Lec 5 chuong 3 dieu hoa bieu hien gen eukaryote

Sinh học phân tử là khoa học nghiên cứu các hiện tượng sống ở mức độ phân tử. Phạm vi nghiên cứu của môn học này có phần trùng lặp với một số môn học khác trong sinh học đặc biệt là di truyền học và hóa sinh học. Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này. Hiện nay, sinh học phân tử và sinh học tế bào được xem là nền tảng quan trọng của công nghệ sinh học. Nhờ phát triển các công cụ cơ bản của sinh học phân tử như các enzyme cắt hạn chế, DNA ligase, các vector tạo dòng, lai phân tử, kỹ thuật PCR... sinh học phân tử ngày càng đạt nhiều thành tựu ứng dụng quan trọng.

Các cơ chế điều hòa biểu hiện

gene ở tế bào Eukaryote

Chương 2 (tiếp)

• Điều hoà biểu hiện gene &

• Điều hoà dịch mã

Câu hỏi

•  Gene là gì?

•  Tại sao một gene lại được biểu hiện?

•  Khi nào gene được biểu hiện?

•  Gene được biểu hiện ở mức độ nào?

•  Tế bào kiểm soát sự biểu hiện?

•  Tại sao những tế bào khác nhau lại có mô hình biểu hiện gene khác nhau?

•  Tại sao một gene được biểu hiện ở tế bào này

mà không phải tế bào khác?

4

Điều hòa biểu hiện gene

Gene

Sự biểu hiện và hoạt động của gene

Các quá trình điều hòa

RNA Protein

Các quá trình điều hòa

Sự phức tạp của quá trình điều hòa biểu hiện gene ở eukaryote

•  Các yếu tố tham gia điều hòa phiên mã

•  Điều hòa bởi chính trình tự DNA

•  Điều hòa bởi các yếu tố phiên mã

•  Điều hòa bởi các protein khác

6

Cấu trúc gene Eukaryote

• Exon 1 • Exon 2 • Exon 3 • Exon 4

• Intron 1 • Intron 2 • Intron 3

• Start codon • Stop codon

• Trình tự kết thúc phiên mã

So sánh phiên mã ở

Prokaryote và Eukaryote

8

So sánh phiên mã ở

Prokaryote và Eukaryote

So sánh phiên mã ở

Prokaryote và Eukaryote

10

•  Cấu trúc chromatin (Chromatin structure): histone, CpG methylation à

khả năng tiếp cận của RNA pol & TFs với gene

•  Epigenetic control: thay đổi các mô hình biểu hiện gene (không làm

thay đổi gene)

•  Transcriptional initiation: Phương thức điều hòa biểu hiện đặc thù của

Eukaryote với sự tham gia của rất nhiều yếu tố

•  Xử lý và cải biến sau phiên mã: (Transcription processing and

modification): cap, poly adenine hóa, alternative splicing, đặc hiệu mô

(tissue specific)

Điều hòa biểu hiện Eukaryote

12

•  Vận chuyển RNA (RNA transport): vận chuyển khỏi nhân để dịch mã trong tế bào chất

•  Sự ổn định của các bản phiên mã (Transcript stability): thời gian tồn tại của mRNA

•  Translation initiation: nhận dạng tín hiệu khởi đầu (AUG)

•  Small RNAs and control of transcript levels: non-coding RNA (khả năng dich mã mRNA, sự bền vững, cấu trúc chromatin)

•  Cải biến sau dịch mã (Post-translation modification): glycosylation, acetylation, fatty

acylation, disulfide bond formations,

•  Vận chuyển protein tới cơ quan đích (Protein transport)

•  Điều khiển sự bền vững của protein (Control of protein stability): Vùng trình tự

amino acid trong chuỗi à tính bền vững

Điều hòa biểu hiện Eukaryote

Điều hòa biểu hiện gene ở eukaryote:

Những điểm quan trọng

•  Các quá trình liên quan đến điều hòa biểu hiện: chuẩn bị phiên mã, phiên mã, xử lý sau phiên mã, mức độ ổn định mRNA, dịch mã

•  Cải biến histon à thay đổi cấu trúc chromatin

•  Tương tác giữa các yếu tố điều hòa phiên mã và RNA pol (cis-acting, trans-acting)

•  Hiện tượng splicing à nhiều polypeptide (kháng thể)

•  Mối liên hệ: promoter, enhance, silence

•  Các yếu tố khác: các tín hiệu hormone

•  Các yếu tố phiên mã có 2 domain, domain gắn DNA được phân chia dựa vào cấu trúc; zinc finger proteins, helix-turn-helix proteins, leucine

•   Điều hòa biểu hiện gene ở mức độ

cấu trúc nhiễm sắc thể

Nhiễm sắc chất (chromatin)

và sự điều hòa biểu hiện gene

•  Cấu trúc chromatin có 2 dạng (nhuộm màu): dị nhiễm sắc

(heterochromatin) và nhiễm sắc (euchromatin)

•  Heterochromatin xoắn chặt hơn euchromatin, thường nằm gần tâm động

•  Heterochromatin thường không được phiên mã, euchromatin xoắn lỏng

lẻo, thường diễn ra quá trình phiên mã

•  Kỹ thuật tế bào học à phát hiện vùng hoạt động của NST à Cấu trúc

chromatin liên quan đến hoạt động gene

•  Các cơ chế: Methyl hóa các gốc cytidine trong DNA (> 90% tồn tại ở cặp

CG hay CpG), trình tự promoter thường giàu CpGs từ 10 đến 20 lần so với phần còn lại của genome

16

A.  2 giai đoạn hoạt hóa cụm gene globin Giai đoạn 1: cấu trúc chromatin bị cải biến, giảm mức

độ xoắn à lỏng lẻo hơn

B Giai đoạn 2: các protein điều hòa có mặt gắn vào những

vị trí đã được cải biến

18

Chức năng của vùng điều khiển locus và sự hoạt hóa chromatin

A.  Di chuyển của gene ADE2 gần

telomer à không biểu hiên à sắc tố

đỏ

Trong một colony xuất hiện một số có sắc tố trắng do ADE2 được hoạt hóa một cách ngẫu nhiên

B.  Dạng wildtype có mắt đỏ, dạng đột biến mắt trắng Hiện tượng này là do vận chuyển một phần NST vùng

heterochromatin

20

Rett syndrome thường gặp ở nữ

•  Rối loạn phát triển thần kính

•  Chậm chạp,

•  Trí tuệ chậm phát triển

•  Giảm khả năng nói, diễn đạt

Điều hòa biểu hiện gene ở mức độ

phiên mã

Transcription factors (TF)

Các yếu tố và thứ tự

tham gia của chúng

Đặc điểm

1 TFIID Gắn với trình tự TATA (TA box)

TFIID tạo thành phức hợp TATA box-binding

protein (TAP) và có hơn 8 subunits

2 TFIIA Làm ổn định TFIID, ngăn cản các chất ức chế phá hủy phức hợp TFIID

Phân loại các yếu tố phiên mã

•  Các yếu tố phiên mã rất đa dạng nhưng chúng

đều có 2 vùng chức năng:

•  Vùng gắn DNA (DNA-binding domain), vùng này nhận ra trình tự DNA của vùng enhancer và gắn với nó

•  Một vùng gọi là “transactivation domain”, tương

tác với các protein khác à tăng tốc độ phiên mã

26

Phân loại các yếu tố phiên mã

•  Zinc finger proteins:

•  Helix-turn-helix proteins:

•  Leucine zipper proteins:

•  Helix-loop-helix proteins:

•  Steroid receptors:

•   homeodomain là một DNA-binding domain

•  protein domain mã hoá bởi homeobox, dài 60 aa

•   DNA-binding segment của domain liên quan tới helix-turn-helix

motif

sinh vật đa bào

•  Chúng đóng vai trò quan trọng trong những bước đầu tiên của quá trình hình thành phôi, ví dụ như cài đặt chương trình

anterior-posterior gradient trong trứng của ruồi đục quả

Drosophila melanogaster

•   Antennapedia homodomain bám DNA

•  antennapedia homeodomain là một TFs có trình tự đặc

Leucine Zipper – Dimerization Domains

• Cứ 7 amino acids sẽ xuất hiện leucine

bám xung quanh dọc theo trục α-helix

• Một α-helix lặp lại 3.5 amino acid, tất

các các Leucine quanh trục đều xếp

theo một hướng

• Hai α-helix có khả năng liên kết với

nhau, hình thành cấu trúc lõi

“coiled-coil”

•  ‘ zippered ’ α -helices (xám và xanh nhạt) Leu residues

(màu đỏ)

•  Hình thành Homodimers hoặc heterodimers

The leucine zipper motif

• leucine zipper chuyển vị trí bám DNA Binding và protein dimerization

• Một chuỗi của leucine zipper cứ 7

aa chứa chuỗi ngắn alpha-helix với một leucine

34

Tương tác của leucine

zipper với DNA

•   α -helical ( bZip ) tương tác với

mạch DNA backbone tại vị trí kế cận

ngay vùng loop chính

Kích thước của bZip domain

•  AP-1 là bZIP heterodimer protein

với 2 subunits, c-Jun và c-Fos

36

The GCN4 leucine zipper motif

• Yeast GCN4 belongs to the class of eukaryotic transcription

factors whose bZIP DNA-binding domains dimerize via a leucine

zipper motif that structurally resembles a coiled coil

X-Ray cấu trúc vủa vùng GCN4 bZIP trong

phức hợp tương tác với DNA

38

bZIP motif

•   leucine sipper motif có thể bám vào DNA bởi vì nó

chứa một đoạn các aa trên một phía của containing α -helix

zipper

•   α-helical của bZIP proteins rất quan trọng trong

dimerization, trong khi đó, các aa cho phép các

protein nhận biết trình tự đặc thù của DNA

HMG-box motif

•   high mobility group ( HMG) proteins

•   motif chứa three α-helices sắp xếp trong một boomerang-shaped motif có khả năng bám DNA

•   TFs: HMG boxes coi là những yếu tố kiến trúc‘architectural

factors ’

•   Hoạt hoá phiên mã bằng việc bẻ cong DNA ( bending DNA) , tăng

cường sự gắn vào của các TFs (transcription factors) bám vào các

vị trí gần kề

• HMG-box domains được tìm ra trong nhóm các proteins di chuyển linh động cao, tham gia vào điều hoà các quá trình phụ thuộc của DNA như phiên mã, tái bản, và đều thay đổi cấu hình của NST.

• Một Ile ở chuỗi helix đầu tiên và một Ile trong chuỗi thứ 2 helix hình thành T/A

residues của trình tự lõi để

bẻ cong DNA

• Những proteins này bám vào và bẻ cong DNA

•   Cấu trúc NMR của HMG protein nấm men

•   NHP6A trong phức hợp với 15-bp DNA

•   L-shape chứa hai cánh

•   Cánh ngắn chứa helices I & II

•   Cánh dài chứa helix III

•  Góc giữa cánh ngắn và cánh dài

là ~80˚

được đóng gói trong helix III

42

•  UBF là một TF dimeric HMG của Xenopus, bẻ cong DNA tạo

khuôn phù hơp cho RNA polymerase I

•   Bám của RNA polymerase I yêu cầu một số lượng các TFs

•   Zinc finger proteins

• Motif zinc finger Cys2His2 gồm một chuỗi α

helix và một antiparallel β sheet

• Nguyên tử Zn2+ (green) gắn kết bởi 2

histidine và 2 cystein

• 2 cystein là một phần của hai β sheet trên

một phía của finger

• 2 histidine trên α helix, ở vị trí đối diện với

finger

• Là nhóm yếu tố phiên mã lớn nhất của động vật có vú

44

Mô hình zinc finger motif điều hoà protein, những vị

•   Một zinc finger, khoảng 30

aa tạo một vòng loop kéo

dài (elongated loop), được

giữ bởi một Zn2+ ion

•   Trong hầu hết các trường

hợp, zinc ion của mỗi

finger được giữ bởi 2

cysteines và 2 histidines,

hoặc bởi 4 cysteines

zinc finger motif

•   TF Sp1 từ tế bào HeLa chứa

3 Cys2-His2 zinc finger

domains

•  α-helix

•  β -sheet

•   3 Cys2His2 zinc fingers là

motif liên tục X2-Cys-X2-4

-Cys-X12-His-X3-His

46

•  A two-dimensional depiction of C2H2 zinc fingers

•   The X2-Cys-X2-4-Cys-X12-His-X3-His motif

•   A monomeric protein (GL1) chứa 5 C2H2 ZFs

•  α helix

not interact with DNA

48

helix-turn-helix motif với protein điều hoà

• Một helix nhỏ, linh động tạo

vòng loop, cho phép quá trình

50

helix-loop-helix (HLS) motif

•  Motif được xác định bởi 2 α-helix phân tách bởi một đầu loop đa

dạng về độ dài

•  Khác với helix-turn helix-motif liên kết với DNA binding

•  HLS gồm 50 aa quan trọng cả DNA binding và protein

dimerization

•  helix-loop-helix motifs của 2 polypeptides tương tác hình thành

dimers

•  Proteins với HLH motif luôn tương tác như dimers

Những protein này, DNA binding được vận chuyển bởi một trình tự aa ngắn liền kề nhau

• Hai tiểu đơn vị của dimer thường được mã hoá bởi các gene khác nhau

• Heterodimerization đa dạng trong các nhân tố điều hoà có thể tạo ra từ một số lượng polypeptides nhất định

• Chúng được coi là những HLS (bHLS) motifs cơ bản

The helix-loop-helix motif

quanh vị trí gắn DNA

•   Protein dimeric

• Tương tác giữa đầu terminal helices của 2 tiểu phần được coi như là “coiled coil” tương đồng với leucine zipper, không chỉ một cặp Leu

C-• C •  

C

• N

•  N

54

•   Tương tác bHLH proteins với DNA

•   Trong bHLH proteins,

DNA-binding helices ở vị trí cuối

(N-termini) được phân tách bởi

non-helical loops từ vùng giống

leucine-zipper-like chứa

coiled-coil dimerization domain

• N

•  N

• C •  C

•   Tăng cường các vị trí gắn đặc thù của TFs với

DNA-thông qua dimerization của bHLH protien

•   Hai tiểu phần (subunits) của TFs chứa HLS motifs có thể

liên kết trong các vùng tái tổ hợp khác nhau

•   Các TFs khác nhau có thể nhận ra các vị trí gắn DNA

khởi đầu quá trình chuyển

hoá steroid hormones

• Điều khiển sự thay đổi

của biểu hiện gen qua

từng giờ trong ngày

•  steroid hormone hoạt hoá gene

• DNA binding domain has Zn-finger motif with four Cys and no His residues

58

Tháo xoắn và phiên mã

•  Gene mã hóa cho β-globin ở người và gà Gene này gồm 5 cluster, trải rộng khắp 50,000 nucleotide, được phiên mã duy nhất ở các tế bào máu Mỗi gene được “bật” ở những giai đoạn phát triển khác nhau và ở những cơ quan khác nhau

•  Một loạt các protein điều hòa cần thiết cho việc “bật” các gene này phải có mặt đúng cả không gian và thời gian Toàn bộ cụm gene được điều khiển

“ bật hoặc tắt” liên quan đến sự hoạt hóa của chromatin

•  Bằng chứng: Kiểm tra độ mẫn cảm của các gene globin với DNase I Ở các tế bào gene globin không được biểu hiện, DNA trong những gene này hoàn toàn kháng với DNase I à chứng tỏ chúng được bao bọc rất chặt trong cấu trúc chromatin Đối với những tế bào biểu hiện globin, toàn bộ cụm gene này trở lên rất nhạy cảm với DNase I

Phức hợp phiên mã

(Transcription Complex)

•  RNA polymerase II (tạo mRNA) không thể tự bản thân mình bám với promoter

•  RNA pol II đòi hỏi các yếu tố khác tham gia có bản chất là

protein Những protein này hoặc là tương tác với RNA pol II hoặc tương tác với vùng promoter à phiên mã hiệu quả

•  Các yếu tố gọi là “trans-acting factors” tham gia vào quá trình khởi đầu phiên mã

•  à Các yếu tố tham gia vào quá trình khởi đầu phiên mã gọi là

“transcription factors” hay yếu tố phiên mã

Cis-acting Sequences

•  Một yếu tố điều hòa dạng "cis-regulatory” là một vùng DNA hoặc RNA có vai khả năng điều khiển sự biểu hiện của các gene nằm trên cùng phân

tử DNA hoặc RNA đó (thường là cùng nằm trên 1 NST)

•  Thuật ngữ “cis” theo tiếng Latin có nghĩa là “nằm cùng 1 phía/bên”

•  Những yếu tố điều hòa dạng “cis” thường là những vị trí gắn cho 1 hoặc

nhiều yếu tố khác gọi là “trans-acting factors”

•  Yếu tố “cis” thường nằm ở đầu 5’ của trình tự mã hóa (CDS) của gene mà

nó điều khiển (trong vùng promoter hoặc xa hơn về phía 5’)

•  Yếu tố “cis” cũng nằm trong intron hoặc trong vùng không được dịch mã (untranslated region) hoặc vùng không được phiên mã (untranscribed

Những trình tự Cis-acting cơ bản

•  Các trình đầu 5‘ gần vị trí khởi đầu phiên mã

•  Thường gọi là promoter Ở eukaryotes: TATA box (upstream (-30)

•  Các trình tự khác là một phần của các promoter: CCAAT box (hay CAT box) và GC box

•  Những đột biến ở các vùng này à mức độ biểu hiện mRNAs

Danh sách một số yếu tố điều hòa cis

(List of cis-acting elements)

•   Operator: xem lac operon

•   Pribnow box: TATAAT (vi khuẩn)

•   TATA box: Goldberg-Hogness box (eukaryote và archaea)

•   SECIS element (mRNA): selenocysteine insertion sequence

Trans-acting Factors

•  Trans-acting nghĩa là hoạt động từ một phân tử khác (tương tác giữa các phân tử/ intermolecular) Ngược với cis-acting (hoạt động từ cùng một phân tử/ intramolecular)

•  Trans-acting element: là một trình tự DNA chứa 1 gene Gene này mã hóa cho 1 protein (hoặc microRNA hoặc một số phân tử khác) đóng vai trò điều hòa một gene nhất định

•  Trans-acting gene có thể nằm cùng trên 1 NST với gene đích hoặc

khác NST, hoạt động thông qua sự tương tác trung gian protein hoặc RNA do gene đó mã hóa

Trans-acting Factors

•  Trans-acting factors có 2 domain:

•  1 domain cần thiết cho việc gắn với trình tự DNA,

1 domain cho hoạt hóa phiên mã

•  Để xác định 2 domain: Các thí nghiệm nghiên cứu đột biến từng domain và thí nghiệm sử dụng

hybrid protein

64

• http://www.emunix.emich.edu/~rwinning/genetics/eureg4.htm

Trans-acting Factors

Lớp Monomer/Dimer Đặc điểm

Helix-turn-helix Monomer 3 domain xoắn alpha Trong

đó helix 3 gắn với DNA và helixe 1 và 2 gắn với các protein khác

Zinc Finger Monomer Vùng giàu histidine-cysteine

gắn vói Zn

Leucine Zipper Homo/ heterodimers Dimer được tạo thành nhờ sự

tương tác của các protein chứa vùng giàu leucine

Helix-loop-helix Dimer 2 xoắn alpha nối với nhau thông qua một vòng loop

Enhancers và Silencers

•  Một số trình tự DNA ở eukaryote được gọi

là enhancer và silencer

•  Enhacer có khả năng làm tăng mức độ

phiên mã của gene

•  Silencer có vai trò làm giảm sử biểu hiện của các gene kế cận

66