NGHIÊN cứu mối LIÊN QUAN GIữA đa HìNH KIểU GEN MTHFR c677t với mật độ XƯƠNG và NGUY cơ gãy XƯƠNG đốt SốNG ở PHụ nữ mãn KINH

Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Nghiên cứu Y Học Đinh Tiên Hoàng đã tạo điều kiện cho tôi tham gia vào đề tài: “Xác định tính đa hình và sự nhạy cảm của các gen gây loãng xương và gãy xươ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGHI£N CøU MèI LI£N QUANGI÷A §A H×NH KIÓU GEN MTHFR C677T VíI MËT §é X¦¥NG Vµ NGUY C¥ G·Y X¦¥NG

Trong quá trình học tập và tiến hành nghiên cứu, tôi đã được sự giúp đỡ tận tình từ các thầy cô giáo, các bạn đồng nghiệp, từ cơ quan và những người thân trong gia đình Hoàn thành luận văn này, cho phép tôi bày tỏ lòng kính trọng và

đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình làm luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc và Tập thể cán bộ nhân viên Khoa khám bệnh - Bệnh viện Bạch Mai, Khoa cơ xương khớp – Bệnh viện Bạch Mai, Trung tâm Gen và Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi thực hiện nghiên cứu này.

Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Nghiên cứu Y Học Đinh Tiên Hoàng đã tạo điều kiện cho tôi tham gia vào đề tài: “Xác định tính đa hình và sự nhạy cảm của các gen gây loãng xương và gãy xương trên người Việt Nam” mã số

106 – YS.03-2013.33.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, các thầy cô giáo Trường Đại học Y Hà Nội nói chung cũng như các thầy cô giáo Bộ môn Sinh lý học nói riêng đã tạo điều kiện thuận lợi và nhiệt tình giảng dạy truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và làm luận văn tốt nghiệp.

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp, gia đình, những người thân đã động viên, chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập.

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Học viên

Nguyễn Thanh Tùng LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Nguyễn Thanh Tùng, học viên Bác sĩ nội trú khóa 40 chuyên ngànhSinh lý học, xin cam đoan:

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đãđược công bố tại Việt Nam.

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trungthực và khách quan, đã được xác nhận và chấp nhận của cơ sở nơinghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Học viên

Nguyễn Thanh Tùng

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ĐTXĐ Đầu trên xương đùi

Rw Reverse wild type primer

Rm Reverse mutation primer

SNP Single nucleotide polymorphism

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về gãy xương đốt sống 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Dịch tễ học gãy xương đốt sống do loãng xương 4

1.1.3 Chẩn đoán gãy xương đốt sống do loãng xương 5

1.1.4 Chẩn đoán xác định loãng xương 10

1.1.5 Cơ chế bệnh sinh của loãng xương và gãy xương do loãng xương 12

1.1.6 Gen liên quan đến loãng xương và gãy xương 17

1.2 MTHFR 18

1.2.1 Tổng quan về MTHFR 18

1.2.2 Vị trí và cấu trúc của gen MTHFR 18

1.2.3 Cấu trúc và chức năng protein MTHFR 18

1.2.4 Đa hình gen MTHFR 20

1.2.5 SNP rs1801133 - C677T - Ala222Val 21

1.2.6 Các nghiên cứu về MTHFR C677T tương quan với mật độ xương và nguy cơ gãy xương 23

1.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử phân tích vị trí đa hình kiểu gen C677T 24

1.3.1 Kỹ thuật PCR 25

1.3.2 Phương pháp ARMS–PCR 26

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.1 Nhóm bệnh 28

2.1.2 Nhóm chứng 29

2.2 Thiết kế nghiên cứu và cỡ mẫu 29

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 29

2.2.2 Công thức tính cỡ mẫu 29

2.3.2 Địa điểm nghiên cứu 30

2.4 Quy trình nghiên cứu 30

2.5 Các phương pháp và công cụ thu thập số liệu 31

2.5.1 Quy trình lấy máu và bảo quản 31

2.5.2 Đánh giá gãy xương đốt sống trên X Quang 32

2.6 Các bước tiến hành phân tích gen 32

2.6.1 Tách DNA 32

2.6.2 Qui trình xác định kiểu gen bằng ARMS-PCR 33

2.6.3 Phương pháp giải trình tự gen 35

2.7 Các biến số nghiên cứu 36

2.8 Phân tích và xử lý số liệu 37

2.9 Đạo đức nghiên cứu 37

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38

3.1 Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 38

3.1.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 38

3.1.2 Đặc điểm mật độ xương của đối tượng nghiên cứu 39

3.1.3 Đặc điểm gãy xương của đối tượng nghiên cứu 39

3.2 Xác định đa hình kiểu gen MTHFR C677T 41

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA 41

3.2.2 Kết quả xác định kiểu gen MTHFR C677T bằng phương pháp ARMS PCR 43

3.2.3 Kết quảxác định kiểu gen MTHFR C677T bằng phương phápgiải trình tự gen 44

3.2.4 Phân bố kiểu gen và tần số alen của đa hình MTHFR C677T của đối tượng nghiên cứu 45

3.3 Mối liên quan giữa kiểu gen MTHFR C677T với gãy xương đốt sống của đối tượng nghiên cứu 46

3.3.2 Mối liên quan giữa kiểu gen MTHFR C677T với gãy xương đốt

sống của đối tượng nghiên cứu 48

3.3.3 Mối liên quan giữa kiểu gen MTHFR C677T với một số đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 48

3.3.4 Mối liên quan giữa gãy xương và các yếu tố ảnh hưởng trong mô hình hồi quy đa biến nhị phân logistic 52

Chương 4 BÀN LUẬN 53

4.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 53

4.2 Tỷ lệ kiểu gen MTHFR C677T bằng kĩ thuật ARMS PCR 56

4.2.1 Bàn luận về xác định kiểu gen MTHFR C677T bằng kĩ thuật ARMS PCR 56

4.2.2 Phân bố tần số alen của đa hình kiểu gen MTHFR C677T trong nghiên cứu so với tần số người Việt Nam và các nước khác 57

4.2.3.Tỷ lệ đa hình kiểu gen MTHFR C677T ở phụ nữ mãn kinh Việt Nam 58

4.3 Mối liên quan giữa kiểu gen MTHFR C677T với gãy xương đốt sống do loãng xương 59

4.3.1.Mối liên quan giữa kiểu gen MTHFR C677T với gãy xương đốt sống do loãng xương 59

4.3.2 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T và các yếu tố nguy cơ ảnh hưởng đến gãy xương đốt sống do loãng xương 63

4.4 Dự phòng gãy xương đốt sống 64

4.5 Điểm mạnh, điểm yếu của nghiên cứu 68

KẾT LUẬN 69

KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.1 Giá trị tham chiếu thang định lượng trên người Việt Nam 10

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán loãng xương của WHO 11

Bảng 1.3 Mật độ xương đỉnh trung bình (g/cm2) trong quần thể của phụ nữ Việt Nam đo bằng máy Hologic 12

Bảng 1.4 Vị trí và các kiểu đa hình gen MTHFR 20

Bảng 1.5 Bảng phân bố tần số đa hình kiểu gen MTHFR C677T trên thế giới .21

Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 33

Bảng 2.2 Trình tự chuỗi DNA mồi 34

Bảng 2.3 Các biến số nghiên cứu 36

Bảng 3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 38

Bảng 3.2 Đặc điểm mật độ xương của đối tượng nghiên cứu 39

Bảng 3.3 Đặc điểm vị trí, hình thái gãy xương trên X-Quang của nhóm bệnh nhân gãy xương 40

Bảng 3.4 Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch của DNA 41

Bảng 3.5 Nồng độ DNA và độ tinh sạch trung bình 43

Bảng 3.6 Phân bố kiểu gen và tần số alen của đa hình C677T gen MTHFR của đối tượng nghiên cứu 45

Bảng 3.7 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677Tvới mật độ xương cổ xương đùi của đối tượng nghiên cứu 46

Bảng 3.8 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với mật độ xương đầu trên xương đùi của đối tượng nghiên cứu 47

Bảng 3.9 Mốiliên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677Tvới mật độ xương cột sống thắt lưng của đối tượng nghiên cứu 47

Bảng 3.11 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với tuổi của

đối tượng nghiên cứu 48Bảng 3.12 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với chiều

cao của đối tượng nghiên cứu 49Bảng 3.13 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677Tvới cân

nặng của đối tượng nghiên cứu 49Bảng 3.14 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677Tvới BMI

của đối tượng nghiên cứu 50Bảng 3.15 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677Tvới số năm

mãn kinh của đối tượng nghiên cứu 50Bảng 3.16 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với khu vực

sinh sốngcủa đối tượng nghiên cứu 51Bảng 3.17 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với khu vực

sinh sốngcủa đối tượng nghiên cứu 51Bảng 3.18 Sự liên quan giữa gãy xương và các yếu tố trong mô hình hồi

quy đa biến nhị phân logistic 52Bảng 4.1 Hàm lượng folat trong 100 gam phần ăn được của một số thực

phẩm 67

Biểu đồ 3.1 Phân độ gãy xương trên X-Quang theo thang định lượng ở

nhóm bệnh nhân gãy xương 39Biểu đồ 3.2 Đặc điểm số vị trí gãy xương trên X-Quang ở nhóm bệnh nhân

gãy xương 40Biểu đồ 4.1 Tần số alen C và T của đa hình MTHFR C677T ở một số cộng

đồng 57Biểu đồ 4.2 Sự phân bố kiểu gen của đa hình MTHFR C677T ở một số

cộng đồng 58

Hình 1.1 Phân loại gãy xương đốt sống qua đánh giá bằng X-Quang 6

Hình 1.2 Thay đổi hình dáng đốt sống 7

Hình 1.3 Hình ảnh gãy nhẹ 8

Hình 1.4 Cách đặt điểm xác định 3 trục cột sống 9

Hình 1.5 Mô hình xương bình thường và loãng xương 10

Hình 1.6 Quá trình tái mô hình (remodeling) xương xảy ra theo trình tự khởi động, phân hủy, tạm ngưng và tạo xương 13

Hình 1.7 Tương tác giữa các dòng tế bào tạo xương và hủy xương 14

Hình 1.8 Sự thay đổi nồng độ testosteron (A) và estradiol (B) ở nam và nữ người Việt 16

Hình 1.9 Vị trí gen MTHFR trên NST 1 18

Hình 1.10 Cấu trúc của MTHFR 19

Hình 1.11 Chuyển hóa của MTHFR 19

Hình 1.12 Cơ chế tác dụng của nồng độ homocystein máu lên xương 22

Hình 1.13 Minh họa chu kì nhiệt trong phản ứng PCR 26

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 31

Hình 2.2 Đa hình kiểu gen MTHFR C677T 34

Hình 2.3 Kết quả giải trình tự gen 35

Hình 3.1 Kết quả xác định kiểu gen MTHFR C677T bằng phương pháp ARMS – PCR 43

Hình 3.2 Kết quả giải trình tự gen 44

Hình 4.1 Quá trình chuyển hóa acid folic và folat 66

Hình 4.2 Quá trình chuyển hóa Homocystein 66

ĐẶT VẤN ĐỀ

Gãy xương đốt sống là biểu hiện kinh điển của bệnh lý loãng xương[1] Tuy nhiên, đa số các trường hợp gãy xương đốt sống thường không cótriệu chứng, chỉ khoảng 30% các trường hợp được chẩn đoán ngẫu nhiên vàtới 70% các trường hợp không được phát hiện [2]

Kết quả từ các nghiên cứu dịch tễ ở người Âu Mỹ cho thấy, cứ 100người sau độ tuổi 50 thì có khoảng 20 người bị gãy xương đốt sống Ở phụ nữsau mãn kinh, tỷ lệ gãy xương đốt sống thay đổi từ 15% tới 25%, đồng thời có

sự khác biệt cao của tần suất gãy xương đốt sống giữa các quốc gia và các dântộc [3] Tần suất gãy xương đốt sống gia tăng theo độ tuổi cũng ghi nhậnđược ở cả hai giới, và nữ có xu hướng tăng nhiều hơn nam [3] Khoảng 50%phụ nữ bị gãy xương bị tử vong trong vòng 7 năm Đối với các bệnh nhânmay mắn sống sót họ cũng mắc nhiều biến chứng và chất lượng cuộc sống bịgiảm đáng kể Mỗi năm tại Châu Âu có khoảng 8,9 triệu ca gãy xương doloãng xương và dẫn tới mất khoảng 5,8 triệu năm sống có chất lượng [4] Gãyxương do loãng xương gây tổn thất lớn cho nền kinh tế quốc gia Ở châu Âunăm 2010 số tiền mà xã hội phải chi trả cho bệnh nhân loãng xương là 37 tỉEuro [5]; ở Mỹ mỗi năm có khoảng 1,5 triệu ca gãy xương tương đương vớikhoảng 17 tỉ đô la.Theo ước tính thì một nửa số ca gãy xương sẽ xảy ra tạichâu Á [6], [7].Nghiên cứu dịch tễ gần đây tại Thái Lan và Trung Quốc chothấy tần suất gãy xương đốt sống ở phụ nữ sau mãn kinh tại các nước này là10% và 30%[8], [9], [10] Tại Việt Nam tỷ lệ gãy xương đốt sống ở nam là23% và ở nữ là 26% [1] Điều này cho thấy gãy xương đốt sống là một gánhnặng y tế của Việt Nam, nhất là trong điều kiện số người cao tuổi đang gia

tăng nhanh Mặc dù vậy các nghiên cứu để làm sáng tỏ cơ chế bệnh sinh củagãy xương do loãng xương còn hạn chế.

Gần đây nghiên cứu trên các cặp song sinh và phả hệ đã cho thấy genquyết định 50-85% mật độ xương [11] Hiện nay đã tìm thấy 56 loci liên quanđến sự thay đổi mật độ xương trong đó có 14 loci mật độ xương liên quan đếngãy xương và 6 loci trong số đó đạt mức ý nghĩa p < 0,05 bao gồm: 18p11.21(C18orf19), 7q21.3 (SLC25A13), 11q13.2 (LRP5), 2q16.2 (SPTBN1), 4q22.1(MEPE) và 10q21.1 (DKK1) [12]

Một số nghiên cứu mới đây cho thấy đa hình kiểu gen MTHFR C677T

có liên quan đến bệnh lý gãy xương do loãng xương Một điểm đa hình tronggen MTHFR (C677T), liên quan với giảm hoạt động của enzym và tănghomocysteine máu Năm 2007, tác giả Xiumei Hong và cộng sự nghiên cứutại Trung Quốc đã cho thấy đa hình kiểu gen MTHFR C677T là yếu tố độclập dự đoán nguy cơ gãy xương [13] Năm 2011, nghiên cứu của H Wang vàcộng sự phân tích 20 nghiên cứu đã cho thấy sự tương quan mức độ nhẹ giữaMTHFR C677T với mật độ xương và nguy cơ gãy xương [14] Tuy vậy, năm

2013 nghiên cứu của Guan tổng hợp số liệu của 7 nghiên cứu bệnh chứng lạichỉ ra đa hình MTHFR C677T không liên quan đến gãy xương ở phụ nữ mãnkinh [15] Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu nào được công bố phân tích mốiliên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với gãy xương do loãngxương Để chẩn đoán sớm và tiên lượng nguy cơ gãy xương do loãng xương ởphụ nữ mãn kinh nhằm dự phòng và điều trị kịp thời, chúng tôi tiến hành

nghiên cứu: “Nghiên cứu mối liên quan giữa đa hình kiểu genMTHFR

C677Tvới mật độ xương và nguy cơ gãy xương đốt sống ở phụ nữ mãn kinh”với mục tiêu là:

1 Xác định tỷ lệ đa hình kiểu gen MTHFR C677T ở phụ nữ mãn kinh Việt Nam.

2 Xác định mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFRC677T với

mật độ xương và nguy cơ gãy xương đốt sống ở phụ nữ mãn kinh Việt Nam.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về gãy xương đốt sống

1.1.1 Định nghĩa

Gãy xương do loãng xương là gãy xương do chấn thương nhẹ, gãyxương do loãng xương là gãy vi cấu trúc

Bệnh nhân bị loãng xương có nguy cơ cao đối với gãy xương đặc biệt

là đốt sống, gãy xương cổ tay và cổ xương đùi [16] Gãy xương đốt sống làhình thái phổ biến nhất và xuất hiện sớm nhất của gãy xương do loãng xương

ở phụ nữ mãn kinh và đang được xem là vấn đề sức khỏe toàn cầu, tuy nhiêngãy xương đốt sống thường bị bỏ sót Trên lâm sàng chỉ có 30% số ca gãyxương đốt sống được chẩn đoán ngẫu nhiên, 70% còn lại thường không đượcphát hiện [1]

Phụ nữ bị gãy xương đốt sống sẽ bị giảm tuổi thọ và tăng nguy cơ củacác gãy xương đốt sống, gãy xương đùi, và các gãy xương khác Gãy xươngđốt sống thường đi kèm với đau lưng, hạn chế trong hoạt động hàng ngày vàgiảm chất lượng sống [17]

Khoảng một nửa phụ nữ bị gãy xương tử vong trong vòng 7 năm Đốivới các bệnh nhân may mắn sống sót họ cũng mắc nhiều biến chứng và chấtlượng cuộc sống bị giảm đáng kể [4]

Cơ chế sinh bệnh của gãy xương và xẹp đốt sống do loãng xương rấtphức tạp, có sự tham gia của nhiều yếu tố Sự mất chất xương ở bè xương dẫnđến loãng xương cột sống và xẹp đốt sống [18] Tuy nhiên gãy xương do

loãng xương di truyền theo cơ chế không hoàn toàn phụ thuộc vào mật độxương [19].

1.1.2 Dịch tễ học gãy xương đốt sống do loãng xương

Kết quả từ các nghiên cứu dịch tễ ở người Âu Mỹ cho thấy, cứ 100người sau độ tuổi 50 thì có khoảng 20 người bị gãy xương đốt sống, tươngđươngkhoảng 700000 trường hợp gãy xương đốt sống mới mỗi năm và ở phụ

nữ sau mãn kinh, tỷ lệ gãy xương đốt sống thay đổi từ 15% tới 25%, đồngthời có sự khác biệt cao của tần suất gãy xương đốt sống giữa các quốc gia vàcác dân tộc Tần suất gãy xương đốt sống gia tăng theo độ tuổi cũng ghi nhậnđược ở cả hai giới, và nữ có xu hướng tăng nhiều hơn nam [3]

Theo ước tính thì một nửa số ca gãy xương sẽ xảy ra tại châu Á [6],[7].Nghiên cứu dịch tễ gần đây tại Thái Lan và Trung Quốc cho thấy tầnsuất gãy xương đốt sống ở phụ nữ sau mãn kinh tại các nước này là 10 và30% [8], [9], [10] Tại Việt Nam tỷ lệ gãy xương đốt sống ở nam là 23% và

ở nữ là 26% [1]

Gãy xương do loãng xương gây tổn thất lớn cho nền kinh tế quốc gia

Ở châu Âu năm 2010 số tiền mà xã hội phải chi trả cho bệnh nhân loãngxương là 37 tỉ Euro [5]; ở Mỹ mỗi năm có khoảng 1,5 triệu ca gãy xươngtương đương với khoảng 17 tỉ đô la

Hình thái gãy xương đốt sống do loãng xương hay gặp nhất là gãy bờtức là bờ trước của xương bị sụp trong khi bờ sau không thay đổi, vị trí gãythường xảy ra ở những vùng chuyển tiếp do đặc điểm chịu lực của những đốtsống này Đáng chú ý là 2/3 số bệnh nhân gãy xương đốt sống do loãngxương bị bỏ sót chẩn đoán do nó diễn biến thầm lặng không có triệu chứng[16], do đó khi phát hiện ra thì tổn thương thường nặng nề ảnh hưởng nhiềuđến chất lượng cuộc sống Tỷ lệ tử vong do gãy xương ở phụ nữ là 50% đối

với gãy cổ xương đùi, 28% đối với gãy xương đốt sống và 22% do các gãyxương khác [18].

1.1.3 Chẩn đoán gãy xương đốt sống do loãng xương

1.1.3.1 Tiêu chuẩn xác định gãy xương đốt sống trên X-Quang

Tiêu chí cho hình ảnh X Quang rõ nét

Kiểm tra gãy đốt sống do loãng xương chủ yếu dựa vào hình ảnh XQuang, thường là X Quang thẳng và nghiêng cột sống lưng, thắt lưng Xácđịnh mức độ gãy thì chỉ cần X Quang nghiêng là đủ Khoảng cách từ tiêuđiểm phát bức xạ đến phim (focus-to-film distance-FFD) thường là 100 cm XQuang lưng tâm sẽ là T7, thắt lưng là L3 [20]

Hiện nay có hai phương pháp chính để chẩn đoán gãy xương đốt sốngtrên X-Quang

Thang bán định lượng Genant

Năm 1993, Genant và cộng sự đã thiết lập thang đo độ gãy xương đốtsống bán định lượng Phương pháp này đánh giá bằng cách quan sát chiềucao, ước lượng sự giảm chiều cao và thay đổi hình dáng đốt sống [19]

Đốt sống được xác định là bị lún ép khi chiều cao bờ trước hoặc bờgiữa nhỏ hơn chiều cao bờ sau của thân đốt sống từ 20% trở lên, hoặc chiềucao của bờ sau thân đốt sống nhỏ hơn từ 20% trở lên so với chiều cao củathân đốt sống kề cạnh Nếu chỉ giảm chiều cao bờ giữa thân đốt sống gọi làlún ép kiểu lõm hai mặt, nếu chiều cao cả bờ trước và bờ sau đều giảm so vớiđốt sống kề cạnh thì gọi là lún xẹp đốt sống

Hình 1.1 Phân loại gãy xương đốt sống qua đánh giá bằng

Trước

Sau Giữa

Trước

Hình 1.2 Thay đổi hình dáng đốt sống

(Part II: Radiological assessment of vertebral fracture)

Hình 1.3 Hình ảnh gãy nhẹ (các đốt đánh dấu sao)

(Part II: Radiological assessment of vertebral fracture)

Thang Genant dễ dàng xác định gãy vừa và nặng Với gãy nhẹ có thểcăn cứ vào tiêu chí đĩa cùng của đốt đang xét không tiếp giáp, không songsong với đĩa cùng của đốt kế cận

Một ưu điểm của Genant là mức độ nặng nhẹ không tỷ lệ với loại gãy(bờ-nêm-wedge, lõm-đĩa-biconcavity hay nén-lún-crush)

Thang định lượng

Phương pháp này khắc phục được tính ước lượng của thang bán địnhlượng Chẩn đoán gãy xương đốt sống dựa vào bảng tham chiếu kích thướcđốt sống nữ giới của Hồ Phạm Thục Lan [1] Phương pháp này tính cụ thểchiều cao đốt sống trước (Ha), giữa (Hm) và sau (Hp) bằng cách đặt 6 điểmtrên phim, 3 điểm ở đĩa cùng trên và tương ứng với 3 điểm ở đĩa cùng dưới

Tỷ số Ha/Hp và Hm/Hp được sử dụng để đánh giá gãy bờ đốt sống và gãyđĩa, Hp(i)/Hp(i+1) và Hp(i)/Hp(i-1) để đánh giá độ lún Chần đoán gãy xương

khi thay đổi bất kỳ một tỷ lệ chiều cao nào trên 3 lần độ lệch chuẩn Khi cóbất kỳ một tỷ số nào của một thân đốt sống mà có -4SD <tỷ số<-3SD thì chẩnđoán là gãy xương độ I, và tỷ số ≤ -4SD được chẩn đoán là gãy xương độ II.

Nguyên tắc đặt điểm: 2 điểm bên ở tận cùng mép của đĩa cùng, điểmgiữa ở chính giữa

Hình 1.4 Cách đặt điểm xác định 3 trục cột sống

(Part II: Radiological assessment of vertebral fracture)

Bảng 1.1 Giá trị tham chiếu thang định lượng trên người Việt Nam [1]

1.1.4 Chẩn đoán xác định loãng xương

1.1.4.1.Định nghĩa

Loãng xương là hệ quả của sự mất cân đối giữa hai quá trình tạo xương vàhủy xương, trong đó mức độ hủy xương cao hơn mức độ tạo xương Sự mất cân đốidẫn đến tình trạng cơ thể bắt đầu mất xương Mất xương dẫn đến tình trạng lực củaxương suy giảm và làm tăng nguy cơ gãy xương Bởi vì các tế bào hủy xương lànhững tế bào chính trong quá trình phân hủy xương, hầu hết các thuốc được pháttriển để điều trị loãng xương đều đặt mục tiêu ức chế các tế bào hủy xương

Theo định nghĩa của WHO (2001): Loãng xương được đặc trưng bởi sựthay đổi sức mạnh của xương Sức mạnh này được đặc trưng bởi mật độ xương

và chất lượng xương Chất lượng xương được đánh giá bởi cấu trúc của xương,chu chuyển xương, độ khoáng hóa, tổn thương tích lũy, tính chất của các chất cơbản của xương Trong đó, chu chuyển xương đóng một vai trò quan trọng

Hình 1.5 Mô hình xương bình thường và loãng xương

(Nguồn: www.tudu.com.vn)

1.1.4.2.Chẩn đoán loãng xương

Từ năm 2002, các hội nghị quốc tế về loãng xương đã thống nhất quan điểm về giá trị của các loại máy đo mật độ xương: máy đo mật độ xươngdùng siêu âm chỉ có giá trị tầm soát, chỉ có máy sử dụng tia X năng lượngkép, được gọi là Dual Energy X-ray absorptiometry (DXA) mới có giá trịchẩn đoán

Nguyên tắc của phương pháp sử dụng tia X năng lượng kép là dùng tia

X có 2 mức năng lượng khác nhau quét qua một khối xương, máy sẽ đo độhấp thụ năng lượng tia X của xương và tính được mật độ xương (Bonemineral density)

Sau khi đã đo BMD, người ta tính chỉ số T (T-score) là chỉ số BMD của

cá thể đó so với BMD tối đa của quần thể trẻ tuổi làm chuẩn BMD tối đa phảiđược ước tính từ một quần thể mang tính đại diện cao cho một dân tộc (vìBMD khác biệt giữa các dân tộc) Chỉ số T được tính theo công thức sau đây:

T = iBMD−pBMD

SD

- iBMD là mật độ xương của đối tượng i

- pBMD là mật độ xương tối đa của quần thể trong độ tuổi 20-30 (còngọi là mật độ xương đỉnh – peak bone mineral density)

- SD là độ lệch chuẩn của BMD trung bình của quần thể trong độ tuổi 20-30.Tiêu chuẩn chẩn đoán loãng xương theo WHO như sau: [21]

Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chẩn đoán loãng xương của WHO

Chỉ số T cao hơn -1 Bình thường

Chỉ số T trong khoảng -2,5 đến -1,0 Thiếu xương

Chỉ số T thấp hơn hoặc bằng -2,5 Loãng xương

Loãng xương + tiền sử gãy xương gần đây Loãng xương nghiêm trọngGiá trị pBMD trung bình trong quần thể ở các quốc gia là khác nhau Ví dụnhư pBMD của phụ nữ người Việt Nam tại cổ xương đùi (0,94 ±0,11 g/cm2) [22]

tương tự như Hàn Quốc [23], Trung Quốc [24], nhưng cao hơn so với phụ nữIndonexia (0,91±0,12 g/cm2), Nhật Bản (0,90±0,12 g/cm2) [25], thấp hơn so vớiphụ nữ da trắng tại Úc (1,02±0,13 g/cm2) [26]và tại Mỹ (0,98±0,12 g/cm2) [27].

Do vậy, để có thể chẩn đoán chính xác một người Việt Nam bị loãng xương cầnphải áp dụng giá trị tham chiếu của người Việt Nam (Bảng 1.2)

Bảng 1.3 Mật độ xương đỉnh trung bình (g/cm 2 ) trong quần thể của

phụ nữ Việt Nam đo bằng máy Hologic

Vị trí xương Mật độ xương đỉnh

pBMD (SD)

Tuổi mật độ xương đạt đỉnh

Cổ xương đùi 0,80 (0,10) 25

Đầu trên xương đùi 0,86 (0,10) 32

Cột sống thắt lưng 0,98 (0,11) 30

1.1.5 Cơ chế bệnh sinh của loãng xương và gãy xương do loãng xương

Quá trình phát triển của xương phải trải qua hai giai đoạn: tạo môhình (modelling) và tái tạo mô hình (remolling) để biệt hóa các nhóm tếbào xương giúp cho sự tạo thành xương hoặc làm mới xương [28] Tạo môhình là quá trình chu chuyển xương lúc còn nhỏ (tuổi vị thành niên) cóchức năng là tạo hình dạng và chiều dài cho xương Tái tạo mô hình là quátrình bộ xương liên tục sửa chữa và tự làm mới Quá trình này có chứcnăng duy trì BMD ở mức tối ưu [29],[30]

Các tế bào tham gia vào quá trình tạo xương bao gồm: tế bào hủyxương, tế bào tạo xương, cốt bào và các tế bào liên kết Trong điều kiệnbình thường, chức năng của tế bào hủy xương và tế bào tạo xương hoạtđộng song song và mức độ tương đương nhau, với tín hiệu của loại tế bàonày ảnh hưởng tới loại tế bào kia do đó lượng xương bị phân hủy bằnglượng xương mới tạo thành

Hình 1.6 Quá trình tái mô hình (remodeling) xương xảy ra theo trình tự

khởi động, phân hủy, tạm ngưng và tạo xương

( Nguồn: Hồ Phạm Thục Lan, Nguyễn Văn Tuấn "Sinh lý học loãng xương."

Tạp chí Thời sự Y học tháng 07/2011 - Số 62.)

+ Tế bào hủy xương (osteoclast): Là tế bào khổng lồ đa nhân (50-60nhân), đường kính 20-100µm Tế bào hủy xương xuất phát từ tề bào tạomáu(hematopoietic cell),tác động đến sự thay đổi cấu trúc xương,di chuyểntheo chiều dài của xương đặc khoảng40 µm/ngày [31]

+ Tế bào tạo xương (osteoblast): Là những tế bào nhiều nhánh dài, thân tếbào dài 20-30µm, nhân hình trứng, sẫm màu, màng nhân có nhiều lỗ và các tếbào này nằm trong các ổ xương Tế bào tạo xương xuất phát từ tế bào gốc trung

mô (mesenchymal stem cell, MSC),tác động đến sự thay đổi cấu trúc xương Tếbào tạo xương hình thành osteoid với tốc độ khoảng 1µm/ngày [28]

+ Cốt bào (osteocyte): Chiếm đến 95% số tế bào có mặt trong xương.Cốt bào xuất phát từ trung bào mầm,đóng vai trò như là những tác nhân thụcảm cảm nhận tín hiệu trên xương và khởi động qui trình tái tạo mô hình [28]

+ Tế bào liên kết (bone lining cell):Là những tế bào tạo xương đã làmxong nhiệm vụ,đóng vai trò như là những tácnhân thụ cảm, cảm nhận tín hiệutrên xương và khởi động qui trình tái mô hình [29].

Trong giai đoạn tái tạo mô hình, các tế bào tạo xương sinh ra nhiềuprotein có chức năng kiểm soát quá trình tạo xương Trong đó, protein m-CSF(macrophage colony stimulating factor) sẽ tương tác với thụ thể m-CSF để làmtăng các tế bào tạo xương Tế bào hủy xương sản xuất protein RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand) - là yếu tố cần thiết cho sựphát triển của tế bào hủy xương Protein RANKL liên kết với thụ thể RANKnằm trên tế bào hủy xương, có tác dụng kích thích chúng trở thành các tế bàohủy xương hoàn chỉnh Sự tương tác giữa RANKL/RANK làm tăng mức độhủy xương Tuy nhiên, RANKL/RANK bị protein OPG (osteoprotegerin) của

tế bào hủy xương vô hiệu hóa, protein này liên kết với RANKL để ngăn chặnkhông cho tế bào hủy xương tương tác với RANK, do đó làm giảm tế bào hủyxương (Hình 1.3) Sự cân đối của RANKL/OPG quyết định BMD

Hình 1.7 Tương tác giữa các dòng tế bào tạo xương và hủy xương.

(Nguồn: Hồ Phạm Thục Lan, Nguyễn Văn Tuấn "Sinh lý học loãng xương"

Tạp chí Thời sự Y học tháng 07/ 2011- Số 62.)

Trong các yếu tố ảnh hưởng đến chuyển hóa của xương thì hormon sinhdục (bao gồm estrogen và testosteron) đóng vai trò quan trọng trong quá trình

tạo xươngở cả nam và nữ [30],[32] Nghiên cứu invitro và invivo cho thấy

estrogen và testosteron hoạt động thông qua các cơ chế tế bào khác nhau

Cơ chế tế bào của việc thiếu hụt estrogen dẫn đến mất xương đang dầnđược làm sáng tỏ Hormon estrogen do tế bào hạt của buồng trứng bài tiết ra, gọi

là nội tiết tố nữ Tác động của estrogen đến xương là qua thụ thể estrogen(Estrogen receptor-ER) [32],[33] Ảnh hưởng của estrogen là làm giảm số lượng

và ức chế hoạt động của tế bào hủy xương, dẫn đến kìm hãm quá trình phân hủyxương trong mọi giai đoạn của quá trình tái tạo mô hình [34] Khilượng estrogen

bị sụt giảm đột ngột và trầm trọng, các tếbào hủy xương thoát khỏi sự kìm hãm

về số lượng và hoạt động, dẫn đến mất cân bằng giữa hai quá trình tạo xương vàhủy xương, quá trình hủy xương mạnh hơn làm cho lượng khoáng trong xương

bị suy giảm, dẫn đến tình trạng mất xương và loãng xương

Trong cơ thể người có nhiều dạng estrogen lưu hành và chúng được sảnxuất từ các tổ chức khác nhau dưới các dạng như estradiol, estron và estriol.Thời kì trước mãn kinh 95% lượng estradiol trong máu do buồng trứng bài tiết,phần còn lại có nguồn gốc từ sự chuyển hóa estron do androgen của vỏ thượngthận và lớp áo trong của nang trứng bài tiết Mãn kinh là một giai đoạn màbuồng trứng giảm tiết và dần đi đến ngừng hoạt động Mãn kinh được địnhnghĩa là khi người phụ nữ mất kinh liên tục trong vòng 12 tháng [35]

Ở thời kỳ mãn kinh, có sự thay đổi về hàm lượng, nguồn gốc cũng nhưcác dạng estrogen lưu hành trong cơ thể người phụ nữ dohiện tượng ngừng hoạtđộng có chu kì theo sinh lý của buồng trứng Nồng độ estradiol, estron giảm rõtrong 12 tháng đầu tiên mãn kinh, sau đó chúng tiếp tục giảm nhưng với tốc độchậm hơn trong vài năm sau đó Mãn kinh có thể diễn ra bình thường với sự giàhóa sinh lý của các cơ quan, tổ chức khác Tuy nhiên, ở đa số phụ nữ tình trạngnày đã gây nên một loạt những thay đổi về tâm sinh lý với biểu hiện: bốc hỏa,

rối loạn giấc ngủ, thay đổi huyết áp, thay đổi về tâm lí, tim mạch, teo bộ phậnsinh dục, rối loạn chuyển hóa xương như đau xương, loãng xương

Tác dụng của androgen lên xương có thể một phần thông qua cơ chếchuyển androgen thành estrogen tại chỗ (local aromatization); còn một phầnthông qua tác dụng trực tiếp của androgen lên xương Bendixen và cộng sựnăm 2001 đã tìm thấy sự có mặt của các receptor đặc hiệu androgen trên tếbào tạo xương được nuôi cấy [36] Tác dụng của androgen chủ yếu là kíchthích quá trình phân chia tế bào tạo xương và ức chế quá trình chết theochương trình [36] Năm 2004, Vander Schueren và cộng sự đã tiến hànhnghiên cứu trên chuột được điều trị bằng dihydrotestosteron (là một loạitestosteron không có khả năng chuyển thành estrogen thông qua quá trìnharomatization) đã cho kết quả làm tăng tạo xương; và như vậy kết quả nghiêncứu này đã củng cố cho tác dụng trực tiếp của androgen lên xương [37]

Nguyễn Thị Thanh Hương và cộng sự năm 2014 đã công bố sự thay đổicủa nồng độ estrogen và testosteron huyết thanh toàn phần của nam, nữ ngườiViệt tuổi từ 13-83 Ở phụ nữ người Việt, nồng độ estrogen tương đối hằng địnhtrước tuổi 40, sau đó giảm rõ rệt trong giai đoạn từ 40-60 tuổi, sau tuổi 60 thì đạtgiá trị hằng định thấp Trong khi đó nồng độ testosteron toàn phần giảm rõ rệt theotuổi, xung quanh tuổi 50 nồng độ testosteron chỉ bằng ½ so với tuổi 20 (Hình 1.4).Đồng thời kết quả nghiên cứu này cũng cho thấy cả hai hormon sinh dục đều có ýnghĩa thống kê trong mô hình tiên lượng BMD ở cả nam và nữ giới [38]

Hình 1.8 Sự thay đổi nồng độ testosteron (A) và estradiol (B)

ở nam và nữ người Việt [38]

(B)

Tuổi

Mối liên quan giữa mãn kinh và loãng xương đã được biết đến từ lâu.

Đo BMD cho thấy sự mất xương ở CXĐ bắt đầu ở độ tuổi 30 và tiếp diễn vớitốc độ hằng định ở những năm tiếp theo, tuy nhiên có một giai đoạn mà tìnhtrạng mất xương nhanh hơn là trong khoảng 5 năm đầu sau mãn kinh ở nữ[39] Trước mãn kinh, BMD ở CXĐ giảm khoảng 30% và sẽ tiếp tục mấtthêm 25% ngay sau mãn kinh Mức độ mất xương ở cột sống là khoảng 5-7%mỗi năm và chỉ khoảng 93-95% diện tích các khoang huỷ xương được thaythế xương mới Việc thay thế không hoàn toàn này làm xương bè mỏng dần đi

và mất liên tục trong cấu trúc của xương

Ở phụ nữ sau thời kỳ mãn kinh, các yếu tố trên tác động làm suy giảmmật độ xương dẫn tới cấu trúc xương trở nên kém bền vững các bè xương của

họ mỏng đi, xuất hiện các khoảng trống và có thể thậm chí mất hết các bèxương Vỏ xương cũng mỏng đi và trở nên xốp Điều này làm thay đổi hoàntoàn cấu trúc của xương, tuy nhiên các thành phần cấu tạo hóa học của xươngkhông thay đổi [39]

Sự suy yếu của cấu trúc xương là yếu tố nguy cơ lớn nhất dẫn tới gãyxương, đặc biệt là gãy xương đốt sống Gãy xương đốt sống sẽ xảy ra khi có

áp lực đặt vào vùng đốt sống bị suy giảm mật độ xương dẫn tới vỡ đốt sống

và giảm chiều cao các trục đốt sống Gãy xương đốt sống thường là kết quảcủa ngã, nhưng người loãng xương có thể bị gãy xương đốt sống kể cả khi họlàm những việc hàng ngày như cử động cột sống nhẹ, ho hay hắt xì

1.1.6 Gen liên quan đến loãng xương và gãy xương

Ngoài các yếu tố ảnh hưởng tới loãng xương đã được biết đến từ lâunhư: tuổi,tình trạng hormon, các yếu tố về lối sống (thói quen ăn uống và tậpluyện) và yếu tố gia đình

Gần đây sự phát triển của công nghệ gen với khả năng phân tích và xácđịnh các dạng đa hình kiểu gen có ảnh hưởng với bệnh loãng xương và gãy

xương đã mở ra một kỉ nguyên mới trong nghiên cứu về xương nói riêng và yhọc nói chung Các nghiên cứu trên các cặp song sinh cùng trứng cho thấy yếu

tố di truyền đóng vai trò quan trọng với bệnh loãng xương, quyết định 50-80%mật độ xương [40] Hiện nay trên thế giới đã tìm được khoảng 56 locus liênquan tới thay đổi mật độ xương với mức có ý nghĩa (p<5x10-8), trong đó có 14locus mật độ xương cũng liên quan đến nguy cơ gãy xương(p<5x10-4) [12]

1.2 MTHFR (Methylene Tetrahydrofolate Reductase)

1.2.1 Tổng quan về MTHFR

MTHFR là một gen qui định protein enzym Các bệnh liên quan đếnMTHFR bao gồm: bệnh tim mạch, dị tật ống thần kinh, bệnh tâm thần, ungthư đại tràng, ung thư máu, đái tháo đường và tăng nguy cơ gãy xương Hoạtđộng của gen liên quan đến nồng độ homocystein máu, đặc biệt là nồng độfolat huyết thanh [41]

1.2.2 Vị trí và cấu trúc của gen MTHFR

Vị trí của gen được kí hiệu là 1p36.3 có nghĩa là gen nằm trên nhiễmsắc thể số 1 trong bộ gen người, nhánh ngắn Gen MTHFR bắt đầu từ cặpbase 1944 từ đầu p và kết thúc ở cặp base 27374 Tổng cộng có 25431cặpbase.Gen MTHFR bao gồm 11 exon và 11intron

Hình 1.9 Vị trí gen MTHFR trên NST 1

(Nguồn: https://ghr.nlm.nih.gov/gene/MTHFR)

1.2.3 Cấu trúc và chức năng protein MTHFR

Methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR) là một trong nhữngenzyme quan trọng nhất trong quá trình chuyển hóa folat Trong chu trình chuyểnhóa folat MTHFR liên quan tới việc chuyển 5,10 methylenetetrahydrofoltate

(CH2THF) thành 5-methyltetrahydorfolate (CH3THF), con đường này xúc tácviệc loại bỏ gốc methyl của homocystein thành methionin Enzym này cũng ảnhhưởng tới gốc methyl của acid nucleic, các hormon, các chất dẫn truyền thầnkinh, cũng như việc tổng hợp purin và pyrimidin.

MTHFR là phân tử protein có khối lượng phân tử 150kDa bao gồm

1.2.4 Đa hình gen MTHFR

Có khoảng 50 điểm đa hình trên gen MTHFR đã được tìm thấy trong

đó hai đa hình MTHFR hay gặp đó là MTHFR C677T và MTHFR A1298C,

cả hai đều làm giảm hoạt tính của MTHFR và dẫn tới tăng homocystein máu

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra đa hình MTHFR C677T có tính ảnh hưởnglớn tới hoạt tính enzyme MTHFR C677T so với các đa hình khác [43]

Trong nghiên cứu này chúng tôi quan tâm tới đa hình kiểu gen MTHFRC677T, C biến đổi thành T ở vị trí nucleotid số 677 làm biến đổi valin ở vị trí

1068T→C S352S Exon 6 Goyette P et al [42]IVS6+31T→C n/a (intronic) Intron 6 Goyette P et al [48]1298A→C E429A Exon 7 Viel A et al [49]

Bảng 1.5 Bảng phân bố tần số đa hình kiểu gen

MTHFR C677T trên thế giới

Quốc gia N

677T (%)

Tác giả 677CC

) 132(26.4) 46.0 Wilcken et al [53]Nga 587 312(53.0) 234(40.0

) 41(7.0) 26.9 Wilcken et al [53]

Trung Quốc 121 51(42.2) 53(43.8) 17(14.0) 35.9 Sadewa et al [55]Indonesia 68 57(83.8) 11(16.2) 0(0.0) 8.1 Sadewaet al [55]Canada 414 172(41.6) 183(42.2

) 59(14.3) 36.3 Hegele et al [56]Brazil 129 77(59.7) 42(32.6) 10(7.6) 24.0 Sadewa et al [55]Kenya 61 55(90.2) 6(9.8) 0(0.0) 4.7 Schneider et al [54]Gambia 24 24(87.5) 3(12.5) 0(0.0) 6.25 Schneider et al [54]

1.2.5 SNP rs1801133 - C677T - Ala222Val

Nucleotid ở vị trí 677 của gen MTHFR có hai khả năng: C (cytosin) hoặc

T (thymin) tương ứng với sự chuyển đổi Alanin thành Valin Kiểu gen 677TTtạo ra enzym hoạt tính bằng 30% và kiểu gen 677CT tạo enzym hoạt tính bằng65% so với kiểu gen MTHFR 677CC dẫn tới giảm tạo ra sản phẩm 5 –methylenetetrahydrofolate làm tăng nồng độ homocystein huyết thanh (nồng độhomocystein huyết thanh >15mmol/L) [57]

Nồng độ homocystein cao (Elevated Homocystein - Hcys) là một yếu

tố nguy cơ của nhiều bệnh lý mãn tính, bao gồm cả bệnh tim mạch, xơ vữađộng mạch, suy thận mãn tính, ảnh hưởng đến sự phát triển, chất lượngxươngvà cân bằng nội môi [58]

Loãng xương thường thấy ở những bệnh nhân có nồng độ homocysteincao Nguyên nhân do nồng độ homocystein cao ảnh hưởng đến sự hình thànhcủa một nền xương ổn định trực tiếp thông qua sự ức chếenzym tạo liên kết

ngang collagen lysyl oxidase (Lox) (nguyên nhân là do ức chế mRNA tươngứng với enzym) Roman Thaler và cộng sự (2011) đã xác định được tác dụngcủa homocystein phụ thuộc vào sự kích thích giải phóng interleukin 6 (IL-6) vàchất này tham gia vào con đường truyền tín hiệu phụ thuộc IL-6 / Janus kinase

2 (JAK2) trong tế bào tiền tạo xương Hơn thế nữa, nhóm nghiên cứu quan sátđược sự điều hòatăng hoạt động của các gen cần thiết cho sự methyl hóa DNA

di truyền ngoài gen DNA (cytosine-5)-methyltransferases và helicase đặc hiệulymphoid (Hells) Các nghiên cứu sau đó đã chứng minh Homocystein thôngqua IL-6 / JAK2 tăng sự hoạt động của Fli1 (yếu tố phiên mã Friend leukemiaintegration 1), một yếu tố phiên mã cần thiết cho kích thích yếu tố phụ thuộcIL-6Dnmt1 liên quan tới tổng hợp mRNA tương ứng với enzyme tạo liên kếtngang collagen lysyl oxidase Hai yếu tố phiên mã Fli1 và Dnmt1 gây tăngmethyl hóa vùng khởi động gen tổng hợp enzym Lox gây giảm tổng hợpmRNA tương ứng với enzym [59]

Hình 1.12 Cơ chế tác dụng của nồng độ homocystein máu lên xương [59] 1.2.6 Các nghiên cứu về MTHFR C677T tương quan với mật độ xương và nguy cơ gãy xương

Một số nghiên cứu cho thấy MTHFR C677T làm giảm mật độ xương và tăng nguy cơ gãy xương

Bo Abrahamsen và cộng sự (2003) nghiên cứu trên 1748 phụ nữ ĐanMạch mãn kinh chỉ ra kiểu gen MTHFR 677TT liên quan đến giảm mật độxương và tăng tỷ lệ gãy xương trong giai đoạn sớm sau mãn kinh Tỷ lệ gãyxương đã tăng hơn gấp 2 lần ở những người có kiểu gen 677TT [60]

Robert R McLean và cộng sự (2004) nghiên cứu 1632 đối tượng gồm

cả nam và nữ xác định có mối liên quan giữa đa hình kiểu gen C677T củaMTHFR và mật độ xương phụ thuộc vào nồng độ folat huyết thanh [61]

Morten M Villadsen và cộng sự (2004) nghiên cứu trên 724 đối tượnggồm 388 bệnh nhân loãng xương và 336 đối tượng bình thường đã cho thấykiểu gen 677TT của MTHFR C677T làm tăng nguy cơ gãy xương ở phụ nữ

và là một yếu tố yếu trong dự đoán mật độ xương cột sống thắt lưng [62]

Xiumei Hong và cộng sự (2007) nghiên cứu trên 1899 phụ nữ mãn kinhTrung Quốc xác định tính đa hình MTHFR C677T là yếu tố độc lập dự đoánnguy cơ gãy xương – người mang alen T có nguy cơ tương đối gãy xương tăng1,7 lần [13]

Zhu và cộng sự (2008) nghiên cứu trên 1213 phụ nữ tuổi 70-85 đưa ra

sự liên hệ nồng độ homocystein máu cao do đa hình gen MTHFR gây giảmmật độ xương đùi nhưng không làm tăng nguy cơ gãy xương [63]

Masataka Shiraki và cộng sự (2008) nghiên cứu trên 502 phụ nữ mãnkinh Nhật Bản nhập viện cho kết quả tỷ số nguy cơ cao hơn ở người có kiểugen 677TT mắc bệnh loãng xương vẫn còn rõ ràng sau điều chỉnh độ tuổi,kích thước cơ thể [64]

Agueda và cộng sự (2010) nghiên cứu trên 944 phụ nữ mãn kinh Tây BanNha cho thấy MTHFR C677Tkhông liên quan một cách có ý nghĩa thống kê vớimật độ xương cổ xương đùi và cột sống thắt lưng tuy nhiêntác giảcũng chỉ ra rằngkiểu gen 677TT MTHFR gây tăng nguy cơ gãy xương đốt sống [65]

Wang và cộng sự (2011) phân tích 20 nghiên cứu với 3525 bệnh nhân

và 17909 đối tượng thuộc nhóm chứng cho thấy sự tương quan mức độ nhẹgiữa MTHFR C677T với mật độ xương và nguy cơ gãy xương [14]

Một số nghiên cứu chỉ ra đa hình MTHFR C677T không liên quan đến mật

độ xương và nguy cơ gãy xương:

Năm 2006, Valero và cộng sự nghiên cứu trên 823 đối tượng bao gồm:(365 đối tượng chứng, 136 đối tượng gãy xương đốt sống, 322 đối tượng gãyxương hông) đã đưa ra kết luận đa hình MTHFR C677T không có liên quantới nguy cơ gãy xương đốt sống và các gãy xương ngoại vi khác [66]

Năm 2014, Guan và cộng sự phân tích 7 nghiên cứu bệnh chứng với

4258 bệnh nhân và 3454 người khỏe mạnh Kết quả nghiên cứu cho thấykhông có sự liên quan giữa đa hình MTHFR C677T với gãy xương do loãngxương ở phụ nữ mãn kinh [15]

Tại Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào về đa hình gen MTHFRC677T với mật độ xương và nguy cơ gãy xương ở phụ nữ mãn kinh

1.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử phân tích vị trí đa hình kiểu gen C677T

Với sự phát triển của sinh học phân tử, hiện nay có rất nhiều kỹ thuật

để xác định kiểu gen Một số kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong nghiêncứu như kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System –PCR: Kỹ thuật sử dụng hệ thống khuếch đại đột biến), RFLP-PCR(Restriction Fragment Length Polymorphism - PCR: Kỹ thuật xác định cácloại chiều dài phân đoạn DNA của các đa hình gen bằng enzym cắt giới hạn),ASP-PCR (Allelen Specific-PCR: phản ứng khuếch đại chuỗi đặc hiệu alen),Real-Time multiplex PCR, giải trình tự gen trực tiếp (Sequencing) Trong đó,ARMS-PCR là phương pháp có độ nhạy cao, kỹ thuật đơn giản và giá thành

rẻ, được áp dụng rộng rãi trong các labo sinh học phân tử ở Việt Nam Bởivậy, trong phạm vi của đề tài tôi, xin trình bày những nét chính của kỹ thuật

ARMS-PCR, là kỹ thuật liên quan đến việc xác định kiểu gen MTHFR trongnghiên cứu này Sau đó kiểm tra lại bằng phương pháp giải trình tự gen Về

cơ bản, kỹ thuật ARMS-PCR được tiến hành dựa trên cơ sở khuếch đại đoạngen nghi ngờ mang đa hình kiểu gen bằng kỹ thuật PCR

1.3.1 Kỹ thuật PCR

Nguyên tắc của phản ứng PCR dựa trên cơ sở tính chất biến tính, hồitính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA nhờ hoạt tính của các DNApolymerase Với nguyên liệu là bốn loại nucleotid, enzym DNA polymerasexúc tác sự tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch DNA khuôn Phản ứng đòihỏi sự có mặt của những mồi xuôi và mồi ngược có trình tự bổ sung với haiđầu của trình tự DNA khuôn

Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳgồm ba bước:

- Bước 1: là giai đoạn biến tính (denaturation) Trong một dung dịchphản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNAđược biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm (nhiệt độ nóng chảy) của phân tử,thường là 94oC - 95oC trong vòng 30-60 giây

- Bước 2: là giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ được hạ thấp chophép các mồi cặp với khuôn, dao động trong khoảng 40oC-70oC tuỳ thuộc Tmcủa các mồi sử dụng và kéo dài 30-60 giây

- Bước 3: là giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ đượctăng lên 72oC để DNA polymerase là polymerase chịu nhiệt (Taqpolymerase,,…) hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian phụ thuộc vào độ dàicủa trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Sau mỗi chu kỳ các chuỗi đôi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục đượcdùng để làm các DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếptheo Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi có chiều dài

bằng khoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩmđược xác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi.

Hình 1.13 Minh họa chu kì nhiệt trong phản ứng PCR [67]

Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuônDNA ban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ Sau mỗi chu kỳ sẽ làmtăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước Như vậy sau n chu kỳ, từ một DNAđích đã nhân bản được thành 2n bản sao Nhờ vậy đủ số lượng DNA để cóthể tách ra khi điện di, phát hiện được sau khi nhuộm và để tạo dòng hoặcgiải trình tự Trong quá trình thực hiện phản ứng PCR, ở những chu kỳ saulượng khuôn tăng nhưng lượng mồi và dNTP (deoxyribonucleosidetriphosphate) tự do giảm, enzym DNA polymerase hoạt động yếu dần Do

đó, cần tính toán hàm lượng mồi, dNTP và enzym để đảm bảo phản ứngPCR cho kết quả tốt nhất [67]

1.3.2 Phương pháp ARMS–PCR (Amplification refractory mutation system)

ARMS là một ứng dụng của PCR trong đó DNA được khuếch đại bằngcác alen mồi tương ứng đặc hiệu ARMS – PCR là phương pháp rất hữu íchcho việc xác định các đột biến điểm hoặc đa hình Nó cũng là phương phápquan trọng để các định kiểu gen trong DNA là đồng hợp hay dị hợp Dị hợp

tử hoặc đồng hợp tử được phân biệt bằng cách sử dụng ARMS mồi cho alen

đột biến (Mutation) và bình thường (Wild type) Các phản ứng cho alen độtbiến và các alen bình thường được thực hiện trong ống riêng biệt Trongphương pháp này giếng 1 sử dụng cặp mồi F (Forward primer) và Rw(Reverse wild type), giếng 2 sử dụng cặp mồi F và Rm (Reverse mutation).

Sự xuất hiện của sản phẩm đặc hiệu ở cả hai giếng là kiểu gen dị hợp tử, nếuchỉ xuất hiện ở giếng thứ 1 là đồng hợp tử bình thường, nếu chỉ xuất hiệnởgiếng thứ 2 là đồng hợp tử đột biến

Thiết kế mồi:

Nguyên tắc chung của thiết kế mồi PCR cũng được áp dụng với các cặpmồi ARMS Các ARMS – PCR đòi hỏi 1 cặp mồi bao gồm 1 mồi xuôi (F) và

1 mồi ngược (Rw hoặc Rm) Mồi ARMS có tính năng đặc biệt sau đây:

1 Các mồi thông thường có chiều dài 20-30 base

2 Các nucleotid ở đầu 3’ của mồi sẽ bổ sung với các nucleotid mục tiêunghĩa là C – G, G – C, A – T, T – A Sự không phù hợp ở vị trí này có thể làmgiảm đáng kể khả năng khuếch đại, ví dụ 1 đa hình được thay thế C –T cácnucleotid cuối cùng của mồi ARMS cho alen bình thường là G (bổ sung choC), cho alen đa hình lặn là A (bổ sung cho T)

3 Nếu thêm một điểm không bắt cặp ở 1 trong 5 nucleotid cuối cùngtrong mồi ARMS làm tăng thêm tính đặc hiệu cho phản ứng

4 Có rất nhiều nguyên nhân gây ra sự âm tính giả ví dụ như quá ít hoặcquá nhiều DNA, chất lượng mẫu DNA kém, thất bại trong việc thêm mồi,enzyme Taq, hoặc thuốc thử khác và sự xuất hiện của yếu tố ức chế PCR

5 Độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng ARMS có thể kiểm soát đượcbởi các điều kiện phản ứng nghiêm ngặt, thiết kế mồi tốt, và giới hạn số lượngcác chu kỳ là rất quan trọng để tránh kết quả sai Số lượng chu kỳ chỉ phải đủ

để tạo ra một kết quả dương tính chắc chắn, việc tăng số lượng chu kỳ khôngcần thiết có thể gây ra kết quả dương tính giả [68]

Chương 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Nhóm bệnh

Chọn các bệnh nhân được chẩn đoán gãy xương bằng phương pháp Eastel:

Tiêu chuẩn lựa chọn:

- Lâm sàng: Phụ nữ trên 40 tuổi và mãn kinh tự nhiên (tuổi mãn kinh từ

40 đến 55 tuổi) Mãn kinh tự nhiên được định nghĩa là mất kinh liên tục từ 12tháng trở lên

- Cận lâm sàng: Chỉ số T score được tính từ mật độ xương được đo ở cổxương đùi bên phải hoặc đầu trên xương đùi hoặc cột sống thắt lưng từ L1đến L4 ≤ -2,5 Được chẩn đoán là gãy xương theo phương pháp định lượngEastel (tính theo giá trị tham chiếu của người Việt Nam)

Tiêu chuẩn loại trừ:

- Bệnh nhân không có đầy đủ các tiêu chuẩn trên

- Bệnh nhân có tiền sử mắc các bệnh mạn tính nhưbệnh gan, thận mạntính, ung thư, các bệnh nội tiết và các rối loạn liên quan chuyển hóa vitamin

D, chuyển hóa xương như như đái tháo đường, béo phì, hội chứng kém hấpthu, bệnh cường giáp trạng, hội chứng Cushing

- Bệnh nhân sử dụng các loại thuốc liên quan đến chuyển hóa canxi vàvitamin D trong 6 tháng vừa qua, như: corticoid, hormon thay thế, heparin,bisphosphonat

- Bệnh nhân có tiền sử gãy xương, hoặc bất động từ 1 tháng trở lên

- Bệnh nhân bị cắt bỏ tử cung/buồng trứng

- Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

2.1.2 Nhóm chứng