoảng 6m

‹Tế bào tủy xương chuột: đa dạng về kích thước, hình dạng

(tron, thoi, bau duc )

‹Có cả tế bào đơn và cụm tế bào, mảnh mồ nhỏ do khi thao tác

chưa huyền phù đủ mạnh và đủ

lâu

Mật độ tế bào: 1,032.107 (tế

bao/ml)

3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ị

3.3 NGÀY 3: THAY MỖI TRƯỜNG LẦN 1

Môi trường nuôi cấy chuyển từ hồng sang vàng cam do pH môi trường giảm

- Trước khi thay môi trường: Quan sát được có rất nhiều tế bào có hình dạng tròn (không bám

dính), rất ít tế bào hình thoi dài (bám dính) > lượng tế bào bám dính rất ít

- Sau khi thay mồi trường: °

-Thấy có nhiều tế bào hình thoi dài do ban đầu có thể bị các tế bào khác che lấp không thấy được

‹Các tế bào hình tròn không bám dính được đã bị loại bỏ theo môi trường cũ.

3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ị

3.4 NGÀY 4: THAY MỖI TRƯỜNG LẦN 2

v S$o với sau khi thay môi trường lần 1 thì thay môi trường lần 2: các tế bào bám dính (tế bào tủy xương chuột, hình thoi dài) xuất hiện nhiều hơn, mật độ dày đặc hơn do thời gian nuôi cấy đã đủ dài

để tế bào phân chia, đồng thời các chất dinh dưỡng nuôi tế bào cũng được cung cấp đây đủ và môi

* Lượng tế bào tăng sinh chưa đủ để thực hiện cấy chuyền.

3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.4 NGÀY 4: ĐÔNG LẠNH VÀ GIẢI ĐÔNG

v Tế bào chết là màng tế bào bị vỡ, có hiện tượng

v Một số lỗi thao tác mắc phải: nhỏ dung dịch giải

đồng quá nhanh, bị bọt ở miệng bình Roux

18

4 ĐỀ XUẤT VÀ KIẾN NGHỊ

Thời lượng khóa thực tập cần kéo dài hơn để sinh viên có thể quen

hơn với các thao tác nuôi cấy tế bào

Thời gian khóa thực tập cần sắp xếp hợp lý hơn để kéo dài thời

lượng

Cần có một ngày để sinh viên luyện tập trước các quy trình căn

bản vì các quy trình này là mới đối với hầu hết sinh viên

PHAN 2: THU TINH TRONG ONG NGHIÊM

Một số phương pháp được học trong

khóa thực tập

Kết quả và biện luận Những điều cần lưu ý

Đề xuất và kiến nghị

1 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC HỌC TRONG KHÓA THỰC TẬP

1.1 PHƯƠNG PHÁP LỌC DẦU KHOÁNG

» Tác dụng của dầu khoáng:

* Ngăn cản sự xâm nhập của các vỉ khuẩn, bào tử nấm

* Ngăn cản sự bốc hơi của môi trường

v Tạo sự ổn định về áp suất thẩm thấu, pH

‹»Phương pháp:

Hút dầu khoáng vào xilanh

+ Gắn xilanh lên màng lọc dầu khoáng

* Đặt bộ dụng cụ lọc dầu khoáng lên falcon

* Bơm dầu khoáng vào falcon thông qua màng lọc

s* Một số lưu ý

Không để màng lọc dầu tiếp xúc với các vật thể khác

* Dùng lực mạnh 2l

1 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC HỌC TRONG KHÓA THỰC TẬP

1.2 PHƯƠNG PHÁP KÉO PIPET PASTEUR

s* Pipette Pasteur là pipette thủy tỉnh, sử dụng trong thao tác

chuyển trứng, phôi vào các vi giọt trong quá trình giữ trứng, và thụ

tỉnh

s*Phương pháp:

- Để khoảng giữa ống thủy tỉnh trên ngọn lửa đèn cồn, xoay đều cho đến khi thủy tỉnh chảy ra, mang ra khỏi ngọn lửa và kéo đều tay

- Dùng dũa khứa một đường trên thân mới kéo > Dùng kẹp bẻ, bo

phần dư > dùng dũa để tạo phần đầu pipette bằng phẳng hơn

22

1 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC HỌC TRONG KHÓA THỰC TẬP

1.2 PHƯƠNG PHÁP KÉO PIPET PASTEUR

ss» Một số lưu ý:

Tùy vào kích thước của trứng/

phôi mà ta kéo đầu pipette có

kích thước phù hợp

- Kéo đầu lớn: hơ đoạn dài

trên thân, kéo khoảng ngắn

- Kéo đầu nhỏ: hơ đoạn

ngắn, kéo khoảng dài

23

1 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC HỌC TRONG KHÓA THỰC TẬP

1.3 PHƯƠNG PHÁP TẠO VI GIỌT

Vi giọt là mỗi trường giữ

trứng, phoi va la moi trường thụ

s»Vi giọt ngập trong dầu khoáng 2 giọt 10 ul Fertimed

đề tránh sự xâm nhập của vị MS 2 giọt 10+40 ul Fertimed

sinh vật và ngắn sự thoát hol Beni 4 giọt 10+40 ui Embryo

nước của vỉ giọt

s+» Có hai loại vi giọt: Vi giọt đứng

và vỉ giọt nằm

24

1 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC HỌC TRONG KHÓA THỰC TẬP

1.4 PHƯƠNG PHÁP GAY ME CHUOT

Gây mê chuột để thuận tiện hơn trong quá trình thu trứng

và thu tỉnh, tránh các tổn thương cho chuột cũng như ảnh

hưởng đến kết quả thí nghiệm

s* Liều lượng : 1mIl/ lần

s*Tùy vào tuổi đời và sức chịu đựng của chuột mà cần tiêm

liều lượng cho phù hợp

s+*Lưu ý: tiêm vào cơ, tránh tiêm vào xương, tránh gây chảy

máu, thời gian cho mỗi liều gây mê trung bình khoảng 30

phút.

1 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐƯỢC HỌC TRONG KHÓA THỰC TẬP

1.5 NGUYÊN TẮC CHỌN GIAO TỬ

*Nguyên tắc chọn giao tử cái:

Vv Mau sac: sang, thé cực lớn

Y Trifng tron déu, khong thay duoc nhân

v Tế bào chất min

Nguyên tắc chọn giao tử đực:

v Thu tỉnh từ ống dẫn tỉnh, tách mỡ thừa

* Cho vào dung dịch Swim up, thu tinh ở mặt trên tinh

trùng khỏe, bơi tốt, khả năng chịu đựng cao.

2 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

2.1 CHUAN BI TRUNG

2.1.1 Thu nhận trứng

v Giao tử cái được thu từ một phần tử cung, ống dẫn trứng và buồng

trứng

Quan sát dưới kính hiển vi soi nổi> dò tìm đoạn phình to ra, đây

chính là đoạn bóng > xé đoạn bóng > cụm trứng chui ra > tiến hành thu cụm trứng bằng pipette pasteur và xử lý

2.1.2 Phân loại trứng

v«x Trứng trưởng thành: có một thể cực, một noãn hoàn lớn và không

thấy được nhân, có lớp tết bào cumulus bao quanh

v Trứng non: không nhìn thấy nhân

2 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

2 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

—> Mật độ tỉnh trùng: x 10 x 2=B,08*10Ê > chưa đạt mức tối ưu

=_ Độ dị hình của tỉnh trùng: đa dạng nhiều loại như đầu vô định hình, không có đầu, đầu ghim, đầu

= KhOngco su xuat hién cua mảnh vỡ tế bào và các tế bào khác như hồng cầu và bạch cau.

2 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

2 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

yam One

Đánh giá trứng sau khi chuyển phôi

1 Không xảy ra thụ tỉnh

2 Tể bào chất bên trong trào ra

ngoài nhưng vẫn còn dính với tế

2 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3 KẾT LUẬN

s* Thu giao tử cái:

- - Phẫu thuật chuột và thu một phần ống dẫn trứng + buồng trứng

°‹ - Thu cụm trứng > xé đoạn bóng và thu được 3 trứng

‹Ò - Trứng tròn, có lớp cumulus, té bao chất đều, không thấy nhân

-© Chuột khỏe mạnh sau khi thu giao tử

=" Trứng chết và tỉnh trùng yếu nên sau 43h thụ tỉnh không thu được phôi

: Không thực hiện được kỹ thuật nhuộm Hoechst — PI để phân biệt phôi

sống/chết

>Thụ tỉnh trong ống nghiệm không thành công

s» Chuột thí nghiệm

“" Chuột đực: chết, nguyên nhân có thể do sốc thuốc mê

=" Chuột cái: hồi phục, vết mổ lành

35

MỘT SỐ VẤN ĐỀ LƯU Ý/KHÓ KHĂN TRONG KHÓA

THỰC TẬP

- Không có đủ thời gian để luyện tập các thao tác như kéo kim, tạo vi giọt, chuyển trứng dẫn tới việc lúng túng và dễ mắc sai lầm trong lúc làm thí nghiệm

-_ Không đủ thiết bị và dụng cụ để tất cả các thành viên trong nhóm được làm quen

với tất cả các thao tác và thực hiện một cách nhuần nhuyễn

- _ Thao tác mổ chuột không nhanh, làm quá thời gian gây mê nên chuột phải tiêm

thuốc gây mê lần 2 > gây ảnh hưởng đến sức khỏe của chuột

-_ Thời gian khóa thực tập khá ngắn nên một số thao tác phải nhờ thầy cô làm giúp

- Kết quả thụ tỉnh không thành công nên không làm quen được các thao tác sau thụ tỉnh

36

4 ĐỀ XUẤT VÀ KIỂN NGHỊ

v Kéo dài khóa thực tập để sinh viên có cơ hội thực hành nhiều hơn

vThời gian thực tập hợp lý hơn, để sinh viên có thể làm quen với tất

cả các thao tác

v Mỗi nhóm cần ít nhất 2 chuột để tiến hành thu tỉnh và trứng, theo

dõi sức khỏe của chính chuột nhóm mình, từ đó biết được sự ảnh hưởng của các yếu tổ bên ngoài đến quá trình làm thí nghiệm

37

XIN CAM ON THAY CO DA CHU Y

LANG NGHE!