Lec 8 chuong 3 miRNA siRNA

Sinh học phân tử là khoa học nghiên cứu các hiện tượng sống ở mức độ phân tử. Phạm vi nghiên cứu của môn học này có phần trùng lặp với một số môn học khác trong sinh học đặc biệt là di truyền học và hóa sinh học. Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này. Hiện nay, sinh học phân tử và sinh học tế bào được xem là nền tảng quan trọng của công nghệ sinh học. Nhờ phát triển các công cụ cơ bản của sinh học phân tử như các enzyme cắt hạn chế, DNA ligase, các vector tạo dòng, lai phân tử, kỹ thuật PCR... sinh học phân tử ngày càng đạt nhiều thành tựu ứng dụng quan trọng.

hòa biểu hiện gene

miRNA: Thế hệ gene silencer mới

•  MicroRNAs (miRNAs): là những phân tử RNA có chiều dài 19-24 bp

•  Tham gia vào quá trình điều hòa quá trình dịch mã của mRNA

•  miRNA là thành viên của nhóm các RNA điều hòa bao gồm cả small interfering RNA (siRNA)

•  miRNAs điều hòa biểu hiện gene đích theo kiểu “downstream”, bao gồm các yếu tố điều hòa phiên mã, oncogene, và các gene ức chế ung thư

•  Người ta đã phát hiện được một số lượng rất lớn các miRNA Sự có mặt của các miRNA khác nhau ở các mô và ở các mô ung thư

Giới thiệu miRNA

•  miRNAs là những đoạn RNA sợi đơn, nhỏ, không mã

hóa (non-coding RNA) có chiều dài từ 19-24 nt

•  Gene mã hóa cho miRNA được phiên mã từ DNA nhưng không được dịch mã thành protein

•  miRNA được tạo thành từ các bản phiên mã ban đầu

(pri-miRNA) Các pri-miRNA tạo thành cấu trúc

“stem-loop” gọi là pre-miRNA Sau đó chuyển thành các

miRNA hoạt động

Giới thiệu miRNA

•  miRNA có khả năng tác động đến 1 hoặc nhiều mRNA

•  Có khoảng 1.000 miRNA ở genome người, và khoảng 30% gene người được điều hòa bởi miRNA

•  Đối với một số gene ở người, có hơn 1 miRNA liên quan đến

sự điều hòa hoạt động

•  Hơn 80% miRNA có tính đặc hiệu mô

•  miRNA làm “câm” gene đích bởi nhiều cơ chế khác nhau

miRNA ở động vật, thực vật ?

•  Ở thực vật miRNA bổ sung với mRNA đích gần như hoàn hảo với rất ít hoặc không có mismatch

•  Ở động vật đa bào, miRNA bổ sung không hoàn hảo và 1

miRNA có thể tác động đến nhiều vị trí trên cùng một phân tử mRNA hoặc trên nhiều mRNA khác nhau

•  Ở động vật đa bào, vị trí tấn công của miRNA là trong vùng đầu 3’ UTR của mRNA

•  Ở thực vật có thể vị trí tấn công ở 3’ UTR hoặc trong vùng CDS

•  Hầu hết các gene mã hóa microRNA nằm ở vùng intergenic

•  Gene mã hóa miRNA có promoter điều khiển cũng như các đơn vị điều hòa riêng

•  Khoảng 40% gene miRNA nằm trong vùng intron của các

gene mã hóa protein và gene không mã hóa protein

•  6% miRNA người có hiện tượng sửa chữa RNA “RNA editing”

à đa dạng miRNA

Nguồn gốc

•  Gene mã hóa cho miRNAs dài hơn nhiều so với phân tử

miRNA sau khi đã xử lý

•  Nhiều miRNA nằm ở trong intron của các phân tử pre-mRNA của tế bào chủ à cùng sử dụng chung các yếu tố điều hòa phiên mã, cùng mô hình biểu hiện (expression profile)

•  Các gene mã hóa cho các miRNA còn lại được phiên mã bởi các promoter riêng của chúng

Ứng dụng miRNA

•  Việc phát hiện các miRNA được xem như tín hiệu để phát

hiện ung thư và dự đoán những bệnh nguy hiểm

•  miRNAs đã được xem như là một công cụ điều trị dựa trên nguyên lý antisense, hoặc ức chế các oncogene hoặc ức chế các miRNA

•  Trong tương lai, dữ liệu phân tích bioinformatics về genome, proteome, transcriptome à tăng cường hiệu quả ứng dụng phân tử này

Sinh tổng hợp miRNA

•  miRNA được phiên mã bởi RNA pol II thành dạng tiền

miRNA (pri-miRNA), tiếp theo là các bước gắn mũ đầu 5’, polyadenin hóa 3’

•  pri-miRNA được xử lý bằng phức hợp “microprocessor

complex” chứa enzyme RNase III Drosha, RNA-binding protein, Pasha/DGCR8

double-stranded-•  Kết quả tạo ra các pre-miRNAs khoảng 70-nucleotides được gấp lại thành dạng cấu trúc stem-loop không hoàn hảo

Sinh tổng hợp miRNA

•  pre-miRNA à chuyển vào tế bào chất bởi phức hợp karyopherin exportin 5 (Exp5) và phức hợp Ran-GTP Ran (ras-related nuclear protein) là một phức hợp protein nhỏ gắn GTP (thuộc siêu họ RAS) cần thiết cho sự chuyển của RNA và proteins thông qua lỗ nhân

•  Ran GTPase gắn Exp5 tạo thành một phức hợp heterotrimer với pre-miRNAs pre-miRNAs trải qua một bước xử lý bổ sung bởi

enzyme RNAse III Dicer tạo ra miRNA là một RNA sợi kép khoảng

22 nt

•  Dicer cũng khởi đầu sự hình thành RNA-induced silencing

complex (RISC), RISC chịu trách nhiệm cho việc “câm” gene do sự biểu hiện của miRNA và RNAi

Gene mã hóa miRNA RNA pol II/III Phiên mã

Pri-miRNA

Pre-miRNA Drosha-DGCR8 Phân cắt

Nature Gene*cs 37, 1163 - 1165 (2005)

Lựa chọn 1 sợi trong dsRNA

Ago2 Phức hợp RISC

Guide strand

passenger strand, hoặc miRNA*

•  Khi Dicer cắt pre-miRNA stem-loop, 2 sợi RNA bổ sung ngắn được tạo thành, nhưng chỉ có 1 sợi “guid strand” kết hợp với phức hợp RISC Sợi còn lại “passenger strand “ bị phân giải

•  Việc lựa chọn sợi “guid strand” dựa vào sự ổn định của các đầu tận cùng của dsRNA

•  Sợi chứa các base có khả năng bắt cặp thấp (2-4 nt) ở đầu 5’ tận cùng của dsRNA sẽ được ưu tiên kết hợp với RISC và trở thành miRNA hoạt động

•  Sau khi kết hợp với phức hợp RISC, miRNA sẽ thể hiện chức năng điều hòa bằng cách gắn bổ sung không hoàn hảo với trong vùng 3' không được dịch mã (UTR) của mRNA đích

•  Sự hình thành sợi dsRNA (miRNA + mRNA) à ức chế dịch mã

Orthologs of RNAi Machinery

Component Mammals Drosophila C elegans Arabidopsis

Dicer Dicer (siRNA,

miRNA) Dcr-1 (siRNA, miRNA)

Dcr-2 (siRNA)

Dcr-1 (siRNA, miRNA) DCL1 (miRNA, siRNA) DCL2 (siRNA, virus)

DCL3 (siRNA, heterochroma<n) DCL4 (siRNA)

R2D2 TRBP (miRNA;

human) R2D2 (siRNA) Loqs (miRNA) RDE-4 HYL1 (miRNA)

Argonaute Ago1

Ago2 (endonuclease) Ago3

Ago4

Ago2 (siRNA) Ago1 (miRNA) RDE-1 (siRNA) ALG-1 and ALG-2

(miRNA)

AGO1 (miRNA, siRNA) AGO4 (heterochroma<n) (7 other Argonautes: AGO4– AGO9, ZLL/PNH)

h9p://www.ambion.com/techlib/resources/RNAi/overview/2.html

Dicer

•  Là một protein có KLPT khoảng 200 kDa, chứa nhiều domain:

ü ATPase/RNA helicase domain

ü Domain PAZ bảo thủ (cùng với Argonaute)

ü 2 domain xúc tác RNase III

ü Domain đầu C-terminal gắn với dsRNA (dsRBD)

Dicers

•  Là protein lớn (200 kDa) chứa enzyme ATPase/RNA helicase, có domain là DUF283 và PAZ có khả năng gắn với 2 nucleotide đầu 3’ nhô của miRNA và siRNA 2 domain xúc tác RNase III (RIIIa và RIIIb) và một domain ở đầu C-terminal gắn với RNA sợi kép

(dsRBD)

•  Mỗi RNase domain cắt độc lập 1 sợi RNA của phức hợp để tạo ra sản phẩm có 2-nt 3' nhô ra Ngoài việc cắt pre-miRNA thành

miRNA, enzyme Dicer xử lý dsRNA à siRNA

•  Sau khi Dicer phân cắt, con đường tiếp theo của miRNA và RNAi

là tương tự nhau ở động vật

•  Thế nào là siRNA (short interfering RNA)?

•  Thế nào là miRNA (microRNA)?

•  Sự khác nhau giữa siRNA và miRNA?

•  Thế nào là shRNA (short interfering hairpin RNA)?

•  Thế nào là RNAi (RNA interference)?

•  Sự khác nhau giữa siRNa và shRNA?

CÂU HỎI

siRNA, shRNA và miRNA

•  Khi phân tử RNA sợi kép (dsRNA) được đưa vào tế bào dưới dạng oligo gọi là siRNA

•  Khi phân tử này được đưa vào dưới dạng kẹp tóc (hairpin) gọi

là shRNA Như vậy shRNA cũng là một loại siRNA

•  Hairpin RNA được thạo thành trong quá trình phiên mã từ một plasmid ngoại lai và sau đó được xử lý bởi Drosha và Dicer và được đưa vào trong phức hợp RISC cũng được coi là siRNA

•  Khi phân tử RNA được phiên mã từ 1 NST và tạo thành 1 cấu trúc “stem loop” , được xử lý bởi Drosha và Dicer, sau đó được đưa vào RISC thì được gọi là miRNA

Sự khác biệt là do nguồn gốc RNA từ đâu

•  Phiên mã từ nguồn DNA nội sinh (endogenous DNA) à miRNA

•  Phiên mã từ nguồn RNA ngoại sinh (exogenous DNA) à siRNA

•  Việc đưa vào tế bào cấu trúc oligo dsRNA dạng kẹp tóc à siRNA

miRNA và siRNA

•  Cả miRNA và siRNA kiểm soát sự biểu hiện của nhiều gene

•  miRNA: sự điều khiển dựa vào việc lựa chọn tự nhiên

•  siRNA: tác động khó có thể tiên đoán trước

•  RNA nào cũng là RNA cho dù nguồn gốc từ đâu, nhưng các trình tự nội sinh liên quan tới các mối quan hệ với

transcriptome trong khi RNA ngoại sinh có thể tạo ra những tác động khó dự đoán

miRNA và siRNA

Khác biệt giữa siRNA và miRNA:

•  Tiền chất của siRNA là “long dsRNA”

•  Tiền chất của miRNA là dạng RNA hairpin

miRNA và siRNA

•  siRNAs thường được tổng hợp hóa học sau đó đưa vào

tế bào (21 nt dsRNA) siRNA bắt cặp hoàn toàn với gene đích

•  miRNAs có nguồn gốc nội sinh, trải qua quá trình xử lý tạo thành miRNA trưởng thành và gắn vào mRNA Tuy nhiên, mức độ bổ sung không phải 100% Vì vậy miRNA

có xu hướng làm giảm quá trình dịch mã của mRNA hơn

là phá hủy nó

shRNA

(short interfering hairpin RNA)

•  Tiền chất cho miRNA là các vùng bên trong một phân tử RNA tạo thành các cấu trúc hairpin

•  Khi cấu trúc hairpin bị phân cắt bởi drosha enzyme à cấu trúc không có “stem loop” với một đầu nhô ra

•  Dicer sẽ phân cắt tiếp theo, cấu trúc “loop” bị cắt bỏ tạo thành dsRNA dài 21 nt với các đầu nhô ra

•  Khi bị phân cắt bởi dicer, tập tính của chúng cũng giống như siRNA hoặc miRNA

•  Việc phân cắt mRNA hoặc ức chế sự dịch mã mRNA phụ thuộc vào mức độ tương đồng giữa đoạn oligo với mRNA đích

siRNA và shRNA

•  shRNA: sử dụng khi muốn knockdown gene

•  siRNA: phương pháp ưu tiên cho việc sàng lọc

•  Với shRNA người dùng cần phải có các thao tác phức tạp hơn siRNA:

ü  cloning

ü  xác nhận đoạn insert

ü  điều khiển mức độ biểu hiện shRNA trong tế bào

ü  tế bào có thể bị chết do một số gene bị knockdown

ü  khó khăn khi đưa vào tế bào

ü  Khó kiểm soát và hiểu quy luật với các trình tự có

cấu trúc loop

miRNA và siRNA

mRNA giữ lại hoặc bị phân giải mRNA bị phân giải

•  Khác với siRNA, miRNA có thể hướng RISC điều hòa giảm mức độ biểu hiện bằng các ức chế dịch mã hoặc hoạt động như siRNAs và tham gia vào quá trình cắt mRNA

•  Việc lựa chọn cơ chế cải biến sau phiên mã thường không được quyết định bởi nguồn gốc của RNA làm câm gene

(siRNA hay miRNA), nhưng quyết định bởi mức độ bổ sung Nếu miRNA bổ sung hoàn hảo hoặc gần như bổ sung hoàn toàn với gene đích, nó có thể phân cắt đặc hiệu mRNA

•  Các miRNA nội sinh (endogenously expressed miRNAs)

thường bắt cặp không hoàn hảo với gene đích à ức chế

bằng cách can thiệp vào quá trình dịch mã

miRNA và siRNA

miRNA-tham gia điều hòa quá trình biểu hiện gene ở Eukaryote

Cơ chế ức chế dịch mã của mRNA bởi miRNA