NGHIÊN cứu mối LIÊN QUAN GIỮA đa HÌNH KIỂU GEN MTHFR c677t với một số BIẾN CHỨNG ở BỆNH NHÂN đái THÁO ĐƯỜNG TYPE 2

Mối tương quan của gen MTHFR C677T với biến chứng kiểm soát đường máu và HbA1c ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 trong phân tích tương quan đa biến...58Bảng 3.14.. Gen MTHFR C677T làm tăng nồng độ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

PHẠM HỒNG NGỌC

NGHI£N CøU MèI LI£N QUAN GI÷A

§A H×NH KIÓU GEN MTHFR C677T VíI MéT Sè BIÕN CHøNG ë BÖNH NH¢N §¸I TH¸O §¦êNG TYPE 2

Hà Nội - 2017

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và tiến hành nghiên cứu, tôi đã được sự giúp đỡtận tình từ các thầy cô giáo, các bạn đồng nghiệp, từ cơ quan và những ngườithân trong gia đình Hoàn thành luận văn này, cho phép tôi bày tỏ lòng kínhtrọng và biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Bình, TS Nguyễn Thị ThanhHương, người thầy, người cô, người hướng dẫn khoa học, đã hết sức tận tìnhhướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình làmluận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc và Tập thể cán bộ nhân viênKhoa khám bệnh - Bệnh viện đa khoa SaintPaul, Trung tâm Gen và Ứng dụng

- Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi thực hiệnnghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học,các thầy cô giáo Trường Đại học Y Hà Nội nói chung cũng như các thầy côgiáo Bộ môn Sinh lý học nói riêng đã tạo điều kện thuận lợi và nhiệt tìnhgiảng dạy truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong quá trình học tập,nghiên cứu và làm luận văn tốt nghiệp

Cuối cùng tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp, gia đình, nhữngngười thân đã động viên, chia sẽ và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Học viên

Phạm Hồng Ngọc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Phạm Hồng Ngọc, học viên Bác sĩ nội trú khóa 40 chuyên ngànhSinh lý học, xin cam đoan:

1 Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫncủa TS Nguyễn Huy Bình, TS Nguyễn Thị Thanh Hương

2 Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đãđược công bố tại Việt Nam

3 Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trungthực và khách quan, đã được xác nhận và chấp nhận của cơ sở nơinghiên cứu

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này

Hà Nội, ngày tháng năm 2017

Học viên

Phạm Hồng Ngọc

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

5,10-MTHF 5,10- Methylene tetra hydrofolate

5-MTHF 5-Methyl tetra hydrofolate

ARMS Amplification refractory mutation system

Cholesterol TP Cholesterol toàn phần

eGFR Estimate glomerular filtration rate

HDL – C High density lipoprotein cholesterol

IDF International Diabetes Federation

LDL – C Low density lipoprotein cholesterolMTHFR Methyl tetrahydrofolate reductase

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đái tháo đường type 2 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Tình hình đái tháo đường type 2 trên thế giới và Việt Nam 3

1.1.3 Sinh lý bệnh đái tháo đường type 2 4

1.1.4 Triệu chứng lâm sàng 4

1.1.5 Triệu chứng cận lâm sàng 5

1.1.6 Chẩn đoán xác định ĐTĐ 5

1.1.7 Biến chứng 6

1.1.8 Điều trị 11

1.2 Gen MTHFR 12

1.2.1 Tổng quan gen MTHFR 12

1.2.2 Vai trò của gen MTHFR 13

1.2.3 Đa hình gen MTHFR C677T 15

1.2.4 Mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR với các chỉ số lâm sàng và cận lâm sàng ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 18

1.2.5 Một số phương pháp giảm Hcy máu 22

1.3 Các phương pháp phân tích đột biến gen MTHFR 26

1.3.1 Kỹ thuật PCR 27

1.3.2 Kỹ thuật ARMS - PCR 29

CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 32

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 32

2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 32

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 33

2.2.1 Thời gian nghiên cứu 33

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 33

2.3 Sơ đồ nghiên cứu 34

2.4 Công cụ và phương pháp thu thập số liệu 35

2.5 Các bước tiến hành 37

2.5.1 Hỏi bệnh 37

2.5.2 Lâm sàng 37

2.5.3 Cận lâm sàng 38

2.5.4 Tách DNA 38

2.5.5 Đo nồng độ DNA, kiểm tra độ tinh sạch 38

2.5.6 Xác định kiểu gen bằng phương pháp ARMS - PCR 39

2.5.7 Phương pháp giải trình tự gen 41

2.6 Tiêu chuẩn nghiên cứu đánh giá 42

2.6.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán ĐTĐ 42

2.6.2 Tiêu chuẩn kiểm soát đường máu 42

2.6.3 Tiêu chuẩn đánh giá thừa cân béo phì 42

2.6.4 Tiêu chuẩn chẩn đoán rối loạn lipid máu 42

2.6.5 Tiêu chuẩn chẩn đoán THA 44

2.6.6 Tiêu chuẩn chẩn đoán biến chứng thận 44

2.7 Đạo đức nghiên cứu 45

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46

3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 46

3.1.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 46

3.1.2 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng đối tượng nghiên cứu 47

3.2 Kết quả xác định đa hình kiểu gen MTHFR C677T 49

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA 49

3.2.2 Kết quả xác định kiểu gen MTHFR C677T bằng phương pháp

ARMS - PCR 50

3.2.3 Kết quả xác định kiểu gen MTHFR C677T bằng phương pháp giải trình tự gen 51

3.2.4 Kết quả xác định kiểu gen và tần số alen 52

3.3 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với một số chỉ số lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 52

3.4 Mối tương quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với một số biến chứng ở bệnh nhân đái tháo đường type 2 54

3.4.1 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với kiểm soát glucose máu và HbA1c 54

3.4.2 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với RLMM 55 3.4.3 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với THA 56

3.4.4 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với biến chứng thận 57

3.5 Phân tích ảnh hưởng của gen MTHFR C677T với một số biến chứng trong phân tích tương quan quan đa biến 58

CHƯƠNG IV: BÀN LUẬN 62

4.1 Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu 62

4.1.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 62

4.1.2 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của đối tượng nghiên cứu 63

4.2 Kết quả xác định đa hình kiểu gen MTHFR C677T 66

4.2.1 Kết quả tách chiết DNA 66

4.2.2 Phân tích kiểu gen MTHFR C677T bằng phương pháp ARMS-PCR và giải trình tự gen 67

4.2.3 Sự phân bố kiểu gen và tần số alen của gen MTHFR C677T ởngười ĐTĐ type 2 Việt Nam so với các nước khác 684.3 Mối liên quan giữa đa hình gen MTHFR C677T với một số chỉ số lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân ĐTĐ type 2 704.4 Mối liên quan giữa đa hình gen MTHFR C677T với một số yếu tố nguy cơ ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 754.4.1 Mối liên quan giữa đa hình gen MTHFR C677T với kiểm soátglucose máu và HbA1c 754.4.2 Mối liên quan giữa đa hình gen MTHFR C677T với HA và RLMM 754.4.3 Mối tương quan giữa đa hình gen MTHFR C677T với mức lọc cầu thận 764.5 Phân tích ảnh hưởng của gen MTHFR C677T với một số biến chứng trong phân tích mối tương quan đa biến 774.6 Điểm mạnh và điểm yếu của nghiên cứu 78

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Nồng độ Hcy, acid folic, vitamin B12 với đa hình gen MTHFR 16

Bảng 1.2 Vị trí và các kiểu đột biến gen MTHFR 17

Bảng 1.3 Bảng tần số đa hình gen MTHFR trên thế giới 17

Bảng 1.4 Hàm lượng folate trong 100 gam phần ăn được của một số thực phẩm 26

Bảng 2.1 Công cụ và phương pháp thu thập số liệu 35

Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR 40

Bảng 2.3 Trình tự chuỗi DNA mồi 40

Bảng 2.4 Tiêu chuẩn kiểm soát glucose và HbA1c theo IDF 2005 42

Bảng 2.5 Bảng phân loại BMI 42

Bảng 2.6 Phân loại rối loạn lipid máu 43

Bảng 2.7 Phân độ tăng huyết áp 44

Bảng 2.8 Phân độ suy thận theo mức lọc cầu thận 44

Bảng 3.1 Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 46

Bảng 3.2 Đặc điểm lâm sàng của nhóm nghiên cứu 47

Bảng 3.3 Đặc điểm sinh hóa máu của đối tượng nghiên cứu 48

Bảng 3.4 Đặc điểm xét nghiệm chức năng thận ở nhóm nghiên cứu 49

Bảng 3.5 Kết quả đo nồng độ và độ tinh sạch DNA 50

Bảng 3.6 Phân bố kiểu gen và tần số alen của gen MTHFR C677T của đối tượng nghiên cứu 52

Bảng 3.7 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu 52

Bảng 3.8 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh nhân ĐTĐ type 2 53

Bảng 3.9 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với kiểm soát glucose máu và HbA1c ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 54

Bảng 3.10 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với kiểm

soát chỉ số cholesterol TP, triglyceride, LDL - C, HDL - C ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 55Bảng 3.11 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với HATT,

HATTr và kiểm soát HA ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 56Bảng 3.12 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với protein

niệu và eGFR ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 57Bảng 3.13 Mối tương quan của gen MTHFR C677T với biến chứng kiểm

soát đường máu và HbA1c ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 trong phân tích tương quan đa biến 58Bảng 3.14 Mối tương quan của gen MTHFR C677T với huyết áp ở bệnh

nhân ĐTĐ type 2 trong phân tích tương quan đa biến 59Bảng 3.15 Mối tương quan của gen MTHFR C677T với kiểm soát mỡ máu ở

bệnh nhân ĐTĐ type 2 trong phân tích tương quan đa biến 60Bảng 3.16 Mối tương quan của gen MTHFR C677T với mức lọc cầu thận ở

bệnh nhân ĐTĐ type 2 trong phân tích tương quan đa biến 61

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cơ chế bệnh sinh của bệnh ĐTĐ type 2 7

Hình 1.2 Cơ chế sinh lý bệnh trong bệnh thận ĐTĐ 9

Hình 1.3 Vị trí gen MTHFR 13

Hình 1.4 Vai trò của MTHFR trong chu trình chuyển hóa acid folic 14

Hình 1.5 Cơ chế bệnh sinh của tăng nồng độ Hcy 15

Hình 1.6 Cơ chế hình thành huyết khối do ảnh hưởng gen MTHFR 19

Hình 1.7 Con đường chuyển hóa phụ homocystein 20

Hình 1.8 Tác dụng H2S lên chuyển hóa glucose 21

Hình 1.9 Quá trình chuyển hóa acid folic và folate 24

Hình 1.10 Quá trình chuyển hóa Hcy 25

Hình 1.11 Minh họa chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR 28

Hình 1.12 Nguyên lý kỹ thuật ARMS - PCR 29

Hình 1.13 Kết quả chụp huỳnh quang sau ARMS - PCR 30

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu 34

Hình 2.2 Đột biến MTHFR C677T 41

Hình 2.3 Kết quả giải trình tự gen 41

Hình 3.1 Kết quả xác định kiểu gen MTHFR C677T bằng phương pháp ARMS - PCR 50

Hình 3.2 Kết quả giải trình tự gen 51

ĐẶT VẤN ĐỀ

Đái tháo đường (ĐTĐ) là bệnh lý phức tạp do nhiều yếu tố và nhiều gengây nên Theo thông báo của Liên đoàn ĐTĐ quốc tế IDF (InternationalDiabetes Federation) hiện nay có khoảng 415 triệu người mắc ĐTĐ type 2 vàcon số này sẽ tăng lên tới 642 triệu người vào năm 2020 nếu không có hànhđộng can thiệp kịp thời IDF cũng ước tính là 183 triệu người không biết rằng

họ mắc ĐTĐ [1] Tại Việt Nam tỷ lệ mắc ĐTĐ rất cao và cũng đang gia tăngnhanh chóng Theo điều tra năm 1990 điều tra tại Hà Nội, Huế, thành phố HồChí Minh tỷ lệ mắc ĐTĐ type 2 tương ứng là 1,20%, 0,96% và 2,52% [2].Thống kê năm 2008, tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ trong cả nước là trên 5,0% (khoảng4,5 triệu người), tại các thành phố lớn và khu công nghiệp có tỷ lệ từ 7,0%đến 10,0% [3] Như vậy chỉ sau 10 năm tỷ lệ ĐTĐ đã gia tăng 300% [4] Tỷ

lệ mắc bệnh ĐTĐ đang gia tăng nhanh chóng trên toàn thế giới kéotheo những hậu quả nghiêm trọng về sức khỏe và kinh tế đối với toàn xã hội.ĐTĐ là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 4 trên thế giới, gây giảm tuổithọ trung bình từ 5 đến 10 năm, là nguyên nhân hàng đầu gây mù loà và suythận giai đoạn cuối [5]

Có rất nhiều nguyên nhân làm gia tăng biến chứng của ĐTĐ như chế độ

ăn uống không hợp lý, ít vận động, không tuân thủ chế độ chăm sóc và điềutrị, cũng như dùng thuốc không đúng, Ngoài ra còn một số yếu tố khác cũnggóp phần làm gia tăng biến chứng trên như là đa hình gen, trong đó có genMTHFR C677T Gen MTHFR C677T làm tăng nồng độ homocystein (Hcy)máu do làm giảm hoạt tính enzyme methyl tetrahydrofolat reductase(MTHFR), giảm chuyển hóa Hcy thành methionine Do đó ức chế phát triểnnội mạc, giảm đáp ứng vận mạch, giảm tác dụng heparin làm gia tăng biếnchứng ĐTĐ đặc biệt biến chứng tim mạch [6], [7], [8] Những người mang

gen MTHFR C677T ở dạng dị hợp tử thì hoạt tính enzyme MTHFR giảm30% - 40% so với bình thường còn ở dạng đồng hợp tử là 70% [9], [10] Trênthế giới có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra mối liên quan giữa đa hình kiểu genMTHFR C677T với biến chứng tim mạch, thận, thần kinh,… [11], [12], [13],[14], [15] Ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào đề cập đến vấn đề trên, vì vậy

chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với một số biến chứng ở bệnh nhân đái tháo đường type 2” với hai mục tiêu:

1 Xác định tỷ lệ đa hình kiểu gen MTHFR C677T ở bệnh nhân ĐTĐ type 2.

2 Xác định mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MTHFR C677T với một số biến chứng ở bệnh nhân ĐTĐ type 2.

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đái tháo đường type 2

1.1.1 Định nghĩa

Theo WHO 2002: Đái tháo đường (ĐTĐ) là tình trạng tăng đường máu mạntính phối hợp với rối loạn chuyển hoá carbohydrate, lipid, protein do thiếu hụtbài tiết insulin hoặc hoạt động kém hiệu quả của insulin hoặc cả hai [16]

1.1.2 Tình hình đái tháo đường type 2 trên thế giới và Việt Nam

Các chuyên gia của WHO đã dự báo: "Thế kỷ 21 sẽ là thế kỷ của cácbệnh nội tiết và rối loạn chuyển hoá, đặc biệt bệnh ĐTĐ sẽ là bệnh không lâyphát triển nhanh nhất" Số người mắc ĐTĐ trên toàn thế giới tăng từ 171 triệungười năm 2000 lên 194 triệu người năm 2003, đã tăng vọt lên 246 triệungười năm 2006 và được dự báo tăng lên 380 - 399 triệu người vào 2025.ĐTĐ là nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ 4 trên thế giới, gây giảm tuổithọ trung bình từ 5 đến 10 năm, là nguyên nhân hàng đầu gây mù loà và suythận giai đoạn cuối Cứ 10 giây lại có một người chết do nguyên nhân ĐTĐ

và các biến chứng Chi phí cho điều trị ĐTĐ của toàn thế giới năm 2007 ướctính khoảng 232 nghìn tỷ đô la Mỹ, dự báo tăng lên khoảng 302 nghìn tỷ đô la

Mỹ vào năm 2025 [17], [18]

Tỷ lệ ĐTĐ tại các nước thuộc khu vực Đông Nam Á cũng tương đối cao.Tại Philippine, kết quả điều tra quốc gia năm 2008 cho thấy tỷ lệ ĐTĐ là 7,2%,trong đó tỷ lệ ĐTĐ khu vực thành thị là 8,3% và khu vực nông thôn là 5,8%[19] Theo kết quả điều tra năm 2008, tỷ lệ ĐTĐ tại Indonesia là 5,7% [20]

Ở Việt Nam, ĐTĐ đang gia tăng theo thời gian và theomức độ phát triển kinh tế cũng như đô thị hóa Năm 2001,điều tra dịch tễ học bệnh ĐTĐ theo chuẩn quốc tế với sự giúp

đỡ của các chuyên gia hàng đầu của WHO, được tiến hành ở 4thành phố: Hà Nội, Hải Phòng, Đà Nẵng, Hồ Chí Minh Kết quả

tỷ lệ mắc bệnh ĐTĐ tại 4 thành phố ở đối tượng lứa tuổi 30

-64 tuổi là 4,9%, rối loạn dung nạp glucose máu là 5,9%, tỷ lệrối loạn glucose máu lúc đói là 2,8%, tỷ lệ đối tượng có yếu tốnguy cơ bệnh ĐTĐ là 38,5%, đáng lo ngại là trên 44% sốngười mắc bệnh ĐTĐ không được phát hiện và không đượchướng dẫn điều trị [21]

1.1.3 Sinh lý bệnh đái tháo đường type 2 [16]

Hiện nay cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ type 2 chưa thực sự rõ ràng Tuynhiên người ta nhận thấy đặc điểm nổi bật nhất trong ĐTĐ type 2 là những rốiloạn không đồng nhất biểu hiện bằng giảm nhạy cảm với insulin ở gan, cơvân, mô mỡ và sự suy chức năng tế bào beta

ĐTĐ type 2 không liên quan tới cơ chế tự miễn và hệ thống HLA (humanleucocyte antigen) Thay vào đó là tình trạng rối loạn tiết insulin, khánginsulin ở mô đích, tăng sản xuất đường ở gan và sự tham gia của các yếu tố cơđịa cũng như môi trường Ngoài ra trong cơ chế bệnh sinh của ĐTĐ type 2còn liên quan tới sự tương tác giữa yếu tố gen và yếu tố môi trường

Đa số bệnh nhân tình cờ phát hiện ĐTĐ khi đi thử máu (75%) và có tới50% mắc đái tháo đường 1 - 5 năm mà không có triệu chứng Cũng có nhiều

trường hợp bệnh nhân vào viện với các biến chứng nặng nề của đái tháođường như nhiễm trùng bàn chân, TBMMN, hôn mê TALTT,…

1.1.5 Triệu chứng cận lâm sàng [16]

 Đường huyết lúc đói > 126 mg/dl (hoặc > 7 mmol/l)

 Đường niệu dương tính

 HbA1c: HbA1c > 6,5%, HbA1c tăng (đường máu kiểm soát không tốt)

 Peptid C: Bình thường hoặc tăng

 Định lượng insulin máu: Bình thường hoặc tăng

 Kháng thể kháng tiểu đảo tụy: Âm tính

 Đường huyết 2 giờ sau uống 75 g glucose > 11,1 mmol/l (nghiệm pháptăng đường huyết)

 HbA1c > 6,5% bằng phương pháp sắc lỏng ký cao áp

1.1.7 Biến chứng

Đường huyết cao là yếu tố rất quan trọng đối với biến chứng của bệnhnhân ĐTĐ Có 4 cơ chế khác nhau phối hợp gây nên các biến chứng của ĐTĐ

[23] Thứ nhất, tăng AGEs (Advances glycation end products): Sự tăng

glucose máu kéo dài gây ra hiện tượng glycosyl hóa protein thông qua conđường không enzym Các sản phẩm chuyển hóa glycosyl hóa bậc cuối này lànhững tác nhân tiền viêm mạnh Nó gây biến đổi cấu trúc protein dẫn đếnbiến đổi chức năng tế bào, đồng thời kích thích gia tăng sản xuất các cytokin

và yếu tố tăng trưởng, làm xơ vữa mạch máu, giảm chức năng cầu thận, biếnđổi nội mạc mạch máu do giảm sản xuất nitric oxyde, thay đổi chất gian bào(HbA1c cũng là một AGEs, do glycosyl hoá hemoglobin, bình thường chiếm

< 6,5% tổng số hemoglobin, có vai trò quan trọng trong chẩn đoán sự ổn định

của glucose máu) Thứ hai, tăng sorbitol: Glucose nội bào chủ yếu được

chuyển hóa qua 2 con đường: Phosphoryl hóa và glycosyl hóa Tuy nhiên khinồng độ glucose quá cao sẽ có một phần chuyển thành sorbitol thông qua vaitrò của enzym aldose reductase Sự tăng nồng độ sorbitol nội bào làm tăng ápsuất thẩm thấu tế bào và tăng các gốc oxy hóa tự do, từ đó gây các biến đổi

chức năng tế bào Thứ ba, tăng diacylglycerol: Tăng glucose máu gây tăng

tổng hợp diacylglycerol, gây kích hoạt protein kinase C, từ đó gây thay đổiquá trình dịch mã tổng hợp fibronectin, collagen type IV, các protein co, cácprotein gian bào, đồng thời cũng ảnh hưởng đến chức năng nội mạc mạch

máu thông qua giảm nitric oxyde Thứ tư, tăng fructose–6-phosphate: Tăng

fructose–6- phosphate gây kích thích tăng sản xuất yếu tố tăng trưởng TGF β(transforming growth factor β) và PAI-1(plasminogen activator inhibitor-1).Các yếu tố tăng trưởng có vai trò quan trọng trong các biến chứng của ĐTĐ

Hình 1.1 Cơ chế bệnh sinh của bệnh ĐTĐ type 2 (Nguồn http://dmm.biologists.org/content/5/4/444)

(PKC: Protein kinase C; AGE: Advanced glycagon end production)

1.1.6.1 Biến chứng cấp tính [16]

a Hôn mê do nhiễm toan ceton

Hôn mê do nhiễm toan ceton là biến chứng cấp tính của ĐTĐ có nguy cơ

tử vong cao Nguyên nhân là do tăng các hormon gây tăng đường huyết vàthiếu hụt insulin làm giảm sản xuất glucose tại gan, giảm chuyển hóa glucose,tăng ly giải lipid, tăng tổng hợp thể ceton gây toan ceton Hậu quả cuối cùngdẫn tới tình trạng lợi niệu thẩm thấu gây ra tình trang mất nước và điện giải,toan chuyển hóa

b Hôn mê tăng áp lực thẩm thấu

Tăng đường máu

Con đường Polyol AGEs

Hoạt hóa PKC Nhiễm khuẩn

Oxy hóa

Hoạt hóa cytokines và yếu tố

tăng trưởng Rối loạn chức năng mạch máu và thần kinh

Bệnh thận ĐTĐ

Mất thị lực Tân tạo vi mạch Thiếu oxy võng mạc

Rối loạn chức năng thần kinh

Thẩm thấu thành mạch

Là biến chứng thường xảy ra ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 do tình trạngđường máu tăng rất cao kèm theo mất nước do lợi niệu thẩm thấu Khi ALTT

> 320 - 330 mOsm/l, nước sẽ bị kéo ra khỏi các neuron, gây ra tình trạng lúlẫn, hôn mê

c Hôn mê do nhiễm toan acid lactic

Xảy ra ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 lớn tuổi điều trị bằng biguanide, thường

có tổn thương suy tế bào gan, suy thận Biến chứng này ít gặp trên lâm sàng

d Hôn mê hạ đường huyết

Là biến chứng nguy hiểm gặp ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 điều trị bằngsulfonylureas Nếu bệnh nhân ĐTĐ có biến chứng thần kinh tự động làm mất đápứng tiết catecholamine có thể che giấu đi các triệu chứng của hạ đường huyết.1.1.6.2 Các biến chứng mạn tính [16]

Có 2 thể hay gặp là thể dưới vỏ và thể lão hóa

 Tăng nhãn áp: Xảy ra ở 6% bệnh nhân ĐTĐ, thường là tăng nhãn ápgóc mở, tăng nhãn áp góc đóng ít gặp, gặp trong trường hợp có tân mạch ởmống mắt

b Biến chứng thận

Cơ chế tổn thương thận trong bệnh ĐTĐ phức tạp, có sự tham gia của rấtnhiều yếu tố, trong đó hai yếu tố quan trọng là tăng glucose máu mạn tính vàvấn đề huyết động của thận (tăng áp lực cầu thận) đóng vai trò chính gây nênmột loạt biến đổi trong cấu trúc thận, ngoài ra có thể chịu ảnh hưởng mạnhbởi yếu tố gen

Con đường huyết độngCon đường chuyển hóa

Hình 1.2 Cơ chế sinh lý bệnh trong bệnh thận ĐTĐ [24]

(AGE: Advanced glycation end products; PCK: Protein kinase C; IL: Interleukin; RAAS: Renin– angiotensin–aldosterone system; ROS: Reactive oxygen species; TGF - β: Transforming growth factor beta;

TNF - α: tumor necrosis factor alpha; VEGF: Vascular endothelial growth factor)

 Bệnh cầu thận ĐTĐ: Nguyên nhân do dày màng đáy mao mạch cầu thận

và lắng đọng glycoprotein ở trung mạc Có 3 dạng tổn thương cầu thận đó là xơhóa ổ hoặc lan tỏa hoặc phối hợp cả hai Bệnh tiến triển qua các giai đoạn:

 Giai đoạn 1: Im lặng, tăng mức lọc cầu thận

 Giai đoạn 2: Albumin niệu vi thể 30 - 300 mg/ngày

 Giai đoạn 3: Albumin niệu đại thể > 500 mg/ngày, có thể kèm theo HCTH

 Giai đoạn 4 : Suy thận tiến triển giai đoạn cuối

c Các biến chứng thận khác

 Viêm hoại tử đài bể thận: Ít gặp Biểu hiện gồm: Sốt, đau thắt lưng, đái mủ

Tăng áp lực lọc RAAS

VEGF TGF - β Endothelin

Tăng glucose máu mạn tính

AGE

PKC

Con đường Polyo

Sản phẩm oxy hóa

Thay đổi tín hiệu phân tử và tăng oxy gen hoạt hóa (ROS)

Hoạt hóa các yếu tố tăng trưởng và cytokines

(TGF - β, VEGF, IL - 1, IL - 18, TNF – α))

Tích lũy chất nền gian mạch Dày màng đáy cầu thận

Xơ hóa cầu thận Tổn thương tổ chức ống kẽ thận Tổn thương mạch thận

Bệnh thận ĐTĐ

 Tổn thương thận mất bù sau khi tiêm thuốc cản quang trong chụp đườngtiết niệu, chụp mạch, nong động mạch vành có thể gây suy thận cấp.

d Bệnh lý mạch máu lớn

Biểu hiện xơ vữa nhiều mạch máu lớn: Thiếu máu cơ tim im lặng, nhồimáu cơ tim (50% tử vong), viêm tắc động mạch chi dưới gây hoại tử khô,viêm xương, tắc mạch bàn chân, cẳng chân, phải cắt cụt chi, TBMMN, tắcmạch thận, THA, suy thận Xơ vữa động mạch sớm lan rộng ảnh hưởng đếncác mạch máu

f Biến chứng xương và khớp

 Bệnh lý bàn tay ở người ĐTĐ trẻ tuổi: Tay cứng dần do co kéo da ởtrên khớp Nguyên nhân do biến đổi các collagen và các protein khác ở môliên kết

 Gãy Dupuytren: Cân ở gan tay dày thành nốt, gây biến dạng như vuốt thú

 Mất chất khoáng xương

g Bàn chân người ĐTĐ

Bệnh lý bàn chân ĐTĐ là biến chứng hay gặp và là nguyên nhân dẫn tớicắt cụt chi và tử vong cao ở người ĐTĐ Trong bệnh lý bàn chân vai trò củabiến chứng thần kinh ngoại vi, bệnh lý mạch máu ngoại vi và nhiễm trùngluôn gắn bó mật thiết với nhau Tổn thương bàn chân bắt đầu ở những ngónchân, ô mô bị mất cảm giác, đặc biệt những nơi ngón bị biến dạng và hoặcthiếu máu Những ngón chân dễ bị chấn thương, dễ hình thành cục chai, ổloét, nhiễm trùng và hoại tử Tổn thương thần kinh gây giảm tiết mồ hôi vàkhô da, làm da người bệnh dễ nứt nẻ, loét và hoại tử

h Các biến chứng nhiễm khuẩn

Biến chứng này rất hay gặp, bệnh nhân thường mắc các bệnh như: Lao,nhiễm khuẩn tiết niệu dai dẳng và tái phát nhiều lần, viêm thận bể thận ngượcdòng và suy thận Nhiễm trùng da và niêm mạc: Nhọt tụ cầu vàng, viêm âm hộ,viêm bao quy đầu, đôi khi chính nhiễm trùng này làm khởi phát ĐTĐ có sẵn

1.1.8 Điều trị

 Chế độ ăn: Thực hiện chế độ ăn hợp lý, cân đối giữa các thành phầnglucid (chiếm 50 - 60%), protid (chiếm 15 - 20%), lipid (chiếm 20 - 30%).Nên chọn loại thực phẩm có chỉ số tăng đường huyết thấp nhiều chất xơ,kiêng đồ ăn ngọt Chế độ ăn không những kiểm soát glucose máu mà cònngăn ngừa các biến chứng [26]

 Hoạt động thể lực: Tối thiểu 30 phút/ngày, 5 ngày/tuần lưu ý đườnghuyết, huyết áp trước tập Các loại hình luyện tập như đi bộ, bơi lội, cầu lông,leo cầu thang, Hoạt động thể lực thường xuyên hàng ngày, việc giảm 5%trọng lượng cơ thể làm giảm 55% tỷ lệ mắc ĐTĐ trên nhóm đối tượng nguy

tăng nhạy cảm insuline ở ngoại vi, giảm đề kháng insuline (metformin,thiazolidinedione), nhóm ức chế enzym alpha glucosidase (acarbose), nhómglinid, Thầy thuốc phải nắm vững cách sử dụng các thuốc hạ glucose máubằng đường uống, sử dụng insulin, cách phối hợp thuốc trong điều trị vànhững lưu ý đặc biệt về tình trạng người bệnh khi điều trị bệnh ĐTĐ [3].

- Điều trị yếu tố nguy cơ: THA, rối loạn lipid, các biến chứng,

1.1.2 Gen MTHFR

1.1.1 Tổng quan gen MTHFR

Methylene tetrahydrofolate reductase (MTHFR; EC 1.5.1.20) là một trongnhững enzyme quan trọng nhất chu trình chuyển hóa folate MTHFR liênquan tới việc chuyển 5,10 - methylene tetrahydrofolate (CH2THF) thành 5 -methyl tetrahydorfolate (CH3THF), con đường này xúc tác việc loại bỏ gốcmethyl của homocysteine để tạo thành methionine Sau đó, cơ thể sử dụngmethionine để tạo ra protein và các sản phẩm quan trọng khác Ngoài ra, nócũng ảnh hưởng tới gốc methyl của acid nucleic, các hoormon, các chất dẫntruyền thần kinh, cũng như việc tổng hơp purin và pyrimidine

MTHFR là phân tử protein có khối lượng phân tử 150 kDa bao gồm 656 aa.Gen MTHFR nằm trên nhánh ngắn p của NST số 1 (1p36.3) Gen MTHFR bắtđầu từ cặp base 1944 và kết thúc ở cặp base 27374, tổng cộng có 25431 cặpbase, bao gồm 11 exons và 11 introns [28] Gen MTHFR còn được biết đếnvới các tên gọi khác như: 5,10 - methylene tetrahydrofolate reductase,methylene tetrahydrofolate reductase, MTHFR_HUMAN

Hình 1.3 Vị trí gen MTHFR

(Nguồn: https://ghr.nlm.nih.gov/gene/MTHFR)

1.1.2 Vai trò của gen MTHFR

MTHFR tham gia vào quá trình chuyển hóa của acid folic, xúc tác sựhình thành của 5 - methylene tetrahydrofolate từ 5,10 - methylenetetrahydrofolate Đa hình gen MTHFR C677T sẽ làm giảm hoạt tính củaenzyme MTHFR, với những người mang gen MTHFR C677T ở dạng đồnghợp tử (MTHFR 677TT) thì enzyme hoạt động ít hơn 70% so với bình thườngcòn ở dạng dị hợp tử (MTHFR 677CT) là 30 - 40% [29], [30] Rất nhiềunghiên cứu đã chỉ ra rằng người mang gen MTHFR C677T có yếu tố nguy cơcủa nhiều bệnh lý như tim mạch, đột quỵ, tăng huyết áp, tiền sản giật, tăngnhãn áp, rối loạn tâm thần, và một số loại ung thư Nguyên nhân được cho làgen MTHFR C677T làm thay đổi hoặc giảm hoạt động của enzymemethylene tetrahydrofolate reductase, dẫn đến sự gia tăng Hcy trong máu

Hình 1.4 Vai trò của MTHFR trong chu trình chuyển hóa acid folic (Nguồn: http://drfairchild.blogspot.com/2013/08/homocysteine.html)

Khi Hcy máu tăng, Hcy nhanh chóng bị oxy hóa tạo thành hỗn hợpdisulfides và Hcy thiolactone, đồng thời sinh ra các gốc oxy hóa superoxide

và hydrogen peroxide, gây tổn thương màng tế bào nội mô, gián tiếp thôngqua hydrogen peroxide do làm bộc lộ cấu trúc phía dưới và tế bào cơ trơn,thúc đẩy quá trình tăng sinh và hoạt hóa tiểu cầu, bạch cầu [31], [32] Đồngthời khi đó quá trình tự oxy hóa Hcy tạo ra những dạng oxygen độc tế bàokhác bao gồm gốc anion superoxide và gốc hydroxyl Superoxide khởi đầucho sự oxy hóa lipid, quá trình này xảy ra ở màng bào tương tế bào nội mô vàphân tử lipoprotein trọng lượng phân tử thấp Ngoài ra Hcy làm thay đổi quátrình đông máu thông qua tăng cường hoạt động của yếu tố V, XII và ức chế

hoạt động của protein C, ức chế thrombomodulin, cũng như hoạt tính củaheparin sulfat, từ đó thúc đẩy quá trình hình thành cục máu đông [33], [29],[30], [34], [35] Như vậy sự giảm hoạt tính enzyme MTHFR do gen MTHFRC677T ảnh hưởng tới quá trình chuyển hóa acid folic và dẫn tới nhiều tìnhtrạng bệnh lý Tuy nhiên, vẫn còn nhiều yếu tố về di truyền và môi trường tácđộng vào bệnh lý nói trên [36], [37], [38].

Hình 1.5 Cơ chế bệnh sinh của tăng nồng độ Hcy (https://www.intechopen.com/source/html/39114/media/image21.png)

1.2.3 Đa hình gen MTHFR C677T

Một số người có nồng độ Hcy cao do trong chế độ ăn của họ thiếuvitamin B12 và acid folic Nồng độ Hcy cao cũng thấy ở người mắc bệnhthận, suy giảm hormon tuyến giáp, bệnh vảy nến hoặc dùng một số thuốc nhưthuốc chống động kinh hay methotrexate Ngoài ra cũng khá phổ biến là tìnhtrạng mang gen đột biến được gọi là MTHFR, đột biến gen này cũng dẫn đếntình trạng tăng Hcy máu Có khoảng 50 kiểu đột biến gen MTHFR đã đượctìm thấy trong đó hay gặp kiểu gen MTHFR C677T và MTHFR A1298C, cảhai đều làm giảm hoạt tính của MTHFR và dẫn tới tăng Hcy máu Trong

NOS

ADMA HcyS-NO

Homocysteine

Giảm sinh NO

Tổn thương tế bào

Giáng hóa Nitric oxyde

nghiên cứu này, chúng tôi chỉ quan tâm tới đa hình gen MTHFR C677T, C(cytosine) biến đổi thành T (thymine) ở vị trí nucleotid số 677 làm biến đổivaline thành alanine Từ đó hình thành nên các kiểu gen 677CC, 677CT và677TT Những người mang gen MTHFR ở dạng đồng hợp tử 677TT thìenzyme hoạt động ít hơn 70% so với bình thường, còn ở dạng dị hợp tử677CT là 30 - 40% [29], [30].

Nghiên cứu của Ozmen, Xianhui Qin, Emoto M, Tessari P chỉ ra rằngnhững người mắc ĐTĐ có nồng độ Hcy máu cao hơn những người khôngmắc ĐTĐ [39], [40], [41], [42] Theo tác giả Han Wang, Cong Hu và Shu -Hui Xiao nồng độ Hcy máu ở người Trung Quốc mang gen MTHFR 677CC

là 11,3 µmol/l, MTHFR 677CT là 12,1 µmol/l, còn MTHFR 677TT là 12,5µmol/l [43] Theo Santosh Kumar Gupta thì có sự khác biệt về nồng độ Hcygiữa người mang gen MTHFR 677CC (17,38 ± 8,01 µmol/l) với người manggen MTHFR 677TT (30,4 ± 15,7 µmol/l) ở nhóm người khỏe mạnh cũng như

ở nhóm có nguy cơ mắc bệnh lý động mạch cảnh (21,67 ± 10,84 µmol/l với45,53 ± 14,71 µmol/l) (p<0,001) [44] Các kết quả của các tác giả Karin J,Nair KG, Micheal S, Thögersen AM, Pinto X cũng kết luận rằng những ngườimang kiểu gen MTHFR 677CT và MTHFR 677TT có nồng độ Hcy máu caohơn so với những người mang kiểu gen MTHFR 677CC [45], [46], [47], [48],[49] Bên cạnh sự gia tăng nồng độ Hcy máu, rất nhiều nghiên cứu cũng chỉ rarằng ở những người mang gen MTHFR 677CT có giảm nồng độ vitamin B12

và acid folic so với người mang gen MTHFR 677CC [50]

Bảng 1.1 Nồng độ Hcy, acid folic, vitamin B12 với đa hình gen MTHFR [51]

Bảng 1.2 Vị trí và các kiểu đột biến gen MTHFR

Kiểu đột biến Bộ ba biến đổi Vị trí Tác giả

IVS2+533G→A n/a (intronic) Intron 2 Rosenberg N et al [53]

IVS6+31T→C n/a (intronic) Intron 6 Goyette P et al [56]

IVS10+262C→G n/a (intronic) Intron 10 Linnebank M et al [52]

(Nguồn: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK6561/table/A52375)Tần số của alen T gen MTHFR C677T thay đổi đáng kể tùy theo từng dântộc và địa lý Tần số cao nhất được tìm thấy ở những người gốc Tây Ban Nha,Colombia và Brazil Ngược lại, ở quần thể người da đen, ít hơn 5% ngườimang alen T [60]

Bảng 1.3 Bảng tần số đa hình gen MTHFR trên thế giới

Quốc gia N

Gen

Alen T (%) Tác giả

ĐTĐ type 2 là bệnh lý phức tạp do nhiều yếu tố và nhiều gen gây nên, làvấn đề sức khỏe lớn trên toàn thế giới Bệnh nhân mắc ĐTĐ tăng nguy cơ timmạch từ 2 - 6 lần so với bệnh nhân không mắc ĐTĐ [2].

MTHFR tham gia vào quá trình chuyển hóa của acid folic, nó xúc tác sựhình thành của 5 - methyl tetrahydrofolate từ 5,10 - methylenetetrahydrofolat 5 -methyl tetrahydrofolat xúc tác cho chu trình chuyển hóa từhomocystein thành methyonine Do đó, khi gen MTHFR bị đột biến sẽ làmtăng nồng độ Hcy trong huyết tương bệnh nhân Từ đó:

 Thúc đẩy tăng sinh tế bào cơ trơn mạch máu, ức chế phát triển tế bàonội mạc

 Rối loạn chức năng mạch máu do giảm đáp ứng vận mạch cũng nhưgiảm đáp ứng của thrombomodulin ở động mạch chủ

 Ức chế tác dụng của heparin, ức chế phóng thích NO (nitro oxyde) vàprostacyclin, gia tăng tổng hợp fibrinogen, gia tăng sự hoạt hóa yếu tố X, V

và kéo dài quá trình sống của tiểu cầu

Hình 1.6 Cơ chế hình thành huyết khối do ảnh hưởng gen MTHFR

(Nguồn: http://drjockers.com/homocysteine-levels)Những người mang gen MTHFR C677T có hoạt tính enzyme MTHFRgiảm do đó dẫn tới gia tăng nồng độ Hcy Khi nồng độ Hcy tăng, Hcy sẽchuyển hóa tạo thành cysteine dưới tác dụng của cystathionine β - synthase vàcystathionine γ - lyase từ đó sinh ra phân tử H2S

Tổn thương

thành động

mạch

Tế bào miễn dịch

Vết thương

Tổn thương tế bào nội mạc

Hình 1.7 Con đường chuyển hóa phụ homocystein (Nguồn http://www.mdpi.com/1422-0067/16/6/12560/htm)

H2S tăng làm tăng sản xuất glucose thông qua hoạt hóaphosphoenolpyruvate carboxykinase và ức chế protein kinase B H2S cũng ứcchế AMP - activated protein kinase do đó làm tăng nồng độ glucose máu, cóthể dẫn tới kháng insulin ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 Như vậy với việc làm tăngnồng độ glucose máu mạn tính ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 sẽ làm làm gia tăngcác biến chứng của ĐTĐ

CBS: cystathionine β - synthase CSE: cystathionine γ - lyase GHS: glutathione

Hình 1.8 Tác dụng H 2 S lên chuyển hóa glucose

so với người mang gen MTHFR 677CC [65] Trong nghiên cứu của mình,Boyi Yang và cộng sự đã kết luận có mối liên quan giữa đa hình gen MTHFRC677T với tình trạng cao huyết áp (OR = 1,86, 95%CI = 1,22 - 2,82), cũng nhưtăng triglyceride (OR = 1,61, 95%CI = 1,06 - 2,46) [66] Cùng quan điểm đó,Nevin llhan chỉ ra mối liên quan giữa đa hình gen MTHFR C677T với THA và

Sản xuất glucose

tăng giảm

ức chế

Kháng insuline

Dung nạp glucose Sản xuất

glucose Insulin bình

thường

bệnh lý về tim mạch [67] R F Franco khi nghiên cứu trên 337 đối tượng trong

đó có 186 nam và 151 nữ đã kết luận rằng đa hình gen MTHFR C677T làm giatăng yếu tố nguy cơ của xơ vữa mạch và huyết khối tĩnh mạch [68]

Theo Santosh Kumar Gupta khi nghiên cứu trên 199 đối tượng dưới 45 tuổisống tại New Delhi từ năm 2005 đến năm 2008 chỉ ra rằng gen MTHFR 677CTlàm tăng các chỉ số cholesterol, LDL - C, triglycerid hơn so với nhóm mang genMTHFR 677CC (95 %CI = 1,27 - 2,94) [69] Còn theo Frosst P và cộng sự thìgen MTHFR là yếu tố nguy cơ quan trọng của bệnh lý mạch máu [70]

Khi nghiên cứu trên 156 bệnh nhân đái tháo đường type 2, Makiko Maeda

đã chỉ ra tần số mang gen MTHFR 677CT là 40%, đồng thời cũng xác địnhmối liên quan giữa đa hình gen MTHFR C677T với các chỉ số lâm sàng vàcận lâm sàng như tuổi, giới, BMI, HbA1C, glucose máu, HDL - C (highdensity lipoprotein cholesterol), LDL - C, cholesterol, triglycerid, vàcreatinin Ngoài ra Maeda còn nhận thấy rằng tỷ lệ gen MTHFR 677TT ởbệnh nhân có biến chứng võng mạc do đái tháo đường cao hơn các kiểu gencòn lại [71]

Nghiên cứu của Vlad Shpichinetsky kết luận rằng đa hình gen MTHFRC677T có mối liên quan với sự phát triển của bênh thận ở bệnh nhân đái tháođường [72]

1.2.5 Một số phương pháp giảm Hcy máu

Hcy máu tăng sẽ làm gia tăng biến chứng ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 Do

đó việc kiểm soát nồng độ Hcy máu rất quan trọng ở những bệnh nhân này.Hcy được chuyển hóa thành methionine thông qua xúc tác của 5 - methyltetrahydrofolat và coenzyme vitamin B12 Vì vậy để làm giảm nồng độ Hcymáu người ta cần bổ sung vitamin B12, acid folic hoặc folate cho những bệnhnhân này Acid folic là chất tổng hợp và không có trong tự nhiên Khi bổ sungacid folic, acid folic nhanh chóng chuyển thành dihydrofolate (DHF) rồi tetra

hydrofolate (THF) dưới tác dụng của enzyme dihydrofolate reductase(DHFR) Nhờ enzyme methylene tetrahydrofolate dehydrogenase 1 (MHFD1),THF lại chuyển thành 5,10 - methylene tetrahydrofolate (5,10 - MTHF) 5,10

- MTHF chuyển thành 5 - MTHF thông qua tác dụng enzyme MTHFR Chính

5 - MTHF xúc tác cho quá trình chuyển hóa Hcy thành methionine Do đólàm giảm nồng độ Hcy máu [73], [74] Quá trình trên chỉ được diễn ra khihoạt tính enzyme MTHFR bình thường Bệnh nhân ĐTĐ mang gen MTHFR677CT hoạt tính enzyme MTHFR giảm 30% - 40%, bệnh nhân mang genMTHFR 677TT hoạt tính enzyme giảm 70% [9], [10] Khi bổ sung acid foliccho những bệnh nhân này sẽ làm ứ đọng 5,10 - MTHF do hoạt tính enzymeMTHFR giảm nên 5,10 - MTHF không chuyển hóa thành 5-MTHF Không có

sự xúc tác 5 - MTHF, Hcy không chuyển hóa thành methionine nên khônglàm giảm nồng độ Hcy máu Với lý do trên những bệnh nhân mang kiểu genMTHFR 677CT và 677TT nói riêng và bệnh nhân có hoạt tính menMTHFR giảm nói chung, chúng ta nên bổ sung folate hoặc 5 - MTHF thay

vì acid folic Khi đó folate sẽ chuyển hóa theo 3 con đường thành DHF,5,10 - MTHF và 5 - MTHF 5 - MTHF sinh ra sẽ chuyển hóa Hcy thànhmethionine, từ đó làm giảm nồng độ Hcy máu [73] Như vậy, với bệnhnhân mang gen MTHFR 677CC, chúng ta có thể bổ sung acid folic hoặcfolate nhưng với những bệnh nhân mang gen MTHFR 677CT và 677TT thìchỉ được bổ sung folate hoặc 5 - MTHF

Hình 1.9 Quá trình chuyển hóa acid folic và folate

(Nguồn:

https://www.dietvsdisease.org/wp-content/uploads/2016/10/Folic-Acid-vs-Folate-Metabolism-and-Methylation-1.png)

Từ nguyên nhân trên, để giảm nồng độ Hcy máu, theo khuyến cáo FameHospital Kanpur, Ấn Độ, cần bổ sung vitamin B12 (methylcobalamin) và 5 -methyl tetrahydrofolate cho bệnh nhân có nồng độ Hcy máu cao để tăngcường chuyển hóa Hcy thành methionine, từ đó làm giảm nồng độ Hcy máu.Trên thế giới, các hãng dược phẩm đã sản xuất ra rất nhiều loại thuốc có tácdụng giảm Hcy máu như Thorne 5 - MTHF 5mg, L - methylfolate 15mg,Methyl pro,…

Hình 1.10 Quá trình chuyển hóa Hcy (Nguồn https://en.paperblog.com/the-problem-with-folic-acid-supplements-

2, ngoài chế độ ăn cho người tiểu đường thì nên bổ sung những loại thựcphẩm trên để giúp làm giảm nồng độ Hcy máu

Bảng 1.4 Hàm lượng folate trong 100 gam phần ăn được của một số thực phẩm

Hàm lượng folate

(µg)

(Nguồn: Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam – Viện dinh dưỡng)

1.1.3 Các phương pháp phân tích đột biến gen MTHFR

Với sự phát triển của sinh học phân tử, hiện nay có rất nhiều kỹ thuật

để xác định kiểu gen Một số kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong nghiêncứu như kỹ thuật ARMS - PCR (amplification refractory mutation system -PCR: Hệ thống khuếch đại đột biến chịu nhiệt), ASP - PCR (Allelen specific -PCR: Phản ứng khuếch đại chuỗi đặc hiệu alen), real - time multiplex PCR,Sequencing (giải trình tự gen trực tiếp) Trong đó, ARMS - PCR là phươngpháp có độ nhạy cao, kỹ thuật đơn giản và giá thành rẻ, được áp dụng rộng rãitrong các labo sinh học phân tử ở Việt Nam Bởi vậy, trong phạm vi của đềtài, tôi xin trình bày những nét chính của kỹ thuật ARMS - PCR, là kỹ thuậtliên quan đến việc xác định kiểu gen MTHFR trong nghiên cứu này Ngoài ra

độ tin cậy của kỹ thuật này được kiểm chứng bằng giải trình tự gen Về cơbản, kỹ thuật ARMS - PCR được tiến hành dựa trên cơ sở khuếch đại đoạngen nghi ngờ mang đột biến bằng kỹ thuật PCR

1.3.1 Kỹ thuật PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Karry Millus đưa

ra vào năm 1985 và được Saiki hoàn thiện vào năm 1988, kể từ đó tạo nên

một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới PCR làphương pháp vitro sử dụng các cặp mồi để tổng hợp số lượng lớn các bản sao

từ một trình tự DNA đích dựa trên hoạt động của enzyme polymerase.Phương pháp PCR được thực hiện trong một ống nghiệm nhỏ chứa dung dịchphản ứng (gọi là PCR mix), có thể tích vào khoảng 10 µl - 50 µl với các thànhphần chủ yếu là: (1) enzyme polymerase chịu nhiệt, thường dùng Taqpolymerase, có hoạt tính tối đa ở 72oC và bền với nhiệt độ; (2) 4 loạideoxyribonucleotide (dNTP) là adenine, guanine, thymine và cytosine (dATP,dGTP, dTTP, dCTP); (3) DNA chứa các đoạn DNA đích sẽ được nhân bảntrong ống phản ứng; (4) các đoạn mồi (primer) xuôi và ngược là các đoạnoligonucleotide có chiều dài khoảng 20 - 30 nucleotide có trình tự bổ sungmột cách đặc hiệu với trình tự của hai đầu đoạn DNA sẽ được nhân bản; (5)ion Magie (Mg2+) trong muối MgCl2 ở nồng độ thích hợp; (6) dung dịch đệmTris - KCl để làm dung môi cho phản ứng Khi ống nghiệm phản ứng nàyđược cho vào buồng ủ nhiệt của máy luân nhiệt (máy PCR), chương trìnhnhiệt độ trong máy sẽ làm cho nhiệt độ trong buồng ủ nhiệt thay đổi theo chu

kỳ, nhờ vậy mà phản ứng PCR sẽ xảy ra

Về nguyên tắc, phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau,mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn:

- Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation): Đầu tiên nhiệt độ sẽ

được đưa lên 94oC, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của mạch đôi DNA sẽ bịmất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn

- Giai đoạn 2: Giai đoạn bắt cặp (annealing) Nhiệt độ được hạ đến

55oC - 65oC, là nhiệt độ thích hợp để các các đoạn mồi tìm đến và bắt cặp bổsung vào hai đầu của đoạn DNA đích

- Giai đoạn 3: Giai đoạn tổng hợp hay kéo dài (extension) Nhiệt độ

được tăng lên 72oC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính enzyme Taq

polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’của sợi DNA đích Từ đó bắt nguồn cho sự tổng hợp mạch bổ sung.

Sau mỗi chu kỳ, các chuỗi DNA mới tạo thành sẽ tiếp tục được dùng đểlàm các DNA khuôn cho sự tổng hợp các DNA mới trong chu kỳ tiếp theo.Sản phẩm cuối của phản ứng PCR là đoạn DNA chuỗi đôi, có chiều dài bằngkhoảng cách giữa hai đoạn gen mồi, và hai đầu tận cùng của sản phẩm đượcxác định bởi đầu tận cùng 5’ của hai đoạn gen mồi

Hình 1.11 Minh họa chu kỳ nhiệt trong phản ứng PCR

(Nguồn: http://s1050.photobucket.com/user/skysky246/media/hinh4.png.html)

Số lượng chu kỳ mỗi phản ứng PCR phụ thuộc vào số lượng khuôn DNAban đầu, thường không vượt quá 40 chu kỳ Sau mỗi chu kỳ sẽ làm tăng gấp đôilượng mẫu của lần trước Như vậy sau n chu kỳ, từ một DNA đích đã nhân bảnđược thành 2n bản sao Nhờ vậy đủ số lượng DNA để có thể tách ra khi điện di,phát hiện được sau khi nhuộm và để tạo dòng hoặc giải trình tự Trong quá trìnhthực hiện phản ứng PCR, ở những chu kỳ sau lượng khuôn tăng nhưng lượngmồi và dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) tự do giảm, enzym DNApolymerase hoạt động yếu dần Do đó, cần tính toán hàm lượng mồi, dNTP vàenzym để đảm bảo phản ứng PCR cho kết quả tốt nhất [76]

15 s

50s

72o C 30s

72o C

1 m

61oC

ARMS là một ứng dụng của PCR trong đó DNA được khuếch đại bằngcác alen mồi tương ứng đặc hiệu Trong PCR, sự không bắt cặp ở đầu 3’ củamồi có thể làm giảm đáng kể quá trình khuếch đại ARMS - PCR là phươngpháp rất hữu ích cho việc xác định các đột biến điểm Nó cũng là phươngpháp quan trọng để xác định sự thay đổi trong DNA là đồng hợp hay dị hợp.

Dị hợp tử hoặc đồng hợp tử được phân biệt bằng cách sử dụng ARMS mồicho alen đột biến (reverse mutation primer) và alen bình thường (reverse wildtype primer) Các phản ứng cho alen đột biến và các alen bình thường đượcthực hiện trong các ống riêng biệt Trong phương pháp này ống 1 chúng tôi sửdụng cặp mồi F (forward primer) và Rw (reverse wild type primer), ống 2 sửdụng cặp mồi F và Rm (reverse mutation primer)

Hình 1.12 Nguyên lý kỹ thuật ARMS - PCR

(Nguồn: https://www.picquery.com/c/amplification-refractory-mutation-system_9html)

Như vậy với cách thức thực hiện như trên chúng tôi nhận thấy rằng: Sựxuất hiện của sản phẩm đặc hiệu ở cả hai ống là kiểu gen dị hợp tử, nếu chỉxuất hiện ở ống thứ 1 là đồng hợp tử bình thường, nếu chỉ xuất hiện ở ống thứ

2 là đồng hợp tử đột biến