tổng quan về enzyme

Ứng dụng của enzyme • Y học: • Nattokinase tan huyết khối • Protease: sx mt nuôi vsv sinh kháng sinh, thuốc hỗ trợ tiêu hóa • Urease định lượng ure • Glucose oxidase xác định glucose

Trang 2

Ứng dụng của enzyme

• Y học:

• Nattokinase tan huyết khối

• Protease: sx mt nuôi vsv sinh kháng sinh, thuốc hỗ trợ

tiêu hóa

• Urease định lượng ure

• Glucose oxidase xác định glucose trong nước tiểu

Tổng quan enzyme 3

Ứng dụng-hóa học

• Dùng enzyme cố định để tổng hợp các hợp chất mong muốn

(glutathion, acid béo, alcaloid, hormone…)

• Xử lý nước thải, sản xuất cồn, amino acid

• Làm thuốc thử trong hóa phân tích

Trang 3

3

Ứng dụng công nghiệp

• Protease: làm mềm thịt

• Rennin- phomat

• Pectinase: nước trái cây, rượu vang, mứt…

• Cellulase: tăng giá trị của nguyên liệu (agar, đại mạch), phế liệu nông

nghiệp

• Amylase: bánh mì, glucose, rượu, bia

Trang 4

ĐỀ CƯƠNG CHI TIẾT

• Định nghĩa enzyme

• Lịch sử

• Cách gọi tên và cách phân loại

• Bản chất hóa học của enzyme

• Phương thức thực nghiệm xác định các tham số động học

• Nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme:

• Phương pháp khảo sát và phát hiện các nhóm chức năng của TTHĐ của enzyme

• Các dạng phân tử của enzyme

Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ENZYME

Trang 5

5

• Nguyên lý điều hòa quá trình sinh tổng hợp enzyme

• Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống VSV cho enzyme có hoạt lực cao

• Phương pháp bảo quản giống VSV

• Môi trường nuôi cấy VSV sinh tổng hợp enzyme

• Một số phương pháp chủ yếu tạo enzyme cố định

• Một số liên kết trong việc cố định enzyme

• Ảnh hưởng của sự cố định đến hoạt tính của enzyme

• Các reactor chứa enzyme cố định

• Sử dụng enzyme cố định trong y học và trong công nghiệp

Trang 6

Chương 5: NHỮNG XU HƯỚNG MỚI TRONG CÔNG NGHỆ ENZYME

• Sàng lọc enzyme

• Công nghệ protein

Tài liệu tham khảo

• Trevor Palmer Understanding enzymes Ellis Horwood.1991

• Bryan Cooper Enzymes in Industry: Production and Applications Wiley

2007

• Đặng Thị Thu Công nghệ enzym NXB KH&KT.2004

• Nguyễn Đức Lượng Công nghệ enzym NXB ĐHQG TP HCM.2004

Trang 7

Yêu cầu về seminar

Mỗi nhóm (5-6 sv) chọn một Bài Báo Khoa Học liên quan đến enzyme

(lớp trưởng nộp danh sách tên bài báo trước khi làm để tránh trùng lặp)

• Tiểu luận (50%) : Tổng quan về enzyme (5-10 trang)

Trình bày tất cả thông tin liên quan đến enzyme quan tâm

• Slide (20%) : 5 phần (đặt vấn đề, mục tiêu nghiên cứu, quy trình nghiên cứu, kết quả và thảo luận, kết

luận)

Yêu cầu trong phần đặt vấn đề, làm nổi bật phần ứng dụng nổi bật của enzyme Hình ảnh rõ ràng, ít chữ và trình

bày logic

• Thuyết trình (10% - 10 phút), trả lời câu hỏi (10% - 10 phút)

Mỗi nhóm cử ra một bạn nhóm trưởng Mỗi nhóm sẽ bốc thăm thứ tự để làm MC cho nhóm khác

Nôp bản mềm và bản cứng của tiểu luận và slide một tuần trước khi báo cáo

Thời gian báo cáo: sau khi học xong 5 chương

Trang 8

Yêu cầu về seminar

Ý tưởng mới liên quan đến enzyme

Nhóm tự lên ý tưởng và thiết kế quy trình công nghệ

Yêu cầu tính mới, sáng tạo, kinh tế

• Tiểu luận (50%) : Tổng quan về enzyme (5-10 trang)

Trình bày tất cả thông tin liên quan đến enzyme quan tâm

• Poster (20%): trình bày ý tưởng của nhóm trong 10 phút

• Thuyết trình (15% - 10 phút), trả lời câu hỏi (15% - 10 phút)

Chương 1 TỔNG QUAN ENZYME

• Được tạo ra như thế nào?

• Cấu trúc?

• Chức năng của enzyme trong tự nhiên?

• Điểm nổi bật của enzyme?

• Động học enzyme?

Trang 9

9

Định nghĩa

• Enzyme là chất xúc tác sinh học Chúng được tạo ra trong

các tế bào sống

• Chúng làm tăng tốc độ phản ứng hóa học xảy ra trong tế bào

sống, và nó không bị phá hủy hay biến mất sau phản ứng

• Các chất tham gia phản ứng được xúc tác bởi enzyme được

gọi là cơ chất

Ưu điểm của enzyme

• Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, có tính đặc hiệu cao, tác

dụng trong điều kiện êm dịu, có ý nghĩa cao trong y học và thực

phẩm do tính an toàn sinh học

• Tạo sản phẩm chất lượng cao, ít lẫn sản phẩm phụ, dễ tinh sạch

• Enzyme không độc và có khả năng bị phân giải (thân thiện với môi

trường)

• Có thể tạo ra dựa vào sự tổng hợp của vsv

Trang 10

Trang 11

- Ferment: tác nhân gây

nên sự chuyển biến các chất

Van Helmont Spalanzani

độ thường

Gittlieb Kirhoff

Anselme Payen Năm 1833:

-Thu nhận được enzyme diastate (phân giải tinh bột thành

có tổ chức”

Louis Pasteur Năm 1836:

-Tách được pepsin

Theodor Swann

Whilhem Kuhne 1877:

Sử dụng enzyme

để chỉ “enzyme không có tổ chức” và ferment ~ Enzyme “có tổ

chức

1871:

enzyme như một chất hóa học, xúc tác không phụ thuộc vào hoạt động sống của vi sinh vật

1897:

Dịch chiết nấm men thu được không chứa tế bào

và có khả năng lên men rượu

Trang 12

1926:

Tinh thể hóa urease

1951:

trình tự amino acid của chuỗi beta thuộc insuline (enzyme có cấu trúc bậc một) đã được giải mã (Sanger

và Tuppy)

1953:

cấu trúc phân tử DNA được khám phá (Watson và Crick)

1960:

Sản xuất glucose nhờ ứng dụng enzyme alpha-amylase

Trang 13

1988:

enzyme Lipolase thương mại đầu tiên được sản xuất

từ chủng biến đổi gen (Novo, Lion Corporation)

Đầu những năm 1980:

công nghệ thông tin được sử dụng mạnh

mẽ để phân tích cấu trúc tinh thể của protein

Cuối những năm 80:

công nghệ protein phát triển, tạo ra nhiều sản phẩm protein tái tổ hợp với chi phí sản xuất thấp hơn, tạo tiền đề sử dụng enzyme trong công nghiệp

2010:

20% thị trường hóa chất liên quan đến công nghệ sinh học (biofuel)

1981: Ribozyme

Trang 14

Cách gọi tên và phân loại enzyme

• Tên thông thường: trypsin, pepsin, renin…

• Tên hệ thống: tên cơ chất đặc hiệu của nó + tên của kiểu phản

ứng mà nó xúc tác+ đuôi “ase”

• ví dụ enzyme xúc tác cho sự thủy phân ure (carbamid) có tên hệ thống

là Carbamid-aminohydrodase (tên thường dùng là urease)

Trang 15

15

• Oxydoreductase: các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy

hóa-khử

• Transferase: các enzyme xúc tác cho các phản ứng chuyển vị

• Hydrolase: các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân

• Lyase: các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần

nước, loại nước tọ thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử nước

vào nối đôi

• Isomerase các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa

• Ligase xúc tác phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu

năng lượng ATP

Trang 16

Thành phần cấu tạo của enzyme

Trang 17

• coenzyme tham gia quá

trình trao đổi chất (ATP,

Trang 18

Cấu trúc của enzyme

Enzyme là các protein hình cầu tan trong nước, có chứa ít nhất

một trung tâm hoạt động

Trang 19

19

Cấu trúc bậc bốn của enzyme

polymer do nhiều đơn vị nhỏ cấu tạo nên được gọi là protomer

(tiểu phần dưới đơn vị), mỗi đơn vị nhỏ là một chuỗi

polypeptide

• Các protomer: giống hoặc khác nhau về cấu tạo và chức năng

• Các tiểu phần tương tác với nhau bằng các kiểu liên kết kỵ

nước, liên kết hydrogen, một số khác nhờ liên kết disulfide

Trang 20

Trung tâm hoạt động

Vùng chứa vị trí gắn và vị trí xúc tác gọi là trung tâm hoạt động

của E Đây là phần của phân tử E kết hợp với S, trực tiếp xúc tác

phản ứng hóa học chuyển hóa phức chất trung gian ES tạo

thành P Sau phản ứng, TTHĐ được tiếp tục sử dụng

Trung tâm hoạt động

• Nhiều nhóm chức năng khác nhau của các amino acid, phân tử

nước liên kết và nhiều khi có cả cofactor

• Nhóm chức năng của các amino acid bao gồm:

• nhóm –SH của cysteine;

• -OH của serine, threonine, và tyrosine;

• ε-NH2 của lysine;

• -COOH của glutamic acid, aspartic;

• vòng imidazol của histidine;

• indol của tryptophan,;

• nhóm guanidine của arginine

Trang 22

Cấu trúc dị lập thể

Trang 23

• trytophan + glyoxylic acid (H2SO4)màu tím (phản ứng Hopkins-Cole)

• Tyrosine + mercuric sulpate + sodium(gia nhiệt) màu đỏ (phản ứng

Millon)

Trang 24

Đặc điểm acid-base

• Tổng điện tích của một phân tử protein phụ thuộc vào mức độ

phân ly của các nhóm ion hóa, do đó phụ thuộc vào pH

• Enzyme sẽ tích điện dương tại mức pH thấp và tích điện âm tại

mức pH cao Giá trị pH tại đó protein không tích điện được gọi

là điểm đẳng điện pI

• Enzyme có hoạt tính xúc tác khi nhóm cạnh bên được ion hóa

ở dạng thích hợp, do đó hoạt động xúc tác của enzyme phụ

• Nồng độ dung môi hữu cơ ethanol, aceton giảm độ hòa tan

• Nhiệt độ: tăng ở 40-50oC Nếu cao hơn, giảm độ hòa tan

Trang 25

25

Đặc hiệu của enzyme

Mỗi enzyme chỉ xúc tác chuyển hóa được một hoặc một số cơ

chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định, được gọi là

tính đặc hiệu của enzyme

Trang 26

Đặc hiệu theo cơ chất

• Đặc hiệu liên kết (tính đặc hiệu thấp): cơ chất tương tự về cấu trúc và có

cùng loại liên kết

• Đặc hiệu nhóm hay cấu trúc (tính đặc hiệu trung bình): loại liên kết và cấu

trúc xung quanh nó

• Đặc hiệu cơ chất tuyệt đối (tính đặc hiệu tuyệt đối): các enzyme xúc tác

trên một loại cơ chất duy nhất

• Đặc hiệu quang học: tác dụng với một trong hai dạng đồng phân không

gian của cơ chất

Đặc hiệu liên kết

Trang 28

Đặc hiệu quang học

Đặc hiệu của enzyme

• Thuyết “ba điểm” của Ogston, 1894

• Thuyết “ổ khóa và chìa khóa” của Fisher, 1890

• Thuyết “mô hình cảm ứng không gian” của Koshland, 1958

Trang 29

29

Thuyết “ba điểm” của Ogston (1948)

• E+S: 3 điểm khác biệt (gắn

Thuyết “ba điểm” của Ogston (1948)

• Các amino acid trong TTHĐ không có chức năng gắn hay xúc

tác có thể có vai trò quan trọng trong tính đặc hiệu của

enzyme

(không ngăn cản sự gắn của cơ chất, nhưng lại ngăn cản sự gắn của các phân tử khác có

cấu trúc hóa học tương tự)

xúc tác trong không gian, mà còn phụ thuộc vào môi trường tại

TTHĐ hạn chế của thuyết “3 điểm”

Trang 30

Thuyết “ổ khóa và chìa khóa” của Fisher (1890)

• tương tác giữa E và S tạo thành

phức hợp ES giống như quan

hệ của ổ khóa và chìa khóa

(hình dạng của E và S bổ sung cho nhau),

 nghĩa là enzyme nào chỉ xúc tác cho đúng cơ

chất đó

• giải thích được tính đặc hiệu

tuyệt đối của E, nhưng không

giải thích được tính đặc hiệu

tương đối của E

Thuyết “mô hình cảm ứng không gian” của Koshland (1958)

TTHĐ của E có tính mềm

dẻo và linh hoạt, có thể biến

đổi về cấu hình không gian

trong quá trình tương tác với

S sao cho phù hợp với S, để

ES

Sự gắn của S vào E làm thay

đổi cấu hình không gian

Trang 31

31

Cơ chế phản ứng

Nguyên tắc của Arrhenius và van’Hoff: phân tử chỉ có thể phản

ứng chỉ khi nó tiếp xúc với phân tử khác

Để một phản ứng có thể xảy ra, phân tử tham gia va chạm

phải có đủ năng lượng để vượt qua hàng rào thế năng hay còn

gọi là năng lượng hoạt hóa

MỌI TIẾP XÚC ĐỀU XẢY RA

PHẢN ỨNG???

Cơ chế phản ứng

• Năng lƣợng hoạt hóa là năng lượng tối thiểu cần thiết để hình thành

trạng thái chuyển tiếp từ các chất tham gia phản ứng

• Trạng thái chuyển tiếp (trạng thái trung gian có mức năng lượng tự do

cao nhất trong tất cả các phản ứng) không bền vững nên sẽ nhanh chóng

bị phá vỡ để hình thành sản phẩm

Trang 32

Năng lượng hoạt hóa

Năng lượng hoạt hóa được đo bằng

Trang 33

hơn so với trạng thái chuyển tiếp

của phản ứng không có sự tham

gia của chất xúc tác Vì thế E làm

gia tăng vận tốc phản ứng

Sau phản ứng, E lại hồi phục về

trạng thái ban đầu để tiếp tục xúc

tác

Mô hình phản ứng sinh học

Trang 34

Quá trình tạo thành phức ES và sự biến đổi phức này thành

sản phẩm thường xảy ra qua ba giai đoạn:

• E gắn với S bằng các liên kết yếu (tương tác tĩnh điện, liên kết hydro, tương tác

Van der Waals) tại TTHĐ tạo phức ES không bền Phản ứng xảy ra

nhanh và đòi hỏi năng lượng hoạt hóa thấp

• Các nhóm chức năng của các gốc amino acid trong TTHĐ tương tác

với S, xảy ra sự biến đổi S,  sự kéo căng và phá vỡ các liên kết

đồng hóa trị tham gia phản ứng S được hoạt hóa, dễ dàng tham

• Động hóa học là môn khoa học nghiên cứu về tốc độ phản ứng

phản ứng hóa học

• Tốc độ phản ứng là đại lượng đặc trưng cho diễn biến nhanh

nồng độ chất phản ứng trong một đơn vị thời gian

• Định luật tác dụng khối lƣợng (Guldberg và Waage, 1867):

tốc độ của phản ứng tại mỗi thời điểm tỷ lệ thuận với tích số

nồng độ của các tác chất

Trang 37

37

Vận tốc đầu

• 𝛝𝟎 cho mỗi [S] được xác định là

đường dốc của đường cong tại

điểm bắt đầu của phản ứng khi

phản ứng nghịch chưa xảy ra

• 𝛝𝟎 được xác định bằng cách vẽ

một đường tiếp tuyến với đồ thị

Từ đường tiếp tuyến này, ta có:

Trang 39

39

Giả thiết Michaelis Menten là một sự cân bằng giữa E, S và ES

đã được thiết lập và duy trì, sự phân giải phức để tạo ra sản

phẩm quá thấp để phá vỡ trạng thái cân bằng này

𝒌𝟏 𝑬 𝑺 = 𝒌−𝟏 𝑬𝑺

𝐸𝑆 =𝑘−1

𝑘1 = 𝑘𝑎𝑙 (2) Với 𝑘𝑎𝑙 là hằng số phân ly của ES

enzyme tự do [E] và nồng độ của enzyme gắn với cơ chất [ES]

Từ đó, suy ra: [E]= [𝐸0]- [ES] (3)

đại 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑘2[𝐸0] (6)

Thay (6) vào phương trình (5), ta có: 𝝑𝟎 = 𝑽𝒎𝒂𝒙 [𝑺]

𝑺 +𝑲𝒔 (7)

Trang 40

Mô hình Michaelis-Menten

• Trong mô hình đơn giản của Michaelis-Menten, hằng số

ES

• Giả thiết này đúng với thực nghiệm, nhưng không thể áp dụng

với tốc độ đủ nhanh để phá vỡ cân bằng tạo ra sản phẩm)

Điều chỉnh của Briggs-Haldane- trạng thái tĩnh

𝑘2[𝐸𝑆]

Sử dụng giả thiết trạng thái tĩnh (d[ES]/dt=0), nghĩa là tốc độ hình

thành phức ES bằng tốc độ phá vỡ phức ES tại thời điểm t:

Trang 41

Do [𝑆0]>>[ 𝐸0], nồng độ cơ chất giảm không đáng kể Vận tốc đạt

giá trị lớn nhất khi toàn bộ enzyme liên kết với cơ chất, nghĩa là

𝑉 𝑚𝑎𝑥 chính là vận tốc ban đầu tối đa tại giá trị [ 𝐸0], đặc biệt có thể được tính toán

và thu nhận từ biểu đồ trên và có cùng đơn vị với 𝜗0

Trang 42

Ái lực giữa enzyme và cơ chất, giá trị 𝐾𝑚 cao thì ái lực E và S cao và

ngược lại khi 𝑘2 ≪ 𝑘−1

Là giá trị của cơ chất mà tại đó vận tốc đầu bằng một nửa vận tốc

cực đại (có cùng đơn vị với [S])

Giá trị 𝐾𝑚 nằm trong khoảng 10 -2 -10 -6 M

Phụ thuộc [S] và các yếu tố của môi trường như nhiệt độ, pH, nồng

độ ion…) và đặc trưng cho hệ thống đang được nghiên cứu

Trang 43

• Người nhạy cảm với rượu: Km cao (ti thể) nhiều acetate được

chuyển vào máu gây ra hiện tượng đỏ mặt và tim đập nhanh

Trang 44

Hằng số 𝒌𝒄𝒂𝒕 (turnover number), đại diện cho số phân tử cơ

chất cực đại được chuyển đổi thành sản phẩm trên một phân tử

enzyme trong một đơn vị thời gian khi E bão hòa với S và tính

theo công thức 𝑉𝑚𝑎𝑥 = 𝑘𝑐𝑎𝑡 [𝐸0]

Tương ứng với tốc độ phá vỡ phức ES để hình thành sản phẩm,

Trang 45

45

Hằng số đặc hiệu

K A = 𝒌𝒄𝒂𝒕

 đo lường tính đặc hiệu của enzyme

Trang 46

• Có thể xác định được hai giá trị

Km và Vmax Từ đó suy ra kcat

• Đường tuyến tính chưa rõ ràng

• Kết quả đôi khi không chính xác

Trang 47

47

Phương pháp đồ thị Hanes

• Ưu: dữ kiện phân phối đều

• Nhược: Không có sự tách biệt của biến số ([S]

xuất hiện trên cả hai trục đồ thị)

Phương pháp đồ thị Eisenthal và Cornih-Bowden

• Ưu: sai số không biến đổi nhiều như ở

đồ thị Lineweaver-Burk

• Nhược: Không có sự tách biệt của

biến số (v xuất hiện trên cả hai trục đồ

thị)

Định dạng
Số trang	58
Dung lượng	1,89 MB