công nghệ enzyme - tổng quan về enzyme

công nghệ enzyme - tổng quan về enzyme

CHÖÔNG 2

Tài liệu tham khảo

1 Hóa sinh công nghiệp- Lê Ngọc Tú

2 Công nghệ enzyme- Đặng Thị Thu

3 Công nghệ enzyme- Nguyễn Trọng Cẩn

4 Các tài liệu hóa sinh

5 Động học các quá trình xúc tác sinh học- Trần

Đình Toại

6 Food enzymes- Dominic W.S Wong

7 Biotechnology, volume 9- G.Reed and T.W

Nagodawithana

8 Food biotecnology- R.D King and P.S.J

Cheetham

• Enzyme trong ngành bánh kẹo

• Enzyme trong chế biến rau quả

• Enzyme trong ngành rượu bia

• Enzyme trong ngành bột, đường

• Enzyme trong ngành thịt, cá

• Enzyme trong ngành sữa

Ngày báo cáo: Chủ nhật, 30/08/2008

CHẤT XÚC TÁC

- Thay đổi tốc độ phản ứng: dương, âm

- Giúp chuyển hóa lượng lớn chất phản ứng

- Tỉ lệ chất phản ứng: chất xúc tác lớn

- Sau phản ứng: không đi vào sản phẩm cuối, không biến đổi, không thay đổi số lượng

ENZYME- Khái niệm

• Chất xúc tác sinh học

- Do sinh vật tổng hợp

- Xúc tác phản ứng trong cơ thể

• Đặc tính:

- Cường lực cao: 1g pepsin, 5kg protein trứng

(2h), 1 β-amylase, 4000 glucoside

- Đặc hiệu

- Xúc tác mềm= điều kiện bình thường: 30-50 0 C,

pH trung tính, áp suất thường .

• Bản chất: chủ yếu là protein

Amylase

Back

TÍNH ĐẶC HIỆU

Chuyển hóa

Chuyển hóa 1 hoặc 1 số ít cơ chất 1 hoặc 1 số ít cơ chất không tạo

sản phẩm phụ

Tuyệt đối: 1 cơ chất nhất định, vd urease

Tương đối= đặc hiệu liên kết hóa học: lipase: liên kết ester

Đặc hiệu nhóm= đặc hiệu liên kết + điều kiện Carboxypeptidase: peptide gần –COOH tự do Đặc hiệu quang học: 1 trong 2 đồng phân, L hoặc D, cis hoặc trans

Đặc hiệu môi trường: chymoptrypsin, trypsin

BẢN CHẤT ENZYME- Protein

phân tử lượng lớn: 20-1000kDa  không qua được màng bán thấm

• Cầu tan trong nước

• Có cấu trúc bậc 4 Dễ bị biến tính mất hoạt tính: nhiệt, acid, kiềm, kim loại năng .

• Lưỡng tính: âm, dương, trung hòa tùy pH

Catalase

ENZYME 2 CẤU TỬ

= ENZYME PHỨC TẠP

= PROTEIN + PHI PROTEIN (Coenzyme: kim loại, vitamine .)

ENZYME 1 CẤU TỬ

= ENZYME ĐƠN GIẢN

= CHỈ CÓ PROTEIN

amylase

GỌI TÊN

• TÊN THÔNG THƯỜNG: amylase, bromelin

dùng trong sx bia của hãng Novo Đan Mạch

• THEO QUI ƯỚC QUỐC TẾ

- Phần 1: tên cơ chất đặc hiệu

- Phần 2: kiểu phản ứng enzyme xúc tác

- Phần 3: đuôi “ase”

Vd: alcohol dehydrogenase= enzyme xúc tác

phản ứng làm mất H của rượu

cùng lớp nhưng tác động lên nhóm chức hoặc liên kết khác

cùng lớp phụ, cơ chất khác

6 LỚP ENZYME

nước

OXYREDUCTASE: oxi hóa khử

Có 4 nhóm

• Dehydrogenase:

- Tách H trực tiếp từ cơ chất

- Có các coenzyme: NAD + , NADP + ,

- Có vai trò trong sinh tổng hợp

- Vd: alcohol dehydrogenase, chuyển rượu thành

- Xúc tác phản ứng kết hợp oxi vào hợp chất hữu cơ

- Gồm oxygenase (kết hợp O2) và hydroxylase

(kết hợp OH)

Peroxydase

- Xúc tác oxi hóa các chất hữu cơ khi có H2O2

- Điển hình là catalase, giải độc H2O2 cho cơ thể

- Vd: catalase

H2O2 + H2O2  O2 + 2H2O

OXYREDUCTASE: oxi hóa khử

Xúc tác chuyển các gốc, nhóm từ chất này

sang chất khác Tùy bản chất nhóm

• Acyl-transferase: chuyển nhóm acyl, quan trọng trong trao đổi chất

• Glucozyl-transferase: chuyển gốc đường

• Amino-transferase: chuyển amin từ acid

amin sang α-ketoacid acid amin mới

• Phospho-transferase (kinase): chuyển gốc phosphat từ ATP đến –OH của alcohol hoặc đường

TRANSFERASE

Xúc tác phản ứng thủy phân, luôn có nước tham gia

Không cần coenzyme

Quan trọng trong quá trình tiêu hóa

- Peptihydrolase: thủy phân liên kết peptide

- Lipase (esterase): thủy phân liên kết ester trong dầu mỡ

- Glycoside hydrolase: thủy phân glucoside

trong tinh bột, cellulose

HYDROLASE

• Tách nhóm chức không cần nước

• Ví dụ: pyruvat-decarboxylase, loại CO 2 khỏi

pyruvat  Acetaldehyd

- Xảy ra trong quá trình lên men rượu

CH 3 COCOO -  CH 3 CHO + CO 2

isomerase

Đồng phân hóa hình học, quang học,

chuyển vị nội phân

Ví dụ: Glucoisomerase chuyển glucose

thành fructose

Ligase

Xúc tác tổng hợp các

chất hữu cơ

Ví dụ:

Pyruvat-carboxylase

chuyển C đến acid

pyruvic và tạo thành

oxaloacetic

Trong chu trình krebs

quan trong trong trao

đổi chất

CƠ CHẾ PHẢN ỨNG

Làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng

Ví dụ:

H 2 O 2  H 2 O + O 2

- Năng lượng hoạt hóa: 18 kcal/mol

- Có xúc tác hóa học platin: 11,7 kcal/mol

- Có enzyme: 5,5 kcal/mol

Năng lượng hoạt hóa giảm tốc độ phản ứng

tăng lên

3 giai đoạn

CƠ CHẾ PHẢN ỨNG

Giai đoạn 1:

- Enzyme kết hợp

với cơ chất bằng

liên kết yếu

Giai đoạn 3:

-Tạo sản phẩm (P)

-Giải phóng E tự do

TRUNG TÂM HOẠT ĐỘNG

• Là một phần rất nhỏ của phân tử enzyme

TRUNG TÂM HOẠT ĐỘNG

• Tâm hoạt động có thể là:

- Các nhóm chức của phần protein

- Các nhóm ngoại

• Các nhóm tạo tâm hoạt động xa nhau trong mạch peptide nhưng gần về không gian Đủ gần để tương tác

Tâm hoạt động - S: tương ứng về cấu trúc theo kiểu:

Các nhóm chức ở tâm hoạt động thay đổi

vị trí tạo hình thể E khớp với S mềm

dẻo

TÂM ĐIỀU HÒA

• Allosteric site

• Trên enzyme

• Khác vị trí tâm hoạt động

• Điều hoà hoạt động của enzyme

• Kết hợp với chất điều hòa thay đổi cấu

trúc enzyme thay đổi hình thể tâm hoạt động thay đổi khả năng xúc tác của

enzyme

• Chất điều hòa: kiềm hãm hoặc hoạt hóa

HOẠT TÍNH ENZYME

• Là mức độ hoạt động của enzyme cần xác định hoạt tính

• 3 phương pháp: 3 phương pháp

- Đo S mất đi hoặc P tạo thành (nồng độ E

không đổi)

- Đo thời gian thu 1 lượng cơ chất

- Đo nồng độ E cần để thu được lượng P nhất định

Đơn vị hoạt tính: 1UI= lượng E chuyển hóa 1µmol cơ chất /phút (điều kiện tiêu chuẩn)

HOẠT TÍNH ENZYME

• Hoạt độ của một chế phẩm enzym: số UI trong 1ml hoặc 1mg

• Hoạt độ riêng phân tử: số phân tử cơ chất được

chuyển hóa bởi 1 phân tử E

• Xác định hoạt tính E cần chú ý: Xác định hoạt tính E cần chú ý

- [S]: thích hợp, đủ nhưng không quá cao

- Cho chất hoạt hóa, chất làm bền vào trước, loại chất kiềm hãm

- pH thích hợp, ổn định

- Nhiệt độ: thấp hơn nhiệt tối ưu

- Thời gian:5-30phút Quá dài cần chất diệt vsv

ỨNG DỤNG CỦA ENZYME

Trong thực phẩm:

- bia, nước giải khát: amylase, papain, pectinase

- Thực phẩm dinh dưỡng cao: thủy phân protein người không thể tiêu hóa (vd: tảo)

-

Trong y dược

- Tính đặc hiệu điều chế dược phẩm

vd: chitin chitinase, esterase glucosamin kháng sinh

- Chữa bệnh: ribonuclease chữa bệnh nhiễm virus (vd: viêm não)

- Phát hiện bệnh: aldolase: viêm gan; creatinkinase:

nhồi máu cơ tim .

ỨNG DỤNG CỦA ENZYME

Trong phân tích

- Cơ chất sản phẩm phát hiện

- Phủ enzyme lên điện cực phát hiện

- Độ nhạy cao (10 6 phương pháp hóa học)

Sản xuất và định lượng kháng sinh

- Kháng sinh bán tổng hợp: bền, ít độc, hoạt tính mạnh, không dị ứng

- Vsv kháng sinh enzyme kháng sinh bán tổng hợp

- Vd: penicillin (do Penicillin chrysogenum)

penicillinase, acylase penicillinic acid

ỨNG DỤNG CỦA ENZYME

Một số ngành công nghiệp khác:

- Thuộc da: protease làm mềm, tách lông, da

- Giặt tẩy

- Mỹ phẩm

- Gi y ấ

-

Giải quyết vấn đề năng lượng

- Hydrolase, năng lượng mặt trời

- Chuyển H2O thành H2

 Chuyển năng lượng mặt trời thành năng lượng dự trữ

- H2 tạo năng lượng không ô nhiễm

PHẢN ỨNG BẬC 1

1 cơ chất sản phẩm: S k P

k: hằêng số vận tốc phản ứng (1/s)

v: vận tốc phản ứng (mol/s)

v = -d [S]

dt =

d [P]

dt = k [S]

[S]: nồng độ cơ chất (mol/lít)

Khi t tăng v giảm và tiến về 0, [S] giảm

k phụ thuộc S

 xem như phản ứng bậc 1 (ví dụ phản ứng thủy phân)

 v biến đổi theo thời gian tạo đk để v không đổi=

[S] thấp: phản ứng bậc 1

[S] cao: phản ứng bậc 0

Phản ứng tạo phức tạm thời enzyme-cơ chất

E + S k 1 E S P + E

k -1

k 2

k -2

Phản ứng xảy ra theo 3 pha:

• Pha tiền dừng: tạo phức ES, nhanh, tăng theo

t, kéo dài vài phần ngàn giây

• Pha dừng: [ES] cực đại, P tăng , v=vận tốc

đầu, P ít, bỏ qua chiều nghịch, vài phút, vài

chục phút

• Pha sau dừng: S cạn, ES giảm, v giảm0

Các pha phản ứng enzyme 1 cơ chất

E + S k 1 E S P + E

k -1

k 2

k -2

Phản ứng xảy ra theo 2 giai đoạn:

• Giai đoạn đầu: Giai đoạn đầu E + S k 1 E S

• Giai đoạn 2: giai đoạn xúc tác Giai đoạn 2:

- Xảy ra một chuỗi các phản ứng

- ES  EP  E + P

- Phản ứng bậc 1

- kcat: hằng số xúc tác (1/s)

- Giai đoạn 2 dài hơn 1 kcat< k1

E S k cat P + E

Vận tốc phản ứng ban đầu

v0= d [P]

d t = kcat[ES]

E S k cat P + E

E + S k 1

k -1

Vận tốc tạo thành ES: va= k1 [E][S]

Vận tốc phân giải ES: vd = k-1 [ES] + kcat [ES]

Ở trạng thái dừng: va=vd

 k1 [E][S] = (k-1 + k cat ) [ES]

 Km= (k -1 + k cat ) hằng số Michaelis-Menten

PHƯƠNG TRÌNH MICHAELIS-MENTEN

Ta có: Km [ES]= [E][S]

Enzyme là xúc tác số lượng không đổi trong quá trình phản ứng

Nghĩa là: [E]0= [E] + [ES]

Hay [E]= [E]0- [ES]

Vậy: Km [ES]= ([E]0- [ES]) [S]

Hay (Km+ [S]) [ES] = [E]0 [S]

Suy ra: [ES] = [E] 0 [S]

K m + [S]

Mà v0= kcat[ES] v0= K cat K [E] 0 [S]

m + [S]

YÙ NGHÓA CUÛA PHÖÔNG

Ý NGHĨA CỦA HẰNG SỐ Km

• Do kcat<< k1 nên Km= 1/kal biểu thị ái lực enzyme-cơ chất

• Km càng lớn, ái lực enzyme-cơ chất càng bé

• Cùng enzyme,Với những cơ chất khác nhau,

Km càng nhỏ  cơ chất càng thích hợp

DaÏng: y= ax+b

Phản ứng enzyme nhiều cơ chất

Phần lớn là phản ứng enzyme 2 cơ chất

Ít gặp phản ứng vượt quá 3 cơ chất, 3 sản phẩm

• Cơ chế: tạo nhiều tổ hợp Enzyme-cơ chất

- Tổ hợp 2 (binary)

- Tổ hợp 3 (ternary)

Có 4 mô hình phản ứng chính

Bi-Bi bấp bênh

Vận tốc phản ứng

A, B gắn kết với E một cách ngẫu nhiên tạo tổ hợp 3

Sản phẩm cũng giải phóng theo trật tự bấp bênh

Bi-Bi ping-pong

Vận tốc phản ứng

• Cơ chất 1 gắn với E sp đầu tiên

• Cơ chất 2 gắn vào sp 2

• F: dạng tạm thời của E trong quá trình phản ứng

Tương tự kiểu Bi-Bi có trật tự

EAB nồng độ rất thấp, tồn tại rất ngắn