Nghiên cứu thành phần hóa học tầm gửi cây nghiến phần 1 Nghiên cứu thành phần hóa học tầm gửi cây nghiến phần 1 Nghiên cứu thành phần hóa học tầm gửi cây nghiến phần 1 Nghiên cứu thành phần hóa học tầm gửi cây nghiến phần 1 Nghiên cứu thành phần hóa học tầm gửi cây nghiến phần 1 Nghiên cứu thành phần hóa học tầm gửi cây nghiến phần 1
Trang 1giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều không thấy xuất hiện màu đỏ cam (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có glycosid tim
• Định tính Saponin:
- Quan sát hiện tượng tạo bọt: Cho khoảng Ig dược liệu đã tán nhỏ
vào ống nghiệm 20ml Thêm 5ml nước cất đun cách thuỷ 5 - 1 0 phút Lọc qua bông vào ống nghiệm 20ml thêm nước cất vừa đủ lOml Bịt ống nghiệm bằng ngón tay cái lắc mạnh theo chiều dọc 5 phút, để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt Sau 15 phút, cột bọt vẫn bền vững
- Phản ứng phá huyết:
Chuẩn bị làm kính máu: đun 3-4g gelatin với nước muối sinh lý (Natriclorid
0.9%) ở 60°c Điều chỉnh dung dịch gelatin có pH =7 Hỗn hợp 5 ml Gelatin ở
trên với 1,2 ml máu đã loại fibrin Đun ấm 40°c rồi rót vào lam kính làm thành lớp mỏng Dùng miếng giấy lọc tròn (đường kính 5 mm), tẩm dung dịch dược liệu rồi đặt lên mặt gelatin Sau 12-24 giờ quan sát thấy có một vòng dung huyết.( Phản ứng dương tính)
- Phản ứng phân biệt 2 loại Saponin:
Qio vào 1 ống nghiệm lớn 0,5g bột dược liệu, thêm 5ml cồn 90° Đun cách thủy đến sôi, lọc nóng lấy dịch lọc làm các thí nghiệm sau:
+ Ống 1: ƠIO 5ml dd NaOH 0,1N + 5 giọt dịch lọc trên
+ Ống 2: Cho 5ml dd HCl 0,1N + 5 giọt dịch lọc trên
Lắc mạnh cả 2 ống nghiệm trong 3 phút Để yên, quan sát cột bọt: thấy
cột bọt ở ống 1 cao hơn ở ống 2
- Phản ứng Salkowski: Cho vào ống nghiệm 2g bột dược liệu thêm lOml cồn 90°, đun sôi cách thuỷ, lọc nóng Lấy Iml dịch chiết cho vào ống nghiệm nhỏ, thêm vài giọt H2SO4 đậm đặc nhỏ theo thành ống nghiệm Mặt phân cách xuất hiện màu đỏ tím đỏ, lắc đồng nhất.(Phản ứng dương tính )
Trang 2Sơ bộ kết luận: Dược liệu có saponin Steroid.
• Định tính Flavonnid:
Cân khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón lOOml, thêm 50ml cồn 90° Đun cách thuỷ 10 phút, lọc nóng, dùng dịch lọc làm các phản ứng sau:
- Phản ứng Cyanidin: Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm thêm một ít
bột Magie kim loại và 5 giọt HCl đậm đặc Lắc đều thấy xuất hiện màu hồng.(Phản ứng dương tính)
- Phản ứng vói Kiềm:
+ Phản ứng với NHg! Nhỏ 1 giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc, sấy khô rồi
hơ lên miệng lọ có chứa Amoniac đặc đã mở nút Thấy màu vàng của vết dịch chiết đậm lên.( Phản ứng dương tính)
+ Phản ứng với NaOH: Cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết, thêm vài giọt dd NaOH 10%, thấy xuất hiện tủa vàng và màu vàng của dịch chiết tăng lên rõ rệt.( Phản ứng dương tính)
-Phản ứng với FeClji Cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết, thêm 3 giọt FeClj 5% thấy màu của dịch chiết chuyển từ xanh nhạt sang xanh đen (Phản ứng dưcmg tính)
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có Flavonoid
• Định tính Coumarin:
- Vi thăng hoa: Cho Ig dược liệu vào một nắp chai bằng nhôm Hơ lên ngọn lửa đèn cồn đến khi bay hết hơi nước trong dược liệu Đặt lên trên miệng nắp nhôm một lam kính trên có để một miếng bông ướt Đặt nắp nhôm trực tiếp lên nguồn nhiệt Sau 5 phút lấy lam kính ra để nguội, soi dưới kính hiển
vi Thấy có tinh thể hình kim (Phản ứng dưoỉng tính)
- Phản ứng mở - đóng vòng Lacton.
Lấy khoảng lOg dược liệu cho vào bình nón lOOml, thêm 50ml cồn 90° đun cách thuỷ 5 phút, lọc nóng qua giấy lọc Dịch lọc thu được dùng làm các
Trang 3Qio vào 2 ống nghiệm mỗi ống Iml dịch chiết cồn:
Acid hoá ống 1 bằng vài giọt HCl đậm đặc, ống 1 sẽ trở lại đục như ống2.(Phản ứng dương tính)
- Phản ứng chuyển dạng đồng phân Cis - trans:
Nhỏ vài giọt dịch chiết lên giấy lọc, nhỏ chồng tiếp vài giọt dd NaOH
1 0%, sấy nhẹ Qìe 1 nửa phần diện tích vết chất bằng một đồng xu rồi chiếu ánh sáng tử ngoại trong vài phút, bỏ đồng xu ra sẽ thấy phần không bị che có huỳnh quang sáng hofn, nếu tiếp tục chiếu thì sau vài phút cả hai nửa vết chất đều phát quang như nhau.( Phản ứng dưofng tính)
- Phản ứng Diazo hoá; Cho Iml dịch chiết vào ống nghiệm nhỏ, thêm
2ml dd NaOH 10%, Đun cách thuỷ đến sôi, để nguội Thêm vài giọt TT Diazo mới pha Thấy trong ống nghiệm xuất hiện kết tủa đỏ gạch.( Phản ứng dưofng tính)
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có coumarin
• Định tính Aỉcaloid:
Cho khoảng 3g dược liệu đã làm nhỏ vào một cốc nhỏ dung tích 50ml, thấm ẩm bằng dd amoniac đặc, sau khoảng 30 phút cho dược liệu vào túi giấy lọc rồi đưa vào bình Soxhlet, chiết kiệt alcaloid bằng 50 ml chloroíom Sau đó
Trang 4cất thu hồi dung môi thu được cắn Hòa tan cắn bằng 3 ml dd H2SO4 IN, chia dịch chiết này vào ba ống nghiệm mỗi ống 1 ml dịch chiết.
- Ông 1: Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Mayer, không thấy xuất hiện tủa trắng.(Phản ứng âm tính)
- Ông 2: Nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat, không thấy xuất hiện tủa nâu (Phản ứng âm tính)
- Ông 3: Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Dragendorff, thấy có xuất hiện tủa
Lấy khoảng 3g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml Thêm vào
đó 20ml H2SO4 IN, đun sôi cách thuỷ 15 phút Để nguội, lọc qua bông vào một bình gạn, lắc với 5ml Chloroform, gạn lấy phần Qiloroform để tiến hành phản ứng:
Trang 5Lấy Iml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm Iml dd N H 4 O H 10% lắc đều, lớp amoniac không xuất hiện màu đỏ mận Tiếp tục cho từng giọt dd NaOH 10% vào lắc nhẹ, lớp dung môi cũng không xuất hiện màu hồng (Phản ứng âm tính).
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có anthranoid
• Định tính Acid hữu cơ:
- Cho Ig dược liệu vào ống nghiệm, thêm 5ml H2O cất Đun sôi trực tiếp trong 10 phút, để nguội rồi lọc Thêm vào dịch lọc một ít tinh thể Na2C0 3, không thấy có bọt khí bay lên (Phản ứng âm tính)
- Cho khoảng Ig dược liệu vào ống nghiệm, thêm 5ml cồn 90°, đun sôi nhẹ trong vài phút, để nguội rồi lọc Thêm vào dịch lọc một ít tinh thể NajSOj Không thấy có bọt khí bay ra (Phản ứng âm tính)
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có acid hữu cơ
• Định tính đường khử:
Lấy khoảng 2g dược liệu cho vào ống nghiệm to, thêm 5ml cồn 90° , đun cách thủy 10 phút, lọc lấy dịch Cho Iml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm 3 giọt thuốc thử Fehling A và 3 giọt thuốc thử Fehling B, thấy xuất hiện màu xanh lá Đun cách thủy 10 phút thấy có tủa đỏ gạch ở dưới đáy ống nghiệm.( Phản ứng dương tính)
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có đường khử
• Định tính acid amỉn:
Cho khoảng 2g dược liệu vào ống nghiệm to, thêm lOml H2O cất đun sôi 5 phút, lọc nóng Lấy 2ml dịch lọc cho vào một ống nghiệm khác thêm 3giọt thuốc thử Ninhydrin 3%, đun cách thuỷ sôi 10 phút thấy xuất hiện màutím đậm (Phản ứng dương tính)
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có acid amin
• Định tính chất béo:
Trang 6Lấy khoảng 5g dược liệu cho vào bình nón dung tích 50ml Đổ ngập Ether dầu hoả, đun cách thuỷ 15 phút, lọc lấy dịch lọc để làm phản ứng Nhỏ
1 giọt dịch lọc lên miếng giấy lọc, hơ nóng cho bay hết hơi dung môi, không thấy để lại vết mờ trên miếng giấy lọc (Phản ứng âm tính)
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có chất béo
• Định tính Caroten:
Cho vào ống nghiệm to 2ml dịch chiết Ether dầu hoả, bốc hơi trên nồi cách thủy đến cắn Thêm vài giọt H 2 SO 4 đậm đặc vào cắn Dịch lỏng không chuyển màu xanh (Phản ứng âm tính)
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có caroten
• Định tính Sterol
Cho vào ống nghiệm Iml dịch chiết Ether dầu hoả, bốc hơi trên nồi cách thuỷ đến cắn Thêm vào Iml Anhydrid acetic, lắc kỹ cho tan hết cắn Để ống nghiệm nghiêng 45° Thêm từ từ Iml H 2 SO 4 đậm đặc theo thành ống nghiệm Mặt phân cách giữa 2 lớp chất lỏng có màu xanh (Phản ứng dương tính)
Sơ bộ kết luận: Dược liệu có sterol
Ống 1: 4ml dịch chiết và 5 giọt TT Lugol
Ống 2: 4ml nước cất và 5 giọt TT Lugol
Quan sát thấy ống 1 có màu xanh đậm, ống 2 có màu vàng (Phản ứng âm tính)
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có polysaccharid
Trang 7• Định tính muối canxi
Cho 2g bột dược liệu vào 1 ống nghiệm lớn, thêm lOml nước cất, đun cách thủy đến sôi, để nguội, lọc Cho dịch lọc vào 2 ống nghiêm nhỏ, mỗi ống 2ml
- Ống 1: Thêm vào một ít tinh thể NâoCOy Không thấy xuất hiện tủa đục.
-Ống 2: Thêm vào một ít tinh thể (NH4)2C2 0 4 Không thấy xuất hiện kếttủa
Sơ bộ kết luận: Dược liệu không có ion
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá và rễ dược liệu xích đồng nam được tóm tắt ở bảng 2.1
Bảng 2.1: kết quả định tính các nhóm chất trong lá và rễ cây XĐN
quả
Sơ bộ kết luận
Trang 81 0 Acid amin Phản ứng vói I'l Ninhydrin 3% ++ Có
Trang 92.I.2.2 Nghiên cứu Flavonoid ở lá và rễ XĐN
❖ Chiết xuất Flavonoid
Cân chính xác khoảng 20g dược liệu lá hoặc rễ đã xác định độ ẩm bằng máy XM 120 Precica cho kết quả (Độ ẩm của lá = 9.58%, rễ = 8.89%) Cho vào túi làm bằng giấy lọc, đặt túi vào bình Soxhlet Chiết bằng Chloroform đến khi dịch chiết không còn màu xanh Lấy túi dược liệu ra khỏi bình Soxhlet Để bay hết hơi Chloroform tới khô rồi lại đặt vào bình, chiết tiếp bằng methanol đến khi dịch chiết trong suốt (Thử không cho màu vàng vói NaOH IN) Tập trung dịch chiết methanol, đem cất thu hồi dưói áp suất giảm, tiếp tục bay hơi trên nồi cách thủy đến khô thu được cắn B Hoà tan cắn B vào nước nóng, đun cách thuỷ 30 phút Lọc nóng qua bông sau đó lọc tiếp qua giấy lọc gấp nếp Lọc và tráng nhiều lần để loại tạp chất Để nguội, gộp dịch lọc vào bình gạn, lắc với ethyl acetat nhiều lần cho tói khi phần ethylacetat trong suốt, không màu (Thử không cho màu hồng với phản ứng Cyanidin) Gộp dịch chiết Ethylacetat, cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm Thu được cắn
Flavonoid.(Cắn F) Quá trình chiết xuất được biểu diễn ở sơ đồ sau.
Trang 10Hình 2.7; Sơ đồ chiết xuất flavonoid
Trang 11a.SKĐ dịch chiết
Flavonoid TP của lá
b.SKĐ dịch chiết Flavonoid TP của lá
C.SKĐ dịch chiết
Flavonoid TP của rễ
d.SKĐ dịch chiết Saponin TP của rễ
Hình 2.8: Ảnh SKĐ các dịch chiết ở Uv365nm,
ƯV254nm và phun TT hiện màu
Trang 12Hình 2.9: Đồ thị phân tích SK, SKĐ tuơng ứng và bảng số liệu thu đựơc của dịch chiết
Flavonoid TP của lá khi triển
khai ở hệ ni, quan sát khi phun TT hiện màu
ị 0.177 m 0232 699J& \i.\2 OJSO 347.3 i:*7SD 16 J&
Ĩ 023Ù 3*7.3 o:£$ Ili6$ 0JS3 48+.: «ogoũ lo:*
e o :»3 48*.T 0.X)» W.5 r.5 : Ũ.Ỉ3Ỉ 156^.3 :» £ :
i o.m O.'m 7.9Í 0.^ 21.3 7853.3 10.43
Ỗ O.ĨÕÌ 50 j 8 Ö.577 mồ ỉj 60 0.579 I9IJ& I590: 2.11
9 o ::* i&l.l O.T4t 243.: ịtô 0.74S 2432 25515 3J9
Saponin TP của lá khi triển khai ở hệ ni, quan sát khi phun TT hiện màu
Trang 13C H O O ) Hình 2.11: Đồ thị phân tích SK,
SKĐ tuơng ứng và bảng số liệu thu đựơc của dịch chiết
Flavonoid TP của lễ khi triển khai ở hệ ni, quan sát khi phun IT hiện màu
Saponin TP của rễ khi triển khai ở hệ ni, quan sát khi phun TT hiện màu
Trang 14❖ SKLM.
- Dịch chấm sắc ký: Hoà tan cắn F trong methanol
- Bản mỏng: Silicagll G F 2 5 4 (Merck) tráng sẵn, được hoạt hóa ở 110°c trong
Ih Để nguội bảo quản trong bình hút ẩm
- Hệ dung môi khai triển: Tiến hành thăm dò trên các hệ dung môi
Hệ I: Ethylacetat: a.formic: H2O (4: 1: 1)
Hệ II: Toluen: Ethylacetat: a.formic (5: 4: 1)
Hệ III: Chlorofom: ethylacetat: acid formic (5:5:1)
- Quan sát vết chất:
+ Dưới ánh sáng thường
+ Soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 và 365 nm
+ Thuốc thử hiện màu: Phun hỗn hợp vanilin/cồn + H2SO4 đậm đặc
- Kết quả: Hệ III cho kết quả tách tốt nhất Trên bản mỏng silicagel, cắn flavonoid của lá xuất hiện 10 vết vói Rf và diện tích các pic khác nhau,trong
đó vết 2 và vết 6 cho diện tích lớn nhất, cắn flavonoid của rễ xuất hiện 6 vết vói Rf và diện tích các pic khác nhau,trong đó vết 1 và vết 6 cho diện tích lớn nhất, Kết quả định tính flavonoid toàn phần bằng SKLM chạy với hệ dung môi
III được trình bày ở hình 2.9 (lá) và 2.11 (rễ).
❖ Định lượng flavonoid trong lá, rễ xích đồng nam
Flavonoid trong lá và rễ xích đồng nam được định lượng bằng phương pháp cân
Tiến hành chiết xuất theo qui trình trên (Hình 2.7) thu được cắn flavonoid toàn phần Sấy cắn ở 60°c đến khối lượng không đổi, để nguội trong bình hút ẩm 30 phút rồi đem cân ngay Kết quả xác định hàm lượng các phân đoạn được trình bày ở bảng 2.2 và 2.3
Hàm lượng flavonoid được tính theo công thức:
Trang 15x% = m -X 100
Mx{\ — à)
Trong đó: X : Hàm lượng % cắn thu được (%).
m : Khối lượng cắn (g)
M : Khối lượng dược liệu dùng để chiết xuát (g)
a : Độ ẩm của dược liệu (%)
Bảng 2.2; Kết quả xác định hàm lượng cắn Aavonoỉd trong lá XĐN
TT Khối lượng dược
liệu (g) Độ ẩm a (%)
Khối lượng cắn Aavonoid (g)
Hàm lượng Aavonoid (%)
Bảng 2.3: Kết quả xác định hàm lượng cắn Aavonoỉd trong rễ
TT Khối lượng dược
liệu (g) Độ ẩm a (%)
Khối lượng cắn Aavonoid (g)
Hàm lượng Aavonoid (%)
Trang 16Nhận xét: Bằng phương pháp cân, sơ bộ định lượng flavonoid toàn phần trong lá XĐN có hàm lượng là: 1,69 ± 0,09%, trong rễ XĐN có hàm lượng là:0,92 ± 0,07%.
2.2.2.3 Nghiên cứu saponin trong lá và rễ XĐN
❖ Chiết xuất saponin:
Cân chính xác khoảng 30g bột dược liệu vào túi giấy lọc, đặt túi giấy lọc vào bình Soxhlet, chiết bằng ether dầu hoả cho đến khi dịch chiết trong bình trong suốt Túi bã dược liệu được lấy ra và để cho bay hơi hết ether dầu hoả Sau đó tiếp tục chiết bằng methanol 80% trong bình Soxhlet cho tới khi dịch chiết trong suốt và không có phản ứng với acid sulfuric đặc Dịch chiết methanol đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm được dịch chiết methanol đậm đặc (cao lỏng), sau đó lắc kỹ với ether dầu hoả để loại tạp Phần cao lỏng đem lắc vói n-butanol (đồng thể tích) cho đến hết saponin (thử vái phản ứng Salkowski) Cất thu hồi n-butanol dưới áp suất giảm đến dạng cao đặc Hoà cao trong một lượng methanol vừa đủ sau đó thêm một lượng ether ethylic: aceton (1:4) gấp 10 lần, saponin toàn phần kết tủa Gạn lọc phần ether ethylic ra, tủa tiếp tục làm lại như trên 1-2 lần Lọc lấy tủa, để cho bay hơi hết ether, sấy nhẹ tủa ỏ 60°c tới trọng lượng không đổi, thu được saponin toàn phần (Cắn S)
Trang 17Hình2.13: Sơ đồ qui trình chiết xuất saponin.
❖ SKLM
- Dịch chấm sắc ký: Hoà tan cắn s trong methanol
- Bản mỏng: Silicagel Gp254 (Merkc) tráng sẵn, được hoạt hoá ở 110°c
trong Ih Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm
- Hệ dung môi khai triển:
Trang 18Hệ I: Ethylacetat: Acid acetic: H2O (3:3:1)
Hệ II: Toluen: Ethylacetat: Acid Formic: HjO (6:5:1,5:1)
Hệ III: Chloroform: Methanol: ethyl acetat (9:1:1)
Hệ IV : n-butanol: Ethyl acetat: HjO (4:1:5)
- quan sát vết chất:
+ Dưói ánh sánh thường
+ Soi dưói đèn tử ngoại ở bước sóng 254 và 365 nm
+ Thuốc thử hiện màu: Phun hỗn hợp vanilin/ cồn + H2 SO4 đậm đặc
- Kết quả: Hệ II cho kết quả tách tốt nhất Trên bản mỏng silicagel, cắn saponin của lá xuất hiện 6 vết vói Rf và diện tích các pic khác nhau,trong đó vết 1 và vết 2 cho diện tích lớn nhất, cắn saponin của rễ xuất hiện 1 0 vết với
Rf và diện tích các pic khác nhau,trong đó vết 1 và vết 6 cho diện tích lớn nhất Kết quả định tính saponin toàn phần bằng SKLM chạy với hệ dung môi III được trình bày ở hình 2.10 (lá) và 2.12 (rễ)
M x {\-a )
Trong đó: X : Hàm lượng % cắn thu được (%),
m : Khối lượng cắn (g)
M : Khối lượng dược liệu dùng để chiết xuất (g)
a : Độ ẩm của dược liệu (%),
