Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của dây chìa vôi

Đặc điểm soi bột của dây Chìa vôi Cissus modeccoides Planch.. Dây Chìa vôi – Cissus modeccoides Planch., có tên gọi khác là Bạch phấn đằng, Rau chua, có sẵn ở Việt Nam, cây mọc khắp nơi

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và giúp đỡ tận tình từ các thầy cô, gia đình và bạn bè Tôi xin

bày tỏ sự kính trọng và cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Văn Điền, giảng viên

bộ môn Dược học cổ truyền, người đã trực tiếp hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành khóa luận

Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn tới HVCH Hoàng Sỹ Hùng, học viên cao

học khóa 21, trường Đại học Dược Hà Nội, đã quan tâm giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu để có thể hoàn thành khóa luận

Ngoài ra, tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô, các bạn và anh chị ở bộ môn Dược học cổ truyền đã luôn đồng hành và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này

Cuối cùng là lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi muốn gửi tới gia đình

và bạn bè, những người luôn ủng hộ và động viện tôi trong học tập và cuộc sống

Hà Nội, ngày 18 tháng 5 năm 2018 Sinh viên,

Phạm Thị Thu Hiền

MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về chi Cissus 2

1.1.1 Đặc điểm hình thái và phân bố 2

1.1.2 Thành phần hóa học, công dụng và tác dụng sinh học 4

1.1.2.1 Thành phần hóa học 4

1.1.2.2 Công dụng và tác dụng sinh học 8

1.2 Tổng quan về loài Cissus modeccoides Planch 11

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố 11

1.2.2 Thành phần hóa học 12

1.2.3 Công dụng và tác dụng dược lý 12

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu 13

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 13

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 13

2.1.2.1 Hóa chất, dung môi 13

2.1.2.2 Trang thiết bị 13

2.2 Phương pháp nghiên cứu 14

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật 14

2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 14

2.2.2.1 Định tính các nhóm chất 14

2.2.2.2 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập các hợp chất 14

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16

3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật 16

3.1.1 Đặc điểm thực vật của dây Chìa vôi (Cissus modeccoides Planch.) 16

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu của dây Chìa vôi (Cissus modeccoides Planch.) 17

3.1.3 Đặc điểm soi bột của dây Chìa vôi (Cissus modeccoides Planch.) 21

3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học 23

3.2.1 Định tính các nhóm chất 23

3.2.1.1 Chiết xuất và phân lập các chất 30

3.2.1.2 Phương pháp chiết xuất 30

3.2.1.3 Phân lập bằng phương pháp sắc ký cột 32

3.3 Bàn luận 36

3.3.1 Về đặc điểm thực vật 36

3.3.2 Về thành phần hóa học 37

Kết luận 39

Kiến nghị 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Viết tắt Viết đầy đủ

13C-NMR Carbon 13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13)

1H-NMR Proton Magnetic Resonance Spectroscopy

(Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) BMI Chỉ số khối cơ thể

COX-2 Cyclooxygenase-2

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer DPPH 2,2 – diphenyl – 1 - picrylhydrazyl

HBV DNA Tải lượng vi rút viêm gan B

HMBG1 High mobility group box 1

MS Mass Spectroscopy (Phổ khối lượng)

NMR Nuclear magnetic resonance spectrometry (phổ cộng

hưởng từ hạt nhân)

TLTK Tài liệu tham khảo

TGF-β Transforming growth factor beta

v/v Volume to volume ratio

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 1-1 Phân bố của một số loài trong chi Cissus 3

2 Bảng 1-2 Thành phần hóa học của một số loài trong chi

5 Hình 3-5 Bột lá dây Chìa vôi (Cissus modeccoides Planch.) 23

6 Hình 3-6 Sắc ký đồ N4R64 khi so sánh với cao phân đoạn

ethyl acetat

33

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chi Cissus là một chi thuộc họ Vitaceae, gồm nhiều loài có các tác dụng

dược lý như kháng tiểu đường, kháng khuẩn, chống viêm, giảm đau, chữa gãy xương, [18]; hiện nay có 350 loài phân bố chủ yếu ở các khu vực nhiệt đới như châu Phi, châu Á, châu Úc và châu Mỹ trong đó có ít nhất 12 loài được sử dụng

để điều trị bệnh [35], ở Việt Nam có 14 loài, trong đó có một số loài được dùng

để làm thuốc [6]

Dây Chìa vôi – Cissus modeccoides Planch., có tên gọi khác là Bạch phấn

đằng, Rau chua, có sẵn ở Việt Nam, cây mọc khắp nơi ở vùng trung du và đồng bằng miền núi [2], được sử dụng để chữa phong thấp, sưng tấy, đau lưng, đau nhức xương, ung nhọt sưng lở, trĩ và bỏng; được sử dụng kết hợp với nhiều dược liệu khác trong các bài thuốc để chữa phong thấp, đau xương, tê mỏi; chữa rắn độc cắn hay chữa mụn nhọt ổ gà ở nách [2] Tuy nhiên, hiện nay cả trong nước và nước ngoài hầu như có rất ít nghiên cứu về dây Chìa vôi Vì vậy, để góp phần xây dựng cơ sở dữ liệu về dây Chìa vôi làm cơ sở cho việc khai thác sử dụng dược liệu này bền vững, an toàn và hiệu quả hơn, bước đầu chúng tôi tiến

hành nghiên cứu đề tài ‘Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học

của dây Chìa vôi’ được thực hiện với các mục tiêu sau:

1 Mô tả đặc điểm thực vật, vi phẫu và soi bột thân, lá dây Chìa vôi thu hái ở Bắc Giang

2 Nghiên cứu định tính các nhóm chất hữu cơ và phân lập một thành phần trong dây Chìa vôi

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về chi Cissus

Vị trí phân loại:

Theo hệ thống phân loại thực vật của Armen Takhtajan (2009) [38], chi Cissus

có vị trí phân loại như sau:

Giới thực vật (Plantae)

Phân giới thực vật bậc cao (Kormobionta)

Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)

Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Phân lớp hoa hồng (Rosidae)

hố nhỏ ở gốc [6]

Phân bố

Chi Cissus có khoảng 350 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới như

Châu Phi, Châu Á, Úc, Trung - Nam Mỹ và Bắc Mỹ (Mexico); 15 loài (hai loài

đặc hữu) ở Trung Quốc [35] Ở Việt Nam, chi Cissus có 14 loài [1] và có một số loài được dùng làm thuốc Phân bố của một số loài trong chi Cissus có ở Việt

Nam [6] được tóm tắt ở bảng sau:

Bảng 1-1 Phân bố của một số loài trong chi Cissus

1 Cissus

quadrangularis

Linn

Hồ đằng bốn cạnh - Ấn Độ, Sri Lanka, Ả Rập, châu

Phi và Thái Lan

- Ở Việt Nam, cây trồng ở thành phố Hồ Chí Minh và một số nơi khác

2 Cissus hastata

(Miq.) Planch

Chìa vôi mũi giáo - Trung Quốc, Thái Lan,

Singapore, bán đảo Mã Lai

- Ở Việt Nam, có ở Bà Rịa – Vũng Tàu (Côn Đảo)

3 Cissus

hexangularis

Planch

Chìa vôi sáu cạnh - Nam Trung Quốc, Lào,

Campuchia và Thái Lan

- Ở Việt Nam, cây mọc ở Hà Nội, Thanh Hóa, Thừa Thiên – Huế,

Đà Nẵng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Đồng Nai, Bình Dương, Tây Ninh, Kiên Giang

5 Cissus javanica

DC

Chìa vôi java - Ấn Độ, Trung Quốc, Đông

Dương, Mianma, Philippin và Indonesia

- Việt Nam có ở Lâm Đồng, Đồng

Nai, Bình Dương, Tây Ninh, Bà Rịa - Vũng Tàu

6 Cissus assamica

(Laws.) Craib

Chìa vôi lông - Ấn Độ, Trung Quốc, Mianma,

Philippin, Thái Lan và Indonesia

- Ở Việt Nam có ở Lào Cai, Thanh Hóa, Quảng Trị, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Bà Rịa – Vũng Tàu, Kiến Giang

1.1.2 Thành phần hóa học, công dụng và tác dụng sinh học

1.1.2.1 Thành phần hóa học

Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy các loài trong chi Cissus

có chứa các nhóm chất chính như flavonoid, dẫn chất của stilbene, các triterpen

và coumarin, Các chất phân lập từ chi Cissus được trình bày trong Bảng 1-2

Bảng 1-2 Thành phần hóa học của một số loài trong chi Cissus

Cissus

quadrangularis

Linn

Dịch chiết methanol của thân và lá chứa:

- Flavonoid: kaempferol (1), quercetin (2), luteolin [20],

[37]

- Dẫn chất của stilbene: resveratrol (3), piceatanon,

Rễ và thân chứa hàm lượng cao ion canxi và phospho

Cissus

sicyoides L

Dịch chiết methanol của bộ phận trên mặt đất chứa:

- Hàm lượng lớn α-tocoferol (vitamin E)

- Flavonoid glyoside (cissoside I, II, III), flavonol (kaempferol, quercetin và các dẫn chất như

5

6

Cissus

assamica

(Laws.) Craib

Dịch chiết methanol của phần trên mặt đất chứa:

- Triterpenoid: acid ursolic, lupeol

- Hợp chất khác: acid n-hexadecanoic, acid dimethyl ellagic, β-Sitosterol, bergenin, Vitamin E, 4-vinylphenol,

3,3'-[42], [9]

Cissus hastata

(Miq.) Planch

Dịch chiết methanol của phần trên mặt đất chứa methoxy-3,5-dihydroxybenzoic acid, 23-R-methylcholesterol, acid n-hexadecanoic, β-sitosterol

Dịch chiết ethanol của bộ phận trên mặt đất có chứa

các polyphenol bao gồm bergenin (7), norbergenin,

bergenin-11-O-α-D-galactopyranoside, resveratrol, myricetin và acid gallic

[25]

Cissus ibuensis

Hook

Phân đoạn n-butanol của dịch chiết ethanol lá cây

phân lập được các flavonoid glycoside bao gồm rutin, dẫn chất của kaempferol như kaempferol 3-O- α-rhamnopyranosyl (1→6)-β-D-galactopyranoside,

[8]

Cissus Phân đoạn chloroform của dịch chiết ethanol lá cây [15]

7

- Cissus quadrangularis L.: dùng dây C quadrangularis L sắc làm trà cho phụ

nữ sau sinh uống cho lại sức, lá và chồi hoa giã làm bột trị rối loạn tiêu hóa [5]; chữa đau nhức xương, tăng sức mạnh của xương, thân và rễ được sử dụng để điều trị gãy xương Thân có vị đắng nên thường được dùng để đắp ngoài xương gãy, hoặc đắp ngoài tại vị trí đau lưng hoặc đau cột sống [28]; điều trị bệnh Scorbut, rối loạn kinh nguyệt, tăng tiết sữa [5], [28] [37]

- Cissus sicyoides L.: dùng để chữa tiểu đường, lợi tiểu, chống viêm và chống co

giật [18]

- Cissus repens Lam.: giã cây dùng đắp ung nhọt lở loét, dây và lá trị sâu quảng,

rắn cắn, mụn nhọt, rễ dùng để chữa sốt, giảm đau, lâm ba kết hạch và viêm thận [5]

- Cissus assamica (Laws) Craib.: dùng để chữa mụn nhọt, ghẻ và dùng để giải

độc, lọc huyết; trị bắp thịt bầm sưng mưng mủ [5]; ngoài ra còn dùng để trị rắn độc cắn [18]

- Cissus hastata (Miq.) Planch.: dây và thân được dùng để trị phong thấp, đòn

ngã, cơ bắp co quắp, khó co duỗi và dùng ngoài đắp trị mụn nhọt [5]

- Cissus hexangularis Thorel ex Planch.: cành lá dùng để trị đòn ngã, dao chém

[5]

- Cissus javanica DC.: dùng để trị mày đay, thấp sang, viêm da dị ứng, gãy

xương đứt gân, đòn ngã tổn thương và phong thấp tê bại [5]

- Cissus astrotricha Gagnep.: lá dùng làm thuốc trị vết thương do chấy rận [6]

- Cissus subtetragona Planch.: rễ cây được dùng làm thuốc trị tê thấp, trúng độc

và co gân [6]

➢ Tác dụng sinh học

Một số tác dụng sinh học đã được nghiên cứu trên một số loài của chi

Cissus, cụ thể:

- Tác dụng chống viêm:

Dịch chiết methanol của C quadrangularis L có tác dụng giảm đau, chống

viêm được cho là do sự có mặt của flavonoid luteolin và β-sitosterol, làm giảm hoạt động của bạch cầu ở ổ viêm; cùng với calci oxalat, carotene, tetraterpenoid, β-sitosterol, amyrine và ketosteroid có tác dụng chống viêm và làm nhanh quá trình làm lành mô [37]

Ngoài ra, tác dụng chống viêm còn được nghiên cứu ở loài C repens Lam

trên chuột, đánh giá bằng mức độ phù và phân tích mô bệnh học khi gây viêm

bằng λ-carrageenan, cho thấy liều 500 mg/kg thì gần như tương đương với tác

dụng của indomethacin 10 mg/kg [12]

Tương tự, với mô hình gây viêm bằng λ-carrageenan, dịch chiết MeOH của

lá C aralioides liều 300 và 600 mg/kg làm giảm tình trạng phù chân trên chuột

có ý nghĩa thống kê và có phụ thuộc liều Khi gây phù chân bằng formalin, dịch

chiết C aralioides liều 150, 300 và 600 mg/kg cũng làm giảm tình trạng phù có

ý nghĩa thống kê, kết quả tương đương với aspirin liều 200 mg/kg [27]

- Tác dụng giảm đau:

Tác dụng giảm đau trên chuột của C repens Lam được đánh giá bằng tình

trạng quằn quại khi gây đau bằng acid acetic và liếm chân khi gây đau bằng formalin Kết quả cho thấy tình trạng đau quằn quại được giảm có ý nghĩa thống

kê khi được sử dụng dịch chiết methanol của C repens Lam liều 500 mg/kg

đường uống, và liều 100 hoặc 500 mg/kg có thể làm giảm có ý nghĩa thống kê khả năng đáp ứng đau của chuột khi gây đau bằng formalin [12]

- Chống oxi hóa và gốc tự do:

Khả năng dọn dẹp gốc tự do của dịch chiết C quadrangularis L được thử bằng phương pháp DPPH, cho kết quả C quadrangularis L có khả năng chống

oxy hóa chủ yếu là do sự có mặt của β-carotene [37] [47], mức độ chống oxy hóa khác nhau ở các nồng độ khác nhau [47]

- Tác dung kháng khuẩn:

Dịch chiết methanol và dichloromethan của thân và rễ C quadrangularis L

có tác dụng kháng Staphylococcus aureus, E coli và Pneumoniae aeruginosa [37] Các vi khuẩn Gram (+) (Bacillus subtilis, Bacillus cereus, S aureus và các chủng Streptococcus) có độ nhạy cảm cao hơn, ngược lại vi khuẩn Gram (-) thì

kháng mạnh [47] Tác dụng kháng khuẩn giảm dần theo thứ tự với dịch chiết phân đoạn ethyl acetat > methanol > nước [47] Dịch chiết ethanol của phần trên

mặt đất có tác dụng kháng nấm chủng Entamoeba histolytica [37]

Dịch chiết của lá C aralioides trong methanol và nước có tác dụng ức chế

sự phát triển của Salmonella enterica [17]

Dịch chiết methanol của C ibuensis Hook có tác dụng kháng khuẩn phổ rộng bao gồm các vi khuẩn Gram (+) như Staphylococcus aureus, Streptococcus

faecalis, Bacillus cereus; vi khuẩn Gram (-) như Escherichia coli, Salmonella typhi và nấm Candida albicans, Candida tropicalis [33]

- Tác dụng lên chuyển hóa:

C quadrangularis L trong công thức kết hợp với một số thực phẩm bổ sung

(trà xanh, đậu nành, vitamin nhóm B, selenium, chromium) có tác dụng làm giảm cân nặng, BMI, vòng eo của người béo phì có ý nghĩa thống kê sau 8 tuần

sử dụng [32] Tương tự, một nghiên cứu khác cho thấy cân nặng giảm có ý

nghĩa thống kê khi sử dụng CQR-300 (dịch chiết chuẩn của C quadrangularis

L chứa 2,5% ketosterol) so với placebo [31]

Ngoài ra, chuột bị gây tiểu đường bằng alloxan có mức glucose máu giảm có

ý nghĩa thống kê khi sử dụng dịch chiết nước lá C sicyoides L tươi trong 7

ngày liều 100 và 200 mg/kg, dùng đường uống; mức triglycerid giảm 48% với mức liều 200 mg/kg trong 4 ngày [39]

Ngoài các tác dụng trên, một số tác dụng dược lý khác được tìm thấy khi

nghiên cứu các loài thuộc chi Cissus như:

+ Tác dụng liền xương: hiệu quả liền xương của C quadrangularis L là nhờ cơ

chế kích thích nguyên bào xương chuyển hóa và tăng hấp thu ion calci và phospho, ngoài ra loài này chứa vitamin và steroid – có tác dụng liền xương

[21] Tại tuần thứ 4, quan sát trên X - quang cho thấy xương bị gãy trước đó của

chuột liền hoàn toàn sau khi uống dịch chiết ethanol của C quadrangularis L

liều 500 mg/kg, uống hằng ngày [22]

+ Tác dụng chống loét: dịch chiết C quadrangularis L có hiệu quả với vết loét

do ethanol gây ra trên chuột [16] Triterpenoid và β-sitosterol có trong dịch chiết methanol có tác dụng kháng peroxy hóa lipid vì vậy có tác dụng ngăn ngừa loét

dạ dày [24]

+ Tác dụng chống dị ứng: C sicyoides L có đặc tính chống dị ứng in vitro có

thể là nhờ tác dụng của resveratrol [34]

+ Tác dụng an thần và chống lo âu: dịch chiết C sicyoides L có tác dụng an

thần, chống lo âu trên chuột, có thể là do tác dụng của flavonoid, linalool, tocopherol có trong lá cây [14]

α-1.2 Tổng quan về loài Cissus modeccoides Planch

1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Đặc điểm thực vật

Dây leo, dài 2 - 4 m hay hơn Thân màu lục, hơi có khía, thường pha lơ nhạt hay màu tía, phủ phấn trắng Tua cuốn đơn, mọc đối diện với lá Lá mọc so le, gốc hình tim, đầu nhọn, gân hình chân vịt, dài và rộng 6 - 8 cm, là gốc gần như nguyên, mép khía răng, lá ở phần trên xẻ sâu thành 5 - 7 thùy (thường là 5), thùy hình mác hẹp dài, có răng cưa, mặt trên xanh lục sẫm, mặt dưới hơi trắng; cuống

lá to dày; lá kèm thuôn, rụng sớm [2]

Cụm hoa mọc thành ngù, đối diện với lá, ngắn hơn lá, lá bắc thuôn, rụng sớm; hoa màu vàng nhạt; đài hình đấu hay hình chén, nhẵn, 4 răng nhỏ, tràng 4 cánh; nhị 4, bao phấn tròn; bầu nhẵn Mùa hoa quả từ tháng 7 - 9 [2]

quanh làng (vùng đồng bằng); ở ven các đồi cây bụi, bờ nương rẫy (vùng trung

du và núi thấp) [2]

1.2.2 Thành phần hóa học

Thân dây Chìa vôi chứa hợp chất phenolic, acid amin, saponin, acid hữu cơ Ngọn và lá non có nước 91,3%, protid 1,4%, glucid 5,4%, xơ 1,1%, tro 0,8%, caroten 1,5 mg%, vitamin C 45 mg% Hiện chưa có nghiên cứu chiết xuất và phân lập các hoạt chất trong cây Chìa vôi [2]

1.2.3 Công dụng và tác dụng dược lý

- Công dụng

Dây Chìa vôi chữa phong thấp, sưng tấy, đau lưng, đau xương, tê mỏi, đau đầu, ung nhọt sưng lở, trĩ, tràng nhạc, bỏng Lá, dây Chìa vôi giã đắp chỗ đau, liều lượng không hạn chế Lá giã với muối, nhai nuốt nước, bã đắp để chữa rắn cắn Ngoài ra, dây chìa vôi kết hợp với kim tiền thảo và một số dược liệu khác

có tác dụng điều trị sỏi niệu quản [2] Dây Chìa vôi được dân tộc Mường và Dao

ở vườn quốc gia Ba Vì sử dụng trong điều trị viêm khớp [13]

- Tác dụng dược lý

Dây chìa vôi có tác dụng lợi tiểu; làm tăng tỷ lệ sống và kéo dài thời gian cầm

cự của chuột khi tiêm liều độc nọc rắn hổ mang cho chuột [2]

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

Phần trên mặt đất dây Chìa vôi thu hái vào tháng 7/2017 tại xã Cẩm Lý, huyện Lục Nam, tỉnh Bắc Giang, về rửa sạch thái thành đoạn ngắn 3 - 4 cm phơi sấy khô cho vào túi nilon kín bảo quản để nghiên cứu

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Hóa chất, dung môi

- Các dung môi hữu cơ dùng để chiết là các dung môi tinh khiết : EtOH 96%,

MeOH, n-hexan; chloroform; dicloromethan; ethyl acetate; n-butanol

- Các chất tẩy – nhuộm tiêu bản: Nước Javen, cloral hydrat, acid acetic, đỏ son phèn, xanh methylen

- Các thuốc thử cho phản ứng định tính: TT Bouchardat, TT Mayer, TT Dragendorff, TT Diazo, FeCl3 5%, NaOH 10%, HCl, H2SO4 đặc,

- Bột silica gel pha thuận cỡ hạt 40 – 63 µm; bột silica gel pha đảo cỡ hạt 30 –

- Máy cất quay chân không Buchi Rotavapor R-200

- Đèn tử ngoại CAMAG 2 bước sóng 254 nm, 366 nm

- Kính hiển vi nối camera, máy tính (Eclipse Ci-L) 520-526NSADBTW

- Bản mỏng silica gel 60 F254 tráng sẵn trên tấm nhôm (Merck), bản mỏng

➢ Đặc điểm hình thái thực vật và giám định tên khoa học:

Quan sát, mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu theo các phương pháp mô tả cây thuốc Đối chiếu đặc điểm của cây với các tài liệu và nhờ sự giám định của chuyên gia để giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu Tiêu bản mẫu khô được lưu tại phòng Tiêu bản cây thuốc, Bộ môn Thực vật – trường Đại học Dược Hà Nội

➢ Nghiên cứu đặc điểm vi học:

- Đặc điểm vi phẫu: Vi phẫu được cắt theo phương pháp cắt trực tiếp, tẩy và nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép, quan sát dưới kính hiển vi để xác định đặc điểm vi phẫu và chụp ảnh dưới kính hiển vi [7]

- Đặc điểm bột: Lá, thân sấy khô ở 600C, nghiền nhỏ thành bột mịn bằng thuyền tán, rây lấy bột mịn, lên tiêu bản, quan sát dưới kính hiển vi để xác định đặc điểm bột và chụp ảnh dưới kính hiển vi [4]

2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

2.2.2.1 Định tính các nhóm chất

Dùng thuốc thử đặc trưng của mỗi nhóm chất để định tính trong ống nghiệm các nhóm chất trong dược liệu theo các tài liệu [3], [4]

2.2.2.2 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập các hợp chất

- Chiết xuất: chiết xuất bộ phận trên mặt đất cây chìa vôi bằng EtOH 960, cô thu hồi dung môi tới cắn, hòa tan cắn với khoảng 500 ml nước, tiến hành chiết

lỏng – lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần thu được 4 phân đoạn: hexan, chloroform, ethyl acetat và n-butanol Phân lập một hợp chất từ phân

n-đoạn ethyl acetat

Kiểm tra các chất rửa giải bằng sắc kí lớp mỏng, gộp các chất có cùng sắc ký

đồ, cùng màu sắc lại kiểm tra độ tinh khiết Sau đó đưa đi đo phổ để nhận dạng chất

- Xác định cấu trúc chất phân lập được

Các chất phân lập được xác định cấu trúc dựa trên kết quả phân tích phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 1C-NMR, DEPT) và so sánh

dữ liệu thu được với các dữ liệu đã công bố

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật

3.1.1 Đặc điểm thực vật của dây Chìa vôi (Cissus modeccoides Planch.)

Cơ quan sinh dưỡng

Dây leo, dài 2 - 4 m Thân màu lục, thường pha lơ nhạt hay màu tía, tiết diện tròn, phủ một lớp bột trắng Tua cuốn đơn, mọc đối diện với lá

Lá đơn, mọc so le Cuống lá dài 5 - 7 cm, hình trụ, màu xanh hoặc xanh sẫm, gốc hơi to và thường bị vặn Phiến lá thường xẻ thùy chân vịt từ 3 - 5 thùy sâu hoặc nông, gốc hình tim, dài 7 - 11 cm, rộng 6-9 cm; ít khi hình mũi giáo, gốc hình tim, dài và rộng 7 - 10 cm; nhẵn cả hai mặt, mặt trên màu xanh lục sẫm, mặt dưới nhạt hơn; mép lá có răng cưa Gân lá hình lông chim, thường có 3 gân gốc Lá kèm rụng sớm, là 2 phiến hình bầu dục, nhỏ, mỏng, mọc rời, khi non màu xanh lục, về sau chuyển màu nâu (Hình 3-1)

Hình 3-1 Cơ quan sinh dưỡng của dây Chìa vôi (Cissus modeccoides Planch.)

A Dây có tua cuốn; B, C Lá xẻ thùy; D, E Lá hình mũi giáo; F Lá kèm; G

Bột trắng phủ thân

Cơ quan sinh sản

Do trong thời gian thực hiện nghiên cứu, cây chưa ra hoa, quả nên nhóm nghiên cứu chưa phân tích được đặc điểm của cơ quan sinh sản

Giám định tên khoa học

Quan sát các đặc điểm của loài nghiên cứu và tham khảo các tài liệu sẵn có

và sự xác nhận của Ths Nghiêm Đức Trọng (giảng viên Bộ môn Thực vật – Đại

học Dược Hà Nội) dây Chìa vôi được giám định tên khoa học là Cissus

modeccoides Planch., họ Nho (Vitaceae) Cây được gửi tiêu bản tại bộ môn

Thực vật – Đại học Dược Hà Nội theo số hiệu HNIP/18519/18

3.1.2 Đặc điểm vi phẫu của dây Chìa vôi (Cissus modeccoides Planch.)

➢ Quy trình tẩy, nhuộm

- Vi phẫu được cắt theo phương pháp cắt trực tiếp

- Tẩy mẫu bằng nước Javen trong 15 phút, rửa với nước cất 3 lần

- Tẩy mẫu với Cloral hydrat trong 30 phút, rửa với nước cất 3 lần

- Ngâm mẫu trong acid acetic trong 15 phút, rửa với nước cất 3 lần

- Nhuộm xanh bằng xanh methylen trong 10 giây, rửa với nước cất 3 lần

- Nhuộm đỏ bằng cách ngâm vào dung dịch đỏ son phèn trong 5 phút, rửa sạch với nước cất 3 lần

- Lên tiêu bản

➢ Vi phẫu thân Dây chìa vôi (Hình 3-2):

Vi phẫu cắt ngang hình tròn, vùng vỏ chiếm 1/5 diện tích, vùng trung trụ 4/5 Đi

từ ngoài vào trong có các đặc điểm sau:

+ Vùng vỏ:

- Biểu bì là 1 lớp tế bào hình chữ nhật, lớp cutin dày

- Dưới biểu bì là mô mềm vỏ ngoài, gồm 4-6 lớp tế bào hình đa giác hay hình

mềm vỏ ngoài, tập trung ở lớp tế bào ngay trên mô dày

gỗ, xếp khít nhau; gỗ cấp 1 gồm 2-5 mạch gỗ không đều, phân hóa ly tâm

- Giữa 2 bó libe – gỗ có các tia ruột, là những tế bào hình chữ nhật, vách mỏng, xếp thành dãy xuyên tâm

- Nối liền các bó libe - gỗ là một vòng mô cứng liên tục, gồm 2-3 lớp tế bào

vách hóa gỗ

- Mô mềm ruột rộng, tế bào hình tròn hay hình đa giác, vách mỏng

Hình 3-2 Vi phẫu thân dây Chìa vôi (Cissus modeccoides Planch.)

1- Biểu bì; 2- Mô mềm vỏ ngoài; 3- Tinh thể canxi oxalat hình cầu gai; 4- Mô dày; 5- Mô cứng; 6- Mô mềm vỏ trong; 7- Libe; 8- Mô mềm gỗ; 9- Tia ruột; 10- Mạch gỗ cấp 2; 11- Vòng mô cứng; 12- Mạch gỗ cấp 1; 13- Mô mềm ruột

➢ Vi phẫu lá dây chìa vôi (Hình 3-3)

+ Gân lá: mặt trên chóp nhọn, mặt dưới lồi tròn

- Biểu bì trên và biểu bì dưới tế bào không đều, hình chữ nhật; lớp cutin dày

- Mô dày trên chỉ có ở phần đỉnh chóp nhọn

- Bó libe gỗ ở giữa, 6 bó kích thước không đều xếp thành vòng; bó lớn nhất phía trên và ngay dưới chóp nhọn, hình bầu dục; 3 bó phía dưới nhỏ hơn, thuôn dài; 2

bó bên rất nhỏ; mỗi bó gồm libe ở dưới bao lấy bó gỗ ở trên; mạch gỗ hình đa giác, không đều, xếp lộn xộn

- Mô mềm gỗ là những tế bào nhỏ, hình đa giác, xếp khít nhau

- Mô dày dưới 2-3 lớp tế bào có vách dày ở góc, tạo thành một cung liên tục

- Hạ bì là 1-2 lớp tế bào hình tròn, thường to hơn các tế bào mô dày

- Tinh thể calci oxalat hình cầu gai và hình kim nằm rải rác

+ Phiến lá:

- Biểu bì là một lớp tế bào hình đa giác, kích thước không đều; lớp cutin mỏng hơn ở gân lá

- Mô giậu trên là các tế bào hình chữ nhật, vách mỏng, xếp khít nhau

- Tinh thể calci oxalat hình cầu gai nằm rải rác, tế bào chứa tinh thể hình kim có vách dày

Hình 3-3 Vi phẫu lá dây Chìa vôi (Cissus modeccoides Planch.)

1, 11- Biểu bì dưới; 10,12- Biểu bì trên; 2- Hạ bì; 4,9- Mô dày; 3- Tinh thể canxi oxalat hình cầu gai; 5- Mô mềm; 6- Libe; 7- Mạch gỗ; 8- Mô mềm gỗ; 13- Mô giậu trên; 14- Tinh thể canxi oxalat hình kim

3.1.3 Đặc điểm soi bột của dây Chìa vôi (Cissus modeccoides Planch.)

➢ Bột thân: Bột màu vàng, soi thấy có hạt tinh bột dày đặc, nằm tự do hoặc

nằm trong mô mềm, hình trứng, hình tròn hoặc hình bầu dục với nhiều kích thước khác nhau; tinh thể calci oxalat có 3 dạng: tinh thể hình cầu gai nằm rải rác hay nằm trong mảnh bó sợi; tinh thể hình kim kết thành bó hay nằm rời

rạc, bó tinh thể nằm trong tế bào mô mềm vách dày và tinh thể hình khối; ngoài ra còn có các mảnh biểu bì, một số mảnh có mang lỗ khí và mảnh mạch mạng (Hình 3-4)

Hình 3-4 Bột thân dây Chìa vôi (Cissus modeccoides Planch.)

1- Mảnh biểu bì chứa lỗ khí; 2- bó sợi chứa tinh thể canxi oxalat; 3- Tinh thể canxi oxalat hình cầu gai; 4- Tinh thể canxi oxalat hình khổi; 5- Hạt tinh bột; 6- Mảnh mô mềm mang hạt tinh bột; 7- Mảnh mạch mạng; 8,9- Tinh thể canxi

oxalat hình kim

➢ Bột lá: bột màu xanh, soi thấy có mảnh biểu bì, mảnh mạch xoắn, mảnh sợi

mang tinh thể canxi oxalat hình cầu gai, lông che chở đơn bào, tinh thể calci oxalat có 2 dạng: hình cầu gai và hình kim đặc điểm tương tự như trong bột thân; ngoài ra cón có hạt tinh bột rải rác, số lượng ít hơn so với bột thân (Hình 3-5)

Hình 3-5 Bột lá dây Chìa vôi (Cissus modeccoides Planch.)

1- Mảnh biểu bì; 2- Sợi mang tinh thể canxi oxalat; 3- Lông che chở, 4- Bó sợi; 5- Mảnh mạch xoắn; 6- Hạt tinh bột; 7,8- Tinh thể canxi oxalat hình kim; 9-

Tinh thể canxi oxalat hình cầu gai

3.2 Nghiên cứu thành phần hóa học

3.2.1 Định tính các nhóm chất

3.2.1.1 Định tính glycosid tim

Chiết xuất: Chiết 5-10 g dược liệu với ether dầu hỏa bằng Soxhlet để loại tạp Chlorophyll hay sắc tố khác Dược liệu thu được chiết với cồn ethylic 50-900trên bếp cách thủy trong 30 phút, lọc Dịch lọc được loại tạp bằng chì acetat 30%, khuấy kỹ, lọc bỏ tủa Thêm vào dịch lọc dung dịch natri sulfat 15% để loại chì thừa Lọc, bay hơi dịch lọc trên bếp cách thủy cho đến cắn Cho dịch lọc vào bình gạn, lắc với chloroform Gạn lớp chloroform, bay hơi tới cắn Cắn thu được đem làm phản ứng định tính

➢ Phản ứng Liebermann – Burchard

Hòa tan cắn với 1 ml CHCl3, 1 ml anhydrid acetic trong ống nghiệm, lắc cho tan hết Nghiêng ống 450, cho từ từ vào thành ống nghiệm H2SO4 đậm đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng ngăn cách màu biến đổi từ hồng sang xanh lá

➢ Phản ứng Baljet

Hòa tan cắn trong ống nghiệm với 1 ml CHCl3 Thêm 1 ml thuốc thử Baljet

(1 phần acid picric 1% và 9 phần NaOH 10%), lắc đều Phản ứng dương tính nếu có màu đỏ cam đậm hơn so với ống chứng (chỉ chứa thuốc thử Baljet)

➢ Phản ứng Legal

Hòa tan cắn trong 3-4 giọt EtOH 960 Thêm vào đó 1-2 giọt pyridin (có thể thay bằng NaOH 10% trong EtOH), thêm tiếp dung dịch natri nitroprussiat 0,5% Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu đỏ cam, so sánh với ống chứng là ống không có cắn thấy ống thử có màu đậm hơn

➢ Phản ứng Keller – Kiliani

Hòa tan cắn trong ống nghiệm nhỏ với 1 ml dung dịch FeCl3 5% trong acid acetic, lắc đều Nghiêng ống 450, cho từ từ theo thành ống H2SO4 đậm đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Phản ứng dương tính nếu ở mặt tiếp xúc 2 lớp chất lỏng xuất hiện vòng màu đỏ hoặc nâu đỏ và dần dần lớp chất lỏng phía trên có màu xanh

3.2.1.2 Định tính saponin

Chiết xuất: Chiết 10 g dược liệu bằng ether dầu hỏa bằng Soxhlet để tạp Chlorophyll hay sắc tố khác Chiết dược liệu thu được bằng EtOH 700, đun hồi lưu Dịch chiết EtOH được bay hơi dung môi tới cắn

➢ Hiện tượng tạo bọt

Cho vào ống nghiệm lớn 0,1 g dược liệu, thêm 5 ml nước cất Lắc mạnh trong 5 phút Để yên, quan sát hiện tượng tạo bọt Nếu bọt còn bền vững sau 15 phút thì sơ bộ kết luận dược liệu có saponin

➢ Phản ứng Liebermann – Burchard

Hòa tan cắn trong 1 ml anhydrid acetic, thêm vào dung dịch 0,5 ml chloroform Nghiêng ống nghiệm 450, thêm từ từ theo thành ống H2SO4 đậm đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng ngăn cách có màu giữa hai lớp chất lỏng

- Có màu hồng đến đỏ tím thì sơ bộ kết luận dược liệu có saponin triterpen

- Có màu xanh dương đậm hay xanh lá cây thì sơ bộ kết luận dược liệu có saponin steroid