Lec 7 chuong 3 protein binding DNA

Sinh học phân tử là khoa học nghiên cứu các hiện tượng sống ở mức độ phân tử. Phạm vi nghiên cứu của môn học này có phần trùng lặp với một số môn học khác trong sinh học đặc biệt là di truyền học và hóa sinh học. Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này. Hiện nay, sinh học phân tử và sinh học tế bào được xem là nền tảng quan trọng của công nghệ sinh học. Nhờ phát triển các công cụ cơ bản của sinh học phân tử như các enzyme cắt hạn chế, DNA ligase, các vector tạo dòng, lai phân tử, kỹ thuật PCR... sinh học phân tử ngày càng đạt nhiều thành tựu ứng dụng quan trọng.

trong điều hòa biểu hiện gene

trong điều hòa biểu hiện gene

•  Khái niệm DNA-binding protein

•  Các protein điều hòa nhận dạng và tương tác với DNA

•  Helix-Turn-Helix Motif

•  Vai trò của Zinc finger

•  Vai trò của Leucine Zipper Motif

2

(1)   đoạn DNA ngắn trong vùng trình tự nhất định

(2)   các protein điều hòa gene (gene regulatory proteins) nhận ra và gắn với

các trình tự đó

•  lambda repressor được mã hóa bởi virus xâm

nhiễm vi khuẩn

•  Chất ức chế này tắt các gene mã hóa cho

protein của virus à genome virus nằm im lặng trong NST vi khuẩn, cùng sao chép với NST vi khuẩn khi điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng của vi khuẩn

4

•  Tắt các gene không cần thiết khi chưa cần

sử dụng

•  lac repressor, ức chế quá trình phiên mã

các gene trong operon lac khi lactose

vắng mặt trong môi trường

Ví dụ 2

6

Câu hỏi

•  Tại sao các protein repressor lại

có thể nhận ra vùng trình tự

nhất định trên phân tử DNA?

•  Thay đổi cấu trúc các phân tử

này à ảnh hưởng đến khả năng

tương tác với các vùng đó?

Xác định mô hình điều hòa biểu hiện gene?

•  Phân lập các dạng đột biến mà không thể tắt những bộ

gene nhất định

•  Nguyên nhân không thể tắt được là do thiếu một số

protein hoạt động như chất ức chế (repressor)

•  Do những protein ức chế thường có mặt với lượng rất

nhỏ à phân lập rất khó khăn

•  Khi đã phân lập à sử dụng kỹ thuật footprinting để phát

hiện các trình tự DNA có liên quan đến điều hòa biểu

•  Hiên nay cho rằng trình tự DNA chứa những thông tin cho phép các protein điều hòa có thể nhận ra mà không

•  Các protein điều hòa thường gắn vào rãnh

chính (major groove) trong cấu trúc DNA

(chứa 2 rãnh nhỏ và lớn)

•  Tùy thuộc vào trình tự DNA mà cấu trúc của vùng này khác nhau à protein có thể phân biệt mà không cần phải tháo xoắn DNA

Tương tác giữa protein điều hòa và DNA

10

Cấu trúc phân tử DNA

•  Những trình tự nucleotide đặc biệt, có chiều dài thường ngắn hơn 20 bp có chức năng như là vị trí gắn cho các

protein điều hòa

•  Hàng nghìn trình tự DNA đã được xác định, mỗi trình tự chứa các vùng khác nhau được nhận ra bởi các protein khác nhau

•  Một số protein bám với các trình tự này đã được xác định

Tương tác giữa protein điều hòa và DNA

Một số

proteins và trình tự DNA tương ứng

Các protein điều hòa chứa các cấu trúc motif

có khả năng nhận diện trình tự DNA

•  Nhận dạng phân tử dựa vào:

•  Tương tác bề mặt giữa các phân tử

•  Các liên kết hóa học tham gia: liên kết

hydrogen, ion, tương tác kị nước

•  Nhiều liên kết à tương tác ở mức độ tương

đối chặt à tương tác DNA và protein

Tương tác giữa DNA và Protein

16

Tương tác protein với rãnh lớn DNA

Chỉ một tương tác được minh hoạ Cụ thể, nội tương tác protein-DNA có thể chứa từ 10 đến 20

tương tác, bao gồm các amino acids, mỗi một sự đóng góp vào độ mạnh của phản ứng protein-DNA

•  Mỗi protein điều hòa nhận dạng 1 loại trình tự DNA

•  Các nghiên cứu x-ray crystallographic và NMR hàng

trăm protein à nhiều protein chứa 1 hoặc nhiều motif có khả năng gắn với DNA

•  Các motif thường có dạng xoắn α hoặc phiến β để gắn với rãnh lớn của DNA

•  Rãnh lớn chứa đủ thông tin để phân biệt giữa trình tự

DNA này và DNA khác

Tương tác giữa protein điều hòa và DNA

18

DNA binding protein

•  Các protein gắn DNA và liên quan đến quá trình sao chép hoặc phiên

mã đều phải nhận ra những trình tự đặc thù trên DNA

•  Có 3 đặc điểm chung với hầu hết các DNA binding protein:

•  Rãnh lớn (major groove) là vị trí găn của các protein thông qua xoắn alpha Kích thước của rãnh lớn: 12Å rộng và 8Å sâu Rãnh nhỏ (minor groove) của dạng B-DNA là 5Å rộng, 8Å sâu à quá hẹp để gắn với xoắn alpha nhưng lại được nhận ra bởi phiến beta của các protein gắn hộp TATA

•  Các trình tự protein gắn DNA thường không phá vỡ liên kết giữa 2 sợi DNA mà chúng làm thay đổi cấu hình của mạch liên kết

Các dạng protein gắn DNA

20

(prokaryote system)

•  Cấu tạo gồm 2 chuỗi xoắn α nối với nhau bởi một chuỗi ngắn amino acid kéo dài gọi là

“turn”

•  Hai chuỗi xoắn alpha được giữ cố định ở một góc nhờ vào tương tác giữa 2 chuỗi

22

•  Motif đầu tiên của các protein thuộc nhóm “DNA-binding

protein” được nhận dạng là “helix-turn-helix”

•  Hiện nay hàng trăm protein có dạng motif này đã được xác định ở cả prokaryote và eukaryote

•  Đầu C tận cùng của chuỗi xoắn helix được gọi là “recognition helix” do nó có khả năng gắn đặc hiệu với rãnh lớn của DNA

•  Các chuỗi bên amino acid của cấu trúc này khác nhau ở các protein khác nhau à vai trò quan trọng trong việc nhận diện

các trinh tự DNA đặc thù

Helix-turn-helix

Tất cả các protens bám vào DNA như dimers trong đó hai bản sao của

helix nhận biết (màu đỏ) được phân tách một cách chính xác bởi một vòng xoắn của DNA helix

Một helix khác của helix-turn-helix motif được đánh dấu màu xanh nhạt Lambda repressor và Cro proteins điều khiển biểu hiện gene của

bacteriophage lambda

Tryptophan repressor và catabolite activator protein (CAP) điều khiển biểu

hiện gene của nhiều gene vi khuẩn E coli

24

Trình tự DNA đặc thù được nhận ra bởi

•  Helix-turn-helix motif chỉ được cấu tạo bởi amino acids

•  Một nhóm thứ 2 của DNA-binding motif bổ sung thêm kẽm (Zn) vào trong cấu trúc Mặc dù tất cả các cấu trúc DNA-

binding motif có sự tham gia của kẽm đều được gọi là “zinc fingers”, mô tả này chỉ mang tính lịch sử khám phá ban đầu

•  Có nhiều cấu trúc khác nhau trong nhóm này

26

•  Nhóm 1: các protein hoạt hóa phiên mã

của các gene mã hóa rRNA ở eukaryote

•  Nhóm này chứa 1 α helix và 1 β sheet

được giữ với nhau bởi Zn để đảm bảo cho chuỗi α helix có thể tương tác với rãnh

chính của DNA

DNA-binding Zinc Finger Mo`fs

•  Nhóm 2: Một dạng cấu trúc gần giống với helix-turn-helix motif, trong đó 2 chuỗi xoắn α được kết nối lại với nhau với một nguyên tử Zn

•  Giống với helix-turn- helix proteins, những protein này thường tạo thành dimer cho phép 1 trong 2 chuỗi tương tác với rãnh chính của DNA

•  Mặc dù 2 cấu trúc zinc finger khác nhau nhưng chúng cùng có 2 đặc điểm: Có Zn và chuỗi xoắn α có khả năng nhận diện và gắn với rãnh lớn DNA 28

DNA-binding Zinc Finger Mo`fs

DNA-binding Zinc Finger Motifs

Một dạng của zinc finger protein Proteins này thuộc nhóm Cys-Cys-His-His

(A) Cấu trúc của một đoạn protein điều hoà biểu hiện gene ở chuột, bám vào vị trí đặc thù trên DNA Protein này nhận ra DNA bằng 3 zinc fingers

dạng Cys-Cys-His-His sắp xếp như đường hướng lặp lại

(B)  3 fingers có trình tự amino acid tương tự và tương tác với DNA với

cách thức tương tự nhau

Cả (A) và (B), nguyên tử Kẽm Zn++ của mỗi finger đều được biểu hiện

Leucine Zipper Motif

(Eukaryote transcription factor)

•  Một motif gọi là leucine zipper motif (tên gọi như vậy vì

2 xoắn α, mỗi cái là một monomer, được kết hợp với

nhau tạo thành "coiled-coil

•  2 xoắn alpha được giữ với nhau bởi tương tác kị nước bởi các chuỗi bên amino acid

•  Do sự dimer hóa, phần tương tác giữa 2 chuỗi xoắn

alpha tạo thành một cấu trúc dạng chữ Y, cho phép các chuỗi bên của chúng tiếp xúc với rãnh lớn của DNA

•  Phần dimer giữ chặt DNA sợi kép giống như khóa kéo 32

Leucine Zipper Mo`f

Tương tác với DNA

34

Các phương pháp xác định

protein binding DNA

Kỹ thuật thay đổi tính linh động trong gel

(gel mobility shift assay)

Dựa vào ảnh hưởng của một protein liên kết với các phân tử DNA đang di chuyển trong điện trường

36

Gel-Mobility Shift

•  DNA tích điện âm à di chuyền về cực âm à

tách riêng do khác nhau về kích thước

•  Các phân tử protein bám với một phân tử DNA

Sắc ký ái lực

có thể được nhận biết

40

A Chromatin

Immunoprecipitation