Xác định mối liên quan giữa các đa hình đơn rs3738423 c t và rs1201807 c t của gen NPHS2 với một số chỉ tiêu sinh hóa ở bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát kháng corticoid

MỞ ĐẦU Hội chứng thận hư tiên phát trẻ em HCTHTPTE là một hội chứng lâm sàng và sinh hóa xuất hiện khi có tồn thương cầu thận do nhiều nguyên nhân khác nhau, thường không rõ ràng được đặ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐỖ THẾ HOÀNH

XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA CÁC ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID RS3738423 (C>T) VÀ RS12401708

Hà N ội – 2017

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

ĐỖ THẾ HOÀNH

XÁC ĐỊNH MỐI LIÊN QUAN GIỮA CÁC ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID RS3738423 (C>T) VÀ RS12401708

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

LỜI CẢM ƠN

Luận văn này được hoàn thành bằng sự nỗ lực của tôi cùng sự quan tâm giúp

đỡ của nhiều cá nhân và tập thể Nhân dịp hoàn thành luận văn tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới: Ban giám hiệu; Phòng đào tạo sau đại học;

Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN; Bộ môn Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, ĐHQGHN; Phòng Kế hoạch tổng hợp, BV Nhi TW; Khoa Xét nghiệm tổng hợp, BV Mắt TW đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho

tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Thơm - Chủ nhiệm Bộ môn

Y Dược học cơ sở, Khoa Y Dược, ĐHQGHN và TS Nguyễn Văn Sáng - Bộ môn

Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, hai người thầy đã tận tình hướng dẫn và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn đề tài Cấp Đại học Quốc gia Hà Nội, mã số

QG.16.23 đã tài trợ cho tôi thực hiện đề tài này

Xin trân trọng cảm ơn các Thầy, Cô trong hội đồng chấm luận văn đã có các ý kiến đóng góp quý báu, sẽ là bài học cho tôi trên con đường nghiên cứu khoa học

Tôi xin chân thành cảm ơn Ths BS Phạm Văn Đếm - Bộ môn Y Dược học

cơ sở, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia HN; TS BS Hoàng Anh Tuấn - trưởng

Khoa Xét nghiệm tổng hợp, ThS.BS Cao Vũ Thư, anh Bùi Quang Long, cô Nguyễn Ngọc Diệp cùng các anh chị đồng nghiệp Khoa Xét nghiệm tổng hợp BV

Mắt TW đã thật sự động viên và giúp đỡ rất nhiều để tôi hoàn thành luận văn

Xin bày tỏ lòng biết ơn tới bố mẹ, người thân, vợ và 2 con nhỏ của tôi cùng các bạn bè đồng nghiệp đã luôn động viên, khích lệ tinh thần và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc tới những bệnh nhi và gia đình của họ

đã tham gia vào nghiên cứu này Sự đóng góp của họ đã giúp tôi hoàn thành luận văn này

Hà nội, ngày tháng năm 2017

Học viên

Đỗ Thế Hoành

LỜI CAM ĐOAN

Tên tôi là Đỗ Thế Hoành, cao học khóa 24, trường Đại học Khoa học tự nhiên

Hà Nội, chuyên ngành Sinh học thực nghiệm, xin cam đoan:

1 Đây là Luận văn do bản thân tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn của TS Vũ Thị Thơm và TS Nguyễn Văn Sáng

2 Nghiên cứu này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào đã được công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu, thông tin và kết quả trong luận văn là hoàn toàn chính xác, trung thực, đã được xác nhận của cơ sở nơi nghiên cứu

Hà nội, ngày tháng năm 2017

Học viên

Đỗ Thế Hoành

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT Ở TRẺ EM 3

1.1.1 Khái niệm 3

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu 3

1.1.3 Sinh lý bệnh HCTHTPTE 6

1.2 MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA TRONG HCTH 10

1.2.1 Protein toàn phần trong máu và protein nước tiểu 24h 10

1.2.2 Albumin máu và nước tiểu 11

1.2.3 Ure máu và nước tiểu 11

1.2.4 Creatinin máu và nước tiểu 12

1.2.5 Một số nghiên cứu về các chỉ số sinh hóa trong bệnh HCTH 13

1.3 ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN NPHS2 13

1.3.1 Khái niệm về đa hình đơn nucleotit 13

1.3.2 Protein podocin và gen mã hóa 15

1.3.3 Đa hình đơn rs12401708 C>T và rs3738423 C>T của gen NPHS2 16

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID 18

GEN NPHS2 18

1.4.1 Phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert 18

1.4.2 Phương pháp xác định trình tự Sanger-Coulson 19

1.4.3 Giải trình tự bằng máy tự động 19

1.5 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐA HÌNH DI TRUYỂN GEN NPHS2 VỚI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA 20

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 21

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.2 Các chỉ số nghiên cứu 22

2.2.3 Phương tiện nghiên cứu 22

2.2.4 Các bước tiến hành nghiên cứu 25

2.2.5 Xử lý số liệu 29

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 30

3.1 ĐẶC ĐIỂM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 30

3.2 MỘT SỐ KẾT QUẢ SINH HÓA MÁU VÀ NƯỚC TIỂU 33

3.3 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT DNA 36

3.3.1 Kết quả đo độ hấp thụ quang (OD) 37

3.3.2 Kết quả điện di kiểm tra DNA tổng số 38

3.4 KẾT QUẢ KHUẾCH ĐẠI EXON 2 VÀ EXON 4 CỦA GEN NPHS2 38

3.4.1 Kết quả khuếch đại exon 2 38

3.4.2 Kết quả khuếch đại exon 4 39

3.5 KẾT QUẢ GIẢI TRÌNH TỰ GEN 40

3.5.1 Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen hai đa hình đơn rs3738423 40

3.5.2 Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen đa hình rs12401708 42

3.6 MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐA HÌNH ĐƠN RS3738423 VÀ RS12401708 VỚI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA Ở BỆNH NHÂN NHI MẮC HCTHTP KHÁNG CORTICOSTEROID 43

3.6.1 Mối tương quan giữa đa hình đơn RS3738423 và một số chỉ tiêu sinh hóa 44 3.6.2 Mối tương quan giữa đa hình đơn RS12401708 và một số chỉ tiêu sinh hóa 48

KẾT LUẬN 52

KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC

D ANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ATP

ADH

Adenosine triphotphat Antidiuretic hormone

HCTHTP Hội chứng thận hư tiên phát

HCTHTPTE Hội chứng thận hư tiên phát trẻ em

NCC Nhóm nhạy cảm với corticosteroid

NKC Nhóm kháng corticosteroid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Mồi exon 2 và exon 4 của gen NPHS2 28

Bảng 2.2 Nồng độ các thành phần phản ứng PCR 28

Bảng 3.1 Phân bố tuổi và giới tính của 2 nhóm đối tượng nghiên cứu 31

Bảng 3.2 Tuổi khởi phát và số lần tái phát trong 6 tháng của bệnh 31

Bảng 3.3 Mức độ tái phát của bệnh 32

Bảng 3.4 Kết quả phân tích protein, albumin, creatinin và ure máu, protein niệu và tỷ lệ protein/creatinin niệu 34

Bảng 3.5 Một số kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch sản phẩm tách DNA 37

Bảng 3.6 Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen của rs3738423 41

Bảng 3.7 Tỷ lệ kiểu gen, tần số alen của rs12401708 42

Bảng 3.8 Nồng độ protein, albumin, creatinin và ure máu ở các kiểu gen của RS3738423 44

Bảng 3.9 Nồng độ protein niệu và tỷ lệ protein/creatinin niệu ở các kiểu gen của RS3738423 46

Bảng 3.10 Nồng độ protein, albumin, creatinin và ure máu ở các kiểu gen của rs12401708 48

Bảng 3.11 Nồng độ protein và tỷ lệ protein/creatinin niệu ở các kiểu gen của rs12401708 50

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1 Phân bố số lượng bệnh nhân HCTHTPTE 30

Biểu đồ 3.2 So sánh nồng đồng protein máu, albumin máu, creatinin máu, ure máu, protein niệu và tỷ lệ protein/creatinin niệu của nhóm NCC và NKC 35

Biểu đồ 3.3 So sánh nồng độ protein niệu, tỷ lệ protein/creatinin niệu của 3 kiểu gen rs3738423 trong nhóm NCC 47

Biểu đồ 3.4 So sánh nồng độ protein niệu, tỷ lệ protein/creatinin niệu của 3 kiểu gen rs3738423 trong nhóm NKC 47

Biểu đồ 3.5 So sánh nồng độ protein niệu, tỷ lệ protein/creatinin niệu của 2 kiểu gen rs12401708 trong nhóm NCC 51

D ANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Mô tả đa hình đơn nuclotide (SNP) 14

Hình 1.2 Cấu tạo màng cầu thận 15

Hình 1.3 Vị trí của gen NPHS2 trên NST số 1 ở người 16

Hình 1.4 Cấu trúc các đoạn exon và intron của gen NPHS2 16

Hình 3.1 Hình ảnh điện di trên gel agarose 0,7% sản phẩm tách DNA tổng số từ mẫu máu toàn phần 38

Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phầm PCR của exon 2 38

Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của exon 4 39

Hình 3.4 Kết quả giải trình tự cho rs3738423 40

Hình 3.5 Kết quả giải trình tự cho rs12401708 42

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1 Sinh lý bệnh HCTH 7

Sơ đồ 2 Sơ đồ nghiên cứu 25

MỞ ĐẦU

Hội chứng thận hư tiên phát trẻ em (HCTHTPTE) là một hội chứng lâm sàng

và sinh hóa xuất hiện khi có tồn thương cầu thận do nhiều nguyên nhân khác nhau, thường không rõ ràng được đặc trưng bởi: protein niệu tăng cao, protein máu giảm,

albumin máu giảm, lipit và cholesterol máu tăng Bệnh thường gặp nhất ở trẻ em, 90% trường hợp xảy ra ở độ tuổi dưới 16 với tỷ lệ trẻ nam mắc nhiều hơn trẻ nữ Tỷ

lệ mắc bệnh thay đổi theo địa dư, tuổi, giới tính và chủng tộc Khoảng 20% bệnh nhân không đáp ứng sau điều trị với corticoid (HCTH kháng steroid) và các thuốc

ức chế miễn dịch khác, trong đó 50% bệnh nhân sẽ tiến triển thành suy thận hoặc các bệnh thận giai đoạn cuối có thể gây tử vong và ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe, cuộc sống của trẻ

Ngoài các dấu hiệu lâm sàng và dịch tễ học như: phù nhanh toàn thân, mềm,

ấn lõm và không đau, tiểu ra máu…thì một số chỉ tiêu sinh hóa cận lâm sàng dựa theo đặc điểm sinh lý bệnh có nghĩa rất quan trọng trong công tác chẩn đoán, theo dõi và điều trị cho bệnh nhân HCTH Thận hư là một bệnh mạn tính, diễn biến với các đợt bộc phát nên bệnh nhân cần phải theo dõi và điều trị lâu dài (ít nhất 5 năm sau khi bệnh thuyên giảm)

Nhờ tiến bộ của ngành sinh học phân tử người ta có thể nghiên cứu sâu hơn

về cơ chế bệnh học của HCTHTPTE để từ đó đề ra các biện pháp điều trị hiệu quả hơn đối với từng bệnh nhân Hiện nay, đã xác định được gen mã hóa cho các protein

có vai trò chính đảm bảo chức năng lọc của cầu thận, trong đó có protein podocin

được mã hóa bởi gen NPHS2 Gen NPHS2 gồm 8 exon, nằm trên vai dài của nhiễm

2016 Tại Việt Nam, hiện chưa có nghiên cứu nào xác định mối tương quan giữa hai

đa hình trên với một số chỉ tiêu sinh hóa trong HCTHTP Vì vậy, để bước đầu có thể giúp cho lâm sàng trong khám bệnh, theo dõi và điều trị bệnh nhân hiệu quả hơn, đặc biệt là những bệnh nhân kháng thuốc chúng tôi tiến hành nghiên cứu:

"Xác định mối liên quan giữa các đa hình đơn nucleotid rs3738423 C>T và rs12401708 C>T của gen NPHS2 với một số chỉ tiêu sinh hóa ở bệnh nhân nhi

mắc hội chứng thận hư tiên phát kháng corticoid" với hai mục tiêu sau:

1 Xác định tần số alen và tỷ lệ đa hình đơn rs3738423 C>T và rs12401708 C>T ở bệnh nhân nhi mắc HCTHTP

2 Đánh giá mối tương quan giữa hai đa hình trên với một số chỉ tiêu sinh hóa ở bệnh nhân nhi mắc HCTHTP kháng corticoid

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HỘI CHỨNG THẬN HƯ TIÊN PHÁT Ở TRẺ EM

1.1.1 Khái niệm

Hội chứng thận hư tiên phát (HCTHTP) là bệnh cầu thận phổ biến nhất trong các bệnh về thận ở trẻ em Là một hội chứng lâm sàng và sinh hóa, xuất hiện khi có tổn thương cầu thận do nhiều tình trạng bệnh lý khác nhau, các triệu chứng chính là: phù, protein niệu tăng cao, protein máu giảm, albumin máu giảm, lipid và cholesterol máu tăng Thuật ngữ "thận hư" được dùng lần đầu vào năm 1905 bởi Friedrich Von Muller để chỉ những bệnh thận mà các tổn thương giải phẫu bệnh chỉ

có tính chất thoái hóa, không có đặc tính viêm [25] Theo nghiên cứu của P.Niaudet, khoảng 20% bệnh nhân HCTHTP bị kháng với thuốc steroid và các thuốc ức chế miễn dịch khác, trong đó 50% bệnh nhân sẽ tiến triển thành suy thận hoặc các bệnh thận giai đoạn cuối gây ảnh hưởng rất lớn đến sức khỏe và cuộc sống của trẻ cũng như gia đình bệnh nhi [41]

Tỷ lệ mắc bệnh thay đổi theo tuổi, giới tính, chủng tộc, địa dư và cơ địa Khoảng 90% trường hợp xảy ra ở tuổi dưới 16, tần suất gặp 2/30.000 HCTHTP xảy

ra ở trẻ trai nhiều hơn trẻ gái (tỷ lệ nam/nữ là 2/1) Ở Mỹ, Châu Âu, Châu Úc tỷ lệ mắc mới hàng năm là 1-3/100.000 trẻ dưới 16 tuổi Ở Anh tỷ lệ mắc mới ở trẻ em gốc Châu Á cao gấp 6 lần trẻ em Châu Âu [16] Tại Nhật Bản, khoảng 5/100.000 trẻ mỗi năm [51] Ở Việt Nam hiện chưa có thống kê tỷ lệ mắc mới hàng năm Tại một

số khoa Nhi hoặc bệnh viện Nhi số trẻ em bị HCTH chiếm khoảng 0,5-1% tổng số bệnh nhân nhi nội trú và chiếm khoảng 10-30% tổng số trẻ bị bệnh thận [17]

1.1.2 Lịch sử nghiên cứu

1.1.2 1 Các nghiên cứu trên thế giới

Năm 1827, Bright là người đầu tiên mô tả về lâm sàng và giải phẫu của bệnh nhân thận, đến đầu thế kỷ XX những bệnh nhân có phù và protein niệu vẫn được gọi chung là bệnh Bright Cùng thời điểm đó John Bostock, Robert Christion và một số nhà khoa học khác đã chứng minh được có nhiều trường hợp có biểu hiện

lâm sàng giống bệnh Bright (phù, protein niệu) nhưng khi mổ tử thi lại không thấy hình ảnh của thận viêm [28, 43] Vì vậy, đến năm 1905, Friedrich Von Miiller đã đưa ra thuật ngữ “thận hư” để chỉ các triệu chứng bệnh lý ở thận có tính chất thoái hóa mà không phải do viêm [25]

Năm 1913, Munk dùng thuật ngữ "thận hư nhiễm mỡ" để chỉ một loại bệnh thận mà về lâm sàng có phù, protein niệu, giảm protein máu và tăng lipid máu, đồng thời giải phẫu bệnh có hiện tượng nhiễm mỡ trong các tế bào ống thận trong khi cầu thận gần như bình thường [25] Cùng thời điểm đó, Volhard F và Fahr T (năm 1914) cho rằng "thận hư" chỉ là một bệnh thoái hóa của ống thận, từ đó thuật ngữ

"thận hư nhiễm mỡ" được dùng để chỉ bệnh thận do nhiễm mỡ ở ống thận [50] Govaerts (năm 1928) và Bell (năm 1929) cho rằng tổn thương chủ yếu của bệnh thận hư là ở cầu thận [5, 20] Năm 1937, Epstein đề xướng giả thuyết "thận hư nhiễm mỡ" không phải là bệnh ở thận mà là tình trạng rối loạn chuyển hóa lipid Quan điểm này được ủng hộ rộng rãi trong một thời gian dài và còn được gọi là bệnh "Epstein" [18] Cho đến năm 1950, nhờ tiến bộ của khoa học kỹ thuật như sinh thiết thận, kính hiển vi điện tử, miễn dịch huỳnh quang người ta thấy rằng những tổn thương trong bệnh "thận hư nhiễm mỡ" và bệnh "Epstein" không phải do nhiễm

mỡ ở ống thận gây nên mà tổn thương mô bệnh học chủ yếu ở cầu thận

Ngày nay, các nghiên cứu cho thấy các triệu chứng của thận hư có thể gặp trong nhiều bệnh cầu thận tiên phát và thứ phát, các tổn thương thận cũng đa dạng

Vì vậy thận hư không phải là một bệnh đơn thuần như những quan niệm trước kia nữa Do đó các nhà nghiên cứu đều thống nhất sử dụng thuật ngữ "hội chứng thận hư" [22, 53]

1.1.2 2 Các nghiên cứu ở Việt Nam

Từ năm 1974 đến năm 1978 tại Viện Nhi, số trẻ bị HCTH chiếm 2,48% tổng

số bệnh nhân nội trú và gần 50% bệnh nhân khoa thận [9, 16] Năm 1981, theo nghiên cứu trên 59 bệnh nhân HCTHTP của tác giả Tạ Thị Hòa cho thấy tỷ lệ khỏi

bệnh hoàn toàn sau 7 năm là 61,2%, thuyên giảm một phần là 10,2%, tái phát là 26,5% và tử vong là 2% [5] Năm 1996, nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Diệu Thúy về "Đặc điểm lâm sàng và biến đổi sinh học của suy thận cấp trong HCTHTP

ở trẻ em" cho thấy tần suất suy thận cấp là 84,6%, tỷ lệ mạn tính và tử vong là 15,4% [13] Năm 2012, theo nghiên cứu của Đoàn Thị Thắm về "Nhận xét kết quả điều trị hội chứng thận hư tiên phát ở trẻ em" tại khoa Thận-Tiết niệu bệnh viện Nhi

TW trong 3 năm từ 2008-2011 đã gặp chủ yếu là bệnh nhân HCTH đơn thuần 83,04% và HCTH kết hợp có biểu hiện lâm sàng và cận lâm sàng nặng hơn bị HCTH đơn thuần [14]

1.1.2.3 Hội chứng thận hư kháng corticoid

HCTHTP kháng corticoid đã được chú ý từ những năm 1950 với biểu hiện lâm sàng sau khi điều trị liều tấn công 4-8 tuần bằng corticoid, thậm chí dùng cả liều rất cao (1000 mg/1,73 m2 cơ thể/ngày) mà bệnh không thuyên giảm [16] Cho đến nay đã có nhiều khái niệm về HCTPTP kháng corticoid, song gần đây đều thống nhất với định nghĩa "HCTHTP kháng corticoid là HCTHTP sau khi điều trị hết 4 tuần liều tấn công bằng corticoid và 3 liều Methylprednisolon bolus 1000 mg/1,73m2 cơ thể/48h

mà protein niệu vẫn ≥ 50 mg/kg/24h" [41]

Năm 1970, theo báo cáo của trung tâm nghiên cứu bệnh thận trẻ em quốc tế tỷ

lệ bệnh nhân nhạy cảm với corticoid là 93-98% ở những bệnh nhân mắc HCTH thể sang thương tối thiểu; thể xơ hóa cầu thận cục bộ từng phần chỉ 17-30% bệnh nhân nhạy cảm với corticoid, tỷ lệ kháng thuốc là 20% [19]

Năm 1998, theo nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Sáng trên 52 bệnh nhi mắc HCTHTP cho thấy tỷ lệ kháng thuốc là 12,4% [12] Nghiên cứu của tác giả Lê Nam Trà và cộng sự trên 42 bệnh nhi mắc HCTHTP kháng corticoid được điều trị bằng methylprednisolon liều cao truyền tĩnh mạch cho kết quả tỷ lệ thuyên giảm hoàn toàn là 33,3%, thuyên giảm một phần là 30,9% và không thuyên giảm là 35,7% [15]

1.1.3 Sinh lý bệnh HCTHTPTE

1.1.3.1 Nguyên nhân

Bình thường protein trong máu rất khó lọt qua được màng lọc của cầu thận vì

có lớp điện tích âm ngăn cản [7] HCTHTP ở trẻ em xảy ra là do tăng tính thấm màng mao mạch cầu thận đối với protein Mao mạch cầu thận bị tổn thương do có phức hợp kháng nguyên - kháng thể lưu hành (bệnh tự miễn) gây hủy hoại lớp điện tích âm của màng đáy cầu thận, đồng thời có sự hiện diện một số chất lymphokines

ở đây đã làm thay đổi lỗ lọc của màng đáy cầu thận khiến cho các protein mang điện tích âm lọt ra ngoài thành mạch, nhất là những protein có trọng lượng phân tử nhỏ như albumin [7, 16, 32] Gần đây người ta nhận thấy sự thay đổi của các phân

tử ceratin bộc lộ trên chân giả của tế bào biểu mô tạng, đặc biệt là nephrin, podocin

và α-actin cũng có vai trò gây xuất hiện protein niệu Một số nghiên cứu còn cho thấy có vai trò của yếu tố di truyền trong cơ chế sinh bệnh học HCTH nguyên phát,

có khoảng 20-30% bệnh nhân nhi mắc HCTH kháng corticoid hoặc mắc HCTH bẩm sinh có nguyên nhân do gen di truyền [31]

1.1.3 2 Rối loạn chuyển hóa trong HCTH

Ở bệnh nhân HCTH, mất protein niệu có tính chọn lọc, chỉ để thoát ra ngoài những protein có trọng lượng phân tử nhỏ như albumin 69.000 kDa Albumin bị mất nhiều qua nước tiểu gây ra giảm albumin máu do gan không kịp bù đắp Khi albumin máu giảm xuống dưới 25 g/l thì phù sẽ xuất hiện do giảm áp lực keo huyết tương khiến muối và nước từ lòng mao mạch thoát vào các tổ chức kẽ Phù làm giảm thể tích tuần hoàn hiệu dụng, giảm lưu lượng máu tưới cho thận gây cường aldosterone thứ phát (làm tăng tái hấp thu Na+ ở ống lượn xa) và tăng tiết ADH

gây ra hiện tượng giữ nước, đái ít, phù tăng, có thể có rối loạn khác về nước và điện giải [7, 16]

Giảm áp lực keo máu và rối loạn điều chỉnh tổng hợp protein đã kích thích gan tăng tổng hợp đạm nhằm bù trừ protein máu giảm, trong đó có lipoprotein sẽ vận chuyển nhiều triglycerid, cholesterol ra máu ngoại vi làm tăng lipid máu, nếu nhiều

sẽ gây tổn thương thành mạch và tắc mạch, đồng thời làm xuất hiện các thể mỡ trong nước tiểu

Sơ đồ 1 Sinh lý bệnh HCTH

Các protein khác mất qua nước tiểu bao gồm cả các enzym, hormon, các yếu

tố đông máu dẫn tới nhiều rối loạn chuyển hóa Các protein này bao gồm protein mang thyroxin, mang vitamin D3, transferin và mang các yếu tố vi lượng Tình trạng tăng đông là do antithrombin III bị mất qua nước tiểu; giảm nồng độ protein

C, protein S huyết thanh; tăng fibrinogen máu và tăng ngưng tập tiểu cầu

Một số bệnh nhân bị mất IgG nặng có thể gây giảm khả năng miễn dịch và dễ

bị nhiễm khuẩn Các phản ứng viêm của bệnh tự miễn hoặc có kèm theo bội nhiễm làm tăng tốc độ máu lắng, ngoài ra có thể làm tăng bạch cầu đa nhân [1, 7, 16]

1.1.3 3 Tiêu chuẩn chẩn đoán

Dựa vào dịch tễ học, các yếu tố thuận lợi và dấu hiệu lâm sàng xuất hiện sớm: phù nhanh toàn thân (mềm, trắng, ấn lõm, không đau), tiểu ít, rối loạn tiêu hóa, khó thở, dễ nhiễm khuẩn [7]

Chẩn đoán HCTHTP theo tiêu chuẩn của KDIGO (Kidney Disease Improving

Global Outcomes) năm 2012 gồm: Protein niệu ≥ 50 mg/kg/24h hoặc Protein niệu/Creatinin niệu ≥ 200 mg/mmol, Albumin máu ≤ 25 g/l, Protein máu ≤ 56 g/l [36]

Chẩn đoán HCTHTP kháng steroid theo một trong ba tiêu chuẩn sau [10]:

không thuyên giảm sau 6 tuần điều trị bằng prednisolon liều tấn công 2 mg/kg/ngày mỗi ngày liên tục; không thuyên giảm sau 4 tuần điều trị bằng prednisolon liều tấn công 2 mg/kg/ngày mỗi ngày liên tục và 4 tuần điều trị bằng prednisolon liều 2 mg/kg/ngày mỗi ngày cách ngày; không thuyên giảm sau 4 tuần điều trị bằng prednisolon liều tấn công 2 mg/kg/ngày mỗi ngày liên tục và 3 liều truyền Methylprednisolon bolus 1000 mg/1,73 m2 cơ thể/48h

Ở trẻ em sinh thiết thận không cần thiết vì đa số (80-90%) có tổn thương tối thiểu và đáp ứng tốt với corticoid, nhất là đối với trẻ em dưới 8 tuổi Chỉ sinh thiết thận trong một số ít trường hợp như HCTH bẩm sinh, HCTH phối hợp, HCTH kháng corticoid [7]

1.1.3 4 Theo dõi và điều trị

 Điều trị triệu trứng

Điều trị phù bằng sử dụng các thuốc lợi tiểu để duy trì lượng nước tiểu hàng ngày 1,5-2 lít Điều trị tăng huyết áp nếu bệnh nhân bị cao huyết áp cao, phải dùng thuốc hạ huyết áp để đưa huyết áp về mức bình thường Điều trị rối loạn mỡ máu,

phòng chống nhiễm khuẩn, dự phòng các biến chứng do sử dụng corticosteroid và tắc nghẽn tĩnh mạch [7, 16]

 Điều trị đặc hiệu

Corticoid là thuốc ưu tiên hàng đầu trên những bệnh nhân HCTHTPTE có sang thương tối thiểu Sang thương tối thiểu chiếm 79-90% HCTHTPTE, cần loại

trừ các nguyên nhân thứ phát gây sang thương tối thiểu

Đối với thể nhạy cảm với corticoid: Prednisolone tấn công với liều 60 mg/m2/ngày hoặc 2 mg/kg/ngày nhưng không vượt quá 60 mg/ngày, uống một lần vào buổi sáng sau khi ăn hoặc chia 2 lần, tùy từng bệnh nhân Thời gian điều trị tùy theo tác giả, có thể là 4, 6 hoặc 8 tuần nhưng ít nhất là 4 tuần liền Thời gian điều trị kéo dài thì tỷ lệ tái phát ít nhưng tác dụng phụ sẽ nhiều Sau đó sẽ tùy vào đáp ứng của từng bệnh nhân mà chọn thuốc và phác đồ thích hợp Nếu sau đợt tấn công bệnh nhân thuyên giảm hoàn toàn (hết phù, protein niệu < 4 mg/m2/giờ trong 3 ngày liên tiếp) thì chuyển sang đợt điều trị duy trì với liều prednisolon 60 mg/m2/ngày, uống cách nhật, tối đa 60 mg/ngày Liều củng cố (2 - 5 tháng): 40 mg/m2/ngày cách nhật hoặc 1,5 mg/kg/ngày cách nhật x 4 tuần, giảm liều 5 mg/mỗi tuần cho đến liều tối thiểu 0,3 mg/kg/ngày; 4 ngày một tuần

Đối với thể kháng với corticoid: việc điều trị tuỳ thuộc vào tổn thương giải phẫu bệnh và xét nghiệm gen học Cho đến nay chưa có một phác đồ chung cho thể này Ngoài việc kéo dài thời gian điều trị prednisolon liều tấn công khoảng 8-12 tuần, một số trường hợp có thể trở nên đáp ứng hoặc có thể dùng methylprednison liều cao tiêm tĩnh mạch [7, 35]

Tái phát không thường xuyên (tái phát thưa): bệnh nhân đáp ứng hoàn toàn,

hết protein niệu khi dùng prednisolon nhưng tái phát lại dưới 2 lần trong 6 tháng

Tái phát thường xuyên (tái phát dày): bệnh nhân đáp ứng hoàn toàn khi dùng

prednisolon nhưng tái phát lại trên 2 lần trong 6 tháng hoặc 6 lần trong 18 tháng

Lệ thuộc steroid: bệnh nhân đáp ứng hoàn toàn khi dùng steroid, nhưng tái

phát khi giảm liều steroid hoặc ngưng steroid trong vòng 2 tuần

Nhóm đề kháng với corticoid (NKC): không hết protein niệu sau 8 tuần điều trị

bằng steroid [7]

1.2 MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA TRONG HCTH

1.2.1 Protein toàn phần trong máu và protein nước tiểu 24h

 Protein toàn phần trong máu

Protein là nhóm chất hữu cơ có hàm lượng nhiều nhất và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với cơ thể Trong cơ thể, protein được tổng hợp từ 20 loại acid amin, trong đó có nhiều acid amin cơ thể không tự tổng hợp được mà phải được lấy từ thức ăn Sự sai lệch trong trình tự sắp xếp của các acid amin sẽ dẫn đến biến đổi cấu trúc, hoạt tính của protein và có thể gây bệnh tật cho cơ thể [6]

Protein huyết tương là những phân tử lớn, có trọng lượng phân tử cao Giá trị bình thường protein huyết tương là 68 - 80 g/l, bao gồm các thành phần cơ bản sau: albumin, globulin và fibrinogen Các chức năng chính của protein huyết tương là tạo áp suất keo của máu, vận chuyển các chất, bảo vệ cơ thể, cầm máu và cung cấp protein cho toàn bộ cơ thể [2]

Trên lâm sàng hay gặp giảm protein toàn phần nhiều hơn trong các bệnh thận khi màng lọc cầu thận bị tổn thương, đặc biệt trong HCTH hoặc thận hư nhiễm mỡ [2, 16]

 Protein nước tiểu

Nước tiểu bình thường có một lượng rất ít protein, chỉ khoảng 50 - 100 mg/24h, với nồng độ này các xét nghiệm thông thường không phát hiện được nên trong nước tiểu của người bình thường được coi là không có protein [48]

Protein xuất hiện trong nước tiểu gặp chủ yếu trong các bệnh lý tổn thương cầu thận (viêm cầu thận cấp, viêm cầu thận mãn, hội chứng thận hư ) và một số bệnh lý nội khoa khác gây tổn thương thận (đái tháo đường, bệnh hệ thống, tăng huyết áp ) [2, 16, 48]

1.2.2 Albumin máu và nước tiểu

Albumin là thành phần protein quan trọng nhất, chiếm tới 58 - 74% lượng protein toàn phần, trọng lượng phân tử 66.000 – 69.000 kDa Albumin đóng vai trò thiết yếu trong duy trì áp lực keo, tham gia vận chuyển một số chất sinh ra trong quá trình chuyển hóa trong cơ thể và cung cấp acid amin cho quá trình tổng hợp protein

ở ngoại vi [2]

Albumin có thời gian bán hủy từ 16 đến 26 ngày, gan là cơ quan duy nhất tạo

ra albumin, trung bình mỗi ngày gan tạo ra khoảng 10,5 g Nồng độ albumin máu bình thường khoảng 35 - 50 g/l Albumin máu giảm trong các trường hợp: giảm cung cấp albumin cho cơ thể (suy dinh dưỡng, suy kiệt, rối loạn tiêu hóa ), giảm sản xuất albumin (xơ gan, viêm gan mạn ), bệnh thận gây mất albumin qua nước tiểu (hội chứng thận hư, viêm cầu thận cấp hoặc mạn), đái tháo đường giai đoạn muộn, ung thư [2, 16]

Bình thường hầu như không có albumin trong nước tiểu Khi có tổn thương thận thì albumin là một trong những protein đầu tiên được phát hiện trong nước tiểu Những người có một lượng nhỏ albumin được phát hiện trong nước tiểu có nguy cơ phát triển suy thận và bệnh tim mạch [2]

1.2.3 Ure máu và nước tiểu

Ure có nguồn gốc chủ yếu từ quá trình thoái hóa protein trong cơ thể và là sản phẩm quan trọng nhất của chuyển hóa nitơ Quá trình tổng hợp ure diễn ra ở gan Nồng độ ure máu phụ thuộc cùng lúc vào chức năng thận, khẩu phần ăn, quá trình

di hóa protein nội sinh và tình trạng thăng bằng điện giải trong cơ thể Ure được đào thải qua thận và một phần qua đường tiêu hóa Bản thân ure là chất không độc nhưng sự ứ đọng ure trong huyết tương thường là dấu hiệu của nhiều bệnh lý, đặc biệt là bệnh thận [2]

• Nồng độ ure máu bình thường là 3,3 - 8,3 mmol/l; ở trẻ em là 1,8 - 5,4 mmol/l

• Nồng độ ure nước tiểu: 250 - 500 mmol/24h

Nồng độ ure máu tăng cao trong các trường hợp: suy thận, thiểu niệu, vô niệu, chế độ ăn nhiều protein, xuất huyết tiêu hóa, nhiễm trùng nặng, sốt, bỏng, suy dinh dưỡng, u tân sinh, ngộ độc thủy ngân Giảm trong các trường hợp: suy gan, xơ gan, viêm gan nặng, chế độ ăn nghèo protein, loãng máu, hội chứng thận hư, có thai, giảm hấp thu [2, 48]

1.2.4 Creatinin máu và nước tiểu

Creatinin trong cơ thể có nguồn gốc hỗn hợp: ngoại sinh (do thức ăn cung cấp), nội sinh (được gan, thận và tụy tổng hợp) Creatinin được tổng hợp chủ yếu tại gan rồi được máu vận chuyển đến cơ Tại tế bào cơ creatinin gắn phosphat từ ATP

để tạo thành creatin-phosphat, một dạng dữ trữ năng lượng cho quá trình co cơ Khi vận cơ creatin-phosphat bị thủy phân giải phóng phosphat và mất nước, đóng vòng tạo thành creatinin, đó là sản phẩm cặn bã không được cơ sử dụng và đào thải ra ngoài duy nhất theo đường nước tiểu, phản ánh chính xác chức năng lọc của thận Creatinin được lọc ở cầu thận trong mỗi giây là 2 ± 0,3 ml/s ở người trưởng thành bình thường

• Creatinin huyết thanh ở người trưởng thành bình thường ở nam và nữ có khác nhau do lượng cơ ở nữ thấp hơn ở nam: ở nam: 62 - 115 µmol/l, ở nữ:

44 - 88 µmol/l, trẻ em: 27 - 62 µmol/l

• Creatinin nước tiểu không bị ảnh hưởng bởi lượng thức ăn hoặc thể tích nước tiểu được bài tiết: ở nam là 177 - 230 µmol/kg/24h, ở nữ là 124 - 195

µmol/kg/24h

Creatinin tăng trong các các bệnh lý về thận: suy thận do nguồn gốc trước thận (suy tim, mất nước, xuất huyết ), suy thận do nguồn gốc tại thận (đái tháo đường, tăng huyết áp), suy thận do nguồn gốc sau thận (sỏi thận, ung thư tiền liệt tuyến ) Giảm trong các trường hợp: loãng máu, có thai, tăng tiết ADH không thích hợp, suy dinh dưỡng nặng, đái tháo đường, nhiễm trùng, suy tuyến giáp [2, 48]

1.2.5 Một số nghiên cứu về các chỉ số sinh hóa trong bệnh HCTH

Theo nghiên cứu của Om P Mishra và cộng sự (2014) trên 110 bệnh nhân nhi mắc HCTH trong đó có 90 bệnh nhân NCC và 20 bệnh nhân NKC cho kết quả nồng

độ protein máu, albumin máu, ure máu và creatinin máu ở 2 nhóm bệnh nhân là tương đương nhau Trong đó, nồng độ protein và albumin máu thấp hơn khoảng giá trị bình thường; nồng độ ure và creatinin máu đều nằm trong khoảng giá trị tham chiếu [39]

Năm 2016, nghiên cứu của Mohammad H và cộng sự được thực hiên trên

138 bệnh nhân nhi mắc HCTH tại Iran cho kết quả nồng độ protein máu là 46,1±9 g/l, albumin máu là 23,7 ± 5,5 g/l đều thấp hơn khoảng giá trị bình thường [30] Theo nghiên cứu của tác giả Vũ Vân Nga (2016) trên 120 bệnh nhi mắc HCTHTP, chia làm 2 nhóm gồm 58 bệnh nhân NCC và 62 bệnh nhân cho thấy nồng độ protein máu, albumin máu, protein niệu và tỷ lệ protein/creatinin niệu trước khi điều trị đều được cải thiện rõ rệt sau khi điều trị 6 tháng [10]

Năm 2017, nghiên cứu của Shatha Hussain Ali và cộng sự trên 54 bệnh nhi mắc HCTH tại Iraq, được chia làm 2 nhóm 27 bệnh nhân nhạy cảm steroid và 27 bệnh nhân nhạy cảm steroid cho kết quả trung bình nồng độ albumin máu ở 2 nhóm tương tự nhau Nồng độ trung bình ure máu và creatinin máu ở nhóm NCC cao hơn

có ý nghĩa so với nhóm NKC (p < 0,05), tuy nhiên vẫn nằm trong khoảng giá trị bình thường [49]

1.3 ĐA HÌNH DI TRUYỀN GEN NPHS2

1.3.1 Khái niệm về đa hình đơn nucleotit

Một trong những thành tựu của dự án giải trình tự hệ gen người cho thấy trình

tự DNA của hơn 6 tỷ người trên Trái Đất hiện nay có sự tương đồng 99,9% và chỉ

có 0,01% khác biệt Theo Kruglyak và Nikerson, hơn 90% sự khác biệt là do các đa hình đơn nucleotide (SNP: Single Nucleotide Polymorphism) Hầu hết sự biến động

về một gen giữa các cá thể là do sự khác nhau của một nucleotide trong gen đó Đây chính là tính đa hình thái đơn nuclotide [6, 34, 52] Ví dụ: một SNP có thể thay đổi

trình tự DNA: từ GGTCAT thành GGTTAT

Nguyên nhân của sự biến đổi là sự sai lệch trong quá trình sao chép DNA hoặc

do các tác nhân môi trường như hóa chất, phóng xạ, tia UV hay virus Hậu quả của đột biến là tạo ra một quần thể với những cá thể có sự khác biệt di truyền Đa hình thái được gọi là đột biến khi có tỷ lệ < 1% trong quần thể [54]

Hình 1.1 Mô tả đa hình đơn nuclotide (SNP)

(Nguồn: http://www

rna-seqblog.com/opossum-pre-processing-sequencing-data-for-reliable-snp-variant-detection/)

Đột biến tại một nucleotide có thể dẫn đến những trường hợp sau: SNP không thuộc các trình tự mã hóa nhưng vẫn có thể chi phối đến mức độ biểu hiện gen; SNP tại các đoạn trình tự mã hóa có thể dẫn đến thay đổi trình tự mã hóa acid amin hoặc

độ dài chuỗi polypeptide nếu bộ ba nucleotide kết thúc bị biến đổi; SNP thuộc các vùng mã hóa hay không mã hóa các gen không gây ảnh hưởng đến cấu trúc hay biểu hiện hoạt động gen [34]

Hiện nay đã có hơn bốn triệu SNP đã được xác định trong hệ gen người, do có tần xuất hiện cao nên người ta sử dụng SNP là dấu mốc để lập bản đồ gen SNP được tìm thấy trên khắp bộ gen giúp cho việc dễ dàng nghiên cứu các ảnh hưởng liên quan đến chức năng, sinh lý của các gen Do chỉ thay đổi một nucleotide nên các kỹ thuật sinh học phân tử có thể phân tích nhanh chóng và hiệu quả kiểu gen hàng trăm hàng ngàn cá nhân cho hàng trăm hàng ngàn SNP Các nhà di truyền học phân tử hy vọng rằng trong tương lai có thể hoàn thiện bản đồ các SNP có liên quan đến bệnh tật, tiến đến việc

giải mã chức năng của các gen trong mỗi cá thể giúp tiên lượng các nguy cơ bệnh tật, đưa ra các giải pháp thích hợp trong vấn đề phòng bệnh với mỗi cá thể [47]

1.3.2 Protein podocin và gen mã hóa

Quá trình lọc huyết tương để tạo thành nước tiểu xảy ra chủ yếu ở màng cầu thận Cầu thận được cấu tạo bởi một mạng lưới mao mạch xếp song song và được bao quanh bởi bao Bowman Dịch được lọc từ huyết tương vào trong bao Bowman gọi là dịch lọc cầu thận Màng cầu thận được cấu tạo bởi 3 lớp: tế bào nội mô thành mao mạch, lớp màng đáy và lớp tế bào biểu mô chuyên hóa [29]

Lớp biểu mô chuyên hóa đóng vai trò quan trọng trong điều hòa chức năng lọc tại cầu thận, gồm các tế bào biểu mô được biệt hóa ở mức độ cao, gọi là podocyte Podocyte là tế bào biểu mô có kích thước lớn, hình thể không đều, có nhiều tua bào tương nằm song song với màng đáy Từ những tua bào tương này phát sinh nhiều tua nhỏ thẳng góc tận cùng trên màng đáy với khoảng cách đều nhau tạo ra các khe

hở nhỏ gọi là slit diagram, đường kính khoảng 70-75 Ao Gần đây người ta đã chứng minh được rằng có 3 protein quan trọng trong slit diagram điều hòa HCTH là: Nephrin, CD2AP và Podocin [45]

Hình 1.2 Cấu tạo màng cầu thận

(Nguồn: http://www

researchgate.net/figure/5991022_fig2_Fig-2-Schematic-view-of-the-molecular-anatomy-of-two-podocyte-foot-processes-yellow)

Podocin là một loại protein gắn màng, thuộc họ stomalin có cấu trúc giống như kẹp tóc, cả hai đầu đều nằm trong tế bào chất Podocin tồn tại dưới dạng oligo

trên màng lipid kép và tập trung nhiều ở khu vực slit diagram nơi nó tương tác với

các protein khác như CD2AP hay nephrin Podocin do gen NPHS2 mã hóa, được

cấu tạo từ 383 acid amin, trọng lượng phân tử 42 kDa [21, 50]

Hình 1.3 Vị trí của gen NPHS2 trên NST số 1 ở người

(Nguồn: https://ghr.nlm.nih.gov/gene/NPHS2#location ) Gen NPHS2 nằm trên vai dài của nhiễm sắc thể số 1 ở người (1q25-q31), từ cặp nucleotide 179550539 đến 179575976, kích thước 25438 bp (www.gennecards.org) Vùng mã hóa gồm 8 exon, có chiều dài 1149 bp [26]

Hình 1.4 Cấu trúc các đoạn exon và intron của gen NPHS2

(Nguồn: http://www.nature.com/gim/journal/v8/n2/fig_tab/gim200612f1.html)

Các exon được kí hiệu bằng hình chữ nhật màu đen, các intron được thể hiện bằng đường gạch nối giữa các exon Trên từng exon cũng chỉ rõ từng điểm đột biến “hot spot” Vùng khởi đầu 5’UTR và vùng kết thúc khung đọc mở 3’UTR của gen

NPHS2

Bằng những bằng chứng thực nghiệm trên động vật các nhà khoa học đã

chứng minh được đột biến gen NPHS2 có liên quan tới HCTH [21, 27, 46, 56]

1.3.3 Đa hình đơn rs12401708 C>T và rs3738423 C>T của gen NPHS2

 Đa hình đơn rs3738423 C>T

SNP rs3738423 C>T (tên gọi khác là S96S hoặc nt16710 C>T) là sự thay thế

C=>T tại nucleotid số 16710 ở exon 2 của gen NPHS2 Đa hình này tạo ra 3 kiểu

gen: CC (kiểu gen đồng hợp kiểu dại), CT (kiểu gen dị hợp tử), TT (kiểu gen đồng hợp tử đột biến) [36]

Năm 2001, theo nghiên cứu trên 44 bệnh nhân HCTH đã được chẩn đoán mô bệnh học ở Ý có tần số alen T là 0,06 đối với SNP 288C>T [22]

Năm 2005, nghiên cứu của Zihua Yu trên 23 bệnh nhân nhi Trung Quốc đã gặp 1 trường hợp đồng hợp, 1 trường hợp dị hợp SNP 288C>T Nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt rõ về kiểu gen và tần số alen giữa 23 bệnh nhân nhi và

53 đối chứng [54]

Năm 2011, Ren Q và Yu Sy đã gặp 3 SNP: 288C>T thể dị hợp ở exon 2, 954T>C thể đồng hợp và 1038A>G thể dị hợp ở exon 8 ở 35 bệnh nhi và 30 đối chứng khỏe mạnh [23]

Nghiên cứu trên hơn 97 bệnh nhân ở Singapore của Junli có 7 di hợp và 1 đồng hợp SNP 288C>T Nghiên cứu này nhận thấy SNP 288C>T có thể có tác dụng bảo vệ trên những bệnh nhân gốc Trung Quốc, tác dụng này không được ghi nhận ở nhóm bệnh nhân gốc Malaysia [36]

Năm 2015, nghiên cứu của Rachmadi trên 52 bệnh nhi mắc HCTH ở Indonesia gặp 4 trường hợp có dị hợp SNP 288C>T chiếm 14% [44]

Theo các nghiên cứu trên, SNP 288C>T gặp cả ở cộng đồng người châu Âu và châu Á, trong đó có nghiên cứu của tác giả Junli cho thấy SNP này có thể có tác dụng bảo vệ [36]

 Đa hình đơn rs12401708 C>T

SNP rs12401708 C>T (tên gọi khác là nt21268 C>T) là sự thay thế C=>T tại

nucleotid số 21268 ở exon 4 của gen NPHS2 Đa hình này tạo ra 3 kiểu gen: CC

(kiểu gen đồng hợp kiểu dại), CT (kiểu gen dị hợp tử), TT (kiểu gen đồng hợp tử đột biến) SNP này đại diện cho miền Nam Ấn Độ, được Dhandapani MC và cộng

sự báo cáo tới cơ sở dữ liệu DBSNP năm 2016

Nghiên cứu của Dhandapani M C và cộng sự (2016) được tiến hành trên 300 bệnh nhi chia làm 3 nhóm: nhóm đối chứng 1 gồm 100 bệnh nhi khỏe mạnh, nhóm

2 gồm 100 bệnh nhi mắc HCTH nhạy cảm với steroid, nhóm 3 gồm 100 bệnh nhi mắc HTCH kháng steroid ở miền Nam Ấn Độ, phân tích cho thấy không có đột biến

gen NPHS2 ở nhóm bệnh nhân 1 và 2 Ngược lại ở nhóm bệnh nhân 3 phát hiện có

12 đột biến gồm 4 đột biến dị hợp tử, 8 đột biến đồng hợp tử Trong 8 đột biến dị hợp tử có 3 đột biến xảy ra ở exon 4 là: nt21237 T>C chiếm 1%, nt21240 G>A chiếm 3%, nt21260 C>T chiếm 1% Tỷ lệ kiểu gen và tần số alen của rs12401708 C>T ở 2 nhóm không có sự khác biệt đáng kể so với nhóm đối chứng [24]

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐA HÌNH ĐƠN NUCLEOTID

1.4.1 Phương pháp giải trình tự Maxam-Gilbert

Năm 1977, Maxam và Gilbert lần đầu tiên phát minh ra phương pháp giải trình tự gen bằng phương pháp hóa học Nguyên lý của phương pháp dựa trên phản ứng hóa học đặc hiệu, các DNA không tự xoắn lại với nhau tạo thành tập hợp các phân đoạn có kích thước khác nhau Đầu tiên, phân tử DNA được đánh dấu đồng vị phóng xạ 32P ở đầu 5' của mạch đơn, để có thể được phát hiện bằng phóng xạ Xử lý hóa học đặc hiệu phân hủy một loại nucleotid của mạch DNA đã đánh dấu phóng

xạ, các phản ứng tạo ra các đoạn DNA cắt ngẫu nhiên có chiều dài chỉ hơn kém nhau 1 nucleotid Kết quả các phản ứng hóa học xử lý mạch DNA được phát hiện

bằng điện di trên gen polyacrylamid và đọc kết quả bằng máy phóng xạ tự ghi thu được trình tự nucleotid của mạch đơn DNA [8, 17]

1.4.2 Phương pháp xác định trình tự Sanger-Coulson

Được Sanger và cộng sự phát minh cũng vào năm 1977, nguyên tắc của phương pháp dựa vào sự tổng hợp mạch bổ xung cho trình tự cần xác định nhờ vào hoạt động của enzyme DNA polymerase (enzyme DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotid vào mạch đơn DNA đang tổng hợp ở vị trí 3'OH, khi gặp nucleotid không

có nhóm 3'OH thì phản ứng dừng lại)

Phản ứng sử dụng đoạn mổi khoảng 20 nucleotid, 4 loại dNTP (trong đó có một loại đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ), bổ xung thêm 1% một loại ddNTP (dideoxynucleotid) cho mỗi loại phản ứng Các ddNTP mất 2 nguyên tử O2 ở C3 và

C2,khi mạch đơn đang tổng hợp được gắn 1 ddNTP phản ứng ngừng tổng hợp Mỗi

loại phản ứng được thực hiện riêng rẽ, kết quả phản ứng tổng hợp nên các đoạn oligonucleotid dài ngắn khác nhau một nucleotid và được nhận biết bằng phương pháp điện di Tổng hợp kết quả phản ứng ở 4 ống thu được trình các nucleotid của mạch đơn, có thể biết được trình tự sắp xếp các nucleotid trong gen [8, 17]

1.4.3 Giải trình tự bằng máy tự động

Hiện nay, việc giải trình tự được thực hiện dễ dàng bằng máy giải trình tự tự động, hoạt động theo nguyên lý của phương pháp Sanger cải biến Trong kỹ thuật này, người ta không đánh dấu bằng phóng xạ mà mỗi loại ddNTP được đánh dấu bằng một màu huỳnh quang khác nhau Như vậy, tất cả các oligonucleotid cùng chấm dứt tại một loại ddNTP sẽ có cùng một màu, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thề thực hiện được chỉ trong một ống nghiệm

Máy giải trình tự gen tự động bao gồm các thành phần chính như: hệ điện di mao quản, laser, hệ thống nhận và xử lý tín hiệu Giải trình tự đang là xu thế phát triển và được ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác nhau [8, 17]

1.5 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐA HÌNH DI

TRUYỂN GEN NPHS2 VỚI MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA

Năm 2004, nghiên cứu của Alexandre C Pereira và cộng sự ở Brazil lần đầu

tiên thấy sự có mặt của alen 229Q của gen NPHS2, được xác định là nguyên nhân

gây ra HCTH với tần số alen là 4% so với nhóm đối chứng và có liên quan đến nguy cơ tăng microalbumin niệu trong dân số nói chung Sự hiện diện của alen này

có liên quan đáng kể với tăng nguy cơ microalbumin niệu gấp 2,77 lần ngay cả khi

đã điều chỉnh các yếu tố gây nhiễu như tuổi tác, huyết áp, béo phì, tiểu đường và sắc tộc [42]

Năm 2016, nghiên cứu của Mohammad Hashemi và cộng sự về đa hình đơn

rs5370 G>T của gen ET-1 trên 138 trẻ em mắc HCTH và 150 trẻ khỏe mạnh ở Iran

cho thấy của đột biến rs5370 G>T không có sự khác biệt đáng kể về tỷ lệ kiểu gen

và tần số alen giữa các trường hợp và nhóm chứng, đa hình đơn của rs5370 G>T không liên quan đến giới tính bệnh nhân Ở những bệnh nhân HCTH, kiểu gen không có liên quan với các thông số sinh hóa: cholesterol, triglyceride, protein huyết tương và albumin máu [30]

Nghiên cứu của tác giả Vũ Vân Nga (2016) trên 120 bệnh nhân nhi mắc hội chứng thận hư tiên phát, kết quả phân tích đối với SNP 288C>T cho thấy kiểu gen

TT chiếm một tỷ lệ rất nhỏ, kiểu gen CC chiếm đa số Nồng độ protein máu và albumin máu giữa các kiểu gen của SNP 288C>T trong nhóm kháng corticosteroid không có sự khác biệt, bệnh nhân có kiểu gen TT có nồng độ protein niệu và tỷ lệ protein/creatinin niệu thấp hơn so với các bệnh nhân của các kiểu gen CC và CT [10]

C hương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

 Tiêu chuẩn lựa chọn

Gồm 128 bệnh nhân nhi tại khoa Thận-Tiết Niệu, bệnh viện Nhi TW được chẩn đoán HTCHTP theo tiêu chuẩn của KDIGO (Kidney Disease Improving Global Outcomes) năm 2012 từ tháng 01/2016 - 08/2017 gồm: Protein niệu ≥ 50 mg/kg/24 giờ hoặc Protein niệu/Creatinin niệu ≥ 200 mg/mmol, Albumin máu ≤ 25 g/l, Protein máu ≤ 56 g/l [37]

 Tiêu chuẩn loại trừ

HCTH thứ phát: phát hiện được nguyên nhân như đái tháo đường, lupus ban

đỏ hệ thống, dị ứng, ong đốt, ngộ độc và các bệnh về cầu thận khác

Bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu

 Bệnh nhân được chia thành 2 nhóm dựa vào đáp ứng sau điều trị với corticoid

Nhóm nhạy cảm với corticoid (NCC): bệnh nhân hết phù, hết protein niệu sau khi dùng prednisone 8 tuần

Nhóm đề kháng với corticoid (NKC): không hết protein niệu sau 8 tuần điều trị bằng steroid, dựa theo 3 tiêu chuẩn sau:

• Không thuyên giảm sau 6 tuần điều trị bằng prednisolon liều tấn công 2 mg/kg/24h liên tục hàng ngày vào buổi sáng

• Không thuyên giảm sau 4 tuần điều trị bằng prednisolon liều tấn công 2 mg/kg/24h liên tục hàng ngày vào buổi sáng và 4 tuần điều trị bằng prednisolon

2 mg/kg/24h liều cách ngày

• Không thuyên giảm sau 4 tuần điều trị bằng prednisolon liều tấn công 2 mg/kg/24h liên tục hàng ngày vào buổi sáng và 3 liều truyền Methylprednisolon bolus 1000 mg/1,73m2 cơ thể/48h

 Theo KDIGO[36], dựa vào lâm sàng và protein niệu 24h hoặc chỉ số protein/creatinin niệu, protein máu, albumin máu lúc nhập viện và sau 6 tháng để đánh giá kết quả điều trị:

• Thuyên giảm hoàn toàn: bệnh nhân hết phù, protein niệu âm tính hoặc protein/creatinin niệu < 20 mg/mmol hoặc 20 mg/mmol và giảm được 50% protein niệu so với ban đầu

• Không thuyên giảm: protein/creatinin niệu ≥ 200 mg/mmol; albumin máu < 25 g/l; protein máu < 56 g/l

2.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian bắt đầu nghiên cứu từ tháng 01/2016 đến 08/2017

- Địa điểm:

• Khoa Thận Tiết niệu, Bệnh viện Nhi TW

• Phòng thí nghiệm Bộ môn Y dược học cơ sở, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia

Hà Nội

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu là mô tả cắt ngang và một phần theo dõi dọc

2.2.2 Các chỉ số nghiên cứu

Các chỉ số lâm sàng: độ tuổi, giới tính, tuổi khởi phát, mức độ tái phát

Các chỉ số sinh hóa cận lâm sàng: nồng độ protein máu, albumin máu, ure

máu, cre máu; protein niệu, creatinin niệu

Dữ liệu đa hình thái đơn nucleotide 2 SNP rs3738423 và rs12401708 của gen

NPHS2

2.2.3 Phương tiện nghiên cứu

2.2.3.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu nước tiểu 24h: 5ml nước tiểu 24h được bảo quản bằng dung dịch thymol 10%

Mẫu máu cho phân tích sinh hóa: 2 ml máu tĩnh mạch đựng trong ống nghiệm chống đông bằng Heparin

Mẫu cho phân tích gen: 2 ml máu tĩnh mạch được đựng vào ống nghiệm

chống đông EDTA

2.2.3.2 Hóa chất

- Cặp mồi được đặt tổng hợp từ hãng IDT-Mỹ với trình tự đã được sử dụng trong các nghiên cứu trước đây [11]

- Lambda DNA/HindIII Marker, code: SM0103, hãng: Thermo Scientific

- 6X DNA loading dye, code: R0611, hãng: Thermo Scientific

- GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, code: SM0321, hãng: Thermo Scientific

- Pfu hãng Thermo Scientific

- dNTP Mix, 2 mM each, code: R2041, hãng: Thermo Scientific

- Nước khử ion, code: PD092, hãng: Omega Biotek

- Ultra Pure Agarose, code: 16500100, hãng: Invitrogen

- Tris base, code: TB0196, hãng: Bia basic

- Ethidium bromide 10mg/ml, hãng: Beckman

- E.Z.N.A blood DNA Mini kit, code: D3392, hãng: Omega Biotek

- Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing kit, hãng: Thermo Fisher Scientific

- GeneJET PCR Kit, hãng: Thermo Fisher Scientific

- Big Dye Terminator Purification kit, hãng: Thermo Fisher Scientific

2.2.3.3 Thiết bị

- Máy xét nghiệm sinh hóa tự động AU2700 và hóa chất của hãng Beckman Coulter

- Máy PCR Prime Thermal Cycler (code: 5PRIME/02, Anh)

- Máy đo nồng độ DNA Eppendorf Bio Photometer Plus (Eppendorf, Đức)

- Máy giải trình tự 3500 Genetic Analyzer applied Biosystems, Mỹ

- Hệ thống điện di Cole-Parmer (code 97623-06, Mỹ)

- Máy soi và chụp ảnh Gell (code UVCI01 Compact Digimage System, Mỹ)

- Máy lắc VELP Scientifica (code D20220176, Châu Âu)

- Tủ ấm Digisystem Laboratory Instrutment In (Đài Loan)

- Máy ly tâm EBA21 Hettich Zentrifugen, code D78532, Đức

- Máy Vortex VELP Scientifica, code F2020176, Châu Âu

- Cân điện tử Model: AWS, Mỹ

- Tủ lạnh âm sâu Panasonic, model MDF - U334 - PE, Nhật Bản

2.2.3 4 Dụng cụ

- Các pipet Eppendorf dải: 0,5 - 10 µl, 10 - 100 µl, 100 - 1000 µl, hãng Thermo

- Đầu côn: 10 µl, 200 µl, 1000 µl, hãng Thermo

- Ống Eppendorf 1,7 µl, hãng Thermo

- Ống PCR 0,2 ml, hãng Thermo

- Ống máu EDTA 5 ml, hãng HTM - Việt Nam

- Khay đổ gel, lược tạo giếng

- Bình thủy tinh, cốc đong

- Găng tay, khẩu trang Việt Nam

- Giấy không bụi M3, Nhật Bản

2.2.4 Các bước tiến hành nghiên cứu

Trình tự các bước tiến hành nghiên cứu được mô tả theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2 Sơ đồ nghiên cứu

2.2.4.1 T hu thập, xử lý và bảo quản mẫu

Mẫu nước tiểu 24h: lấy toàn bộ số lượng nước tiểu trong một ngày đêm (đủ

24h) Bô đựng nước tiểu phải có nắp đậy, rửa sạch và được sát khuẩn bằng 5 ml dung dịch HCl đậm đặc Bảo quản nước tiểu bằng dung dịch thymol 10% (5 ml)

BỆNH NHÂN THỎA MÃN TIÊU

kiểm tra chất lượng DNA

PCR khuếch đại exon 2 và exon 4 của

gen NPHS2 chứa 2 SNP quan tâm

Giải trình tự gen

Kiểm tra chất lượng và tinh sạch

sản phẩm PCR

PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ

Tối hôm trước bệnh nhân tắm rửa, vệ sinh sạch bộ phận sinh dục-tiết niệu, 6 giờ sáng đái bỏ đi và bắt đầu ghi thời gian Sau đó cả ngày và đêm nước tiểu được đựng vào bô, kể cả lượng nước tiểu lúc đại tiện cũng phải gom cho vào, 6 giờ sáng hôm sau đi tiểu lần cuối cùng vào bô Bảo quản nước tiểu bằng dung dịch thymol 10%

Đo thể tích nước tiểu 24h, lấy 5 ml để làm xét nghiệm

Mẫu máu xét nghiệm sinh hóa: lấy máu buổi sáng lúc bệnh nhân chưa ăn

Lấy 1,5 - 2 ml máu tĩnh mạch đựng trong ống nghiệm chống đông bằng Heparin Bệnh phẩm được vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm để phân tích

Mẫu cho phân tích gen: 3 ml máu tĩnh mạch được đựng vào ống nghiệm

chống đông EDTA Đảm bảo mẫu không bị nhiễm bẩn, không lẫn mẫu với nhau Mỗi ống máu đủ cho một lần tách DNA tổng số và luôn đảm bảo còn mẫu lưu có thể lặp lại việc tách DNA tổng số đến khi xác định được kiểu gen bệnh nhân Các mẫu được bảo quản trong ngăn đá tủ lạnh dân dụng không quá 1 ngày, sau đó được vận chuyển theo nguyên tắc đảm bảo an toàn sinh học đến phòng thí nghiệm bộ môn Y dược học cơ sở - Khoa Y dược - Đại học quốc gia Hà Nội Mẫu được giữ ở -

30oC trước khi sử dụng

Ký hiệu: Ống chứa máu phải có đầy đủ thông tin như mã bệnh nhân, tên tuổi, ngày giờ lấy mẫu Thông tin về mẫu máu phải được lưu trong sổ với các thông tin: tên, tuổi, ngày giờ lấy mẫu, tình trạng mẫu khi được bàn giao và khi sử dụng để tách DNA

2.2.4.2 Phân tích định lượng sinh hóa máu và nước tiểu

Bệnh phẩm máu và nước tiểu được phân tích tại khoa Sinh hóa, bệnh viện Nhi

TW Bệnh nhân được xét nghiệm tại những mốc thời gian khác nhau: vào viện, ra viện, sau ra viện 1 tháng và sau ra viện 6 tháng Các chỉ số sinh hóa được phân tích bao gồm: nồng độ protein niệu, tỷ lệ protein/creatinin niệu, protein máu, albumin máu và creatinin máu bằng hệ thống phân tích sinh hóa tự động Beckman Coulter AU2700

2.2.4.3 Phân tích đa hình đơn gen NPHS2

Nguyên lý của kỹ thuật: sử dụng E.Z.N.A Blood DNA Mini Kit để tách DNA

tổng số Nguyên lý của kỹ thuật dựa vào sự hấp thu chọn lọc của các acid nucleic

vào màng silica - gel trong điều kiện nhất định, quy trình gồm 4 giai đoạn chính:

phá vỡ tế bào để giải phóng DNA, DNA liên kết với màng silica-gel, loại bỏ tạp

chất trên màng silica-gel với dung dịch đệm rửa (Wash Buffer) và thu DNA

 Kiểm tra chất lượng DNA tổng số sau khi tách chiết

Bằng phương pháp đo quang: nguyên lý của phương pháp dựa trên sự hấp thụ

khác nhau của phân tử DNA, ARN và protein ở bước sóng 260/280 nm Dịch chiết DNA tổng số được đánh giá là sạch khi có tỷ lệ 260/280 nằm trong khoảng 1,7 - 2,2 Việc nhiễm protein sẽ làm tỷ lệ 260/280 thấp hơn 1,7 Quy trình thao tác chung

gồm các bước sau: đo blank (đo với môi trường dùng để bảo quản/pha loãng mẫu

DNA), đo mẫu DNA (các mẫu được đo ở bước sóng 260 nm và 280 nm, mỗi mẫu

DNA được đo ít nhất 2 lần và lấy giá trị trung bình để xác định nồng độ DNA của mẫu Thực nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Y dược học cơ sở, Khoa Y dược, Đại học Quốc gia Hà Nội)

Bằng phương pháp điện di: nguyên lý của phương pháp là các phân tử DNA

có khối lượng và kích thước khác nhau được tách khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của hệ điện di trong một điện trường có hiệu điện thế và cường độ thích hợp Tốc độ di chuyển của các phân tử trong gel phụ thuộc vào kích thước, cấu trúc phân

tử, nồng độ gel, lực điện trường Quy trình chạy điện di thông thường gồm các bước sau: chuẩn bị gel agarose, tra mẫu DNA vào giếng, chạy điện di, nhuộm DNA, quan sát và chụp ảnh

Trong nghiên của chúng tôi, sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu

NPHS2*2F/R và NPHS2 *4F/R để khuếch đại exon 2 và exon 4 của gen NPHS2

Trước khi thực hiện PCR chúng tôi mastermix với các thành phần như trong bảng 2.2 Thể tích hỗn hợp là 25 µl bao gồm: dNTP, buffer, MgSO4, Pfu, DNA mẫu, mồi xuôi, mồi ngược và nước cất với các tỷ lệ được tối ưu trong quá trình thực hiện kỹ thuật đảm bảo cho sản phẩm PCR là đặc hiệu và hiệu quả nhất

Nhiệt độ gắn mồi (Ta) là yếu tố quan trọng của chu trình nhiệt trong việc tối

ưu phản ứng PCR Ta là nhiệt độ mà ở đó một nửa số lượng mồi được gắn với gen đích tại vị trí đặc hiệu, có thể được xác định dựa trên số lượng của các nucleotide A,

T, G, C ở mồi xuôi và mồi ngược Nghiên cứu được tiến hành thử nghiệm ở dải 10 nhiệt độ từ 50,8 - 68,1oC, cuối cùng chúng tôi đã tìm ra được Ta thích hợp nhất cho

cả hai đoạn gen cần khuếch đại là 56oC

Quy trình PCR cho exon 2 và exon 4 được thực hiện theo cặp mồi, các thành

phần phản ứng và chu trình nhiệt dưới đây:

Bảng 2.1 Mồi exon 2 và exon 4 của gen NPHS2

Nhiệt

độ ( O C)

Độ dài đoạn gen (bp)

Chu trình nhiệt:

• 95oC - 3 phút

• 35 chu kỳ (95oC - 30s, 56oC - 30s, 72oC - 1 phút)

• 72oC - 5 phút

Kiểm tra chất lượng sản phẩm PCR: sử dụng phương pháp điện di tương tự

như điện di kiểm tra chất lượng DNA sau khi tách chiết 5 µl mẫu DNA trộn được với 1 µl DNA 6X loading dye và 5 µl Ruller 100 bp Plus DNA Ladder, tra vào giếng điện di trên giá thể agarose 1,5% trong đệm TAE 1X, hiệu điện thế 70V trong

60 phút

Sử dụng kit GeneJET PCR theo các bước sau:

Thêm thể tích Binding Buffer vào sản phẩm PCR với tỉ lệ 1:1, mix đều Nếu DNA < 500 bp thêm isopropanol 100% tỉ lệ 1:2, mix đều Chuyển 800 µl hỗn hợp

từ bước 1 (hoặc bước 2) vào cột tách GeneJET, ly tâm trong 30 - 60s, bỏ phần dịch lọc Thêm 700 µl Wash Buffer vào cột ly tâm trong 30-60s, bỏ phần dịch lọc Ly tâm cột lọc trong 1 phút để loại bỏ hoàn toàn Wash Buffer Chuyển cột lọc sang ống

ly tâm vô trùng 1,5 ml Thêm 50 µl Elution Buffer Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút Ly tâm thu dịch lọc Bảo quản ở -20o

C

 Phân tích kết quả bằng phương pháp giải trình tự

20 µl sản phẩm PCR lên băng đặc hiệu và sáng nét được gửi đi tinh sạch và giải trình tự tại hãng First Base (Malaysia) Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9

2.2.5 Xử lý số liệu

Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 16, sử dụng các test thống kê: tính trị số trung bình, trung vị, χ2, T - test, ANOVA test Vẽ biểu đồ bằng phần mềm Sigmaplot 14.0 Đọc kết quả giải trình tự gen bằng phần mềm BioEdit