Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học của cây thạch châu (pyrenaria sp )

Do vậy, với mục đích bổ sung tư liệu cho việc nghiên cứu và sử dụng cây Thạch châu từ nguồn dược liệu trong nước một cách khoa học hơn, nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng cây cỏ làm thuốc tr

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà Nội

Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong thời gian nỗ lực nghiên cứu hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được

rất nhiều sự quan tâm, ủng hộ, hướng dẫn của thầy cô, bạn bè và gia đình

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy: TS Bùi

Hồng Cường - giảng viên Bộ môn Dược học cổ truyền, Trường đại học Dược Hà

Nội và DS Dương Thị Hảo đã hết lòng tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và động viên

tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Phương Thiện Thương cùng các anh chị cán

bộ Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu đã tạo điều kiện thuận lợi và

giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khóa luận

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu, các Bộ môn và toàn thể thầy

cô giáo trường Trường đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình dạy bảo tôi trong suốt 5

năm học vừa qua

Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn tới bố mẹ, gia đình, người thân và bạn bè,

những người đã luôn sát cánh động viên và giúp đỡ tôi vượt qua những lúc khó

khăn nhất trong học tập và quá trình hoàn thành khóa luận

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Dung

MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 THỰC VẬT 2

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Pyrenaria 2

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Pyrenaria 2

1.1.3 Phân loại thực vật chi Pyrenaria 3

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 4

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 6

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 6

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 7

2.3.1 Nghiên cứu về mặt thực vật 7

2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học 7

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 7

2.4.1 Nghiên cứu về đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học 7

2.4.2 Nghiên cứu về đặc điểm vi học 8

2.4.3 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng phản ứng hóa học 8

2.4.4 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng SKLM 15

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16

3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY THẠCH CHÂU 16

3.1.1 Đặc điểm hình thái 16

3.1.2 Giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu 19

3.1.3 Đặc điểm vi học 19

3.1.3.1 Đặc điểm vi phẫu 19

3.1.3.1.1 Đặc điểm vi phẫu lá 19

3.1.3.1.2 Đặc điểm vi phẫu thân 21

3.1.2.2 Đặc điểm bột 22

3.1.2.2.1 Đặc điểm bột lá 22

3.1.2.2.2 Đặc điểm bột thân 23

3.2 NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 24

3.2.1 Định tính sơ bộ các nhóm chất trong dược liệu bằng phản ứng hóa học 24

3.2.2 Định tính các nhóm chất đặc trưng bằng sắc kí lớp mỏng 26

3.3 BÀN LUẬN 34

3.3.1 Về thực vật 34

3.3.2 Về thành phần hóa học 34

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

1 DANH MỤC BẢNG

1 Bảng 3.1: Kết quả định tính hóa học các nhóm chất trong Thạch

2 Bảng 3.2: Kết quả SKLM cắn phân đoạn n-hexan 28

3 Bảng 3.3: Kết quả SKLM cắn phân đoạn ethyl acetat 29

4 Bảng 3.4: Kết quả SKLM cắn phân đoạn n-butanol 30

5 Bảng 3.5: Kết quả SKLM định tính nhóm flavonoid trong cắn

6 Bảng 3.6: Kết quả SKLM định tính tanin cắn ethanol và cắn nước 33

DANH MỤC HÌNH

1 Hình 1.1: Một số flavonoid có trong các loại trà Camellia 5

2 Hình 3.1: Ảnh cơ quan sinh dưỡng cây Thạch châu nghiên cứu 18

3 Hình 3.2: Ảnh cơ quan sinh sản cây Thạch châu nghiên cứu 18

9 Hình 3.8: Sơ đồ quy trình chiết các phân đoạn Thạch châu 27

ĐẶT VẤN ĐỀ

Khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng ẩm đã tạo nên cho đất nước Việt Nam thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng với hơn 12.000 loài thực vật khác nhau [15] Từ xa xưa, các lương y đã biết khai thác dược liệu từ thiên nhiên để làm thuốc góp phần làm giàu thêm cho nền y học cổ truyền dân tộc Trong vài thập kỷ gần đây, với xu hướng “Trở về với thiên nhiên”, ngày càng có nhiều nước trên thế giới đẩy mạnh nghiên cứu, bào chế và sản xuất các chế phẩm có nguồn gốc thiên nhiên,

từ dược liệu để phòng và điều trị bệnh Tuy nhiên phần lớn nguồn tài nguyên này ở Việt Nam được sử dụng theo kinh nghiệm y học cổ truyền mà chưa được nghiên cứu đầy đủ

Thạch châu là một loài cây mới được phát hiện ở một số tỉnh nước ta (Lâm Đồng, Quảng Trị, Lào Cai) [12], [30] Người dân những vùng này từ lâu đã thu hái

và sử dụng Thạch châu để pha nước uống giải nhiệt thay cho chè Ngoài ra, loài này còn được sử dụng trong các bài thuốc để thanh nhiệt, lợi tiểu, tăng sức đề kháng…[6] Tuy nhiên, hiện nay ở Việt Nam và trên thế giới có rất ít tài liệu nghiên cứu về cây Thạch châu, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào đặc điểm hình thái và phân loại theo các phương pháp mới như Protein hay AND [9], [12], [15], [24], [22], [31] Do vậy, với mục đích bổ sung tư liệu cho việc nghiên cứu và sử dụng cây Thạch châu từ nguồn dược liệu trong nước một cách khoa học hơn, nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng cây cỏ làm thuốc trong dân gian cũng như phục vụ cho công tác

tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm dược liệu sau này, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm

thực vật, thành phần hóa học của cây Thạch châu (Pyrenaria sp.)” được thực

hiện với hai mục tiêu sau:

1 Mô tả đặc điểm hình thái thực vật, đặc điểm vi học (vi phẫu, soi bột của thân, lá) và giám định chính xác tên khoa học của cây Thạch châu

2 Xác định sơ bộ các nhóm chất trong cây Thạch châu (phần trên mặt đất) bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 THỰC VẬT

1.1.1 Vị trí phân loại của chi Pyrenaria

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [1], [8], [9], [29], vị trí của chi

Pyrenaria như sau:

Ngành (Division): Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)

Lớp (Class): Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)

Bộ (Order): Thạch lam (Ericales)

Họ (Family) : Chè (Theaceae)

Chi (Genus): Pyrenaria

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố của chi Pyrenaria

1.1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Pyrenaria

Cây bụi hoặc cây đại mộc sống nhiều năm, cao từ 8 đến 17 m Thân trụ Lá mọc đối hoặc so le, có cuống nhỏ, mép lá khía răng, phiến lá hình bầu dục, thường

có rang tà, gân phụ, dài 8-14cm [1], [9], [12], [22], [23]

Hoa mọc ở nách lá, đơn độc, có cuống nhỏ hoặc gần như không cuống Tiền khai hoa kiểu vặn hoặc lợp Đài hoa 5 hoặc 6, kích thước không đều nhau, phía ngoài có phủ lông nhỏ và mịn, phía trong màu nâu và nhẵn Tràng hoa 5 hoặc hơn, màu trắng hoặc vàng nhạt, cánh hoa dính nhau ở đáy Nhị nhiều, gắn vào đế hoa theo nhiều vòng; bao phấn 2 ô, hướng trong, nứt dọc Bầu trên, 2-6 ô, mỗi ô 2-5 lá noãn [1], [12], [22], [23]

Quả nang hoặc quả đóng có hột cứng, thường là 2 hạt mỗi ô Vỏ quả hóa gỗ hoặc dai như da [12], [22], [23]

Hạt thuôn dài, bề mặt lồi và có góc cạnh, không cánh, vỏ hạt cứng, mịn, sáng bóng; rốn tuyến tính; không có nội nhũ; phôi lớn; lá mầm mỏng [22], [23]

1.1.2.2 Phân bố

Pyrenaria là một chi nhỏ thuộc họ Chè Theo các nghiên cứu công bố, ước

tính có khoảng hơn 50 loài trên thế giới thuộc chi này [22], [23], [30], phân bố chủ yếu ở vùng núi cao, khí hậu mát mẻ như: Đài Loan, Trung Quốc, Malasia, Đông

Nam Á và một số nước Đông Bắc Châu Mỹ [22], [30] Ở Việt Nam, theo thống kê

có khoảng 4 loài thuộc chi Pyrenaria phân bố ở Đà Lạt, Quảng Trị, Sapa [12]

1.1.3 Phân loại thực vật chi Pyrenaria

Một số loài thuộc chi Pyrenaria thường gặp ở Việt Nam:

1.1.3.1 P garretiana Craib - Thạch châu Garrett

Cây thường mọc ở Sapa, độ cao 1000-1850m [12], [23]

1.1.3.2 P jonqueriana Piere - Thạch châu Jonquier

Quả tự mở, dài khoảng 35mm, tròn hoặc chia thùy mờ Quả có vỏ dai như

da, trong chứa nhân cứng dài 35mm; hột 1-3 [12], [22], [23]

Hạt phẳng, có góc cạnh, không có cánh [23]

b, Phân bố

Cây thường mọc ở núi cao 800-1700m: Vọng Phu, Bạch Mã, Đà Lạt [12]

1 1.3.3 P polilaneana Gagn - Thạch châu Poilane

a, Đặc điểm thực vật

Cây đại mộc 13m; nhánh non mảnh, không lông Lá dài 7-10cm, không lông, tái ở mặt dưới (nâu lúc khô), bìa có răng [12]

Hoa trắng, rộng 3cm; lá đài như tơ ở mặt ngoài; cánh hoa dính nhau ở đáy; nhị nhiều; vòi nhụy 3 [12]

Quả có nhân cứng tròn, dẹp, to 35mm; hột 20x8mm [12]

b, Phân bố

Cây thường mọc ở vùng núi cao: Quảng Trị, Bạch Mã, Braian [12]

1.1.3.4 P serrata Bl - Thạch châu răng cưa

báo quốc tế được công bố gần đây, loại trà hoa Nhật (Camellia japonica) họ Chè có

chứa cafein, polyphenol, tanin (camelliatanin A và B), gemin D, casuariin [25],

[21]… Đặc biệt, loài trà Camellia sinensis đã và đang được quan tâm nghiên cứu

nhiều nhất, các thành phần được biết đến gồm có flavonoid như epigallocatechin, epicatechin, gallocatechin, catechin (Hình 1.1), nhất là hợp chất epigallocatechin gallat (EGCG) có tác dụng tốt cho sức khỏe con người; ngoài ra còn có polyphenol, amino acid, vitamin, alkaloid, polysaccharid [25], [28]

Epigallocatechin gallate Catechin

Hình 1.1: Một số flavonoid có trong các loại trà Camellia

Hiện nay các nghiên cứu về chi Pyrenaria chủ yếu tập trung vào phân loại

theo các phương pháp mới như Protein hay AND [24], [31], hầu như chưa có nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu: Phần trên mặt đất (cành, lá, hoa, quả) của cây Thạch châu được thu hái ở Mê Linh, Lâm Hà, Lâm Đồng vào tháng 3/2015 Mẫu được làm sạch phơi khô, đựng trong 2 lần túi PE kín và lưu trữ tại Phòng Lưu mẫu, Khoa Hóa phân tích - Tiêu chuẩn, Viện Dược liệu

Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học tại Bộ môn Thực vật, Trường đại học Dược Hà Nội theo Phiếu giám định số 02/2015 Mẫu được lưu tại Phòng tiêu bản cây thuốc, Bộ môn Thực vật với số hiệu là HNIP/18110/15

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

 Thiết bị dùng cho nghiên cứu

- Cân kỹ thuật Precisa, cân phân tích, bếp đun cách thủy

- Tủ sấy Memmert, máy xác định độ ẩm Precisa HA60

- Máy cất quay thu hồi dung môi BUCHI R-200

- Đèn tử ngoại Vilbez lourmat (hai bước sóng UV 254nm và UV 366nm)

- Pipet vạch, Pipet Paster, Pipet chính xác, ống nghiệm, bình nón, bình gạn, bình cầu, phễu, giấy lọc…

- Máy chấm sắc ký Camag Linomat 5, máy chụp sắc ký Camag Reprostar 3

- Máy vi tính với phần mềm winCATS và VideoScan

- Bản sắc ký lớp mỏng Silicagel 60F254 (Merck) (code: 1.05554.0001)

- Máy ảnh Canon, Samsung 10.3

 Hóa chất, dung môi, dụng cụ

- Các dung môi: ethanol (C), methanol (Me), hexan (H), ethyl acetat (E),

n-buthanol (B), acid formic, cloroform, toluen, ether dầu hỏa… đạt tiêu chuẩn phân tích theo tiêu chuẩn DĐVN IV

- Các thuốc thử dùng trong nghiên cứu bằng phản ứng hóa học: TT Lugol, TT Bouchardat, TT Mayer, TT Dragendoff, TT Diazo,… được pha chế theo hướng dẫn của DĐVN IV

- Các thuốc thử hiện màu trong sắc ký lớp mỏng, đặc hiệu cho các nhóm chất: hỗn hợp acid boric 10% - acid oxalic 10% trong nước (tỷ lệ 2:1), anisaldehyd trong cồn, acid sulfuric 10% trong cồn… pha theo các tài liệu tham khảo

- Dụng cụ: các dụng cụ thủy tinh và các dụng cụ khác dùng trong phòng thí nghiệm (bộ dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay, dao cắt, cốc có mỏ, đũa thủy tinh, đĩa petri, ống nghiệm, pipet, bình gạn, bình nón, lam kính, chày cối, bát sứ, mao quản, cốc chạy sắc ký…)

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu về mặt thực vật

Đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học: Quan sát, mô tả dược liệu

về đặc điểm thực vật, hình dạng, màu sắc, mùi vị, kích thước bằng mắt thường và chụp ảnh, làm tiêu bản ép, đối chiếu với các tài liệu phân loại thực vật để xác định

tên khoa học của mẫu nghiên cứu [1], [12], [18], [19]

Đặc điểm vi học: Nghiên cứu đặc điểm vi học theo tài liệu thực tập Thực tập

dược liệu (phần vi học) [4] Kết quả được xem dưới kính hiển vi có tích hợp máy

ảnh kỹ thuật số

2.3.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học

Định tính bằng phản ứng hóa học từ dịch chiết toàn phần của Thạch châu bằng các dung môi khác nhau (nước, ethanol, ether dầu hỏa, acid sulfuric)

Định tính một số nhóm chất đặc trưng bằng SKLM: sử dụng ethanol 99,7%

chiết xuất và phân bố dần vào các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexan, ethylacetat, n-buthanol Khảo sát hệ dung môi pha động để định tính các nhóm chất

chính trong các phân đoạn bằng các thuốc thử đặc trưng

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Nghiên cứu về đặc điểm hình thái và giám định tên khoa học

Mô tả đặc điểm theo phương pháp ghi trong tài liệu hướng dẫn thường quy, đối chiếu các tài liệu tham khảo để xác định tên khoa học [1], [12]

2.4.2 Nghiên cứu về đặc điểm vi học

Sau khi thu hái, mẫu được đem xử lý bằng các phương pháp thích hợp rồi

nghiên cứu:

- Vi phẫu: tiến hành làm vi phẫu theo các bước sau:

+ Chọn mẫu thích hợp

+ Cắt tiêu bản bằng dụng cụ cắt vi phẫu cầm tay

+ Xử lý lát cắt: Lựa chọn những lát cắt mỏng, tẩy bằng dung dịch javen, rửa sạch bằng nước cất, tẩy tiếp bằng chloralhydrat 75%, rửa lại bằng nước cất, ngâm trong acid acetic 5%, rửa bằng nước cất đến hết acid Sau đó tiến hành nhuộm kép với xanh methylen và đỏ son phèn

+ Quan sát, mô tả và chụp ảnh: Lên tiêu bản bằng dung dịch hỗn hợp glycerin - nước (1:1) rồi quan sát dưới kính hiển vi, mô tả đặc điểm giải phẫu, chụp ảnh bằng máy ảnh qua kính hiển vi

- Bột dược liệu:

+ Mẫu nghiên cứu được sấy khô, nghiền thành bột

+ Quan sát trực tiếp, nếm, ngửi để xác định màu, mùi, vị

+ Lên tiêu bản bột dược liệu bằng dung dịch hỗn hợp glycerin - nước (1:1), quan sát, mô tả và chụp ảnh những đặc điểm điển hình của bột qua kính hiển vi có kết hợp máy ảnh để lưu mẫu

2.4.3 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng phản ứng hóa học

Chuẩn bị mẫu: Sấy khô dược liệu trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C Đem ra tán nhỏ bằng thuyền tán thành bột thô, bảo quản trong túi nilon kín, để ở chỗ thoáng mát, khô ráo

Định tính các nhóm chất hữu cơ chính trong dược liệu Thạch châu bằng phản ứng hóa học đặc trưng theo các tài liệu [3], [5], [6]

2.4.3.1 Định tính flavonoid

Cân khoảng 10g bột dược liệu cho vào bình nón 100ml, thêm 50ml ethanol 90% Đun cách thủy 10 phút, lọc nóng lấy dịch lọc làm các phản ứng sau:

a, Phản ứng Cyanidin (phản ứng Shinoda)

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết, thêm một ít bột Mg kim loại (khoảng 10mg) Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc (3-5) giọt Để yên một vài phút, nếu có flavonoid sẽ thấy dung dịch chuyển từ màu vàng sang màu đỏ cam

b, Phản ứng với kiềm

Phản ứng với hơi amoniac: Nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô

rồi hơ trên miệng lọ có chứa amoniac đặc đã mở nút, đối chiếu với tờ giấy nhỏ giọt dịch chiết đối chứng Nếu có flavonoid sẽ thấy vết màu vàng đậm lên

Phản ứng với NaOH 10%: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết Thêm

vài giọt dung dịch NaOH 10%, nếu có flavonoid sẽ thấy xuất hiện tủa vàng và khi thêm 1ml nước cất, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch tăng thêm

c, Phản ứng với FeCl 3

Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết, thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, nếu có flavonoid sẽ thấy xuất hiện dung dịch màu xanh đen

d, Phản ứng với diazo hóa

Chuẩn bị thuốc thử: Hòa tan 0,9g acid sulfanilic trong 9ml HCl đậm đặc

(đun nóng), pha loãng với nước đến 100ml Lấy 10ml dung dịch ngâm trong nước

đá rồi cho thêm 10ml dung dịch NaNO2 4,5% cũng vừa được ngâm trong nước đá Lắc đều rồi giữ ở nhiệt độ 0oC trong 15 phút Dung dịch chỉ pha để dùng ngay

Cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (NaOH, KOH, Na2CO3), thêm vài giọt thuốc thử Diazo mới pha, lắc đều (có thể đun nóng trên nồi cách thủy vài phút), nếu có flavonoid sẽ xuất hiện màu đỏ

2.4.3.2 Định tính coumarin

Dịch chiết chuẩn bị như trong phản ứng định tính flavonoid dùng để tiến hành các phản ứng sau:

a, Phản ứng mở đóng vòng lacton

Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết:

- Ống 1: thêm 0,5ml dung dịch NaOH 10%

- Ống 2: để nguyên

Đun cả hai ống nghiệm đến sôi, để nguội rồi quan sát Nếu có coumarin quan sát thấy, ống 1 xuất hiện tủa vàng, ống 2 dung dịch vẫn trong Thêm vào cả hai ống nghiệm mỗi ống 1ml nước cất, lắc đều rồi quan sát:

c, Quan sát huỳnh quang của các vết coumarin dưới ánh sáng tử ngoại khi tác

dụng với dung dịch kiềm

Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy thấm, nhỏ tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5% Sấy nhẹ, che một phần diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng một miếng kim loại (chìa khóa, đồng xu,…) rồi chiếu tia tử ngoại trong một vài phút Bỏ miếng kim loại

ra Quan sát tiếp dưới đèn tử ngoại, nếu có coumarin sẽ thấy: phần không bị che có huỳnh quang sáng hơn phần bị che Nếu tiếp tục chiếu tia tử ngoại, phần bị che sẽ sáng dần lên Sau vài phút cả hai phần sẽ phát quang như nhau

2.4.3.3 Định tính saponin

Quan sát hiện tượng tạo bọt: cho 5g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250ml, thêm 5ml ethanol 90% Đun cách thủy sôi 15 phút Lọc nóng qua giấy lọc, dịch lọc được đưa vào làm các phản ứng:

b, Phân biệt 2 loại saponin

Lấy hai ống nghiệm có đường kính trong bằng nhau:

- Ống 1: cho 5ml HCl 0,1N

- Ống 2: cho 5ml NaOH 0,1N

Cho thêm 1ml dịch chiết ethanol vào mỗi ống rồi bịt miệng ống nghiệm bằng ngón tay cái, lắc mạnh cả hai ống trong 30 giây Để yên, quan sát cột bọt sau 15 phút

Nếu cột bọt ở cả hai ống bằng nhau thì sơ bộ kết luận dược liệu chứa saponin triterpenoid

Nếu cột bọt ở ống chứa NaOH cao hơn thì sơ bộ kết luận dược liệu chứa saponin steroid

c, Phản ứng Salkowski

Cho 2ml dịch chiết vào ống nghiệm Nghiêng ống nghiệm 45 độ, cho từ từ theo thành ống nghiệm 2-3 giọt acid sulfuric đặc, nếu có saponin sẽ xuất hiện vòng màu đỏ tía ở mặt phân cách Lắc nhẹ dung dịch chuyển sang màu đỏ

2.4.3.4 Định tính glycosid tim

Cho 20 g bột dược liệu vào bình nón dung tích 250ml, thêm 60ml cồn 25o, lắc đều, ngâm trong 24 giờ Lọc lấy dịch chiết, loại tạp (chất nhầy, chất nhựa) bằng chì acetat 30% để dư Để lắng, lọc Loại chì acetat thừa bằng dung dịch Na2SO4 bão hòa đến khi không còn tủa với Na2SO4 nữa Lọc lấy dịch lọc vào bình gạn Lắc kỹ 2 lần với hỗn hợp cloroform : ethanol (4:1), mỗi lần 20ml, để lắng, gạn lấy dịch chiết, loại nước bằng cách lọc qua bông Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm đã được sấy khô, đem cô cách thủy đến khô Cắn thu được để làm phản ứng định tính

a, Phản ứng Liberman

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 1ml anhydrid acetic, lắc đều cho tan hết cắn Nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống nghiệm 1ml H2SO4 đặc để dịch lỏng trong ống nghiệm chia thành hai lớp Nếu có glycosid tim, quan sát thấy có vòng màu hồng tím đến xanh ở mặt tiếp xúc 2 lớp chất lỏng

b, Phản ứng Baljet

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet (cho vào ống nghiệm to 1 phần dung dịch acid

picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10%, lắc đều) mới pha vào ống nghiệm Nếu

có glycosid tim sẽ xuất hiện màu đỏ cam

c, Phản ứng Legal

Cho vào ống nghiệm có chứa cắn 0,5ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn Nhỏ 1 giọt dung dịch natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều Nếu có glycosid tim sẽ xuất hiện màu đỏ

d, Phản ứng Keller-Kiliani

Cho vào ống nghiệm chứa cắn 0,5ml ethanol 90%, lắc đều cho tan hết cắn Thêm vào giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic, lắc đều Nghiêng ống 45o Cho từ từ theo thành ống 0,5ml acid H2SO4 đặc, tránh xáo trộn chất lỏng trong ống nghiệm Nếu có glycosid tim, quan sát thấy có vòng màu tím đỏ ở mặt tiếp xúc 2 lớp chất lỏng

2.4.3.5 Định tính anthranoid (dạng tự do)

a, Phản ứng Bortraeger

Chiết xuất: Lấy 1g bột dược liệu cho vào ống nghiệm lớn (10ml) Thêm 5ml

nước cất, đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc hoặc qua một lớp bông mỏng vào trong bình gạn dung tích 50ml Làm nguội dịch lọc Thêm 5ml cloroform Lắc nhẹ Gạn bỏ lớp nước Giữ lớp cloroform

để làm phản ứng

Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1ml dung dịch amoniac 10% Lắc nhẹ nếu có anthranoid tự do lớp nước sẽ có màu đỏ sim Nếu lớp cloroform có màu vàng chứng tỏ trong dược liệu có acid chrysophanic Thêm tiếp tục từng giọt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Lớp dung môi hữu cơ sẽ mất màu vàng còn lớp nước sẽ đỏ thẫm hơn lúc ban đầu

Lấy 1ml dịch chiết cloroform cho vào ống nghiệm nhỏ Thêm 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ Nếu có anthranoid lớp nước sẽ có màu đỏ sim

Anthranoid toàn phần (dạng glycosid và dạng tự do) được định tính hoàn toàn tương tự nhưng trong bước chiết xuất ban đầu thay thế 5ml nước cất bằng 5ml

H2SO4 1N

2.4.3.6 Định tính tanin

Lấy khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi trong 2 phút, để nguội, lọc Dịch lọc được dùng để làm các phản ứng định tính sau:

- Phản ứng 1: cho vào ống nghiệm 2ml dịch lọc Thêm 2 giọt dung dịch FeCl35% (TT) nếu có tanin sẽ xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt

- Phản ứng 2: cho vào ống nghiệm 2ml dịch lọc Thêm 2 giọt chì acetat 10% (TT), nếu có tanin sẽ xuất hiện tủa bông

- Phản ứng 3: cho vào ống nghiệm 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% nếu có tanin sẽ xuất hiện tủa bông trắng

2 4.3.7 Định tính alcaloid

Cân 0,5g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml Thêm 15ml dung dịch acid sulfuric 1N, đun đến sôi, để nguội, lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100ml, kiềm hóa dịch lọc bằng dung dịch amoniac 6N (khoảng 8ml) đến pH = 9-10 (thử bằng giấy quỳ hoặc chỉ thị màu vạn năng) Chiết alcaloid bằng cloroform (chiết 3 lần, mỗi lần 5ml) Gộp các dịch chiết cloroform Loại nước bằng natrisulfat khan Lấy một phần dịch chiết cloroform đem lắc với acid sulfuric 1N hai lần, mỗi lần 5ml Gộp các dịch chiết nước Chia đều vào các ống nghiệm nhỏ, mỗi ống 1ml Nhỏ vào từng ống nghiệm 2-3 giọt lần lượt các thuốc thử sau:

Ống nghiệm Thuốc thử đặc trưng Kết quả phản ứng nếu có

alkaloid sẽ xuất hiện

Ống 1 1ml dịch chiết + 2 giọt thuốc

2.4.3.8 Định tính đường khử, polysaccharid, acid amin, acid hữu cơ

Lấy khoảng 1g bột dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml, thêm 20ml nước cất, đun sôi trong 2 phút Để nguội Lọc Dịch lọc được dùng để làm phản ứng định tính sau:

Định tính đường khử: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2ml dịch chiết nước Thêm vào 5

giọt thuốc thử Fehling A và 5 giọt thuốc thử Fehling B Đun cách thủy 10 phút Nếu

có đường khử: đáy ống nghiệm xuất hiện kết tủa đỏ gạch

Định tính polysaccharid: Lấy hai ống nghiệm lớn Cho vào mỗi ống:

- Ống 1: 4ml dịch chiết nước và 5 giọt thuốc thử Lugol

- Ống 2: 4ml nước cất và 5 giọt thuốc thử Lugol

Quan sát và so sánh hai ống nghiệm: nếu có polysaccharid, ống 1 có màu xanh đậm hơn ống 2

Định tính acid amin: Cho vào ống nghiệm nhỏ 2ml dịch chiết nước Thêm vào 3

giọt thuốc thử Ninhydrin 3% Đun cách thủy sôi 10 phút Nếu có acid amin, xuất hiện dung dịch màu xanh tím

Định tính acid hữu cơ: Cho vào ống nghiệm lớn 4ml dịch chiết nước Thêm một ít

bột Na2CO3 vào ống nghiệm Nếu có acid hữu cơ, xuất hiện bọt khí bay lên

2.4.3.9 Định tính chất béo, sterol, caroten

Cân 10g bột dược liệu cho vào bình nón 100ml Đổ ngập ether dầu hỏa Ngâm qua đêm Lọc thu lấy dịch lọc để làm phản ứng:

Định tính chất béo: nhỏ 2 giọt dịch chiết ether dầu hỏa lên giấy lọc Hơ nóng cho

bay hơi hết dung môi Nếu có chất béo thì quan sát thấy vết mờ trên giấy lọc

Định tính sterol: cho vào ống nghiệm nhỏ 2ml dịch chiết ether dầu hỏa, cô cách

thủy bốc hơi dung môi đến khô Thêm vào ống nghiệm 1ml anhydrid acetic, lắc kỹ

Để nghiêng ống nghiệm 45 độ, nhỏ từ từ 3 giọt acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm Quan sát nếu có sterol thì sẽ thấy tại mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng

có vòng tròn màu tím đỏ

Định tính caroten: cho vào ống nghiệm nhỏ 2ml dịch chiết ether dầu hỏa Cô cách

thủy bốc hơi dung môi đến cắn Thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn Quan sát: nếu có caroten sẽ thấy dung dịch chuyển sang màu xanh lá đậm

2.4.4 Nghiên cứu thành phần hóa học bằng SKLM

Chiết xuất dịch chiết toàn phần bằng ethanol 99,7% bằng phương pháp chiết nóng hồi lưu, thu hồi dung môi dưới áp suất giảm Lắc phân đoạn bằng phân bố cắn dịch chiết ethanol vào nước và chiết lỏng - lỏng với các dung môi có độ phân cực

tăng dần theo thứ tự lần lượt là n-hexan, ethyl acetat, n-butanol kết hợp thu hồi dung

môi dưới áp suất giảm

Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi khác nhau để chọn ra hệ dung môi cho kết quả phân tách tốt nhất đối với từng phân đoạn kết hợp quan sát ở các bước sóng UV-VIS và thuốc thử hiện màu đặc trưng, lưu giữ bằng máy ảnh

Các thông số đặc trưng:

- Bản mỏng: Bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck) kích thước 10x20cm

- Dung môi khai triển: khảo sát theo các tài liệu hướng dẫn có thay đổi theo kết quả thực tế phân tích

- Dung dịch chấm bản mỏng: dịch chiết toàn phần và các phân đoạn

Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên bản mỏng 10-15μl các dung dịch phân

tích Sau khi triển khai bản mỏng bằng các hệ dung môi đã lựa chọn, để khô trong không khí hoặc sấy nhẹ Phun các thuốc thử hiện màu đặc trưng có các nhóm chất

và sấy ở nhiệt độ phù hợp Quan sát kết hợp chụp ảnh dưới ánh sáng UV 254nm, 366nm, ánh sáng thường trước và sau khi phun thuốc thử

Chương 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CÂY THẠCH CHÂU

3.1.1 Đặc điểm hình thái

Cây gỗ 7-15m, sống lâu năm Thân có màu nâu, tiết diện tròn Cành chia nhiều nhánh (Hình 3.1a) Lá đơn, mọc so le (Hình 3.1b); hình mác thuôn, đầu nhọn, phiến lá dài, mỏng, dai; không có lá kèm; dài khoảng 5-15cm; mặt trên nhẵn, có màu xanh nõn chuối khi non (Hình 3.1d), xanh đậm khi già (Hình 3.1a); mặt dưới của lá non và đầu chồi có lông nhỏ, trắng, mịn (Hình 3.1c); gốc lá thuôn hoặc tròn, ngọn lá nhọn; mép lá: phía gốc lá nguyên, phía ngọn lá: khía răng cưa; gân lá hình lông chim, gân chính nổi rõ (Hình 3.1d)

Hoa mọc đơn độc ở đầu cành, nách lá hoặc ở các vết sẹo trên thân; không cuống hoặc có cuống nhỏ (Hình 3.1b); màu vàng, mẫu 5, lưỡng tính (Hình 3.2b) Đế hoa lõm hình chén (Hình 3.2b) Bao hoa xếp xoắn Đài: 10-15 cánh đài gần tròn, hình trứng, có lông phủ ở mặt ngoài và ở mép (Hình 3.2e) Tràng 14-15, đều, hình gần tròn hoặc hình trứng, cả mặt trong và mặt ngoài của cánh hoa phủ một lớp lông mịn (Hình 3.2e), phiến to nhất dài 1,5cm Nhị nhiều, hơi dính nhau ở gốc chỉ nhị thành ống, xếp thành nhiều vòng trên đế hoa (Hình 3.2c); chiều dài bộ nhị 0,5-1cm,

bộ nhị gồm 3-6 hàng tiểu nhị, màu vàng đậm; chỉ nhị dài, nhẵn; bao phấn đính lưng,

2 ô, hình thận, hướng trong, nứt dọc (Hình 3.2c) Bộ nhụy gồm 3 lá noãn hợp thành bầu trên hình cầu (Hình 3.2g) 3 ô; bầu, vòi hàn liền, núm rời; đính noãn trung trụ (Hình 3.2h)

Quả đóng dài 1-1,5 cm, có vỏ dai, ít nhiều hóa gỗ, màu xanh khi non (Hình 3.2k), màu nâu khi già hay khô (Hình 3.2i), trong chứa 3 hột (Hình 3.2l)

Ảnh đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu được trình bày ở hình 3.1, 3.2: