Giới thiệu Để thực hiện phương pháp nuôi cấy tế bào thành công, việc chuẩn bị hệ thống nuôi cấy có điều kiện phù hợp để tế bào sống và biểu hiện các đặc điểm di truyền là rất cần thiết. Nhìn chung có thể chia làm hai kiểu nuôi cấy là: hệ thống nuôi cấy khép kín (đóng không liên tục) và hệ thống nuôi cấy mở (nuôi cấy liên tục). Trong nuôi cấy khép kín, một số thành phần thiết yếu không được cung cấp cũng như không loại bỏ các sản phẩm và chất loại thải trong suốt quá trình nuôi cấy. Trái lại, hệ thống nuôi cấy mở nuôi cấy liên tục có thể duy trì điều kiện nuôi cấy ( thành phần chất dinh dưỡng, pH, chất thải loại,…) ổn định trong suốt quá trình nuôi cấy.
Trang 1ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
KHOA SINH HỌC
TIỂU LUẬN MÔN:
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chủ đề:
NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
Giáo viên hướng dẫn: Học viên thực hiện:
PGS.TS TRẦN QUỐC DUNG 1) PHAN MAI MINH TÂM
Lớp: LL & PPDH SINH HỌC K24 2) PHẠM THÀNH ĐỊNH
Lớp: Động vật học - K24
Trang 2NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
CƠ SỞ KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT CÓ VÚ
Trình bày bởi: Kiran N.Birje
M.Sc.II
Giới thiệu
- Để thực hiện phương pháp nuôi cấy tế bào thành công, việc chuẩn bị hệ thống nuôi cấy có điều kiện phù hợp để tế bào sống và biểu hiện các đặc điểm di truyền là rất cần thiết
- Nhìn chung có thể chia làm hai kiểu nuôi cấy là: hệ thống nuôi cấy khép kín (đóng/ không liên tục) và hệ thống nuôi cấy mở (nuôi cấy liên tục)
- Trong nuôi cấy khép kín, một số thành phần thiết yếu không được cung cấp cũng như không loại bỏ các sản phẩm và chất loại thải trong suốt quá trình nuôi cấy
- Trái lại, hệ thống nuôi cấy mở / nuôi cấy liên tục có thể duy trì điều kiện nuôi cấy ( thành phần chất dinh dưỡng, pH, chất thải loại,…) ổn định trong suốt quá trình nuôi cấy
Trang 3HỆ THỐNG NUÔI CẤY KHÉP KÍN
(Nuôi cấy không liên tục)
- Trên cơ sở tính đồng đều của các thành phần trong hệ thống, nuôi cấy khép kin/không liên tục có hai hình thức là nuôi cấy theo mẻ và nuôi cấy dòng đệm; cả hai hình thức phải đảm bảo mọi vị trí các chất được trộn đều
- Mẻ nuôi cấy: Một lô hay hệ thống nuôi cấy sắp xếp thông thường và được thêm chất chủng ngừa(trong trường hợp của các tế bào ATC) vào trong bể nuôi cấy ngay từ đầu của quá trình; sau đó ủ ở nhiệt độ thích hợp và môi trường khí trong một thời gian thích hợp
HỆ THỐNG NUÔI CẤY THEO MẺ
( Batch culture system)
Nuôi cấy theo mẻ được sử dụng rộng rãi trong một số quá trình sản xuất công nghiệp, ví dụ như công nghiệp rượu bi; mục đích của nó là làm dễ quá trình nuôi cấy; khử trùng ít nghiêm ngặt hơn; dễ điều chỉnh thành phần dinh dưỡng
Thuận lợi nữa là sử dụng lao động phổ thông không yêu cầu kỹ thuật và ít rủi ro về tài chính
Nhược điểm:
Quá trình hình thành sản phẩm được giới hạn trong một khoảng thời gian nhất định Ví dụ như sản phẩm lên men
Trang 4( Open culture system)
- Để day trì ổn định trạng thái nuôi cấy, nghĩa là điều chỉnh điều kiện nuôi cấy luôn đáp ứng nhu cầu sinh lý của tế bào, cần phải thường xuyên bổ sung chất nền (chất dinh dưỡng và các thành phần thiết yếu khác) và đồng thời loại bỏ sản phẩm cuối cùng ra khỏi bể nuôi cấy
- Như vậy, một môi trường nuôi cấy vô trùng được liên tục bổ sung các chất nền thêm vào bình nuôi cấy (bể phản ứng sinh học = bioreactor), đồng thời làm loãng sản phẩm cuối cùng được tích lũy trong hệ thống
Đây còn thường được gọi là hệ thống nuôi cấy liên tục.
Có 3 kiểu hệ thống nuôi cấy mở khác biệt nhau là:
1 Nuôi cấy liên tục chemostat (Chemostat culture) là một phương pháp
nuôi cấy liên tục trong đó một dòng chảy của môi trường mới được đưa vào
bể nuôi cấy với một tỷ lệ được xác định và do đó tốc độ tăng trưởng được giữ không đổi
Trong nuôi cấy hóa ổn định (chemostat culture) thì tỉ lệ pha loãng (D= F/V)
là không đổi
• Ưu điểm:
- Biết được tốc độ tăng trưởng của dòng tế bào trong quá trình nuôi cấy
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy mà không can thiệp vào tốc độ tăng trưởng
- Duy trì sản lượng tối đa của sinh khối hay sản phẩm
Trang 52 Nuôi cấy liên tục Turbidostat (Turbidostat culture) làmột phương pháp nuôi cấy liên tục trong đó mật độ tế bào được giữ ở một mức độ xác định bằng cách hòa loãng môi dịch nuôi cấy với môi trường mới bằng một hệ thống tự động
- Trong turbidostat, nồng độ sinh khối trong dòng dịch nuôi cấy được duy trì ở mức không đổi bằng cách giám sát độ đục của dịch nuôi cấy thông qua việc sử dụng các tế bào quang điện và điều chỉnh tỷ lệ cung cấp dung dịch dinh dưỡng vào hệ thống
- Ưu điểm:
Phù hợp trong trường hợp tế bào sinh trưởng chậm; hoặc sinh vật nhỏ bé
và những tế bào có chu kỳ phức tạp
Trang 63 Nuôi cấy liên tục Fed-batch(Fed-batch culture): là của một cách nuôi
cấy theo mẻ nhưng có một phương tiện hỗ trợ để thêm chất dưỡng vào nhằm ngăn chặn sự suy giảm chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy, nhưng không loại bỏ sản phẩm cho đến khi kết thúc quá trình nuôi cấy
NUÔI CẤY TẾ BÀO SƠ CẤP
- Các tế bào khi được di chuyển bằng cách phẫu thuật hoặc enzyme từ một bộ phận hoặc cơ thể vào môi trường nuôi cấy thích hợp thì các tế bào sẽ thích ứng và phát triển gọi là nuôi cấy sơ cấp
- Tế bào sơ cấp có tuổi thọ nhất định
- Nuôi cấy sơ cấp tạo ra một tập hợp các tế bào rất phức tạp không đồng nhất
- Sự truyền cấy các tế bào sơ cấp tạo ra một thế hệ của các dòng tế bào
- Dòng tế bào có tuổi thọ xác định, chúng biến đổi một thời gian ngắn trước khi bị lão hóa
- Các đại thực bào và tế bào thần kinh không phân chia
- Dòng của tế bào cơ thể hình thành từ nuôi cấy sơ cấp còn gọi là một dòng tế bào
• DÒNG TẾ BÀO LIÊN TỤC (CONTINUOUS CELL LINES)
- Hầu hết các dòng tế bào phát triển qua một số thế hệ sau đó dừng, không tiếp tục phân chia
- Dòng tế bào bình thường có thể hoặc do tự động hoặc do tác động của virut hoặc do biến đổi sinh hóa tạo thành dòng tế bào liên tục
- Đặc điểm của dòng tế bào liên tục là:
+ Nhỏ, tuổi thọ dài/ trải qua nhiều thế hệ, kém bám dính với tỉ lệ nhân/tế bào chất cao
+ Chắc chắn sinh trưởng trong môi trường thích hợp và có bộ NST không đổi
+ Giảm lượng nước trong tế bào; phụ thuộc vào sự neo đậu và phát triển mạnh trong điều kiện treo
Trang 7+ Có khả năng phát triển/ phân chia đến khi mật độ tế bào trong môi trường cao
CÁC DÒNG TẾ BÀO ĐỘNG VẬT ĐÃ NUÔI CẤY THÀNH CÔNG
( Common cell lines)
• Human cell lines/ Các dòng tế bào người:
- MCF-7 breast cancer / tế bào ung thư vú
- HL 60 Leukemia / tế bào bạch cầu
- HEK-293 Human embryonic kidney / tế bào thận
- HeLa Henrietta lacks/
• Primate cell lines/ Các dòng tế bào cơ bản:
- Vero African green monkey kidney epithelial cells/
Các tế bào biểu mô thận khỉ xanh châu Phi
- Cos-7 African green monkey kidney cells/
Các tế bào thận khỉ xanh châu Phi
-Và nhiều dòng tế bào khác như dòng tế bào buồng trứng (CHO) của chuột, sf9 và sf21 từ côn trùng
• CÁC BƯỚC NUÔI CẤY TẾ BÀO SƠ CẤP
Nuôi cấy tế bào sơ cấp gồm các bước sau:
1 Thu mẫu
2 Tách mô
3 Mổ xẻ mô/ hoặc pân tách tế bào
4 Đưa tế bào vào bể nuôi cấy(bioreactor) và thực hiện quá trình nuôi cấy
Trang 8• LƯU Ý KHI TÁCH TẾ BÀO
Có 3 cách phân tách tế bào:
- Cắt nhỏ mô thu được
- Phân tách tế bào bằng cơ học/ xay nghiền cần hoặc không cần ngâm
- Dùng enzyme để các tế bào
KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ CƠ BẢN
- Phát triển ban đầu bởi Harrison vào năm 1907
- Một mảnh của mô nhúng trong huyết tương máu hoặc bạch huyết +huyết thanh chiết xuất từ phôi thai
- Được đặt trên một lam kính có một chỗ lõm
- Ngưng đọng tổ chức mô lại với nhau
- Tế bào phát triển, phân chia, tăng số lượng
- Nó cũng được gọi là nuôi cấy giọt treo.
KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ CẢI TIẾN
- Cắt nhỏ mô
- Rửa sạch với PBS hoặc BSS
- Cấy lên bề mặt chất nền nuôi cấy
- Rồi bổ sung thêm huyết thanh
- Tế bào bám vào bề mặt và phân chia
Trang 9PHÂN TÁCH BẰNG ENZYME
- Enzyme sử dụng trong phân tách tế bào là trypsin + EDTA hoặc chỉ trypsin
- Trypsin ấm (warm trypsin): Ngâm mô với trypsin ở 37oC + sau đó di
chuyển( tách) bằng cách ly tâm + rồi trung hòa với huyết thanh
- Trypsin lạnh (cold trypsin): Ngâm mô trong trypsin ở 4oC trong 6 đến 18 giờ sau đó ủ ở nhiệt độ 37oC trong 20 đến 30 phút thì các tế bào bị tách rời
Hiệu quả của các loại enzyme khác nhau
Trypsin và Pronase cho phân tách
hoàn toàn
Collagenase và dispase phân tách
không hoàn toàn
Trypsin và Pronase có thể làm hỏng các tế bào
Collagenase và dispase ít gây tổn thương tế bào hơn
Hyaluronidase + Collagenase tiêu hóa nội bào chất gian bào
DNase – phân giải DNA giải phóng ra từ các tế bào bị tan
Sự khác nhau giữa trypsin ấm và trypsin lạnh
- Thời gian ngăn hơn
- Năng suất thấp hơn
- Đòi hỏi phải ly tâm sau khi
ngâm
- Cho năng suất cao hơn nhờ cải thiện sự sống của tế bào sau khi nuôi cấy 24 giờ
- Không cần thiết khuấy hoặc ly tâm
- Ủ ở 4oC, có thể được thực hiện qua đêm
- Đối tượng là các cơ quan của phôi thai
Các điều kiện nào cần thiết nhất cho các quá trính nuôi cấy thành công:
- Mỡ và mô hoại tử được loại bỏ trong quá trình bóc tách tế bào
- Khi cắt (mô) nên dùng các dụng cụ thật sắc nhọn
- Nên sử dụng Enzyme khác nhau trong phân tách tế bào
- Mật độ của tế bào sơ cấp lớn hơn trong nuôi cấy thay thế/ truyền cấy
- Nên lựa chọn phương tiện vừa phải
- Nên lựa chọn nguyên liệu nuôi cấy là tế bào mô phôi thai
PHÂN TÁCH CƠ HỌC
- Thu thập các tế bào tách ra khi cắt mô.(tế bào nào dính thì nạo ra)
- Nhấn Sieving( dụng cụ có đầu có lỗ nhỏ như rây) lên mô để các tế bào bị tách ra và đi qua lỗ rây
- Lấy các tế bào trong các mảnh vỡ còn sót vào xilanh
- Dùng pipette trộn mẫu mô liên tục, nhẹ nhàng, khéo léo để các tế bào tách rời nhau Các mẫu mô có thể là lá lách, gan phôi thai, não phôi thai hoặc người lớn và một số khối u mềm của người và động vật
Trang 10PHÂN TÁCH TẾ BÀO
- Có 2 phương pháp phổ biến để tách các tế bào được phân biệt nhau ở kích cỡ, mật độ, điện và diện tích bề mặt
1 Đo dòng tế bào (Flow cytometry): đo lường độ sáng các tế bào trên
bề mặt nuôi cấy
2 Flow cytofluorimetry: fluorochromes cụ thể gắn liền với các tế bào
và các tế bào được tách ra trên cơ sở phát sáng của một số chất dưới tác dụng của bức xạ
Cả hai phương pháp này có thể thực hiện thành công khi sử dụng các chất phát sáng dưới tác dụng của bức xạ
Kích hoạt tế bào Sorter (FACS)
Các phương pháp vật lý:
1 Tách dựa trên kích cỡ tế bào: nằng máy ly tâm v = r2.4
2 Tách dựa trên mật độ tế bào:mật độ chênh lệch gradient thích hợp sử dụng Chủ yếu là trong ATC percoll, Metrazami
3 Tách dựa trên điện trên bề mặt: điện
4 Tách dựa trên mối quan hệ về cấu trúc: sắc ký
Sử dụng kháng sinh hoặc lectin
SỐ LƯỢNG TẾ BÀO TỒN TẠI
Hemacytometer:
Hemacytometer có một số lượng xác định dưới bề mặt môi trường nuôi cấy Nó có thể xác định số lượng các tế bào sống và số lượng tế bào chết trên mỗi ml môi trường
Nồng độ tế bào của dịch treo tương tự như tế bào gốc ngưng hoạt động, sẽ giống nhau ở các buồng bất kỳ- ngoại trừ sự pha loãng
Các tế bào chết bắt đầu bị loãng màu, chuyển màu xanh và xuất hiện các vết loang màu xanh dưới kính hiển vi Các tế bào sống ngăn chặn sự chuyển màu
và có màu sáng trắng Vì thể có thể tính toán được số lượng và tỉ lệ tế bào sống sót
- Xác định số lượng tế bào sống theo công thức sau:
Tổng số tế bào sống
% Tế bào tồn tại = - x 100
Tổng số tế bào sống và không sống
Số tế bào/ml = Tổng số tế bào sống trong 4 ô/4 x 10,000
Số tế bào/ml= Tổng số tế bào sống trong 5 ô/5 x 10,000
Trang 11DUY TRÌ NUÔI CẤY HẰNG NGÀY
- Yêu thích công việc
- Quan sát hằng ngày!!!
+ Về hình thái
+ Về mức độ phù hợp của pH
+ Chất thải trong môi trường/ mức ô nhiễm của môi trường nuôi cấy Kiểm tra bình nuôi cấy các điều kiện thiết lập và mức độ của CO2
Xem mức độ cả trong lồng ủ cả trong thùng về:
+ Nhiệt độ
+ Mực nước/ lượng nước
DUY TRÌ DINH DƯỠNG TRONG NUÔI CẤY
- Để quá trình nuôi cấy thành công đòi hỏi phải duy trì nguồn dinh dưỡng đầy đủ hàng ngày
- Thiết lập và duy trì nguồn dinh dưỡng cho một chuỗi thí nghiệm với mật độ
tế bào xác định, phương tiện thiết bị và điều kiện trong lồng kính
- Bổ sung thêm bình quân hàng ngày, theo định kỳ trước khi một chất nào đó
bị cạn kiệt
- Lượng cung cấp dinh dưỡng tùy thuộc vào mật độ tế bào trong bình nuôi cấy
- Sự cung cấp nguồn dinh dưỡng tuân theo lịch trình xác định
NUÔI CẤY KHÔNG CÓ KHÁNG SINH
- Việc gián đoạn sử dụng kháng sinh trong điều kiện nuôi cấy bình thường sẽ đáng giá được mức độ xâm nhiễm của vi sinh vật lên tế bào
- Một số phòng thực hiện hai mẫu nguồn dự trữ của cùng một dòng tế bào, một mẫu bình thường đầy đủ nguồn dự trữ và một mẫu có chất kháng sinh
và chống nấm tự do trung bình
- Nuôi cấy có kháng sinh thông thường tự do là sự cần thiết
- Một loại kiểm tra đơn giản được sử dụng là mô hình vỏ bọc
- Sự nhiễm khuẩn Mycoplasma có thể là khó khăn dẫn đến sự hủy diệt/ chết hang loạt
- Các loại sinh vật này có thể gây ra một số vấn đề nghiêm trọng như là tính toán các tế bào chết và cũng có thể dẫn đến sự thay đổi trong cấu trúc và chức năng của tế bào nhân thực, trao đổi chất và tăng trưởng đặc điểm mà
có thể không được biểu hiện rõ ràng đối với nhiều thế hệ tế bào
Trang 12CÁC LOẠI HÌNH NUÔI CẤY TẾ BÀO
A Nuôi cấy đơn lớp (Monolayer culture)
- Trong nuôi cấy tế bào một lớp có một lớp tế bào mà không có tế bào đang phát triển trên tế bào khác nhưng tất cả chúng đều đang phát triển bên cạnh nhau và thường xuyên chạm vào nhau trên bề mặt cùng tăng trưởng
- Hầu hết các dòng tế bào động vật và nuôi cấy sơ cấp tăng trưởng là sự dày lên của lớp tế bào hoặc tấm gắn liền với một loại chất nền nhựa hoặc thủy tinh
- Một phần bề mặt chất nền được che phủ bởi các tế bào (một tập hợp nuôi cấy), sự phát triển chậm lại và sáu đó chấm dứt Do đó để giữ được các tế bào khỏe mạnh và phát triển một cách mạnh mẽ thì cần thiết phải nuôi cấy lại chúng một cách thường xuyên
Ưu điểm của nuôi cấy tế bào một lớp:
- Dễ dàng hơn thực hiện, nhưng đòi hỏi kiểm tra số lượng tế bào và khả năng sống của chúng hàng ngày
- Không đòi hỏi tách tế bào bằng enzyme hoặc cơ học
- Tăng trưởng bị hạn chế bởi sự tập trung của các tế bào trong môi trường, nhưng dễ dàng mở rộng quy mô
- Được sử dụng cho sản xuất số lượng lớn protein, thu hoạch hàng loạt, và nhiều ứng dụng nghiên cứu
B.Nuôi cấy huyền phù (Suspension culture)
- Phần lớn nguồn gốc của các tế bào lấy từ động vật có xương sống, ngoại lệ
có dòng tế bào tạo máu và một vài loại tế bào khác, đang neo phụ thuộc và
Trang 13phải được nuôi cấy trên một chất nền thích hợp được xử lý đặc biệt để cho phép tế bào kết dính và lan rộng (nghĩa là xử lý mô nuôi cấy) Cho phép nhiều dòng tế bào có thể thích hợp với nuôi cấy huyền phù Tương tự, một
số dòng tế bào côn trùng có bán sẵn phát triển rất tốt trong nuôi cấy đơn lớp hoặc nuôi cấy huyền phù
- Các tế bào được nuôi cấy trong huyền phù có thể được duy trì trong bình nuôi cấy mà không phải xử lý nuôi cấy mô, nhưng khi khối lượng nuôi cấy
có diện tích bề mặt tăng cao mà không đủ khí trao đổi (thường là 0,2 – 0,5 ml/cm2) thì cần khuấy, lắc hoặc xoay mòng bình nuôi
C Nuôi cấy MICROCARRIER
- Một microcarrier là một khuôn hỗ trợ sự tăng trưởng của các tế bào dính trong bể phản ứng sinh học (bioreactor)
- Các microcarrier được chế tạo từ một số vất liệu quan trọng gồm DEAE-dextran, thủy tinh, nhựa giữ nhiệt, acrylamide, và collagen và các chất liệu này, cùng với chất hóa học bề mặt khác nhau, có thể ảnh hưởng đến các tế bào cả hình thái học và sự phát triển
- Một vài loại microcarriers có bán trên thị trường bao gồm microcarrier dextran-based (cytodex, GE Healthcare), microcarrier collagen-base
(cultispher, percell), và microcarrier polystyrene- base (Solo Hill
Engineering) Chúng khác nhau ở trạng thái rổ của nó, trọng lượng riêng, tính chất quang học, sự hiện diện của các thành phần động vật và chất hóa
Trang 14- Kiểu nuôi cấy tế bào Microcarrier thường được thực hiện trong bình
spinner, mặc dù khác như bình phản ứng sinh học quay không trọng lực hoặc bình phản ứng sinh học tầng sôi cũng có thể hỗ trợ các nuôi cấy microcarrier
- Nuôi cấy Microcarrier giới thiệu những khả năng mới và lần đầu tiên có thể làm cho nuôi cấy các tế bào neo phụ thuộc trong thực tế có năng suất cao
- Trong nuôi cấy microcarrier các tế bào phát triển một lớp trên bề mặt của bình cầu nhỏ
- Bằng cách sử dụng microcarriers trong hệ thống nuôi treo đơn giản, nó có thể để đạt được năng suất một triệu tế bào trong một mililit
• Những ưu điểm của công nghệ microcarrier trong ngành sản xuất vaccine là:
(a) Dễ thiết lập quy mô sản xuất lớn,
(b) Khả năng kiểm soát chính xác các điều kiện tăng trưởng tế bào một cách tinh vi nhờ hệ thống máy tính,
(c) Giảm không gian sàn và khối lượng lồng ấp cần thiết cho một hoạt động sản xuất được kích thước,
(d) Giảm nhu cầu lao động kỹ thuật