Đánh giá mối liên quan giữa tính đa hình gen ACE, AGT, NOS3 và MTHFR với nguy cơ tiền sản giật

Tuy nhiên, phương pháp chẩn đoán nàybộc lộ một số khuyết điểm như: chỉ chẩn đoán được tiền sản giật sớm nhất từ tuần thứ 20 của thai kỳ, khi đã xuất hiện triệu chứng lâm sàng, dễ nhầmlẫn

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tiền sản giật là một tình trạng bệnh lý phổ biến ảnh hưởng đến phụ nữmang thai trên toàn thế giới Tỷ lệ bệnh tiền sản giật thay đổi tùy theo từngvùng, từng nước Theo tổ chức y tế thế giới tỷ lệ mắc tiền sản giật khoảng 4-7% trong thai phụ [1] Tại Mỹ, theo số liệu của Sibai năm 2003, tỷ lệ mắcbệnh là 6-10% [2] Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc tiền sản giật tương đối cao, khoảng5-6% (nếu lấy tiêu chuẩn huyết áp là 140/90mmHg) và tỷ lệ này vào khoảng10% (nếu lấy tiêu chuẩn huyết áp là 135/85mmHg) [3] Tiền sản giật gây ranhiều biến chứng cho thai phụ và thai nhi, làm cho thai chậm phát triển trong

tử cung, thai chết lưu, chậm phát triển tâm thần ở con, gây biến chứng sảngiật, chảy máu, rau bong non và nhiều biến chứng không hồi phục ở mẹ [3],[4],[5] Mặc dù đã có những bước tiến vượt bậc trong việc chăm sóc và điềutrị nhưng tiền sản giật vẫn là nguyên nhân chính gây ra tỷ lệ tử vong cho mẹ

và tử vong chu sản, thậm chí ở những quốc gia có dịch vụ chăm sóc sức khỏetiên tiến nhất [6] Ước mỗi năm có khoảng trên 50,000 thai phụ và 1 triệu trẻ

tử vong tính trên toàn thế giới do tiền sản giật [7] Chính vì vậy, việc pháthiện sớm các yếu tố nguy cơ để có biện pháp chẩn đoán sớm và can thiệp kịpthời nhằm ngăn ngừa và giảm thiểu tối đa các trường hợp tiền sản giật cũngnhư các biến chứng cho thai phụ và thai nhi sẽ đóng vai trò đặc biệt quantrọng trong công tác chăm sóc sức khỏe sinh sản, góp phần nângcao chất lượng cuộc sống

Tiền sản giật đã được biết đến từ nhiều thế kỷ trước nhưng để chẩnđoán bệnh, cho tới nay chủ yếu vẫn dựa vào những triệu chứng cổ điển nhưtăng huyết áp, phù và protein niệu Tuy nhiên, phương pháp chẩn đoán nàybộc lộ một số khuyết điểm như: chỉ chẩn đoán được tiền sản giật sớm nhất

từ tuần thứ 20 của thai kỳ, khi đã xuất hiện triệu chứng lâm sàng, dễ nhầmlẫn trong trường hợp tiền sản giật có triệu chứng không đầy đủ hoặc tiềnsản giật xảy ra trên thai phụ có bệnh nội khoa mắc trước khi có thai có triệu

chứng tương tự tiền sản giật Gần đây, có rất nhiều nghiên cứu phân tíchtương quan gen mục tiêu dựa trên nghiên cứu các đột biến và các đa hình tháiđơn (single nucleotide polymorphisms, SNPs) của các gen phổ biến ở nhómbệnh nhân tiền sản giật và nhóm chứng Các nghiên cứu này cho phép xácđịnh các gen cụ thể tham gia vào quá trình phát triển bệnh tiền sản giật, từ đótiếp tục xác định nhóm người có nguy cơ mắc bệnh tiền sản giật Trong nhữngnăm gần đây, phương pháp này đã được sử dụng rộng rãi, góp phần xác địnhsớm nguy cơ mắc bệnh tiền sản giật.

Các nghiên cứu cho thấy, ACE, AGT, NOS3 và MTHFR đều là những

gen đa hình thái, nhiều đa hình nucleotide đơn của các gen này được tìm thấy

đã tạo ra những kiểu gen khác nhau trong cộng đồng Chính sự khác biệt mộtvài nucleotide trong các SNPs của gen có thể làm thay đổi cấu trúc phân tửprotein và từ đó làm thay đổi sự tương tác và hoat động của protein được mãhoá bởi gen đó.Tuy nhiên, không phải tất cả các kiểu gen đó đều có khả năngthúc đẩy sự hình thành và phát triển tiền sản giật Trên thực tế, người ta đã

xác định được một số SNPs của các gen ACE, AGT, NOS3 và MTHFR có vai

trò quan trọng trong bệnh sinh tiền sản giật Việc xác định các SNPs này cóvai trò quan trọng trong việc đánh giá nguy cơ mắc bệnh tiền sản giật [8] Thực tế tại Việt Nam, việc nghiên cứu biến đổi di truyền ở mức độ phân

tử và ứng dụng các kỹ thuật di truyền để chẩn đoán tiền sản giật vẫn chưanhiều và chưa có hệ thống

Để đánh giá nguy cơ mắc bệnh tiền sản giật, góp phần chẩn đoán sớm vàtìm ra các biện pháp ngăn chặn biến chứng cho thai phụ và thai nhi, chúng tôi

thực hiện đề tài: “Đánh giá mối liên quan giữa tính đa hình gen ACE, AGT, NOS3 và MTHFR với nguy cơ tiền sản giật” với 2 mục tiêu:

1 Xác định tần số xuất hiện các SNP của gen ACE, AGT, NOS3 và MTHFR ở nhóm phụ nữ mang thai bị tiền sản giật và nhóm chứng.

2 Phân tích mối tương quan giữa tính đa hình gen ACE, AGT, NOS3

và MTHFR với nguy cơ tiền sản giật

Chương 1TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về tiền sản giật

1.1.1 Khái niệm về tiền sản giật

Tiền sản giật là tình trạng bệnh lý do thai nghén gây ra trong nửa sau củathời kỳ thai nghén gồm 3 triệu chứng phổ biến là phù, tăng huyết áp vàprotein niệu [4],[5]

1.1.2 Tình hình mắc tiền sản giật trên thế giới và tại Việt Nam

Hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào giải thích rõ được nguyên nhângây tiền sản giật Bệnh thường xảy ra vào ba tháng cuối thai kỳ, tuy nhiên, nócũng có thể xảy ra ở những thai phụ có tuổi thai thấp hơn, sớm nhất là vàokhoảng 20 tuần tuổi thai Kể từ khi phát hiện cho đến nay, tiền sản giật đượcgọi bằng nhiều tên khác nhau Chủ yếu, tên gọi hội chứng tiền sản giật là têngọi do các tác giả Anh, Mỹ đưa ra [9] Năm 1928, Farber gọi “Nhiễm độc dothai”, nước Đức gọi là Gestosis Nước ta gọi là bệnh albumin niệu khi có thai,một thời gian dài gọi là bệnh nhiễm độc thai nghén Năm 1985, tổ chức y tếthế giới đề nghị gọi là rối loạn tăng huyết áp do thai nghén và hiện nay thốngnhất gọi là tiền sản giật

Theo tổ chức y tế thế giới tỷ lệ mắc tiền sản giật khoảng 4-7% thai phụ trêntoàn thế giới [1] Tỷ lệ mắc tiền sản giật dao động từ 2-5% thai phụ ở Tây Âu vàBắc Mỹ đến 18% tại Châu Phi [10] Tại Anh thống kê năm 2003 cho thấy tỷ lệnày là 5-8% [11] Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc tiền sản giật tương đối cao, khoảng 5-6% (nếu lấy tiêu chuẩn huyết áp là 140/90mmHg) và tỷ lệ này vào khoảng 10%(nếu lấy tiêu chuẩn huyết áp là 135/85mmHg) [3] Theo thống kê tại Bệnh việnPhụ sản Trung ương năm 2003, tỷ lệ mắc tiền sản giật là 3,96% [12]

1.1.3 Nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh

Nguyên nhân sinh bệnh học tiền sản giật đến nay vẫn còn chưa rõ, biểuhiện lâm sàng giống bệnh ở thận, hệ tim mạch, ở gan, ở mắt Vì tiền sản giật

có biểu hiện bệnh ở nhiều cơ quan đích nên người ta thường nghĩ tới nhữngchất, những yếu tố gây ảnh hưởng đến đồng thời nhiều cơ quan một lúc Cónhiều giả thuyết được nêu lên như sau:

* Giả thuyết về co thắt mạch máu:

Sự co thắt mạch máu gây tăng huyết áp, gây lắng đọng tiểu cầu, tạo huyếtkhối, dẫn đến sự thiếu oxy mô, gây hoại tử chảy máu và rối loạn tạng đích

Co thắt mạch máu từng đoạn làm cho giảm lưu lượng máu qua thận, tốc

độ lọc cầu thận giảm dẫn đến lượng nước tiểu giảm, xuất hiện protein niệu,xét nghiệm sinh hóa: urê, creatinin và acid uric máu tăng Acid uric máu tăngđược coi là dấu hiệu quan trọng đánh giá tiến triển bệnh nặng [3]

* Thuyết Prostacyclin và Thromboxan:

Prostacyclin (PGI2) sinh ra từ nội mạc mạch máu và một ít từ nguyên

bào nuôi có tác dụng giãn mạch, ức chế sự tập trung tiểu cầu, thúc đẩy tuầnhoàn tử cung rau, giảm hoạt động cơ tử cung

Thromboxan (TXA2) đầu tiên được tổng hợp từ tiểu cầu, mô đệm vànguyên bào nuôi của bánh rau là chất co thắt mạch, tập trung tiểu cầu, giảmlưu lượng tuần hoàn tử cung rau và tăng hoạt động tử cung

PGI2 và TXA2 cân bằng nhau ở thai nghén thường Trong tiền sản giật,TXA2 tăng trội lên Walsh (1988) báo cáo progesteron bánh rau ở TSG tăng vàgiả thiết rằng: nồng độ progesteron tăng có thể ức chế sản sinh ra PGI2 [13].Spitz và cs (1988) báo cáo nữ cao huyết áp dùng 81 mg aspirin hằngngày có khả năng chặn tổng hợp TXA2 khoảng 75%, tổng hợp PGI2 giảm20%, PGE2 giảm 30% Nghĩa là ở TSG, men cyclooxygenase biến đổi acid

arachidonic (AA) thành PGI2 giảm còn TXA2 tăng dẫn đến tình trạng co thắtmạch và nhạy cảm với truyền angiotensin II [14].

Liệu pháp aspirin liều thấp làm giảm mạnh sản sinh TXA2, nhưng chỉchẹn một phần sản sinh PGI2 và PGE2, tạo khả năng giãn mạch của PGI2

Ở thai nghén thường, prostacyclin có thể hoạt động bảo vệ, chống lạihuyết khối Liệu pháp aspirin liều thấp chứng tỏ đã ức chế mencyclooxygenase do vậy hạn chế chuyển AA thành TXA2, ưu tiên tạo PGI2 cảithiện lâm sàng làm giảm nguy cơ cho những thai phụ bị nhiễm độc thainghén, cũng như phòng ngừa TSG Những quan sát này ủng hộ vai trò củaprostacyclin trong phòng ngừa nhiễm độc thai nghén, TSG và sản giật [13],[14]

* Thuyết về tổn thương nội mạc và mạch máu:

Nội mạc không chỉ giữ vai trò là một giao diện giữa dòng máu và tế bào

cơ trơn mạch máu, nó còn đóng vai trò cơ bản trong việc điều hòa trương lựcmạch máu thông qua các chất vận mạch Những chất này được tổng hợp bởicác tế bào nội mô hoạt và tác động lên tế bào cơ trơn theo kiểu cận tiết và gây

ra sự giãn mạch, nhờ oxit nitric (NO) hoặc ngược lại gây co mạch nhờendothelin-1 [15] Nội mạc mạch máu duy trì sự cân bằng giữa trạng thái giãnmạch và co mạch, đông và chống đông máu, kết dính và chống ngưng kết tiểucầu, tăng sinh và chống tăng sinh, viêm và chống viêm, oxy hóa và chống oxyhóa Rối loạn chức năng nội mạc mạch máu xảy ra khi nội mạc mạch máumất khả năng duy trì sự cân bằng giữa các hệ thống đối lập trên Có rất nhiềuyếu tố gây rối loạn chức năng nội mô như thiếu máu cục bộ, stress oxy hóa,gốc tự do, tăng cholesterol máu, sự kích hoạt các cytokine của hệ thống quátrình viêm, tăng homocysteine máu, tăng đường huyết và kháng insulin, tănghuyết áp, nhiễm độc nội sinh (suy thận, viêm tụy ), nhiễm độc ngoại sinh (hútthuốc, vv….) Kết quả làm tăng các hoạt động chức năng của các phân tử kết

dính và chemokine gây ra sự kích hoạt các phản ứng viêm, co mạch và làmthay đổi các chỉ số đông máu.

Một dấu hiệu chỉ điểm của rối loạn chức năng nội mô là mức độhomocysteine (Hcy) trong huyết tương của người mẹ Khi nồng độhomocysteine trong huyết tương của thai phụ trên 7 µmol/l thì tiền sản giậtxảy ra ở dạng nặng hơn Nồng độ homocysteine bình thường trong máu thaiphụ là 3-5µmol/l [16],[17]

Bình thường có khoảng 50% Hcy chuyển hóa theo con đường chuyểnnhóm sulfur tạo cysteine và 50% được tái metyl hóa trở thành methionine.Chất điều hòa cả hai con đường chuyển hóa Hcy là Sadenosylmethionine(SAM) Khi cân bằng methionine âm, nồng độ SAM thấp, Hcy sẽ chuyển hóatrực tiếp theo con đường tái methyl hóa để tạo methionine dưới tác dụng củaenzyme methionine synthetase (MS) có cofactor là vitamin B12, cơ chất củaphản ứng này là Methyltetrahydrofolate (methyl THF) được tạo thành dướitác dụng xúc tác của methyltetrahydrofolate reductase (MTHFR) Enzymenày có ảnh hưởng gián tiếp, mạnh mẽ lên quá trình tái gắn methyl của Hcy.Khi nồng độ SAM cao, Hcy sẽ được chuyển hóa trực tiếp theo conđường tạo cystathionine và cysteine bởi hai phản ứng phụ thuộc vitaminB6.Những nghiên cứu trên chuột cho thấy SAM vừa là chất ức chế MTHFR vừa

là chất kích thích cystathionine beta synthetase (CBS) [1]

Nhóm methyl của methionine được hoạt hóa bởi sự tích điện dương củanguyên tử lưu huỳnh, nó dễ dàng được chuyển cho các chất nhận khác nhưacid nucleic (DNA và RNA), protein, myelin, catecholamine, polysaccarid vàcác chất có phân tử lượng nhỏ Giảm khả năng metyl hóa ảnh hưởng nhiềuđến sự phát triển, biệt hóa chức năng tế bào Quá trình metyl hóa cần cho sựphát triển bào thai và trẻ em [17]

Bất kỳ sự mất cân bằng nào trong quá trình chuyển hóa Hcy đều dẫn đếnthay đổi nồng độ Hcy trong máu Nếu xảy ra một sai sót, thiếu hụt hay mấtcân đối của một trong các enzyme, bao gồm các coenzyme của chúng làvitamin B12, B6, acid folic, của quá trình chuyển hóa đều sẽ làm suy giảmchu trình methyl hóa và làm tăng nồng độ Hcy trong tế bào và bài xuất vàomáu Một số yếu tố liên quan tới lối sống không giữ gìn sức khỏe (hút thuốc

lá, uống rượu, dùng nhiều cà phê…), tình trạng thiếu dinh dưỡng với lượngacid folic, vitamin-B6, vitamin B12 đưa vào thiếu, hấp thu kém… cũng gópphần quan trọng làm tăng Hcy trong máu [17],[1],[2]

Một vài nghiên cứu gần đây đã đề cập đến vấn đề đột biến gen tổng hợpnên các enzyme trong quá trình chuyển hóa Hcy gây nên tăng nồng độ Hcytrong máu Thể MTHFR10 dễ bị đột biến (C677T polymorphism), sự đột biến

có thể xảy ra ở 1/2 hay 1/3 cặp alen tương ứng gây nên những biến đổi củaenzyme MTHFR, làm giảm hoạt độ của enzyme, làm tăng Hcy Một đột biếnkhác là CBS17, đột biến đồng hợp tử CBS17 là nguyên nhân chính dẫn đếntăng Hcy máu [3] Đột biến dị hợp tử chỉ làm giảm 50% hoạt động củaenzyme CBS Đột biến gen CBS làm giảm hấp thu các chất như serine,pyridoxal phosphat [4]

Một dấu hiệu chỉ điểm khác của rối loạn chức năng nội mô là do giảmhoạt tính NO (oxit nitric) Enzyme NOS type II (iNOS, có thể từ cytokine) và

NO type III (eNOS, hình thành từ nội mạc mạch máu) đều xúc tác cho phảnứng chuyển L-arginine thành NO NO là một yếu tố giãn mạch nội sinh đóngvai trò quan trọng trong điều hòa lượng máu lưu thông và huyết áp trong thai

kỳ Ngoài ra, NO còn ức chế sự kết dính tiểu cầu, bạch cầu bám dính vào nộimạc mạch máu

Người ta thấy ở nội mạc mạch máu có yếu tố gây giãn mạch là EDRF(Endotherium derived relaxing factor) và yếu tố gây co mạch là EDCF

(Endotherium derived contracting factor) Trong thai nghén thường EDRF vàEDCF cân bằng nhau nhưng khi tế bào nội mạc bị tổn thương, có sự mất cânbằng giữa chúng, trong đó EDCF tăng lên làm mạch máu bị co thắt gây tănghuyết áp, kết dính tiểu cầu [5].

Trong tiền sản giật không có hiện tượng xâm lấn của nguyên bào nuôi, tếbào nội mạc bị tổn thương, EDRF giảm dẫn tới sự co thắt mạch khu trú vàtruyền máu vào bánh rau ít hơn, dẫu có tăng áp Khi nội mạc mạch bị tổnthương gây protein niệu và phù toàn thân

Người ta cũng biết rằng tế bào nội mạc mạch máu bị tổn thương thườngtiết ra những chất co mạch như endothelin và những chất khác từ tế bào nộimạc Chúng cũng ức chế đông máu và hoạt hoá chất plasminogen mô tanhuyết khối Khi tế bào nội mạc bị tổn thương, không chỉ bị mất chức năngbình thường mà còn sinh ra những chất tiền đông (thay thế chất chống đông)

và chất co thắt mạch máu Do vậy, tổn thương nội mạc, nguyên bào nuôi ởđầu thai kỳ dễ gây rối loạn những chức năng tế bào nội mạc tiếp theo Do đó,

có thể giải thích nhiều thay đổi sinh lý học của bệnh này

* Hệ thống renin - angiotensin - aldosteron:

Trong thai nghén bình thường: Thành phần ở hệ renin- aldosteron tăng

angiotensin-Trong nhiễm độc thai nghén: Một số thành phần của hệ thống này thấphơn so với thai nghén bình thường vì angiotensin II vẫn ở mức phạm vi không

có thai, tức là thấp so với mức thai phụ có thai nghén bình thường Bệnh nhân

bị nhiễm độc thai nghén có mức angiotensin II thấp, nhưng tăng đáp ứng vớităng huyết áp Năm 1973, Gant và cộng sự đã chứng minh: Truyềnangiotensin II vào tĩnh mạch cho những thai phụ có tuổi thai từ 28 - 32 tuần.Nếu truyền angiotensin II với tốc độ trên 8ng/Kg/phút sẽ gây được tăng huyết

áp tâm trương lên 20mmHg trên thai phụ bình thường Ngược lại, nếu truyền

angiotensin II cho những thai phụ cùng tuổi thai với tốc độ dưới 8ng/Kg/phút

đã gây được huyết áp tâm trương lên 20mmHg thì người đó sẽ xuất hiệnnhiễm độc thai nghén ở 3 tháng cuối của thai kỳ Test này có thể phát hiệnsớm những thai phụ sẽ có biểu hiện nhiễm độc thai nghén trước khoảng 8 - 12tuần với giá trị âm tính hay dương tính ở 90% đối tượng thử [18]

Người ta cho rằng sự đáp ứng chất tăng áp angiotensin II bị giảm ở thaiphụ có huyết áp bình thường vì khả năng cảm thụ angiotensin II ở tế bào cơtrơn mạch giảm (MacKanjee và cộng sự, 1991) Sức kháng mạch vớiangiotensin II có thể qua trung gian bởi những yếu tố khác, như tăng tiếtaldosteron Họ cho rằng angiotensin II tác dụng lên cuộn mạch vỏ thượngthận Nhiều nghiên cứu cho rằng cơ trơn thành tiểu động mạch trơ vớiangiotensin II là do có mặt prostaglandin, hay chất giống prostagladin đượctổng hợp từ nội mạc mạch [19],[20] Sự trơ này bị loại, khi dùng những chất

ức chế prostagladin như indomethacin, aspirin [21] Có một số mô, tăngnhanh tổng hợp angiotensin hay giải phóng prostaglandin hay cả hai Ở thainghén bình thường có khả năng tổng hợp prostaglandin loại gây giãn mạchPGI2 nhiều hơn loại gây co mạch TXA2 [5]

Hiện nay chưa biết cơ chế chính xác của prostagladin hay chất liên quan

có hoại động lên mạch máu khi có thai Để làm sáng tỏ cơ chế, Goodman và

cs (1982) đã dùng prostaglandin giãn mạch trong thai nghén thường; Everett

và cs (1978) đã chứng minh liều cao aspirin hay indomethacin sẽ làm tăngnhạy cảm mạch máu khi truyền angiotensin II, và họ cho rằng sự tổng hợpprostaglandin đã bị chẹn [21] Sachez - Ramos và cộng sự (1978) đã ghi nhận

sự đáp ứng mạch máu giảm sau khi uống 40mg aspirin trong vòng 2 giờ,giống như chẹn chất thromboxan co mạch [22]

Tuy nhiên những giả thuyết trên vẫn không giải thích được cặn kẽnguyên nhân cũng như cơ chế phát sinh bệnh, do đó việc theo dõi và điều trịtiền sản giật còn có những hạn chế.

1.1.4 Các yếu tố nguy cơ đối với tiền sản giật

Mặc dù cho đến này vẫn chưa giải thích chính xác nguyên nhân của tiềnsản giật, song nhiều nghiên cứu đã đưa ra một số yếu tố và điều kiện có thể lànguy cơ gây tiền sản giật như:

- Thai phụ có tiền sử gia đình mắc tiền sản giật: Nếu trong gia đình thai phụ cóngười mắc tiền sản giật thì nguy cơ mắc tiền sản giật của những thai phụtrong gia đình ấy cao gần gấp 3 lần bình thường, do đó một thai phụ mắc tiềnsản giật nặng thì nhiều khả năng có mẹ đẻ cũng từng bị tiền sản giật [23]

- Thai phụ có tiền sử bản thân mắc tiền sản giật: Những thai phụ mắc tiền sảngiật ở lần mang thai trước thì ở lần mang thai sau có nguy cơ tiền sản giậttăng gấp 7 lần [24]

- Tuổi của thai phụ: Nhiều nghiên cứu nhận thấy thai phụ ≥ 40 tuổi, có nguy cơtiền sản giật tăng lên 2 lần, cho dù đây là lần mang thai đầu hay không Theothống kê trên toàn nước Mỹ cho thấy nguy cơ tiền sản giật tăng 30% cho mỗinăm khi thai phụ sau độ tuổi 34 Ngoài ra một số nghiên cứu cho rằng tuổicủa thai phụ quá trẻ cũng là nguy cơ gây tiền sản giật Tuy nhiên, một sốnghiên cứu khác lại chỉ ra rằng thai phụ trẻ dường như không ảnh hưởng đếnnguy cơ tiền sản giật [25]

- Số lần sinh con của thai phụ: Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng, thai phụ con so cónguy cơ sản giật gấp 3 lần thai phụ con rạ Nguy cơ này cũng được một sốnghiên cứu ghi nhận và cũng cho mức độ nguy cơ với tiền sản giật vàokhoảng 2-3 lần [26]

- Đa thai: Khi một thai phụ mang thai đôi thì nguy cơ tiền sản giật của thai phụtăng lên gấp 3 lần bất kể là mang thai đôi cùng trứng hay khác trứng Thai

phụ mang thai ba có nguy cơ mắc tiền sản giật cao gấp 3 lần thai phụ mangthai đôi [27].

- Mắc một số bệnh trước khi mang thai

+ Bệnh tiểu đường hay tiểu đường thai kỳ: Nếu thai phụ bị tiểu đườngtrước khi mang thai sẽ có nguy cơ tiền sản giật tăng gấp 4 lần Ngoài ra tiểuđường thai kỳ cũng làm tăng nguy cơ gây tiền sản giật [28]

+ Tăng huyết áp mạn tính và rối loạn tăng huyết áp thai kỳ

Tăng huyết áp mạn tính: Tăng huyết áp từ trước khi mang thai làm tăngnguy cơ tiền sản giật song mức độ cho đến nay vẫn chưa được xác định rõ.Ngoài ra thai phụ tăng huyết áp mạn tính tiến triển thành tiền sản giật có tỷ lệmắc bệnh cao hơn đáng kể so với thai phụ tiền sản giật mà không tăng huyết

áp Tình trạng tiền sản giật/tăng huyết áp mạn tính cũng làm tăng tỷ lệ sinhcon thiếu tháng (trước 32 tuần tuổi) đáng kể so với thai phụ tiền sản giậtkhông tăng huyết áp mạn tính Thai phụ có huyết áp tâm trương trước tuần 20của thai kỳ vào khoảng ≥ 100 mmHg là những trường hợp dễ tiến triển thànhtiền sản giật

Rối loạn tăng huyết áp thai kỳ: Khi tăng huyết áp xảy ra vào giai đoạnnửa sau của thai kỳ ở các thai phụ có chỉ số huyết áp trước lúc mang thai hoàntoàn bình thường được coi là tăng huyết áp thai kỳ Tăng huyết áp thai kỳchiếm tỷ lệ 6-7% số thai phụ và khỏi hoàn toàn khi hết thời kỳ hậu sản Nguy

cơ tiền sản giật của thai phụ tăng huyết áp thai kỳ là 15-26% Nếu tăng huyết

áp xuất hiện vào tuần thứ 36 của thai kỳ về sau thì nguy cơ tiền sản giật chỉchiếm 10% [29]

+ Thai phụ mắc bệnh thận: Những thai phụ mắc bệnh thận như suy thận,hội chứng thận hư….có tỷ lệ mắc tiền sản giật cao hơn thai phụ không bị bệnhthận Mức độ nguy cơ tăng khoảng 2-3 lần [30]

+ Thai phụ mắc bệnh tự miễn: Những trường hợp thai phụ mắc bệnh tựmiễn như lupus ban đỏ hệ thống có nhiều nguy cơ mắc tiền sản giật Mức độnguy cơ có thể tăng lên gấp vài lần so với bình thường.

+ Hội chứng kháng phospholipid: Sự hiện diện của kháng thể khángphospholipid làm tăng đáng kể nguy cơ tiền sản giật Nguy cơ chung vàokhoảng 4 lần [31]

- Khoảng cách giữa hai lần mang thai: Mối liên quan giữa tiền sản giật vớikhoảng cách giữa các lần mang thai rõ ràng hơn mối liên quan giữa tiền sảngiật với thay đổi người cha (người phụ nữ kết hôn hay có thai với người kháckhông phải người chồng của lần mang thai trước) Nguy cơ ở lần mang thaithứ hai hoặc thứ ba trực tiếp liên quan đến khoảng cách giữa hai lần mangthai Nếu khoảng thời gian giữa hai lần mang thai là 10 năm hoặc hơn thìnguy cơ tiền sản giật giống như ở phụ nữ sinh con so Nói chung nguy cơ tiềnsản giật tăng 1,12 lần cho mỗi năm giữa hai lần mang thai [32]

- Chỉ số khối cơ thể (BMI – Body Mass Index): Chỉ số khối cơ thể là chỉ sốđánh giá tính trạng thừa cân hay béo phì ở người bình thường cũng như thaiphụ Nhiều nghiên cứu cho thấy BMI vượt mức bình thường trước khi mangthai làm tăng tiền sản giật lên gấp 2 lần Nếu BMI ở mức > 35 trước khi mangthai thì nguy cơ tiền sản giật gấp 4 lần so với thai phụ có chỉ số khối cơ thể19-27 trước khi mang thai Thai phụ có BMI >35 khi mang thai cũng gặpnguy cơ tiền sản giật tương tự [33].Tuy nhiên một số khuyến cáo khác lại coiBMI >30 là ngưỡng nguy cơ với tiền sản giật

Ngoài ra còn một số yếu tố được nhắc đến như: Điều kiện thời tiết,yếu tố chủng tộc và nhóm dân tộc, đời sống kinh tế và trình độ văn hóa, chế

độ làm việc, dinh dưỡng…

Theo quan điểm hiện nay, tiền sản giật là sự khiếm khuyết về mặt ditruyền của quá trình thích nghi ở cơ thể mẹ với các điều kiện mới trong giaiđoạn thai kỳ [34].

1.2 Chẩn đoán tiền sản giật

Bệnh tiền sản giật mặc dù đã được phát hiện từ lâu nhưng đến nayngười ta vẫn dùng ba dấu hiệu: tăng huyết áp, phù và protein niệu để chẩnđoán tiền sản giật.

+ Tăng huyết áp động mạch là dấu hiệu lâm sàng quan trọng, nó là dấuhiệu sớm nhất và có tỷ lệ cao nhất tới 87,5% và có giá trị tiên lượng cho cả

mẹ và con [3] Tăng huyết áp có thể được đánh giá theo 3 cách:

- Theo hằng số sinh lý: được coi là tăng huyết áp nếu huyết áp

>140/90 mmHg

- Căn cứ vào huyết áp trước khi có thai, nếu huyết áp tâm thu tăng thêm30mmHg và tâm trương tăng thêm 15 mmHg là tăng huyết áp Tuy nhiên cầnxem xét xem tăng huyết áp xảy ra trước hay sau 20 tuần tuổi thai để đánh giátăng huyết áp là do tiền sản giật hay tăng huyết áp mắc trước khi có thai

- Có thể đánh giá thông qua huyết áp trung bình

Huyết áp trung bình = [Huyết áp tối đa + 2(Huyết áp tối thiểu)]/3

Nếu huyết áp trung bình tăng trên 20 mmHg so với trước lúc có thai làtăng huyết áp

+ Protein niệu: Là dấu hiệu quan trọng thứ hai thường xuất hiện muộnhơn tăng huyết áp, nên xét nghiệm với mẫu nước tiểu 24h Protein ≥ 3g/24hhoặc 5g/L ở mẫu ngẫu nhiên trên bệnh nhân không có nhiễm khuẩn đường tiếtniệu [5]

+ Phù: Phù đầu tiên xuất hiện vào buổi sáng sau tăng lên Phù có tínhchất phù trắng, mềm, ấn lõm Nếu phù tạng thì khó phát hiện bằng khám lâm

sàng Có thể đánh giá phù qua cân nặng bệnh nhân, lúc này sẽ thấy bệnh nhântăng cân nhanh >500gr/tuần hay >2250gr/tháng.

+ Những triệu chứng khác bao gồm: Thiếu máu da xanh niêm mạcnhợt Có thể gặp hội chứng ba giảm ở phổi, tiếng thổi tâm thu cơ năng ở tim,tràn dịch màng tim, khó thở nhẹ và các dấu hiệu khác về thần kinh, tiêu hóa

Khi xuất hiện các dấu hiệu trên thường là tiên lượng xấu cho thai phụ,

có thể thai phụ gặp phải các biến chứng của tiền sản giật

và thai nhi, sự phân bố lại cung cấp máu ở thai nhi để tiên lượng việc thai nhi

đã chịu hậu quả thai kém phát triển, suy dinh dưỡng và suy thai trường diễn

Ngoài ra còn có thể xét nghiệm hs-CRP: Nồng độ hs-CRP tăng caotrong máu thai phụ tiền sản giật là do những rối loạn chức năng tế bào nộimạc trong tiền sản giật là kết quả của quá trình phản ứng viêm hệ thống củathai phụ

β-HCG cũng tăng trong những trường hợp thai phụ mắc tiền sản giật

1.3 Thể lâm sàng

Có nhiều cách để phân loại tiền sản giật Theo “Hướng dẫn chuẩn Quốcgia về các dịch vụ chăm sóc sức khoẻ sinh sản” [4], tiền sản giật được chia rathành hai loại:

+ Tiền sản giật nhẹ

- Huyết áp ≥ 140/90 mmHg, đo hai lần cách nhau 4 giờ, sau 20 tuần tuổithai ở người không mắc bệnh tăng huyết áp trước đó

- Protein niệu có thể tới (++) (tương đương với < 3g/l)

- Ngoài ra không có triệu trứng khác

+ Tiền sản giật nặng

- Huyết áp ≥ 160/110 mmHg sau 20 tuần tuổi thai

- Protein niệu (+++) tương đương với Protein ≥ 3g/24h hoặc 5g/L ở mẫungẫu nhiên trên bệnh nhân không có nhiễm khuẩn đường tiết niệu [3]

- Ngoài ra có thể có các dấu hiệu sau: Tăng phản xạ, đau đầu tăng,chóng mặt, nhìn mờ, hoa mắt thiểu niệu (dưới 400 ml/24h), đau vùngthượng vị, phù phổi, tăng enzyme gan, giảm tiểu cầu…

Cách phân loại tiền sản giật thành tiền sản giật nặng và tiền sản giậtnhẹ là cách phân loại mới Trước đây tiền sản giật được phân thành tiền sảngiật nhẹ, trung bình và nặng Cách phân loại mới đã giúp các bác sỹ lâm sàngchủ động hơn trong điều trị tiền sản giật

+ Ngoài ra, tiền sản giật còn phân loại theo triệu chứng kết hợp như:

- Thể có kết hợp 2 triệu chứng: Tăng huyết áp với phù, tăng huyết áp vớiprotein niệu, protein niệu với phù

+ Phân loại theo phát sinh bệnh bao gồm:

- Tăng huyết áp thai kỳ : Huyết áp ≥ 140/90 mmHg sau 20 tuần tuổi thai,trở lại bình thường sau đẻ ở người không mắc bệnh tăng huyết áp trước đó

- Tăng huyết áp mạn tính: Tăng huyết áp trước 20 tuần tuổi thai, có thểtrầm trọng lên khi có thai, tồn tại dai dẳng trên 6 tuần sau đẻ

1.4 Một số biến chứng TSG

1.4.1 Biến chứng đối với mẹ

+ Tử vong mẹ: Người mẹ có thể tử vong do các biến chứng như hộichứng HELLP gây phù phổi, tan huyết, đông máu rải rác trong lòng mạch vàsuy thận cấp

+ Sản giật: Sản giật là biến chứng nguy hiểm của TSG nặng, 75% sản giậtxảy ra ở ba tháng cuối thai kỳ, 20% trong chuyển dạ đẻ, 1-5% trong thời kỳhậu sản Sản giật biểu hiện bằng những cơn giật qua 4 giai đoạn: giai đoạnxâm nhiễm, giật cứng, giật gián cách và hôn mê, có thể gây tử vong cho mẹ

và con trong cơn sản giật [3]

+ Rau bong non: Rau bong non có nguyên nhân do tiền sản giật chiếmkhoảng 3- 4 % [12]

+ Suy tim và phù phổi cấp: Thai phụ bị tiền sản giật thường kèm theo rốiloạn chức năng thất trái và biến chứng phù phổi cấp do tăng hậu gánh

+ Suy thận: Biến chứng này thường gặp ở những thai phụ có bệnh thậntiềm tàng từ trước không được phát hiện hoặc đối với các trường hợp tiền sản giật nặng đặc biệt là trong hội chứng HELLP

+ Suy giảm chức năng gan và rối loạn đông máu: Thường gặp ở thai phụtiền sản giật đặc biệt là hội chứng HELLP

1.4.2 Biến chứng đối với con

+ Tử vong sơ sinh: Tỷ lệ tử vong sơ sinh ngay sau đẻ phụ thuộc vàonhiều yếu tố đặc biệt là tuổi thai nhỏ và hội chứng HELLP là những yếu tốlàm tăng tỷ lệ tử vong sơ sinh

+ Sơ sinh non tháng, nhẹ cân: Sơ sinh nhẹ cân là sơ sinh đẻ ra có cânnặng < 2500g, kể cả non tháng và đủ tháng Tiền sản giật là một trong nhữngnguyên nhân chính gây thai kém phát triển trong tử cung và đẻ non Đẻ nonthường do việc đình chỉ thai nghén nhằm cứu mẹ hoặc cứu con

+ Thai chết lưu trong tử cung: Đây là một biến chứng nặng của tiền sảngiật đối với thai nhi Tình trạng bệnh lý của tiền sản giậtđã gây nên những rốiloạn về tuần hoàn tử cung rau và hậu quả gây giảm sút thậm chí là ngừng trệ

sự trao đổi chất cho thai nhi dẫn đến thai chết lưu trong tử cung

1.4.3 Hội chứng HELLP

Hội chứng HELLP (H- Hemolyse tan huyết; EL – Elevated Liverenzyme: Tăng enzyme gan; LP – Low Platelets giảm tiểu cầu) là hội chứnghiếm gặp và là một là biến thể nặng của TSG với những biểu hiện đông máurải rác trong lòng mạch, tan huyết, lượng fibrinogen giảm xuống dưới300mg/dL, tỷ lệ prothrombin giảm xuống ở mức từ 4-38% Hội chứng nàyđược Sibai mô tả cụ thể bằng các dấu hiệu: huyết tán, bilirubin toàn phần tăngcao trên 1.2mg/dL, enzym LDH tăng trên 600UI/L, emzym AST, ALT tăngtrên 70UI/L, số lượng tiểu cầu giảm <100000/mm3 máu [3],[5]

1.5 Nghiên cứu đa hình di truyền về tiền sản giật

1.5.1 Hiện tượng đa hình thái đơn (Single Nucleotide Polymorphism, SNP)

Hiện tượng đa hình thái đơn là sự khác nhau về trình tự DNA xảy ra khimột nucleotide đơn - A, T, C hay G - ở trong bộ gen (hay trong các trình tựđược phân lập khác) khác nhau giữa các cá thể của một loài hay giữa các cặpNST của một người (Hình 1) Bộ gen người với 23 cặp NST (22 cặp NSTthường và 1 cặp NST giới tính) chứa khoảng 3,2 tỉ bp Giống nhau giữa các cáthể đến trên 99% và khoảng 1% sự khác biệt còn lại chủ yếu biểu hiện bởi cácSNP

SNP là một hiện tượng phổ biến, được coi là hậu quả của những đột biếnđiểm thay thế một cặp Nu, theo ngân hàng dữ liệu của NCBI tính đến tháng6/2012 có khoảng gần 19 triệu SNP trong bộ gen người Tính trung bình, cứkhoảng 3000 bp thì lại xuất hiện một SNP

Sự khác biệt trong trình tự DNA ở người có thể ảnh hưởng đến sự pháttriển bệnh tật; sự đáp ứng với các tác nhân gây bệnh, hóa chất, thuốc, văc xin

và các tác nhân khác Tuy nhiên, ứng dụng lớn nhất của SNP trong nghiên cứu

y sinh học là so sánh các vùng gen giữa các nhóm người với nhau (chẳng hạnnhư những nhóm người bị bệnh và không bị bệnh) để từ đó xác định mối liênquan giữa SNP với bệnh, từ đó tìm ra các yếu tố nguy cơ đối với sự hìnhthành và tiến triển bệnh

Hình 1.1: Minh họa hiện tượng SNP

(Nguồn: http://www.broadinstitute.org)

1.5.2 Nghiên cứu tính chất di truyền về tiền sản giật trên thế giới

Nghiên cứu về tính chất gia đình của bệnh tiền sản giật đã được biếtđến từ thế kỷ XIX, các dữ liệu đầu tiên về lĩnh vực này đã được Chesley công

bố vào năm 1968 [35] Một số nghiên cứu tiếp theo cũng đã khẳng định sựhiện diện của yếu tố gia đình trong sự phát triển tiền sản giật, đồng thời thôngbáo rằng nguy cơ mắc bệnh sẽ tăng 2-5 lần ở người có quan hệ họ hàng bậc 1với thai phụ bị tiền sản giật trong thai kỳ [36] Ngoài ra, một số nghiên cứukhác đã chỉ ra rằng, nguy cơ mắc tiền sản giật không gặp ở con gái và con dâusống trong gia đình người chồng có quan hệ họ hàng với người bị tiền sản giật

[37] Nguy cơ tái mắc tiền sản giật ở lần mang thai tiếp theo thay đổi từ 7,5%đến 65%, tùy thuộc vào mức độ nghiêm trọng của bệnh trong thời gian mangthai đầu tiên [36].

Mặc dù vẫn biết rằng, nguyên nhân gây tiền sản giật có yếu tố di truyền,tuy nhiên hiện nay các cơ sở di truyền chính xác về tiền sản giật vẫn chưađược biết Nhiều tác giả cho rằng, tiền sản giật có thể di truyền theo quy luậtMendel (di truyền trội – lặn), hoặc di truyền đa gen hoặc di truyền ty thể [36].Giải mã sự tham gia của các yếu tố di truyền vẫn đang là thách thức, nhất là vìkiểu hình chỉ được biểu hiện trên thai phụ sinh con rạ Hơn nữa, trong trongcác rối loạn phức tạp của thai kỳ, rất cần thiết để xem xét hai kiểu gen: một từ

mẹ và một từ thai nhi, trong đó bao gồm các gen thừa hưởng từ cả bố và mẹ.Các gen của mẹ và của thai nhi có thể có tác động độc lập hoặc tương tác trênnguy cơ tiền sản giật Rất nhiều nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng sự ditruyền của tiền sản giật khoảng 55% với sự đóng góp của gen cả của mẹ vàthai nhi [38] Vai trò của yếu tố di truyền trong sự phát triển của tiền sản giậthơn 50% và sự đóng góp của các gen ở người mẹ trong quá trình này nhiềuhơn thành phần di truyền của thai nhi [37],[39],[40]

Cnattingius và cộng sự đã tiến hành kiểm tra rộng rãi ở người dân ThụyĐiển và thấy rằng các thành phần di truyền của thai nhi là khoảng 20% biên

độ trong khuynh hướng gây tiền sản giật và xấp xỉ bằng thành phần di truyềncủa cha mẹ [37],[39],[40] Tuy nhiên, các nghiên cứu con sinh đôi đã cho rakết quả trái ngược nhau, điều này cho thấy sự khác biệt trong sự phát triển củatiền sản giật giữa cặp song sinh giống hệt nhau, vì vậy không chấp nhận lýthuyết di truyền như một thuyết duy nhất

Tóm lại, tiền sản giật được cho là do sự tương tác phức tạp giữa các kiểugen của bố và mẹ, các kiểu gen của mẹ, các yếu tố di truyền và các yếu tố cókhuynh hướng gây bệnh ở mẹ

Mặc dù, hiện nay vẫn chưa tìm thấy một gen duy nhất nào gây tiền sảngiật, tuy nhiên các giả thuyết về một gen duy nhất chưa được loại bỏ hoàntoàn, ít nhất là ở gia đình riêng biệt Trong hầu hết các trường hợp, tiền sảngiật được coi là một bệnh lý di truyền phức tạp.

1.5.3 Hệ thống điều hòa trương lực mạch máu.

Hệ thống renin-angiotensin (RAS) đóng vai trò quan trọng trong việcđiều hòa những thay đổi về tim mạch và thận xảy ra trong thai kỳ Rất nhiềunghiên cứu đã cho thấy hệ thống RAS liên quan đến cơ chế bệnh sinh của tiềnsản giật [41] Như vậy, các gens trong hệ thống RAS như enzyme chuyển hóaangiotensin (ACE), angiotensinogen (AGT) đều đã được nghiên cứu rộng rãitrong tiền sản giật Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra alen T của gen AGT(M235T) làm tăng 1,62 lần nguy cơ mắc tiền sản giật và mức tăng nguy cơbệnh tương tự với gen ACE (I/D) [42]

Angiotensinogen (AGT) Gen angiotensinogen (AGT) nằm trên cánh

dài của nhiễm sắc thể số 1 (1q42-43) gồm 5 exon và 4 intron Đột biến làmthay thế (T) bởi (C) tại vị trí 704 cuả gen AGT sẽ dẫn đến thay thế axit aminmethionine ở vị trí 235 thành threonine Do sự thay đổi này làm thay đổi cácthuộc tính của AGT, dẫn đến sự gia tăng nồng độ angiotensin II (Ang II) [43].Ngoài ra một đột biến khác ở vùng promotor gen AGT là adenine thay thếguanine ở vị trí (-6) Đột biến này gần như liên kết hoàn toàn với đột biếnM235T [43],[44]

Gen tổng hợp enzym chuyển hóa angiotensin converting enzyme (ACE)) Gen ACE nằm trên nhánh dài của nhiễm sắc thể

(Angiotensin-17 ((Angiotensin-17q23.3) Nhiều nghiên cứu đã xác định đột biến chèn (I) và mất (D) cácđoạn lặp Alu với kích thước 287 cặp base trong intron 16 của gen ACE Alu-sequence là hiện tượng chèn chuỗi DNA trong genome người, chiều dàikhoảng 300 cặp base, đặt tên như vậy vì thực tế, lần đầu tiên được phát hiện ở

vi khuẩn Arthrobacter luteus (A luteus) Đột biến này xuất hiện liên quan vớimức độ của ACE trong huyết tương và sự phát triển của một số bệnh Ngườimang alen D có nguy cơ tăng ACE trong huyết tương và các tế bào cơ tim, do

đó dẫn đến sự gia tăng nồng độ Ang II [43]

Bảng 1.1 Dữ liệu từ các nghiên cứu về mối tương quan của gen hệ thống

trương lực mạch máu với sự phát triển của tiền sản giật

với tiền sản giật

Không tương quan với tiền sản giật

АСЕ I/D

Serrano N.C et al., 2006; Miskovic

В et al., 2008; Velloso E.P et al.,

Morgan T et al., 1999; Levesque S et

al., 2004; Pfab T et al., 2007;

Zafarmand M.H et al., 2008; Medica

I et al 2007; Benedetto C et al.,

2007 [42],[49],[50],[51],[52],[53]

Mutze S et al., 2008; Knyrim

E et al., 2008 [54],[55]

1.5.4 Rối loạn chức năng nội mô

Nitric oxide (NO) là một yếu tố giãn mạch nội sinh đóng vai trò quantrọng trong điều hòa lượng máu lưu thông và huyết áp trong thai kỳ Ngoài ra,

NO còn ức chế sự kết dính tiểu cầu, bạch cầu bám dính vào nội mạc mạchmáu, được cho là có tham gia vào cơ chế bệnh sinh tiền sản giật [56] NOđược tổng hợp từ L-arginine bởi enzyme eNOS (endothelial nitric oxidesynthase) [57],[58]

Gen eNOS (NOS3) nằm trên nhiễm sắc thể số 7 (7q35-36), mã hóa mộtprotein gồm 1203 axit amin liên quan tới sự biến đổi nồng độ NO trong huyếtthanh [59],[60] Các nghiên cứu nhiều nhất và tiên lượng quan trọng đều tậptrung ở một đa hình cấu trúc trong exon 7 Đó là sự thay thế guanine (G)thành thymine (T) ở vị trí thứ 894 của gen NOS3 dẫn đến làm thay thếasparagine thành glutamine ở vị trí 298 của enzyme này (Glu298Asp), sự biếnđổi này gây ra sự thay đổi trong các protein được mã hóa Điều này làm tăng

sự phân ly eNOS trong tế bào, dẫn đến giảm sự giãn mạch phụ thuộc nội mạc

và phát triển các quá trình sinh lý bệnh dẫn đến sự phá vỡ các chức năng nội

mô [61]

Đa hình 4a/b do sự xuất hiện của 5 hoặc 4 lần lặp 27 bp ở intron 4.Thường gặp trong quần thể người bình thường là dạng lặp 5 lần ký hiệu là 4b.Còn dạng lặp 4 lần là dạng đột biến được ký hiệu là 4a (Del) Ảnh hưởng củađột biến 4a làm mất sự biểu hiện của gen eNOS, dẫn đến làm giảm sự sảnxuất NO [61]

Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) Gen MTHFR gồm

11 exon, nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể 1 (1p36.3) mã hóa enzymeMTHFR chuyển hóa folate và homocysteine Các đột biến được nghiên cứunhiều nhất là sự thay thể cytosine (C) tại vị trí 677 thành thymine (T), dẫn đến

sự thay thế axit amin alanine thành valine ở vị trí 223 (Ala223Val) Ngườimang kiểu gen đồng hợp tử về đột biến này (677TT), làm mất khả năng chịunhiệt của MTHFR và làm giảm khoảng 35% hoạt tính của enzyme này [62].MTHFR xúc tác sự chuyển hóa 5,10-methylenetetrahydrofolate thành 5methyltetrahydrofolate (dạng hoạt động của axit folic) cần thiết cho sự hìnhthành methionine từ homocysteine Thiếu MTHFR sẽ làm tăng homocysteine.Tăng nồng độ Hcy gây tổn thương tế bào nội mạc mạch máu, thay đổi chuyểnhóa arachidonic ở tiểu cầu dẫn đến tăng sản xuất TXA2, hậu quả làm tăng

huyết áp Giảm lưu lượng máu qua thận, giảm mức lọc cầu thận trong tiền sảngiật lại dẫn đến tình trạng tăng Hcy huyết thanh tạo vòng xoắn bệnh lý phứctạp [88] Bảng 1.2 trình bày số các nghiên cứu về mối tương quan giữa gen

mã hóa các thành phần làm rối loạn chức năng nội mô với sự phát triển củatiền sản giật

Bảng 1.2 Dữ liệu từ các nghiên cứu mối tương quan giữa các gen mã hóa

thành phần rối loạn chức năng nội mô với tiền sản giật

tiền sản giật

Không có tương quan với tiền sản giật

NOS3 G894T Chen L.K et al., 2007; Sandrim V.C et

Hocher В et al., 2008 [65]

Lin J., August P., 2005;Stiefel P et al., 2009 [71],[72]

Như vậy, hiện nay vẫn chưa có ý kiến rõ ràng về tác động của hiện tượng

đa hình của gen đến sự phát triển của tiền sản giật Tuy nhiên, các thông tinmới nhất và đưa ra một sơ đồ rõ ràng hơn về phân tích đa yếu tố dựa trênnhiều đột biến điểm như những yếu tố nguy cơ tiềm ẩn Hơn nữa, ngay cả khi

sự hiện diện của các đột biến gây bệnh không phải lúc nào cũng làm bệnhnặng hơn, vì nó chỉ có khuynh hướng di truyền, tuy nhiên không rõ ở nhiềutrường hợp, vì thế không thể hướng vào điều trị đích được Để thu hẹp ranh

giới của những trường hợp này, đồng thời với mục đích hướng đến xây dựng

sơ đồ nguyên nhân và cơ chế bệnh sinh chính xác nhất, chúng tôi đã tiến hànhnghiên cứu thực trạng di truyền bệnh tiền sản giật ở Việt Nam

1.6 Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng để phát hiện đột biến gen.

1.6.1 Phản ứng PCR.

Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa vào hoạt tính của các DNApolymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNAkhuôn, với nguyên liệu là bốn loại nucleotid Phản ứng này đòi hỏi sự có mặtcủa những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với hai đầu của trình tựDNA khuôn

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm

ba bước như sau:

Hình 1.2 Các giai đoạn trong phản ứng PCR (Molecularstation)

- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation) Trong một dung dịch phảnứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA

được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử,thường là 94oC - 95oC trong vòng 30 giây - 1 phút

- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ được hạ thấp cho phépcác mồi bắt cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC - 70oC, tuỳ thuộc

Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây - 1 phút

- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ được tănglên 72oC để cho DNA polymerase là các polymerase chịu nhiệt (Taq polymerase, Tth polymerase, Pfu polymerase,…) hoạt động xúc tác quá

trình tổng hợp tốt nhất Thời gian phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNAcần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng

để làm các phân tử DNA nền để tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếptheo Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài

là khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩmđược xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi [73]

1.6.2 Giải trình tự gen trực tiếp

Khi sản phẩm PCR được đưa vào tách dòng thì có thể tiến hành giải trình

tự gen một cách dễ dàng Tuy nhiên trong trường hợp nhiều sản phẩm PCR cầnphải phân tích sàng lọc thì việc đưa các đoạn DNA khác nhau vào các vectortách dòng là việc mất nhiều công sức Trong trường hợp đó, kỹ thuật giải trình tựgen là khả thi nhất Dù sao đây là một kỹ thuật không đơn giản và tốn chi phícao Ngày nay, nhờ tiến bộ vượt bậc về lĩnh vực này, việc giải trình tự gen ngàycàng được tự động hóa, trở nên đơn giản và đỡ tốn kém hơn [73] Phươngpháp giải trình tự gen cho phép phát hiện tất cả các đột biến, đặc biệt là cácđột biến điểm, do đó kỹ thuật này được áp dụng cho việc phát hiện một sốSNP không có vị trí cắt enzym giới hạn của gen

Đoạn DNA cần được giải trình tự được sử dụng như trình tự mẫu chophản ứng khuếch đại gen (PCR) bắt đầu từ vị trí gắn mồi Hỗn hợp củadeoxy- và dideoxynucleotid được sử dụng trong phản ứng với nồng độ saocho các dideoxynucleotid sẽ gắn vào mỗi vị trí mà các deoxynucleotid thườnggắn trên đoạn DNA đang được tổng hợp Sự gắn của các dideoxynucleotidsẽlàm gián đoạn quá trình kéo dài các đoạn DNA được tổng hợp, kết quả sẽ tạo

ra hỗn hợp các sợi DNA có kích thước khác nhau Nucleotid tận cùng trênmỗi sợi DNA có thể được xác định bằng cách chạy đồng thời bốn phản ứngriêng biệt trong đó mỗi phản ứng chứa một loại dideoxynucleotid (ddATP,ddCTP, ddGTP, ddTTP) hoặc bởi một phản ứng hỗn hợp nhưng từng loạidideoxynucleotid được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang đặc hiệukhác nhau Kết quả là hỗn hợp các sợi DNA tổng hợp từ sợi khuôn được phântách bằng điện di trên gel acrylamid có độ phân giải cao, cho phép phân biệtđược các sợi đơn DNA hơn kém nhau một nucleotid Trình tự các nucleotideđược xác định tương ứng với trình tự của các vạch trên gel ứng với mỗi loạidideoxynucleotid Sau đó, trình tự gen của mẫu nghiên cứu sẽ được đối chiếuvới trình tự gen trên ngân hàng gen thế giới (GenBank) và được phân tích đểxác định vùng hoặc điểm đột biến

1.6.3 Kỹ thuật PCR-RFLP

Kỹ thuật PCR-RFLP dựa trên cơ sở kỹ thuật PCR cổ điển Sau khi kếtthúc phản ứng, sản phẩm PCR đặc hiệu sẽ được tinh sạch và xử lý với enzymecắt giới hạn đã được lựa chọn nhằm tạo ra những phân đoạn DNA nhỏ hơn Vịtrí cắt trên DNA thay đổi nếu có đột biến, tạo ra các đoạn có kích thước khácnhau Các đoạn DNA dài ngắn khác nhau này được phát hiện bằng kỹ thuậtđiện di trên gel agarose hay gel polyacrylamide sẽ giúp phát hiện các trườnghợp đột biến

152 bp

92bp

60bp

Đây là kỹ thuật không phổ biến trong phân tích sản phẩm PCR, tuy nhiên

kỹ thuật này cho ưu điểm như hiệu quả cao, kết quả rõ ràng, nhanh và đơn giản

Kỹ thuật phân tích bằng enzym là công cụ hữu hiệu trong trường hợp cần xácđịnh sự có mặt của đột biến trong quá trình PCR mà khuôn DNA không có Tuynhiên, không phải tất cả các đột biến đều có thể thực hiện được, có thể có cắtkhông hoàn toàn và giá thành một số enzyme khá cao [73]

Hình 1.3: Xác định đa hình SPNs của gen NOS3 G894T

bằng kỹ thuật PCR- RFLP 1.6.4 Phản ứng nối chuỗi (Ligase chain reaction –LCR)

Đây là kỹ thuật cho phép phát hiện sự thay thế một đôi base với tính đặchiệu và độ tin cậy cao và có nhiều ứng dụng trong pháp y LCR không phải là

kỹ thuật PCR vì không có sự tham gia của enzyme polymerase mà quá trìnhkhuếch đại lại nhờ xúc tác của enzyme ligase để kết nối hai đầu tận của haicặp mồi liền kề nhau Kỹ thuật này có độ đặc hiệu cao, với hiệu quả kết nốilên tới 100% nếu như cặp oligonnucleotid đối mã đúng và gần như 0% nếuchỉ có 1 base không đối mã Tuy nhiên trong một số trường hợp nồng độ DNAcao dẫn đến bắt cặp nhầm nên cần pha loãng DNA [73]

1.6.5 Hệ thống khuếch đại các đột biến bền với nhiệt (Amplification refractory mutation system-ARMS)

Nguyên tắc của ARMS tương tự như kỹ thuật LRC là đều dựa trên sự khácbiệt về các nucleotid của primer ở đầu 3’ thiết kế cho các alen khác nhau.Chính vì vậy, ARMS còn có một số tên gọi khác nhau căn cứ vào bản chất kỹ

sẽ trơ với đoạn DNA có đột biến và chỉ bắt cặp với đoạn DNA bình thường đểcho sản phẩm PCR Ngược lại, mồi đột biến sẽ trơ với đoạn DNA bìnhthường và hoạt động với đoạn DNA có đột biến cho sản phẩm PCR.

Mồi bình thường Mồi đột biến

DNA bình

thường

DNA đột biến

Đây là phương pháp phát hiện đột biến đơn giản, rẻ tiền, có thể thực hiện

đa mồi để sàng lọc nhiều đột biến Tuy nhiên, các đoạn mồi có thể bị thoáihóa, tạo ra những sản phẩm không đặc hiệu Kỹ thuật này thường được sửdụng trong trường hợp cơ thể có nhiều cấu trúc đa hình thái, dòng tế bào mầmđột biến tế bào soma, chẩn đoán trước sinh bệnh lý di truyền và phát hiện cácbiểu hiện bệnh trong và sau quá trình điều trị ung thư [73]

5’ 3’

1.6.6 Real-time PCR

Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện nhờ sựphân tích đầu cuối (end-point) bằng cách chạy điện di DNA trên agarose gelsau khi phản ứng kết thúc Ngược lại, phương pháp real-time PCR cho phépphát hiện và định lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đangdiễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về sốlượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang

Trong real-time PCR, người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộmliên kết DNA sợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang, và các probe hoặcprimer đặc hiệu chuỗi (trình tự) được đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR).Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ (máy PCR) đặc biệt được gắn với một module pháthiện tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đạixảy ra Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm đượckhuếch đại trong mỗi chu kỳ

Real-time PCR có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phépchúng ta định lượng số copy khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độnhạy cao trên một phạm vi động học lớn Các kết quả của real-time PCR cóthể là chất lượng (sự có mặt hoặc không của trình tự đích) hoặc định lượng(số bản copy của DNA) Số liệu của real-time PCR có thể đánh giá mà khôngcần điện di gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu đưavào quá trình được tăng lên Cuối cùng, do các phản ứng được chạy và số liệuđược đánh giá trong một hệ thống tube đóng kín, nên các cơ hội nhiễm bẩn đượcgiảm thiểu và sự cần thiết của các thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ

Chương 2ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu:

Đối tượng nghiên cứu là những thai phụ, được khám và quản lý thai tạiBệnh viện Phụ sản Hà Nội trong thời gian từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 9năm 2017, bao gồm 2 nhóm sau:

- Nhóm chứng: Thai phụ bình thường

- Nhóm bệnh: Thai phụ được chẩn đoán tiền sản giật

2.1.1 Tiêu chuẩn chọn nhóm bệnh

+ Có các triệu chứng tiền sản giật như:

- Tăng huyết áp: Huyết áp >140/90 mmHg đo hai lần cách nhau 4 giờ,sau 20 tuần tuổi thai

- Protein niệu : > 0,5 g/l ở mẫu nước tiểu ngẫu nhiên hoặc >0,3g/l ở mẫunước tiểu 24h

- Phù

+ Tiền sử gia đình hoặc bản thân mắc TSG, sản giật, rau bong non, thaichết lưu, thai kém phát triển trong tử cung, đa thai, lớn tuổi (>35), mắc một sốbệnh nội khoa như tăng huyết áp mãn tính, lupus ban đỏ hệ thống, hội chứngthận hư, đái tháo đường, suy thận

+ Thai phụ đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ

Những thai phụ có tình trạng bệnh lý sau không được chọn làm đốitượng nghiên cứu:

- Bệnh tim mạch, bệnh ung thư

- Bị nhiễm trùng đặc biệt, nhiễm trùng thần kinh, có tiền sử chấn thương

sọ não, các bệnh thoái hóa hệ thần kinh, u não

- Có các bất thường ở thai,

Rh Thai phụ không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.3 Tiêu chuẩn lựa chọn nhóm chứng

Nhóm chứng được chọn theo những tiêu chuẩn sau: Thai phụ mang thaiđơn, khỏe mạnh không có các biểu hiện nghén nặng, không phù, không tănghuyết áp, protein niệu âm tính, tuổi tương đương với nhóm bệnh (± 2 tuổi) vàkhông có tiền sử cũng như yếu tố nguy cơ tiền sản giật

2.1.4 Cỡ mẫu nghiên cứu

Cỡ mẫu: cỡ mẫu cần thiết cho nghiên cứu đã được tính toán trên cơ sởtần số xuất hiện các đột biến gen Nhiều nghiên cứu trên thế giới đưa ra tần sốxuất hiện các đột biến ACE (I/D), AGT (M235T), NOS3 (G894T, intron 4a/b)

và MTHFR (C677T) dao động từ 20-70% [62]

Cỡ mẫu được xác định theo công thức:

( )2

2 α/2 1

Δ

p.q Z

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu:

Nghiên cứu bệnh- chứng

2.2.2 Cách thức tiến hành:

Lựa chọn đối tượng nghiên cứu, thông tin bệnh nhân được thu thập theo

Phiếu thông tin bệnh nhân (Phụ lục 6), thu thập mẫu máu toàn phần và bảo

quản mẫu

- DNA sẽ được tách chiết từ mẫu máu toàn phần của các đối tượng này,

sau đó sẽ được phân tích xác định tính đa hình của gen.

- Xác định tính đa hình của các gen MTHFR (C677T), NOS3 (G894T,4b/a) được thực hiện bằng phương pháp PCR sử dụng các enzyme giới hạn vàxác định chiều dài của các đoạn được cắt bằng điện di trên gel agarose ở mẫuDNA của bệnh nhân được chẩn đoán tiền sản giật và mẫu DNA đối chứng

- Xác định các đột biến gen ACE (I/D 287bp), AGT (M235T) bằng kỹthuật Realtime PCR

2.2.2.1 Trang thiết bị, hóa chất

Trang thiết bị: dụng cụ phải được vô trùng tuyệt đối (hấp ướt 120oC trong 20phút)

- Máy hấp vô trùng dụng cụ

- Máy Gen Amp PCR System 9700 (USA)

- Tủ lạnh sâu (-30oC, -80oC), tủ ấm

- Máy Realtime PCR Step One Plus của hãng ABI

- Lò vi sóng (Samsung), bồn ủ nhiệt, buồng hút

- Máy ly tâm để bàn Eppendorf (Đức), máy ly tâm lạnh Beckman (USA)

- Hệ thống điện di ngang Mupid (Nhật Bản)

- Máy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA)

- Máy đo nồng độ DNA Nano Drop 1000 (Mỹ)

- Pipettor, pipette tip, polypropylene tube (200µL, 500 µL)

- Ống PCR, ống effpendorf 1,5ml, ống Falcon, găng tay, giấy thấm đãđược vô trùng tuyệt đối

Hóa chất:

- Tách chiết DNA từ máu toàn phần: phương pháp phenol/chloroform.

+ Dung dịch Lysis buffer, Dung dịch K.

+ Dung dịch SDS 10%, Proteinase K (10mg/ml).

+ Dung dịch phenol: chloroform: isoamyl với tỷ lệ 25:24:1

+ Dung dịch chloroform: isoamyl với tỷ lệ 24:1

+ Ethanol 100% và ethanol 70%, Sodium acetate 3M, pH = 5,2

+ Dung dịch hòa tan DNA (TE hoặc nước lọc 2 lần đã được khử trùng)

- PCR-RFLP: Enzyme cắt giới hạn đặc hiệu tương ứng với mỗi dạng đa hình

thái đơn sẽ được sử dụng

- Điện di sản phẩm PCR: Gel agarose, dung dịch TBE (boric acid EDTA),

ethidium bromide, loading dye, thước đo DNA

- Kỹ thuật Realtime PCR: Bộ kit SNP - express của hãng Lytech

2.2.2.2 Thu thập mẫu bệnh phẩm và bảo quản

- Mẫu máu được thu thập từ nhóm thai phụ được chẩn đoán tiền sản giậttại Bệnh viện Phụ sản Hà Nội và nhóm thai phụ khỏe mạnh làm đối chứng,máu toàn phần chống đông bằng EDTA

- Bảo quản mẫu trong tủ lạnh âm sâu (to = - 80oC) cho đến khi phân tích mẫu

2.2.2.3 Quy trình kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu

 Tách chiết DNA từ máu toàn phần: theo phương pháp phenol/ chloroform,(hóa chất và quy trình tiến hành xem phụ lục 1)

 Đo mật độ quang kiểm tra nồng độ DNA và độ tinh sạch (xem phụ lục 2)

 Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP xác định SNP G894T và 4b/a của genNOS3

- DNA sau khi được tách chiết sẽ được khuếch đại nhờ phản ứng RFLP với cặp mồi đặc hiệu (xem phụ lục 3).

PCR Sản phẩm sau PCR sẽ được điện di trên gel agarose 3% để phát hiện SNPG894T và 4b/a (xem phụ lục 4)

 Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP xác định SNP C677T của gen MTHFR

- DNA sau khi được tách chiết sẽ được khuếch đại nhờ phản ứng RFLP với cặp mồi đặc hiệu (xem phụ lục 3)

PCR Sản phẩm sau PCR sẽ được điện di trên gel agarose 3% để phát hiện SNPC677T (xem phụ lục 4)

 Sử dụng kỹ thuật realtime - PCR xác định các SNP I/D và M235T của genACE và AGT

- DNA sau khi được tách chiết sẽ được khuếch đại nhờ phản ứng realtime-PCR với cặp mồi đặc hiệu để phát hiện đột biến (xem phụ lục 5)

2.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

2.3.1 Địa điểm nghiên cứu

- Bộ môn Hóa sinh, Trường Đại học Y Hà Nội

- Trung tâm Nghiên cứu Gen & Protein, Trường Đại học Y Hà Nội

- Bộ môn Di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội

- Tuổi, BMI, huyết áp.

- Các yếu tố nguy cơ: Có thai khi lớn tuổi, đa thai, thai lưu, tiền sử TSG, thai chậm phát triển

2.4.2 Các đặc điểm lâm sàng: Protein niệu

2.4.3 Vai trò của tính đa hình thường gặp các gen AGT, ACE, NOS3 và MTHFR với TSG.

Thăm khám di truyền Lập bệnh án di truyền

Nhóm bệnh TSG

Realtime PCR (ACE, AGT)

PCR- RFLP (MTHFR, NOS3)

Nhóm chứng

Lấy máu

Xử lý bệnh phẩm

Tách chiết DNA

Đo Nano Drop

Điện di kiểm tra kết quả

Phân tích kết quả:

Xác định tần số xuất hiện các SNP thường gặp của các gen ACE, AGT, NOS3 và MTHFR.

Phân tích mối tương quan giữa tổ hợp các alen của các đa hình gen ACE,AGT, NOS3 và MTHFR Xác định tổ hợp các alen của các gen có giá trị tiên lượng TSG.

2.5 Quy trình nghiên cứu

Các bước thực hiện

* Lập bệnh án di truyền

* Thăm khám di truyền lâm sàng

* Xét nghiệm hóa sinh

* Xét nghiệm sinh học phân tử

* Phân tích kết quả

* Bàn luận

Sơ đồ tóm tắt các bước thực hiện: