nuôi cấy tế bào động vật thụ tinh trong ống nghiệm

NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬTTHỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM PHẦN 1 PHẦN 2... Môi trường màu vàng nâu, do tế bào sinh trưởng-> một số chất có tính acid-> chuyển màu Pronormoblast, myeloblast, neu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

KHOA SINH HỌC-CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Báo cáo THỰC TẬP CHUYÊN NGÀNH

1

NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

PHẦN

1

PHẦN

2

NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

THU XƯƠNG ĐÙI VÀ XƯƠNG CẲNG CHÂN CHUỘT

THU QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNG XÁC ĐỊNH MẬT ĐỘ TẾ BÀO

NUÔI TẾ BÀO TỦY XƯƠNG SAU 2 NGÀY THAO TÁC THAY MÔI TRƯỜNG

CẤY CHUYỀN VÀ ĐÔNG LẠNH GIẢI ĐÔNG VÀ HOẠT HÓA TẾ BÀO

1.1

1.2

1.3

1.4 1.5 1.6

1.7

PHẦN 1:

Sơ đồ phòng thí nghiệm

Pha PBS:

Phòng thay đồ

Phòng hấp rửa Phòng sinh học

phân tử

Phòng nuôi cấy tế bào Phòng IVF

*Cửa ra vào có máy quét phân quyền sử dụng -> an toàn, bảo mật

*Các phòng được phân cách và bố trí dựa theo mức độ vô trùng: phòng nuôi cấy tế bào cần

mức độ vô trùng cao -> trước khi vào cần qua phòng thổi khí (Air shower)

Dụng cụ:

Duran 1L, Erlen 1L, giấy bac, giấy trắng, giấy chỉ thị nhiệt, máy hấp, máy khuấy từ, cá khuấy

từ, cân phân tích, giấy cân, nước cất 1 lần, nước cất 2 lần, ống đong 1L, găng tay, thun

Thành phần trong 1L

Nuôi cấy tế bào động vật là kĩ thuật cơ bản cần nắm để tiến hành những thí nghiệm liên quan đến tế bào động vật, đóng vai trò

quan trọng trong các nghiên cứu Y, Sinh, Dược.

ĐẶC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ (MSC)

Đặc điểm hình dạng

Thuôn dài, như nguyên bào sợi.

Đặc điểm in vitro (theo Dominici và cộng sự, 2006)

1 Bám dính lên plastic ( trong điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn)

2 Kháng nguyên bề mặt đặc trưng (CD105, CD73, CD90), không biểu hiện CD45,

CD34, CD14 or CD11b, CD79α or CD19 and HLA-DR.

3 Biệt hóa thành nhiều loại tế bào: sụn, xương, mỡ (TBG đa năng)

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT

1.1 THU NHẬN XƯƠNG ĐÙI VÀ XƯƠNG CẲNG CHÂN CHUỘT

Thu chân sạch lông, da => Falcon 15ml PBS

Thu được toàn vẹn chân chuột gồm xương đùi, xương cẳng chân, phần khớp không bị cắt phạm, nhưng còn dính lông.

1.2 THU NHẬN QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNG

Mẫu vật: Xương đùi chuột

- Đĩa petri đường kính 9-10cm, Becher 50ml

- Giá để falcon, Pipette, Kim tiêm 1ml

Cắt đầu xương, bơm rửa tủy xương bằng DMEM/F12 FBS

10%

flask

Soi dưới kính hiển vi

nuôi

Khó khăn Cách khắc phục

Mỏi tay trong quá

trình loại bỏ cơ Đặt kéo, kẹp gác lên miệng đĩa petri, để tay nghỉ

Khó tách sạch cơ Cắt riêng 2 khúc xương ->

tách cơ từng khúc một

KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH

1.2 THU NHẬN QUẦN THỂ TẾ BÀO TRONG TỦY XƯƠNG

Ø Hình thái Dự đoán loại tế bào 20-90µm Hơi tròn,

viền lồi lõm Megakaryocyte, hủy cốt bào, Promegakaryocyte 12-20µm Tròn/hơi

bầu dục, viền rõ

Pronormoblast, myeloblast, neutrophilic myelocyte, eosinophilic myelocyte, eosinophil, basophilic myelocyte, lymphoblast,

prolymphocyte, lymphocyte, plasma cell, monoblast, promonocyte, monocyte, Megakaryoblast, promyelocyte

10-15µm Tròn/hơi

bầu dục, viền rõ

basophilic normoblast, neutrophilic metamyelocyte, neutrophilic band, segmented neutrophil, eosinophilic metamyelocyte,

eosinophilic band, basophilic metamyelocyte, basophilic band, basophil,

8-10µm tròn Orthochromic normoblast, reticulocyte,

Polychromatic erythroblast 7-8µm Tròn, lõm ở

giữa

Hồng cầu

Bảng 1: Các loại tế bào trong tủy xương chuôt

(Bảng 1 theo Bernadette F Rodak and Jacqueline H Carr,

Clinical Hematology Atlas, 5th ed.2016)

-Epp chứa 3 giọt dung dịch tế

bào trong tủy xương

Môi trường màu vàng nâu, do tế

bào sinh trưởng-> một số chất

có tính acid-> chuyển màu

Pronormoblast, myeloblast, neutrophilic myelocyte, eosinophilic myelocyte, eosinophil, basophilic

myelocyte, lymphoblast, prolymphocyte, lymphocyte, plasma cell, monoblast, promonocyte, monocyte, Megakaryoblast, promyelocyte

10-15µm Tròn/hơi

bầu dục, viền rõ

basophilic normoblast, neutrophilic metamyelocyte, neutrophilic band, segmented neutrophil, eosinophilic metamyelocyte, eosinophilic band, basophilic

metamyelocyte, basophilic band, basophil,

8-10µm tròn Orthochromic normoblast, reticulocyte, Polychromatic

erythroblast 7-8µm tròn Hồng cầu

Bảng 2: Các loại tế bào trong tủy xương chuột sau 2 ngày nuôi

(Bảng 2 theo Bernadette F Rodak and Jacqueline

H Carr, Clinical Hematology Atlas, 5th ed.2016)

1.5 THAO TÁC THAY MÔI TRƯỜNG

-Kính hiển vi soi ngược.

Vệ sinh, chuẩn bị & sắp xếp dụng cụ,

ủ môi trường (MT) mới

Hút bỏ MT cũ

Rửa TB= PBS 1X(2ml)

Hút bỏ PBS

Thêm 3ml MT mới(DMEM/F12)

PHƯƠNG PHÁP

3

MẪU VẬT:

- Bình Roux chứa TB đã nuôi sau

khi thu TB từ tủy xương

Màu môi trường (MT) sau khi thay: Đỏ hồng

Hình thái TB dưới kính hiển vi:

(sau khi thay MT)

Kích

70-150 µm

Trải, bám dính, sợi

50 µm Hơi tròn, viền TB lồi

lõm Hủy cốt bào,Megakaryocytes

20 -25 µm Hơi tròn Bầu dục,

viền không rõ nét, hình dạng màng biến động

Megakaryocytes, Promegakaryocytes Megakaryoblasts Hủy cốt bào

10-20 µm Tròn, viền tròn rõ

nét Nguyên hồng cầu, tiền nguyên hồng cầu,

Nguyên (tiền) tủy bào và lympho bào, bạch cầu mono 5-7 µm Tròn, viền tròn rõ

nét Hồng cầu lưới, bạch cầu, (tiền) lympho bào

1.5 THAO TÁC THAY MÔI TRƯỜNG

KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH

Bảng 3: Các loại tế bào trong tủy xương sau thay môi trường

(Bảng 3 theo Bernadette F Rodak and Jacqueline H Carr,

Clinical Hematology Atlas, 5th ed.2016)

 NHẬN XÉT - GIẢI THÍCH:

• Số lượng các tế bào không phải MSC ít hơn nhiều so với trước khi thay môi trường

 Do không có đặc tính bám dính lên plastic flask nên bị rửa trôi.

1.5 THAO TÁC THAY MÔI TRƯỜNG

KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH

 Sau thay môi trường: nhiều tế bào trải hơn, tế bào máu ít hơn

 Mật độ dày hơn lúc mới thay môi trường nhưng vẫn không đủ để cấy chuyền

Bảng 4: Các loại tế bào trong tủy xương chuột sau thay môi trường

(Bảng 4 theo Bernadette F Rodak and Jacqueline H Carr, Clinical

Hematology Atlas, 5th ed.2016)

1.6 CẤY CHUYỀN VÀ ĐÔNG LẠNH

VẬT LIỆU

HÓA CHẤT:

- Dung dịch PBS kháng sinh

- 1XTrypsin/EDTA0,25%

- Môi trường nuôi cấy

- Môi trường đông lạnh DMSO 10%

+0,5ml trypsin

+1ml môi trường nuôi cấy, huyền phù -> falcon -> ly tâm 2000rpm, 5p-> bỏ dịch nổi +1ml môi trường nuôi cấy, huyền phù đều

-4 o C Nuôi ở 37 o C, 5% CO2

+ từ từ 0,5ml môi trường đông lạnh + 2,5ml môi trường nuôi cấy

Hút 0,5ml -> cryotube Hút 0,5ml ->Flask

-80 o C -20 o C

hút bỏ môi trường cũ hút sạch PBS

ủ 37 0 C, 5% CO2, 3 phút Quan sát

30 phút 1 giờ tối đa 1 tuần

Khó khăn Khắc phục

Dễ chạm vào miệng falcon khi sử dụng ống hút Thao tác cẩn thận

Sử dụng pipet Pasteur

1.6 CẤY CHUYỀN VÀ ĐÔNG LẠNH

Mức độ che phủ của tế bào trên bề mặt flask đạt khoảng 80%

 Có thể cấy chuyền

VẬT LIỆU:

MẪU VẬT: Cryotube chứa tế bào đông lạnh

HÓA CHẤT: epp dd giải đông,

môi trường DMEM/F12 FBS 10%.

DỤNG CỤ: Falcon 15ml,

ống hút nhựa 1ml,

Becher đựng rác,bình flask 25mm2.

THIẾT BỊ: tủ an toàn sinh học cấp II,

máy Li tâm, bể ủ nhiệt, tủ nuôi tế bào

PHƯƠNG PHÁP

1.7 GIẢI ĐÔNG VÀ HOẠT HÓA TẾ BÀO

ủ 37oC, 30s

Chuyển dịch tế bào vào Falcon +

môi trường giải đôngHuyền phù mặt trên, ly tâm 1100 rpm, 5p

Bỏ nổi, thu cặn, +1 ml môi trường nuôi

3 giọt -> đếm tế bào + 2ml môi trường nuôi ->Falcon,

huyền phù và hút vào flask

tủ nuôi

1.7 GIẢI ĐÔNG VÀ HOẠT HÓA TẾ BÀO

KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH

Sau hoạt hóa: ở dạng huyền phù, phần trăm tế bào nguyên vẹn (sống) cao,tế bào nằm rời rạc

Kích thước Hình thái Dự đoán

Tỉ lệ sống =28,6/32x100= 89,38%

Kết quả đếm tế bào

(Bảng theo Bernadette F Rodak and Jacqueline H Carr,

Clinical Hematology Atlas, 5th ed.2016)

THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

THU NHẬN ỐNG DẪN TRỨNG VÀ MÀO TINH

THU NHẬN TRỨNG VÀ TINH TRÙNG ĐẾM TINH TRÙNG CHUỘT

LOẠI CUMULUS THỤ TINH

NUÔI PHÔI ĐÁNH GIÁ PHÔI SỐNG CHẾT

2.1

2.2 2.3 2.4 2.5

2.7

2.6

PHẦN 2:

Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF): kĩ thuật hỗ trợ sinh sản quan trọng

Đánh giá tinh trùng: mật độ, độ di động, độ sống chết

Đánh giá phôi sống chết: nhuộm huỳnh quang (thuốc nhuộm PI và Hoechst):

Phôi chết (màng tế bào không hoạt độngmàu đỏ PI)

Phôi sống (màng tế bào hoạt động màu xanh Hoest, không có màu đỏ PI)

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT

Sự phát triển của phôi về hình thái( Mammalian Development, Development Biology Interative)

2 CƠ SỞ LÝ THUYẾT

Buổi 1&2: Thao tác với trứng và tinh trùng heo & lọc dầu khoáng, tạo vi giọt

 Phương pháp: Đếm ô giữa buồng đếm (25 ô nhỏ)

xi lanh, đĩa petri, dd PBS, buồng trứng heo

Lưu ý:

• Hút 1 ít dịch môi trường trước khi hút trứng -> trứng không dính vào pipette & đủ lực đẩy trứng ra

• Không hút dịch lên quá cao -> trứng không vướng ở đoạn gấp khúc,

• Không bơm dịch quá mạnh -> tránh tạo bọt khí

Pipette Paster, dây truyền nước biển, xi lanh

Trứng, đĩa vi giọt tập chuyển trứng

Kính hiển vi soi nổi

Dùng pipet Paster hút và chuyển trứng dưới kính hiển vi soi nổi

Trong tủ an toàn sinh học, dùng xilanh bơm dầu khoáng qua màng lọc vô trùng-> falcon,.

 Lưu ý : Bình dầu khoáng chia 2 pha, hút pha trên.

Thu ~ 7,5ml dầu khoáng sạch.

Vi giọt nằm: 50 µl môi trường, bổ sung dầu khoáng ngập vi giọt

Vi giọt đứng: 10 µl môi trường bổ sung dầu khoáng  40 µl môi trường

Lưu ý : Dầu khoáng nặng thao tác nhanh, bơm lên thành.

2.1 THU NHẬN ỐNG DẪN TRỨNG VÀ MÀO TINH

- Khay inox, kéo thẳng, kẹp cong, kẹp thẳng

- Kim tiêm, kim khâu, chỉ khâu, băng dính, dao lam,

bông thấm, đĩa petri, đèn cồn, bật lửa, băng cá nhân

3

Cắt da, cơ

Tìm vị trí ống dẫn trứng/ mào tinh

Cắt, bảo quản trong PBS

Khâu vết mổ, dán băng

cá nhân

Kéo dãn đốt sống cổ (chuột đực)Tiêm thuốc mê (chuộc cái)

Cố định chuột lên khaySát trùng, cạo lông

Thu được: buồng trứng, ống dẫn trứng nguyên vẹn và 1 phần tử cung

mào tinh, phần cuối mào tinh đầu ống dẫn tinh và 1 phần ống dẫn tinh

• Chuột khỏe mạnh sau khi mổ

Khó khăn Cách khắc phục

Không dám kéo đốt sống/chích thuốc mê Luyện tập nhiều

Giữ nội tạng không chạm lông Sát trùng rộng, cạo lông kĩ và rộng

Khâu chỉ không chặt Cố gắng kẹp chặt, kéo căng mỗi lần thắt chỉ

Băng dính dính vào râu và lông chuột Tránh dán vào râu, khi gỡ thấm 1 ít chất sát trùng vào

băng dính (tránh dính mắt chuột)

KẾT QUẢ - GIẢI THÍCH

2.1 THU NHẬN ỐNG DẪN TRỨNG VÀ MÀO TINH

VẬT LIỆU

VẬT MẪU: Buồng trứng và ống dẫn trứng, mào tinh và ống dẫn tinh.

HÓA CHẤT: Epp PBS, epp SWM, Đĩa có vi giọt Hyaluronidase, cồn 700, 900

DỤNG CỤ: Đĩa Φ 35mm, khăn giấy, kim tiêm, kẹp, kéo nhỏ, đèn cồn

THIẾT BỊ: Kính hiển vi, bộ chuyển trứng, pipet pasteur

Tử cung, buồng trứng và ống dẫn trứng Cụm trứng

PHƯƠNG PHÁP THU TRỨNG

Cho dd PBS vào đĩa Φ 35mm

Chuyển buồng trứng và ống dẫn trứng vào

Quan sát dưới kính hiển vi, xác định

đoạn bóng Dùng 2 kim cố định và xé đoạn bóng

Quan sát KHV, xác định vị trí cụm trứng

Chuyển cụm trứng sang vi giọt

HyaluronidaseChuyển trứng sang vi giọt fertimed

Cho dd PBS vào đĩa Φ 35mm Chuyển buồng trứng và ống dẫn trứng vào

Quan sát dưới kính hiển vi, xác định

đoạn bóngDùng 2 kim cố định và xé đoạn bóng

PHƯƠNG PHÁP THU TINH

Lăn mào tinh và ống dẫn tinh trên giấy,

tách mỡDồn tinh lên cấu trúc gấpDùng kim tiêm chích

Thu dịch tinh trùng cho vào epp SWM,

cất giữ mào tinh

1 Thu tinh trùng: ống dẫn tinh bị đứt khỏi mào tinh, lượng tinh dịch thu không nhiều

2.3 ĐẾM TINH TRÙNG CHUỘT 3

VẬT LIỆU gồm:

-Buồng đếm hồng cầu, Lamelle

-Pipette, Eppendorf (2 epp), đầu tip

 Đếm tinh trùng: ô giữa của buồng đếm (25 ô nhỏ)

 Nguyên tắc đếm: tinh trùng di động tinh trùng không di động tinh trùng chết

2.4 LOẠI CUMULUS:

- Đĩa vi giọt loại Cumulus: 1 vi giọt 10 µl FertiMed+ 40ul Hyaluronidase(1), 3 vi giọt 50 µl FertiMed(2,3,4).

- Trứng chuột

- Pipette Pasteur và dây truyền nước biển

- Kính hiển vi soi nổi

Sau 5 giờ thụ tinh, trứng có tinh trùng xung quanh,

1 thể cực, tế bào chất không mịn, không tròn đều

dự đoán: trứng không thụ tinh được

Ghi chú: Do nhóm đã bị mất hết trứng từ bước loại

cumulus nên từ bước thụ tinh nhóm đã mượn kết quả của nhóm 5 và nhóm 6 ( đã được đồng ý của nhóm bạn) để giải thích và biện luận

2.6 NUÔI PHÔI

Đĩa nuôi phôi gồm 4 giọt 10ul+40ul Embryo

Dụng cụ và thiết bị tương tự 2 phần trên

• Phương pháp:

Chuyển trứng đã thụ tinh vào vào vi giọt (1) và (2) để rửa tinh trùng quanh trứng

chuyển phôi vào vi giọt (3) (4) để nuôi (mỗi vi giọt tối đa 5 phôi)

Trứng của nhóm 5

Phôi sau khi nhuộm huỳnh quang (Phôi của nhóm 6)

Ánh sáng trắng Nhuộm Hoechst Nhuộm PI

2.7 ĐÁNH GIÁ PHÔI SỐNG CHẾT

Phôi chết

Xuất hiện ánh sáng khi nhuộm với PI

 Nắm được các thao tác cơ bản của nuôi cấy tế bào động vật.

điểm trải & bám dính).

KẾT LUẬN

PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG

 Nắm được thao tác trên tinh trùng và trứng.

 Mất trứng trong quá trình thao tác (tách và loại cumulus)

 Tinh trùng ít (thất thoát khi thu nhận)

=> Kết luận: Không thực hiện được thao thác thụ tinh vì không còn trứng.

 Thụ tinh không thành công (không tạo được phôi)( tham khảo kết quả nhóm 5).

 Nhuộm huỳnh quang Hoechst-PI: phôi chết (tham khảo kết quả nhóm 6).

PHẦN 2: THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

thêm tinh trùng từ epp dự trữ mào tinh và ống dẫn tinh.

PHẦN 1: NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG

PHẦN 2: THỤ TINH TRONG ỐNG NGHIỆM

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] M Dominici , K Le Blanc, I Mueller et al (2006), Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells The International Society for Cellular Therapy position statement

[2] Trương Định, Trương Hải Nhung, Phạm Văn Phúc, Phan Kim Ngọc, Thu nhận và biệt hoá tế bào gốc trung

mô từ tuỷ xương chuột (mus musculus var albino) Đh Khoa Học Tự Nhiên TPHCM, Hội Nghị Khoa Học Và Công Nghệ 2007

[3] Giáo trình thực tập Chuyên Ngành Công Nghệ Sinh Học Y Dược, Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Phòng Thí Nghiệm Nghiên Cứu Và Ứng Dụng Tế Bào Gốc

[4] Bernadette F Rodak and Jacqueline H Carr, Clinical Hematology Atlas, 5th ed.2016