Lec 2 chuong 1 cau truc genome va tien hoa

Sinh học phân tử là khoa học nghiên cứu các hiện tượng sống ở mức độ phân tử. Phạm vi nghiên cứu của môn học này có phần trùng lặp với một số môn học khác trong sinh học đặc biệt là di truyền học và hóa sinh học. Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này. Hiện nay, sinh học phân tử và sinh học tế bào được xem là nền tảng quan trọng của công nghệ sinh học. Nhờ phát triển các công cụ cơ bản của sinh học phân tử như các enzyme cắt hạn chế, DNA ligase, các vector tạo dòng, lai phân tử, kỹ thuật PCR... sinh học phân tử ngày càng đạt nhiều thành tựu ứng dụng quan trọng.

1

Genome

và sự hoạt động của gene

CHƯƠNG 1

2

1.1 Cấu trúc genome

n   DNA mã hóa

n   DNA không mã hóa

n   RNA mã hóa (Coding RNA)

n   RNA không mã hóa (Non-coding RNA)

n   Gene giả (Pseudogene)

n   Các cấu trúc lặp lại trong genome

n   Bản chất phân tử của các yếu tố di truyền vận động: gene nhảy

n   SNPs (đa hình nuleotide đơn)

n   Lặp gene, cơ sở của tiến hóa

4

Where am I?

Giải mã genome

5

Genomics ?

n   Genomics là một ngành trong di truyền học liên quan

đến việc nghiên cứu genome của sinh vật

n   Nghiên cứu genome bao gồm việc xác định trình tự

genome của sinh vật và lập bản đồ gene

n   Nghiên cứu genome cũng liên quan đến các hiện tượng:

ưu thế lai, tương tác át chế, tính đa hiệu của gene và

các tương tác giữa các gene cùng allele hoặc các gene khác nhau trong genome

7

http://www.scfbio-iitd.res.in/tutorial/geneticorganization.html

Eukaryote genome

Sự khác biệt về cấu trúc

genome ở tế bào prokaryote

và eukaryote

9

10

So sánh cấu trúc genome prokaryote và

eukaryote

So sánh mật độ gen trên NST ở các sinh vật khác nhau (1 vùng DNA

genome có chiều dài 65 kb)

Số lượng các gen được mã hóa bên trong cùng một đơn

vị chiều dài DNA giảm dần khi mà tính phức tạp của sinh vật tăng lên

Watson (2004) Molecular biology of the gene

DNA mã hóa (coding DNA)

11

12

RNA mã hóa

1 gene nhiều mRNA

13

Protein coding gene

n   Allele: Trạng thái tồn tại khác nhau của 1 gene

n   Locus: Vị trí tồn tại của một hoặc nhiều allele trên NST

n   Allele trội, allele lặn: Sự tương tác về mức độ biểu hiện giữa các allele

14

RNA không mã hóa (non-coding RNA)

Định nghĩa: Gene mã hóa cho các phân tử RNA ngoại trừ mRNA

n   RNA vận chuyển (tRNA)

n   RNA ribosome (rRNA)

n   Small nucleolar RNA (snoRNA)

n   Small nuclear RNA (snRNA)

n   Micro RNA (miRNA)

n   Small interfering RNA (siRNA)

n   Piwi-interacting RNA (piRNA)

n   Long non-coding RNA (long ncRNA)

Noncoding RNA

15

RNA không mã hóa

17

tRNA

•  Ở Eukaryote, tRNAs được phiên

mã bởi RNA polymerase III

(pre-tRNA)

•  Pre-tRNA của eukaryote được

cải biến ở trong nhân (cắt, loại bỏ

intron) tRNA prokaryote có khả

năng cải biến (self-splice)

expression system) à cạn kiệt

tRNA à giảm hiệu quả biểu

hiện

n  Xem xét hiện tượng codon

bias à lựa chọn dòng tế bào

chủ biểu hiện

n 

19

RNA ribosome (rRNA)

Prokaryote 70S 50S (5S; 23S) 30S (16S)

Eukaryote 80S 60S (5S; 5,8S; 28S) 40S (18S)

20

Small nuclear RNA (snRNA)

•  snRNA là một lớp của các phân tử RNA nhỏ tìm thấy ở trong nhân của eukaryote snRNA được phiên mã bởi RNA pol II

•  snRNA liên quan đến quá trình loại bỏ intron khỏi các pre-mRNA (hn RNA), điều hòa phiên mã và duy trì các telomere

•  Các snRNA thường kết hợp với các protein để tạo thành phức hợp snRNP (small nuclear ribonucleoprotein)

•  Một nhóm lớn trong số các snRNA là snoRNA (small nuleolar)

21

Loại bỏ intron khỏi tiền mRNA (pre-mRNA) bởi phức hợp

spliosome

Kiểm soát hoạt động gene bởi miRNA

24

Nguồn gốc miRNA

miRNP: Ribonucleoprotein complex

•  Phát hiện bởi nhóm nghiên cứu của David Baulcombe

(England) Công bố trên Science Tiêu đề: "A species of small

antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants“

27

28

•  SiRNA chỉ tác động đến duy

nhất gene quan tâm

•  SiRNA không ảnh hưởng đến

hoạt động của các gene khác

ngoài gene đích

•  Sàng lọc dựa vào thư viện

cDNA (dbEST)

29

Piwi-interacting RNA (piRNA)

•  piRNA được biểu hiện ở

tế bào động vật (kích

thước 26-31 nt)

•  Nguồn gốc: chưa rõ

•  piRNA tạo thành phức

hợp với protein piwi,

tham gia vào quá trình

epigenetic và làm câm

gene (khi gene chuẩn bị

dịch mã)

điều hòa biểu hiện

gene (cơ chế chưa rõ)

31

http://www.scfbio-iitd.res.in/tutorial/geneticorganization.html

32

Gene giả (Pseudogene)

gene (relatives) nhưng mất đi khả năng mã hóa cho các protein hoặc không được biểu hiện

33

Gene giả (Pseudogene)

n   Có thể không có introns hoặc promoter (những bản copy của mRNA kết hợp vào NST)

n   Hầu hết có các đặc điểm của gene như: promoter, CpG island và các vị trí phân cắt (intron junction) Nguyên nhân là do mất khả năng mã hóa protein (premature stop codons, đột biến

lệch khung frameshift, thiếu các yếu tố phiên mã)

n   Đối với các non-coding RNA thì bị mất đi khả năng mã hóa

cho các RNA (ví dụ rRNA pseudogene)

34

Đặc điểm của gene giả (Pseudogene)

n  Có tính tương đồng (homology) do trình tự gần như giống với các gene đang hoạt động (so sánh trình tự alignment khoảng

từ 40 – 100%)

n  Bị lỗi bởi một trong những giai đoạn (phiên mã, xử lý

pre-mRNA, dịch mã, cải biến sau dịch mã (folding))

n  Phần lớn: stop codon, frameshift

n  Các pseudogenes của các RNA thường rất dễ phát hiện bằng cách so sánh trình tự

35

Gene giả (Pseudogene)̉

n   Về mặt tiến hóa: Homology

n   Cùng có tổ tiên chung với các gene đang hoạt động

n   Có ý nghĩa trong việc phân tích nguồn gốc tiến hóa

36

Nguồn gốc gene giả (Pseudogene)

1 Retrotransposed pseudogenes:

•  Các yếu tố lặp lại chẳng hạn LINES ở người có vai trò trong việc phiên

mã ngược một phần của mRNA thành DNA rồi chèn vào NST

•  Khi các gene giả được đưa vào genome, chúng thường chứa các poly A

và các intron đã bị loại bỏ (giống cầu trúc cDNA)

•  Do có nguồn gốc từ các mRNA (trưởng thành) à thiếu các cấu trúc như thành phần upstream chính vì vậy chúng được coi là “những xác chết”

37

Nguồn gốc gene giả (Pseudogene)

n   Lặp gene: phổ biến, có vai trò quan trọng trong tiến hóa genome

n   Gene lặp lại có thể bị đột biến, kết quả làm cho gene này bị bất hoạt

n   Các gene lặp lại thường có đặc điểm giống nhau (kể cả các vùng

intron-exon, promoter và các đặc điểm khác)

n   Một số gene giả được phát hiện thấy ở người và các động vật linh trưởng à giải thích cho mối quan hệ gần gũi trong quá trình tiến hóa

2 Non-processed hoặc duplicated pseudogenes

Các gen giả pseudogene

Pink R C et al RNA 2011;17:792-798

Copyright © 2011 RNA Society

39

Nguồn gốc gene giả (Pseudogene)

n   Các dạng đột biến có thể làm dừng một gene khỏi phiên

mã hoặc dịch mã và một gene có thể không hoạt động chức năng hoặc bị bất hoạt nếu một đột biến như vậy

được giữ lại trong quần thể

n   Khác với trường hợp thứ 2, gene được lặp lại sau khi nó

bị bất hoạt

Ví dụ:

n   Gene mã hóa cho enzyme L-gulono-γ-lactone oxidase (GULO) Ở tất cả các động vật có vú GULO hỗ trở sinh tổng hợp Vitamin C Gene này tồn tại ở bộ linh trưởng nhưng ở trạng thái bất hoạt

3 Gene bị bất hoạt (Disabled gene)

40

http://www.scfbio-iitd.res.in/tutorial/geneticorganization.html

n   Các trình tự lặp lại trải khắp genome (interspersed repeat)

n   SINEs (Short Interspersed Nuclear Elements)

n   LINEs (Long Interspersed Nuclear Elements)

•  Thuật ngữ “satellite DNA” chỉ mức độ lặp lại của những

đoạn DNA ngắn có xu hướng tạo ra các tần suất lặp lại khác nhau của các A, T, G, C

44

Các trình tự lặp lại xen kẽ (tandem repeat)

•  Minisatellite (còn gọi là varian number of tandem repeat, VNTR)

là một phần DNA chứa một loạt những đoạn trình tự ngắn (10-60 bp) Ở genome người có khoảng 1,000 vị trí như thế này

•  Một số minisatellite chứa một lõi trình tự “GGGCAGGANG” hoặc

có xu hướng khác nhau với các base A, T, G, C

•  Khác với microsatellite (còn gọi là short tandem repeat, STR) Các STR cũng là những trình tự lặp lại nhưng chúng thường có kích thước ngắn (2-13 nucleotide)

lặp lại xen kẽ: TTAGGG TTAGGG TTAGGG

•  Minisatellite có tính đa hình cao

•  Phân tích đột biến trong quần thể

•  Đánh giá mối liên hệ về mặt tiến hóa

•  Marker di truyền

•  Phân tích di truyền liên kết

Ứng dụng:

Minisatellite là các đoạn DNA có nhiều đơn vị lặp lại

dưới 25 bp, có chiều dài khoảng 20 kb

Microsatellite thường dùng để chỉ DNA có đơn vị lặp lại ngắn, thường

là 4 bp hoặc ngắn hơn và có chiều dài thường nhỏ hơn 150 bp

►   Microsatellite thường trung tính và mang tính đồng trội Chúng được

sử dụng làm marker trong di truyền, xác định mối quan hệ huyết thống Ngoài ra được sử dụng trong các nghiên cứu về lặp gene hoặc đột

biến mất đoạn

►   Ở cây lúa, các dạng SSR là (GA)n, (GT)n, (AT)n, (GGT)n

►   Microsatellite là yếu tố liên quan đến các bệnh, đặc biệt là các bệnh suy giảm thần kinh và ung thư

47

A number of DNA samples from specimens of Littorina plena amplified

using polymerase chain reaction with primers targeting a variable simple sequence repeat locus Samples have been run on a 5% polyacrylamide gel and visualized using silver staining

SSR analysis

49

http://www.scfbio-iitd.res.in/tutorial/geneticorganization.html

Transposon

►   Lớp 2: Gồm các phân tử DNA di chuyển

trực tiếp từ vị trí này sang vị trí khác trong genome

RNA rồi chèn vào vị trí mới

50

Lớp 1

Miniature Inverted-repeat Transposable Elements (MITEs)

5' GGCCAGTCACAATGG ~400 CCATTGTGACTGGCC 3' 3' CCGGTCAGTGTTACC ~400 GGTAACACTGACCGG 5'

Có khoảng hơn 100,000 trình tự MITEs trong genome lúa đã được biết

MITEs tồn tại trong genome người, ếch, và một số loài thực vật

Retrotransposon

54

Retrotransposons

55

►  Phương thức lặp lại theo kiều “retrotransposons” thông qua trung gian RNA đã làm tăng số bản copy à dẫn đến tăng kích thước genome

►  Retrotransposon có thể gây ra các đột biến bằng cách chèn vào bên cạnh hoặc bên trong các gene một đoạn DNA

►  Hơn nữa, retrotransposon-gây ra các đột biến thường

tương đối ổn định, vì trình tự ở vị trí chèn được giữ lại bởi vì chúng chuyển thông quá cơ chế sao chép

57

Các trình tự lặp lại trải khắp genome

(interspersed repeat)

►  SINES (Short Interspersed Elements) là những trình tự

DNA ngắn (<500 bases) đại diện cho những phân tử RNA được phiên mã ngược được phiên mã từ RNA pol III thành tRNA, rRNA và các snRNA

►  SINES không mã hóa cho reverse transcriptase protein và nhờ vào các yếu tố vận động khác để chuyển vị trí

►  SINES phổ biến nhất là các trình tự Alu Ở người, có khoảng 1,500,000 bản copy, chiếm 11% genome

►  Những nghiên cứu gần đây cho thấy cả SINES và LINES có

liên quan đến việc hình thành các gene mới, gây ra một

số bệnh và ung thư

58

LINES

với lượng lớn ở genome eukaryote

►   Được phiên mã thành RNA bằng promoter nằm bên trong LINE

►   Các LINE mã hóa cho enzyme phiên mã ngược (reverse

transcriptase), ngoài ra còn mã hóa các endonuclease (RNase H)

►   Enzyme phiên mã ngược có tính đặc hiệu với LINE RNA cao hơn các RNA khác

►   Enzyme này tạo DNA từ LINE RNA sau đó xen vào genome ở một vị trí mới

►   Các endonuclease giúp cho quá trình cắt và chèn DNA ở những vị trí nhất định

59

LINEs

(AATAAA) và đuôi poly A

►   Do LINEs di chuyển bằng cách copy chính bản thân (thay vì chỉ di chuyển giống như các transposon), chúng làm genome lớn lên

►   Genome người chứa 500,000 LINEs (17%) Trong đó khoảng 7,000 đoạn copy đầy đủ và một lượng nhỏ có chiều dài ngắn có khả năng

retrotransposition

►   LINE-1 retroposons ở người có khả năng phiên mã một cách chủ động và các LINE-1 RNA có chức năng tham gia vào quá trình hình thành cấu trúc chromatin

60

TRANSPOSON CỦA PROKARYOTE

61

Single-nucleotide polymorphism SNPs

Là trình tự DNA biến động trong

quần thể, chỉ sự khác nhau giữa

các cá thể của loài sinh học hay

cặp NST

Những điểm khác biệt này được

giả thuyết là các dạng đột biến

trung tính tạo nên sự đa dạng

thể loài người Tuy nhiên, một

số điểm đa hình SNP có thể liên

quan đến khả năng mẫn cảm

với bệnh

63

ü  Khảo sát các biến thể đa hình số bản

sao (copy-number variants, CNVs) trên

toàn bộ hệ gene người từ hàng trăm

mẫu đối chiếu của 4 quần thể người

ü  Thống kê khoảng 1500 vùng biến đổi

hàng trăm gene cấu trúc hoặc các vùng

chức năng khác

ü  Kết quả: nguồn đa dạng di truyền của

loài người không chỉ dựa vào hàng triệu

điểm SNP mà còn cả ở biến dị thêm hay

- So sánh từng mẫu với mẫu chuẩn và tìm kiếm các điểm

khác biệt một cách hệ thống của hơn 26,000 đoạn nhiễm sắc thể lớn mà tổng chiều dài đã chiếm gần như tất cả phần hệ

gene đã được xử lý trình tự hiện nay

- Việc kết hợp hai hướng tiếp cận này có thể cho phép dò tìm gần như tất cả các kiểu CNV

- Kết quả đã phát hiện 1447 CNV trong số 270 mẫu HapMap Chiều dài ước tính trung bình của các vùng chứa CNV trong mỗi hệ gene là vào khoảng 20 triệu cặp base

SNPs

người bệnh có nhiều khả năng sẽ bị mất cân bằng về

lượng RNA và protein thích hợp do gene đó mã hóa

ü  Đối với những gene hoặc con đường trao đổi chất mà số lượng enzyme chức năng đóng vai trò chủ chốt thì đột biến CNV có thể gây nên những biến đổi về tính mẫn

ü  Gần đây, số lượng bản sao khác nhau của gene

CCL3L1 cũng cho thấy làm tăng khả năng kháng lại sự xâm nhiễm của HIV