TẠO DÒNG ĐOẠN GEN 3D VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG

Vì vậy chúng tôi thực hiện tạo dòng đoạn gen 3D virus LMLM vào vector pGEM T-easy, làm đối chứng dương cho phản ứng chẩn đoán virus lở mồm long móng.. Bệnh lở mồm long móng LMLM gây thiệ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẠO DÒNG ĐOẠN GEN 3D VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG

Sinh viên thực hiện : TRẦN VIẾT HỌC Niên khóa : 2008 – 2012

Tháng 7 năm 2012

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẠO DÒNG ĐOẠN GEN 3D VIRUS LỞ MỒM LONG MÓNG

KS VÕ KHÁNH HƯNG

Tháng 7 năm 2012

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên con xin bày tỏ lòng biết ơn đến cha mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập

Em xin chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, ban chủ nhiệm bộ môn Công nghệ sinh học cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường

PGS.TS Nguyễn Ngọc Hải và KS Võ Khánh Hưng đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động viên em suốt quá trình thực hiện khóa luận

Các thầy cô và anh chị ở Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường – trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt cho em thực tập tốt nghiệp Tập thể lớp Công nghệ sinh học khóa 2008-2012 và bạn bè đã động viên và giúp đỡ trong suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2012

Trần Viết Học

TÓM TẮT

Đề tài : “Tạo dòng đoạn gen 3D virus lở mồm long móng”

Lở mồm long móng (LMLM) là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, được OIE (Oficina Internacional de Epizootias) xếp ở đầu bảng A, bảng danh mục các bệnh truyền nhiễm đặc biệt nguy hiểm ở động vật Ở Việt Nam, vào năm 2009 - 2010 dịch LMLM đã tái xuất hiện ở nhiều tỉnh trong cả nước Hiện nay, virus LMLM đang lưu hành ở Việt Nam thuộc týp A, O và Asia 1 Phát hiện nhanh virus lở mồm long móng là điều thiết yếu trong việc chẩn đoán và chữa trị bệnh Vì vậy chúng tôi thực hiện tạo dòng đoạn gen 3D virus LMLM vào vector pGEM T-easy, làm đối chứng dương cho phản ứng chẩn đoán virus lở mồm long móng

Tổng cộng 32 bộ gen của các virus được thu thập từ Genbank và thực hiện alignment với cặp mồi 3DF, 3DR bằng phẩn mềm Bioedit version 3.3.19.0 Cặp mồi này có độ tương đồng cao so với genome virus LMLM trên vùng gen 3D Như vậy, cặp mồi này đặc hiệu với virus LMLM và có thể sử dụng để chẩn đoán virus LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR

Đoạn gen 3D được khuếch đại và giải trình tự để xác định týp, sau đó chèn vào vector

pGEM T-Easy (Promega) và chuyển vào tế bào vi khuẩn E coli DH5α Các khuẩn lạc đã

nhận plasmid được chọn lọc và kiểm tra bằng phương pháp PCR và giải trình tự Kết quả

cho thấy đã thu được tế bào E coli DH5α chứa plasmid pGEM T-3D

SUMMARY

Research title : “ Cloning the 3D gene of Foot and Mouth Disease Virus”

Foot and mouth disease (FMD) is a dangerously infectious disease, classified in group

A, the list of particularly dangerously infectious disease in animals In Viet Nam, between

2009 and 2010, FMD reemerged in many provinces Currently, FMD virus type A, O and Asia 1 are circulating in Vietnamese Rapid detecting FMD is essential for diagnosis and treatment Thus, we cloned the 3D gene of FMDV into pGEM T-Easy vector as the positive control for diagnosis of FMDV

32 genome was obtained from Genbank and was aligned to determine the similariry of the primers 3DF, 3DR by Bioedit software version 3.3.19.0 These primers have higher similarity with 3D gene region on FMDV genome Thus, these primers are specific for FMDV detection

Amplification of 3D gene was performed by PCR and then sequencing of the PCR product was done to determine the type virus The amplified 3D gene was inserted

RT-into pGEM T-Easy vector (Promega) and transferred RT-into E coli DH5α The colonies that received plasmids were selected and tested by PCR and sequencing to obtain the E coli

DH5α carrying plasmid pGEM T-3D

Key words : cloning, 3D gene, foot and mouth disease

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH ix

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 1

1.3 Nội dung thực hiện 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Bệnh lở mồm long móng 2

2.2 Virus gây bệnh lở mồm long móng 2

2.2.1 Virus lở mồm long móng 2

2.2.2 Cấu trúc phân tử virus lở mồm long móng 3

2.2.3 Các chủng virus lở mồm long móng và tình hình phân bố trên thế giới 4

2.2.4 Phương pháp chẩn đoán virus lở mồm long móng 6

2.3 Tổng quan về phương pháp RT-PCR 7

2.3.1 Phương pháp RT-PCR 7

2.3.2 Nguyên tắc phản ứng RT-PCR 8

2.3.3 Thành phần phản ứng RT-PCR 8

2.3.4 Các bước phản ứng PCR 8

2.4 Phương pháp tạo dòng đoạn gen 9

2.4.1 Phương pháp tạo dòng đoạn gen có đầu bằng 9

2.4.2 Phương pháp tạo dòng đoạn gen có đầu dính 10

2.3.4 Phương pháp TA cloning 11

2.4.4 Hệ thống vector pGEM T-Easy 11

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13

3.1 Thời gian và địa điểm 13

3.2 Hóa chất và thiết bị 13

3.3 Nội dung nghiên cứu 14

3.4 Phương pháp nghiên cứu 15

3.4.1 Thu nhận mẫu 15

3.4.2 Thu nhận và định týp đoạn gen 3D virus lở mồm long móng 15

3.4.2.1 Ly trích RNA virus lở mồm long móng 15

3.4.2.2 Thực hiện phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gen 3D 16

3.4.3 Tạo dòng đoạn gen 3D virus lở mồm long móng 17

3.4.3.1 Tinh sạch sản phẩm RT-PCR 17

3.4.3.2 Thực hiện phản ứng nối gen 3D vào vector pGEM T-Easy 18

3.4.3.3 Biến nạp plasmid pGEM-T Easy đã chèn DNA đích vào tế bào khả nạp 19

3.4.3.3.1 Chuẩn bị tế bào E coli khả nạp bằng phương pháp calcium chloride 19

3.4.3.3.2 Biến nạp plasmid pGEM-T Easy đã chèn DNA vào tế bào khả nạp 19

3.4.4 Sàng lọc dòng vi khuẩn E coli DH5α mang plasmid pGEM T-3D 20

3.4.4.1 Chọn lọc những tế bào đã biến nạp plasmid DNA 20

3.4.4.2 Phản ứng PCR kiểm tra plasmid 21

3.4.4.2.1 Quy trình ly trích plasmid 21

3.4.4.2.2 Phản ứng PCR kiểm tra plasmid 22

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Độ đặc hiệu của cặp mồi 3DF, 3DR 23

4.1.1 Alignment mồi 3DF, 3DR với genome virus PRRS, PCV2, Aphthovirus 23

4.1.2 Alignment mồi 3DF, 3DR với genome virus lở mồm long móng 24

4.2 Thu nhận và định týp đoạn gen 3D 25

4.2.1 Sản phẩm RT-PCR 25

4.2.2 Kết quả giải trình tự sản phẩm RT-PCR 25

3.4 Kết quả tạo dòng đoạn gen 3D virus lở mồm long móng 27

3.4.1 Tinh sạch sản phẩm RT-PCR 27

3.4.2 Khuẩn lạc E coli DH5α trên môi trường LB 27

4.4 Kết quả sàng lọc dòng vi khuẩn E coli DH5α 28

4.4.1 Kết quả phản ứng PCR khuẩn lạc 28

4.4.2 Kết quả phản ứng PCR kiểm tra plasmid 28

4.4.2.1 Kết quả ly trích plasmid 29

4.4.2.2 Kết quả PCR plasmid 29

4.3.4.3 Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR plasmid 30

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Đề nghị 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC 1

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified fragment length polymorphism

BHK-21 Baby Hamster Kidney 21

cDNA Complementary Deoxynucleic Acid

dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate

dCMP Deoxyribo Cytosine Monophosphate

dGMP Deoxyribo Guanine Monophosphate

dTTP Deoxyribo Thymidine Triphosphate

FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

LB Luria bertani

LMLM Lở mồm long móng

MCS Multi Cloning Site

ORF Open reading frames

OIE Oficina Internacional de Epizootias

PCR Polymerase Chain Reaction

RAPD Random amplified polymorphic DNA

RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

SAT South African Territories

UTR Unstranlated Region

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Cặp mồi trong phản ứng khuếch đại đoạn gen 3D 16

Bảng 3.2 Thành phần hóa chất phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gen 3D 16

Bảng 3.3 Quy trình nhiệt phản ứng RT-PCR khuếch đại đoạn gen 3D 17

Bảng 3.4 Thành phần hóa chất phản ứng ligation 18

Bảng 3.5 Quy trình nhiệt phản ứng PCR phát hiện đoạn gen 3D 20

Bảng 3.6 Thành phần hóa chất phản ứng PCR khuẩn lạc phát hiện đoan gen 3D 21

Bảng 3.7 Thành phần hóa chất PCR kiểm tra plasmid 22

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Virus gây bệnh lở mồm long móng 2

Hình 2.2 Cấu trúc genome virus gây bệnh lở mồm long móng (Grubman and Baxt, 2004) 3 Hình 2.3 Phân bố các chủng virus lở mồm long móng trên thế giới 5

Hình 2.4 Các bước phản ứng PCR (Phạm Hùng Vân, 2002) 9

Hình 2.5 Hệ thống vector pGEM T-Easy (Promega) 12

Hình 4.1 Alignment mồi 3DF, 3DR với genome virus PCV2, PRRSV, Aphthovirus 23 Hình 4.2 Alignment mồi 3DF, 3DR với trình tự virus lở mồm long móng 24

Hình 4.3 Sản phẩm RT-PCR khuếch đại đoạn 3D 25

Hình 4.4 Kết quả giải trình tự sản phẩm RT-PCR 26

Hình 4.5 Kết quả Blast vùng giải trình tự trên NCBI 26

Hình 4.6 Tinh sạch sản phẩm RT-PCR 27

Hình 4.7 Khuẩn lạc thu được trên môi trường LB 27

Hình 4.8 Kết quả PCR khuẩn lạc 28

Hình 4.9 Kết quả điện di plasmid 29

Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid 30

Hình 4.11 Kết quả giải trình sản phẩm PCR plasmid 30

Hình 4.12 Kết quả alignment xếp gióng hàng cột so sánh 2 lần giải trình tự 31

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Chăn nuôi là ngành chiếm tỉ trọng lớn trong nền kinh tế nước ta Bệnh lở mồm long móng (LMLM) gây thiệt hại lớn về kinh tế, do khả năng lây lan nhanh trên nhiều loại gia súc khác nhau, giảm năng suất và phẩm chất của sản phẩm vật nuôi Hiện nay, dịch lở mồm long móng đang có diễn biến khá phức tạp và có nguy cơ bùng phát trở lại Theo những nghiên cứu gần đây, ở Việt Nam lưu hành virus LMLM týp A, Asia 1 và O (Văn Đăng Kỳ, 2010; Nguyễn Văn Hưng, 2009) Vì vậy, việc xây dựng quy trình chẩn đoán virus lở mồm long móng là vấn đề cấp thiết trong phòng dịch lở mồm long móng

PCR là phương pháp chẩn đoán cho kết quả nhanh, có độ nhạy và đặc hiệu cao, là chìa khóa vàng cho công tác chẩn đoán bệnh Genome virus LMLM là RNA có 7 subtype, gây khó khăn cho việc lưu trữ đối chứng dương của phản ứng chẩn đoán virus LMLM bằng

kỹ thuật RT-PCR

Đề tài: “ Tạo dòng đoạn gen 3D virus lở mồm long móng” được thực hiện nhằm giữ dòng và tạo đối chứng dương phản ứng RT-PCR chẩn đoán virus lở mồm long móng

1.2 Yêu cầu

Thu nhận dòng tế bào E coli chứa plasmid mang đoạn gen 3D virus lở mồm long

móng, như là đối chứng dương cho phản ứng chẩn đoán virus LMLM

1.3 Nội dung thực hiện

Khuếch đại đoạn gen 3D virus lở mồng long móng ở thực địa

Tiến hành gắn đoạn gen 3D vào vector pGEM T-Easy (Promega), biến nạp vào vi

khuẩn E coli DH5α khả nạp

Khẳng định dòng vi khuẩn mang gen đích được chèn vào vector pGEM T-Easy bằng phản ứng PCR và giải trình tự

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Bệnh lở mồm long móng

Bệnh lở mồm long móng là căn bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, do virus gây ra với thiệt hại kinh tế nặng nề trên các loại động vật móng guốc chẵn, chẻ đôi như trâu, bò, lợn Bệnh LMLM gây ra do một loại virus có tính thượng bì, có đặc điểm gây sốt cao và hình thành các mụn nước ở niêm mạc miệng, vú, chân của vật mắc bệnh, có khi làm long móng chân Bệnh ít gây chết trâu bò, ngoại trừ các con non bê nghé Thiệt hại chủ yếu của bệnh gây ra do tỷ lệ mắc bệnh rất cao Bệnh xảy ra nghiêm trọng ở trâu, bò, dê, cừu gây thiệt hại trực tiếp do gây xảy thai khoảng 25%, giảm 25% sản lượng thịt, giảm 50% sản lượng sữa, giảm 25% sản lượng lông ở cừu (Doel, 2003) Tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) xếp bệnh này vào vị trí số 1 trong bảng A (bảng các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của động vật) (OIE, 2004), do có khả năng lây lan nhanh, mạnh thông qua nhiều con đường khác nhau, như tiếp xúc trực tiếp, động vật trung gian, gián tiếp qua đường không khí Trên thế giới đã ghi nhận bệnh LMLM tại Đài Loan (1997), Trung Quốc (1999) Năm

2000, dịch lây lan sang Nhật Bản và Hàn Quốc Năm 2001, đại dịch bệnh LMLM xảy ra ở Anh, lây lan sang Hà Lan, Pháp và một số nước châu Âu khác Năm 2004, liên bang Nga, Mông Cổ và Trung Quốc tuyên bố có dịch LMLM (Tô Long Thành, 2006) Hiện nay, tình hình dịch bệnh LMLM có xu hướng gia tăng và phức tạp hơn ở các nước Đông Nam Á

2.2 Virus gây bệnh lở mồm long móng

2.2.2 Cấu trúc phân tử virus lở mồm long móng

Hạt virus chứa 30% RNA mạch đơn Vỏ capside gồm 60 đơn vị capsome, không có vỏ bọc, mỗi capsome có chứa 4 loại protein (VP1 [1D], VP2 [1B], VP3 [1C] và VP4 [1A]) (Doel, 2003) Trong đó protein VP1 có vai trò quan trọng nhất trong việc gây bệnh và hình thành kháng thể chống lại bệnh lở mồm long móng (Nguyễn Văn Dũng, 2001)

Virus LMLM có tính biến dị và truyền nhiễm mạnh Genome là sợi đơn RNA, dài 8,5

kb gồm vùng không giải mã UTR đầu 5’, khung đọc mở ORF và đuôi poly A ở đầu 3’ Vùng không giải mã UTR dài khoảng 1300 bp, có vai trò quan trọng trong việc hình thành độc lực và hình thành capsid Vùng này chứa một cấu trúc thứ cấp có thể xoay (clover-leaf secondary structure) và đƣợc biết nhƣ là vị trí để tiến vào bên trong ribosome Đầu 5’ đƣợc gắn với VPg (khoảng 23 acid amin) Quá trình dịch mã ở virus LMLM cho một polyprotein, sau đó đƣợc cắt bởi các protease để tạo thành các protein cấu trúc và phi cấu trúc cần thiết cho quá trình nhân lên của tế bào Dựa vào các sản phẩm cắt trung gian,

có thể chia genome virus LMLM thành 4 phần

Hình 2.2 Cấu trúc genome virus gây bệnh lở mồm long móng (Grubman and Baxt, 2004)

Vùng L mã hóa 2 protein gồm Lab và Lb, có vai trò nhƣ là chất ức chế phản ứng tổng hợp protein của virus và là nhân tố quan trọng quyết định độc tính của virus

Vùng P1 mã hóa 4 protein cấu trúc VP0 (gồm VP2, VP4), VP3, VP1

Vùng P2 mã hóa protein không cấu trúc, 2A, 2B và 2C

Vùng P3 mã hóa protein không cấu 3A, 3 bản sao của VPg (3B), enzyme protease 3Cpro, enzyme polymerase 3Dpol

VP1 là protein được nghiên cứu nhiều ở virus LMLM, do ý nghĩa của nó trong việc xâm nhập của virus LMLM, có khả năng tạo kháng thể mạnh và đặc trưng cho các serotype (Mohapatra, J.K., 2011) Trình tự vùng VP1 thường được dùng để phân tích cây sinh dòng Dựa vào vùng VP1, virus LMLM týp A được chia thành 10 genotype chính (I-X) (Kitching, 2005) Týp O được chia thành 10 topotype gồm Europe-South America (Euro-SA), Middle East-South Asia (ME-SA), Cathay (CHY), West Africa (WA), East Africa 1 (EA-1), East Africa 2 (EA-2), East Africa 3 (EA-3), Indonesia-1 (ISA-1), và Indonesia-2 (ISA-2) (Knowles và ctv, 2005) Type Asia 1 được chia thành 6 genotype (I-VI) (Valarcher và ctv, 2009)

Gen 3D dài 1410 nucleotide, mã hóa RNA polymerase gồm 470 acidamin, khối lượng

55 kDa, là một protein được bảo tồn cao nhất ở virus LMLM (Carrillo và ctv, 2005; Chen, X., và ctv, 2003), thường được dùng để chẩn đoán virus LMLM

2.2.3 Các chủng virus lở mồm long móng và tình hình phân bố trên thế giới

Hàng năm, các nước trên thế giới báo cáo tình hình dịch bệnh LMLM cho tổ chức OIE/FAO và việc định týp LMLM thường do phòng thí nghiệm tham chiếu về bệnh LMLM (Word Reference Laboratory Foot And Mooth Disease Virus) đảm nhận Hiện nay, virus LMLM có 7 týp chính và hơn 70 sub-type trên toàn thế giới

Virus LMLM được phát hiện lần đầu tiên bởi Loffler and Frosch năm 1897 Những năm đầu thế kỷ 20, tính đa dạng kháng nguyên của virus LMLM được phát hiện và công nhận, 7 týp được mô tả: týp O và A, (Valleé và Carré, 1922; trích dẫn Doel, 2003), týp C (Waldman và Trautwein, 1926; trích dẫn Doel, 2003); các týp SAT1, SAT2, SAT3 (Galloway và ctv,1948; trích dẫn Doel, 2003), týp Asia 1 (Brooksby và Roger,1957; trích dẫn Doel, 2003)

Virus LMLM týp O, A, C có mặt trên khắp thế giới Týp Asia 1 có nguồn gốc ở châu

Á, gần đây lây lan sang châu Âu và châu Mỹ Các týp SAT1, SAT2, SAT3 chỉ lưu hành ở châu Phi, hiếm khi thoát ra ngoài

Hình 2.3 Phân bố các chủng virus lở mồm long móng trên thế giới

(Grubman and Baxt, 2004)

Từ năm 1999 tới nay, bệnh LMLM đã xảy ra ở nhiều quốc gia Năm 1999, ở Nam Mỹ ghi nhận bệnh do virus LMLM týp O gây ra ở Brazil, Bolivia, Columbia Ngoài ra, ở Venezuela, Peru, Columbia lại do virus týp A gây ra Ở Argentina, sau khi ngừng tiêm phòng vaccine năm 1999 đã xảy ra 3 đợt dịch liên tiếp vào năm 2000 và 2001 do virus LMLM týp A và O gây ra Ở châu Phi cũng ghi nhận được các ổ dịch bệnh xảy ra Do týp

O ở một số nước như là Angeri, Ma-rốc, Tunisia, Kenya Týp SAT1, SAT2, SAT3 gây bệnh ở Tanzania, Zambia, Uganda, Zimbabwe Tuy nhiên tình trạng dịch LMLM ở các

nước châu Phi là không rõ ràng, nguyên do không có sự điều tra hoặc điều tra rất ít (Hoàng Văn Năm, 2002)

Ở châu Á, dịch LMLM được ghi nhận ở một loạt các nước thuộc Đông Nam Á, Tây Á

do týp O gây ra Týp Asia 1 được báo cáo ở Iran, Afganistan, Gorgia và Azerbaijan Tại châu Âu, năm 2001 cũng ghi nhận các trường hợp bệnh xảy ra ở Anh, sau đó lây lan sang Scotland, xứ Wales, Ireland, Pháp và Hà Lan Các phân tích chuỗi nucleotide cho thấy các chủng virus gây bệnh đều thuộc týp O-PanAsia (Hoàng Văn Năm, 2002)

Ở Việt Nam, bệnh được ghi nhận lần đầu tiên ở Nha Trang năm 1898 Năm 1992, bệnh LMLM được xảy ra ở miền Bắc và miền Trung Theo các ghi nhận tới năm 1999, ở Việt Nam lưu hành 3 týp virus LMLM là A, O và Asia Năm 1999, dịch LMLM xảy ra ở Cao Bằng, lây lan sang Bắc Ninh, Hà Nội Đầu năm 2000, dịch lan rộng ra cả nước với 58/61 tỉnh, thành phố có dịch Kết quả chẩn đoán týp virus gây bệnh ở các ổ dịch đều là týp O Năm 2005, 2006 ghi nhận lại sự xuất hiện týp A tại Ninh Thuận, týp Asia-1 tại Khánh Hòa, Lào Cai, Hà Giang (Tô Long Thành, 2006)

Năm 2009-2010, dịch lở mồm long móng đã xảy ra trên diện rộng, phổ bệnh lan rộng ở Bắc Trung Bộ (Nghệ An, Huế, Quảng Trị, Hà Tĩnh); duyên hải miền Trung và Tây Nguyên (Quảng Nam, Quảng Ngãi, Phú Yên, Gia Lai, Đắc Lắc, Đak Nông); các tỉnh miền núi phía Bắc (Lào Cai, Yên Bái, Bắc Cạn, Hà Giang, Lạng Sơn, Hòa Bình, Lai Châu, Phú Thọ) Đáng lưu ý, hiện nay dịch bệnh đã tái bùng phát và có hiện tượng dây dưa kéo dài ở một số tỉnh Hầu hết các ổ dịch đều do virus LMLM týp O gây ra, týp A chỉ ghi nhận được ở các tỉnh Bắc Giang, Hà Giang, Kon Tum, Sơn La, Long An (Văn Đăng

Kỳ, 2010)

2.2.4 Phương pháp chẩn đoán virus lở mồm long móng

Việc chẩn đoán lâm sàng virus LMLM thường thực hiện trên bệnh xảy ra ở vùng xác định có dịch Triệu chứng chính của bệnh là sự xuất hiện mụn nước ở các vùng xoang miệng, quanh mũi, vùng da tiếp giáp với móng chân, kẻ móng chân Đối với bệnh nặng, còn xuất hiện hiện tượng đau chân, di chuyển khó Tuy nhiên, chẩn đoán lâm sàng thường nhầm với các bệnh khác có bệnh tích tương tự trên heo, bò như là : bệnh mụn nước lợn, bệnh dịch tả trâu bò, bệnh viêm miệng mụn nước

Với mức độ nhiễm bệnh nhẹ, bệnh tích lâm sàng chưa biểu hiện rõ ràng Cần thực hiện thêm các phản ứng trong phòng thí nghiệm để chẩn đoán Một số phản ứng phòng thí nghiệm chẩn đoán virus LMLM: phân lập virus, miễn dịch học, phương pháp RT-PCR Phân lập virus LMLM Huyễn dịch bệnh phẩm nghi ngờ chứa virus LMLM được ly tâm trước khi cấy vào tế bào nuôi Các tế bào nhạy cảm với virus LMLM bao gồm : tế bào tuyến giáp trạng bò sơ cấp, tế bào thận cừu, bê hoặc lợn sơ cấp Tế bào dòng, như là

tế bào thận chuột hamster non (BHK21 và IB-RS-2) Với phương pháp này, dựa vào kết quả quan sát hình thái tế bào nhận định mẫu bệnh phẩm có chứa virus LMLM hay không Phương pháp miễn dịch học Trước đây người ta thường sử dụng phản ứng kết hợp bổ thể dùng kháng huyết thanh của cả 7 týp để khẳng định là LMLM Sau đó dùng phản ứng trung hòa để xác định sub-type Hiện nay, phương pháp ELISA được khuyến cáo như là phương pháp thích hợp nhất để phát hiện kháng nguyên virus LMLM và xác định các serotype virus LMLM Với ưu điểm là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với các phương pháp miễn dịch học khác

Phương pháp reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) được áp dụng rộng rãi trong chẩn đoán nhanh và định týp virus LMLM Các cặp mồi được thiết kế đặc hiệu để phân biệt 7 sub-type khác nhau Cho phép nhân các đoạn gen của acid nucleic, xác định dựa theo kích thước đoạn gen, quy trình nhanh, độ nhạy và độ đặc hiệu cao, chi phí thấp, đặc biệt là kỹ thuật real-time PCR cho kết quả đặc hiệu và độ chính xác cao cũng như định lượng được số bản sao đích ban đầu của virus trong mẫu bệnh

2.3 Tổng quan về phương pháp RT-PCR

2.3.1 Phương pháp RT-PCR

Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 Kỹ thuật này được tiếp tục hoàn thiện và phát triển thông qua việc phát

hiện và phân lập enzyme DNA polymerase chịu nhiệt từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus

Aquaticus (Saiki và ctv 1988) và việc thiết kế thành công máy luân nhiệt cho phép thay

đổi nhiệt độ nhanh chóng và chính xác PCR cho phép khuếch đại khuôn DNA ban đầu thành nhiều bản sao nhờ hoạt động của polymerase và cặp mồi đặc hiệu với DNA đích

Phương pháp RT-PCR cho phép khuếch đại trình tự RNA đích Trước khi tiến hành PCR thông thường, RNA được chuyển thành cDNA nhờ tác dụng của enzyme reverse transcriptase Sau đó, enzyme DNA polymerase sẽ khuếch đại đoạn gen đích trên cDNA

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ với 3 bước sau (hình 2.4):

Bước 1 : Giai đoạn biến tính Nhiệt độ được đưa lên tới 940

C, nhiệt độ cao làm các liên kết hydro của sợi đôi DNA mất đi, DNA đích biến tính thành các mạch đơn

Bước 2 : Giai đoạn bắt cặp Nhiệt độ được hạ xuống trong khoảng từ 50-650C, thích hợp cho các mồi bắt cặp vào hai đầu đoạn gen đích

Bước 3 : Giai đoạn kéo dài Nhiệt độ được đưa lên 720C, thích hợp cho hoạt động của

enzyme Tag polymerase hoạt động, gắn các dNTP vào đầu 3’ của mồi đang bắt cặp trên

đầu 5’ của sợi DNA đích theo nguyên tắc bổ sung

Mỗi chu kỳ gồm ba bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu của lần trước,cho sản phẩm chứa hàng tỷ bản sao đoạn DNA đích

Hình 2.4 Các bước phản ứng PCR (Phạm Hùng Vân, 2002).

2.4 Phương pháp tạo dòng đoạn gen

Tạo dòng đoạn gen là tập hợp các kỹ thuật nhằm đưa một đoạn gen, một đoạn DNA cần thiết (DNA insert) vào tế bào chủ (host cell), tạo điều kiện thích hợp để tế bào chủ phân bào tạo ra vô số tế bào cùng mang đoạn DNA insert giống nhau, tạo thành dòng tế bào tái tổ hợp mang đoạn gen cần tách dòng

Dựa vào cấu trúc đầu 5’ và 3’ của đoạn gen có thể chia thành các phương pháp tạo dòng như sau : tạo dòng đoạn gen đầu bằng, đầu so le và tạo dòng T-A

2.4.1 Phương pháp tạo dòng đoạn gen có đầu bằng

Trong phương pháp này, sản phẩm PCR được xử lý để tạo đầu bằng và nối vào vector

có đầu bằng Tuy nhiên, một số loại enzyme polymerase, chẳng hạn như Tag, có thể thêm

vào đầu 3’ sản phẩm khuếch đại một deoxynucleotide, điều này làm cho phản ứng nối không thể xảy ra Để khắc phục điều này, sản phẩm PCR được xử lý với enzyme DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Pfu polymerase

Tuy nhiên, việc tạo dòng sản phẩm PCR có đầu bằng thì không hiệu quả so với việc tạo dòng sản phẩm PCR đầu dính, nguyên nhân do hiệu quả nối đầu bằng không cao và hiện tượng tự nối (self-ligation) của vector

2.4.2 Phương pháp tạo dòng đoạn gen có đầu dính

Phương pháp tạo dòng đoạn gen có đầu dính là phương pháp được sử dụng để tạo dòng đoạn gen ở nhiều phòng thí nghiệm

Trình tự vị trí cắt của enzyme cắt có thể được thêm vào trình tự primer khi thực hiện phản ứng PCR, trình tự này có thể là giống hoặc khác nhau giữa 2 primer Sau khi thực hiện phản ứng cắt sản phẩm PCR thu được đoạn gen có đầu dính Việc cắt sản phẩm PCR

và vector với cùng một enzyme cắt cho hiệu quả nối cao, và kết quả là hiệu quả tạo dòng cao Mặt khác, sản phẩm PCR này được xử lý với một số loại DNA enzymes, như là T4 DNA polymerase, exonuclease III, hoặc là uracil DNA glycosylase để tạo đầu dính bổ sung với đầu dính trên vector tạo plasmid tái tổ hợp

Khi sử dụng T4 DNA polymerase, đầu 5’ của primer được gắn thêm trình tự 12 nucleotide thiếu dCMP, tạo ra các sản phẩm thiếu dGMP đầu 3’ Trình tự đầu 3’ của sản phẩm PCR được cắt bởi hoạt động enxonuclease 3’-5’ của enzyme T4 DNA polymerase trong điều kiện có dGTP, tạo thành các đoạn gen có đầu dính 5’ với trình tự và độ dài xác định Tương tự như vậy, toàn bộ vector được khuếch đại bởi primer có trình tự tương đồng với vùng MCS Hoạt động enxonuclease 3’-5’ của enzyme T4 DNA polymerase trong điều kiện có dCTP tạo ra các đoạn khuếch đại có đầu dính 5’ bổ sung với đầu dính 5’ trên đoạn gen cần chèn Phản ứng tạo vòng giữa vector và đoạn gen cần chèn xảy ra thông qua đầu dính 12 nucleotide (Aslanidis, C và Jong, P.J, 1990)

Có một số vấn đề thường gặp với phương pháp tạo dòng đoạn gen có đầu dính :

- Enzyme cắt hoạt động không hiệu quả khi trình tự cắt nằm gần đầu 5’ Một giải pháp

đó là việc thêm nucleotide vào đầu 5’, tuy nhiên điều này làm tăng chi phí tổng hợp primer và có thể ảnh hưởng đến khả năng bắt cặp của primer

- Sự giống nhau giữa trình tự cắt trên DNA đích và primer tạo ra sản phẩm cắt không mong muốn Vì vậy, khi thiết kế primer cần chú ý điều này

- Các trình tự nhận biết vị trí cắt thường là trình tự lặp lại đảo (panlindrome), có thể gây ra hiện tự primer dimer, làm giảm hiệu quả khuếch đại

2.3.4 Phương pháp TA cloning

TA cloning được biết đến như là phương pháp tạo dòng đoạn gen có đầu dính đơn giản

và hiệu quả nhất Tất cả các enzyme DNA polymerase chịu nhiệt, bao gồm cả Tag, đều

thêm một deoxyadenosine (dA) tạo đầu dính 3’ dA trên sản phẩm khuếch đại Sản phẩm PCR với đầu dính 3’ dA có thể tạo dòng với vector có đầu dính 5’ dT (T-vector)

T-vector là sản phẩm thu được từ việc xử lý vector trong môi trường có enzyme Tag

polymerase và dTTP (Marchuk, D và ctv,1990), hoặc phản ứng cắt của một số loại

enzyme cắt như là XcmI, HphI, AdhI cho ra các sản phẩm có đầu dính 5’ dT (Cha, J và

ctv, 1993)

Sản phẩm của các phương pháp như AFLP, RAPD có thể sử dụng để tạo dòng Một số loại enzyme DNA pomymerase không có khả năng tạo đầu dính 3’ dA Tuy nhiên sản

phẩm PCR đó có thể được tạo dòng với T-vector sau khi được xử lý với enzyme Tag

polymerase để tạo đầu dính 3’ dA Vì thế, TA cloning có thể tạo dòng sản phẩm PCR của các loại enzyme DNA polymerase

2.4.4 Hệ thống vector pGEM T-Easy

Vector pGEM T-Easy là được thiết kế cho việc tạo dòng sản phẩm PCR được khuếch

đại bởi enzyme Tag polymerase theo phương pháp TA cloning Vector pGEM T-Easy có dạng mạch thẳng, mang ở hai đầu 3’ một base Thymine được tạo bởi enzyme EcoRV

Vector pGEM T-Easy dài 3015bp, mang hai đoạn quan trọng là gen kháng ampicillin

Bla và gen chỉ thị LacZ cùng với vị trí khởi đầu sao mã ori

Gen Bla mã hóa enzyme beta-lactamase, thủy phân vòng beta-lactam của ampicillin và

bất hoạt chúng

Gen LacZ mã hóa một phần enzyme beta-galactosidase, kết hợp với gen trên vi khuẩn

E coli tạo enzyme beta-galactosidase, có khả năng cắt đứt các disaccharides thành

monosaccharide Nó có thể cắt chất nền nhân tạo 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- b-D –galactoside (X-gal), giải phóng một chất có màu xanh Đoạn gen được chèn vào plasmid

nằm trên gen LacZ, vị trí được cắt bởi enzyme EcoRV Việc chèn đoạn gen vào plasmid phá hủy chức năng của gen LacZ Vùng MCS nằm trên gen LacZ, chứa trình tự nhận biết

vị trí cắt của các enzyme cắt, hình 2.5

Hình 2.5 Hệ thống vector pGEM T-Easy (Promega)

Vị trí các đoạn gen chính của hệ thống vector pGEM T-Easy :

T7 RNA polymerase transcription initiation site 1

SP6 RNA polymerase transcription initiation site 141

pUC/M13 Reverse Sequencing Primer binding site 176–197

pUC/M13 Forward Sequencing Primer binding site 2949–2972

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm

Đề tài được thực hiện từ tháng 02 năm 2012 đến tháng 06 năm 2012, tại phòng thực nghiệm Di truyền phân tử thuộc Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh

3.2 Hóa chất và thiết bị

 QIAamp Viral RNA Mini Kit ly trích RNA tổng số (QIAGEN)

 Hóa chất phản ứng RT-PCR sử dụng bộ kít access quick RT-PCR system (Promega)

Bao gồm : Access QuickTM Master Mix 2X, AMV RT và nuclease free water

 Hóa chất phản ứng ligase sản phẩm PCR vào vector (Promega)

Bao gồm : 2X Rapid Ligation Buffer, pGEM T-easy Vector, Control Insert DNA, T4 DNA Ligase, nuclease free water

 Hóa chất dùng trong phản ứng PCR (abm)

Bao gồm : 10X buffer, dung dịch MgCl2 , enzyme DNA Tag Polymerase

- Môi trường LB thạch bổ sung Agar 15 g/L

- Môi trường LB rắn có bổ sung Ampicilin, X-gal, IPTG

Hấp khử trùng môi trường LB ở 1210C trong 20 phút Để nguội, khoảng 500C bổ sung : ampicilin 100 µg/ml, IPTG 0,5 mM, X-gal 80 µg/ml

 Môi trường SOC cho 100 ml

Bactotrypton (Merck) 2 g