so sánh một số phương pháp phòng thí nghiệm chẩn đoán virus lở mồm long móng tại việt nam

luận văn thạc sĩ, tiến sĩ, cao học, luận văn

==========
==========

TRẦN ðÌNH LĂNG

SO SÁNH MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHÒNG THÍ NGHIỆM CHẨN ðOÁN VIRUS LỞ MỒM

LONG MÓNG TẠI VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực tập và thực hiện luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ

lực của bản thân, tôi ựã ựược sự hướng dẫn trực tiếp của TS Nguyễn Văn Cảm

Tôi xin ựược bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới thầy hướng dẫn

TS Nguyễn Văn Cảm, người ựã giành nhiều thời gian quý báu tận tình giúp

ựỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tới:

- Ban Giám ựốc, tập thể phòng Virus, Trung tâm Chẩn ựoán Thú y TƯ

- Lãnh ựạo cùng toàn thể cán bộ, nhân viên Trung tâm Kiểm nghiệm

Thuốc Thú y TƯ1

- Viện đào tạo sau đại học, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội

- Gia ựình, bạn bè, ựồng nghiệp

đã luôn tạo ựiều kiện, ựộng viên, giúp ựỡ tôi trong suốt quá trình

học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Nhân dịp này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS Tô Long Thành,

PGS TS Phạm Ngọc Thạch ựã giúp ựỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và

hoàn thành luận văn này.

Hà Nội, ngày 19 tháng 9 năm 2009

Học Viên

Trần đình Lăng

LỜI CAM đOAN

Tềi xin cam ệoan ệẹy lộ cềng trừnh nghiến cụu cựa riếng tềi Cịc sè liỷu, kạt quờ nếu trong luẺn vẽn lộ trung thùc vộ ch−a tõng ệ−ĩc ai cềng bè trong bÊt kừ cềng trừnh nộo khịc

Tềi xin cam ệoan rỪng cịc thềng tin trÝch dÉn trong luẺn vẽn ệÒu ệ2

ệ−ĩc chử râ nguăn gèc

Tác giả

Trần đình Lăng

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 Bảng 4.1: Chất lượng mẫu bệnh phẩm LMLM trong 3 năm (2007-4.2009) 41

2 Bảng 4.2: Kết quả chẩn đốn bằng phương pháp ELISA 45

3 Bảng 4.3: Kết quả chẩn đốn bằng phương pháp Realtime PCR 47

4 Bảng 4.4: Kết quả chẩn đốn bằng phương pháp phân lập trên mơi trường tế bào BHK21 49

5 Bảng 4.5: Thời gian chẩn đốn bằng phương pháp ELISA 53

6 Bảng 4.6: Thời gian chẩn đốn bằng phương pháp Realtime PCR 54

7 Bảng 4.7: Thời gian chẩn đốn bằng phương pháp phân

8 Bảng 4.8: So sánh thời gian chẩn đốn của các phương pháp 57

9 Bảng 4.9: So sánh độ nhạy tương đối giữa các phương pháp 58

10 Bảng 4.10: Chi phí xét nghiệm cho một mẫu bệnh phẩm LMLM bằng phương pháp ELISA 61

11 Bảng 4.11: Chi phí xét nghiệm cho một mẫu bệnh phẩm LMLM bằng phương pháp Realtime PCR 62

12 Bảng 4.12: Chi phí xét nghiệm cho một mẫu bệnh phẩm

LMLM bằng phương pháp phân lập trên tế bào BHK21 64

13 Bảng 4.13: So sánh chi phí giữa các phương pháp cho một mẫu xét nghiệm 65

14 Bảng 4.14: Năng lực thực hiện các phương pháp chẩn

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ ðƠN VỊ

dNTP DeoxyriboNucleotide Triphosphate

EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid

FAO Food and Agriculture Organization

GSO General Statistics Office

MHC-II Major Histocompatibility Complex class II

OIE International Office des Epizootics

(nay là World Organisation for Animal Health)

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction TTCðTYTƯ Trung tâm Chẩn đốn Thú y TƯ

UI ðơn vị quốc tế (International Unit)

MỤC LỤC

PHẦN I MỞ ðẦU i

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ðỀ TÀI 1

1.2 MỤC TIÊU CỦA ðỀ TÀI 2

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 CĂN BỆNH 3

2.1.1 Phân bố serotype virus LMLM trên thế giới 3

2.1.2 Hình thái, cấu trúc của virus LMLM 5

2.1.3 Phân loại và biến type của virus 6

2.1.4 ðặc tính nuơi cấy của virus LMLM 7

2.1.5 Sức đề kháng 8

2.1.6 ðộc lực của virus LMLM 8

2.1.7 Cơ chế sinh bệnh 9

2.1.8 Sự mang trùng của động vật mẫn cảm 9

2.2 TÌNH HÌNH BỆNH LMLM TRÊN THẾ GIỚI 10

2.3 DỊCH TỄ HỌC BỆNH LMLM 14

2.3.1 Lồi vật mắc bệnh 14

2.3.2 Lứa tuổi 15

2.3.3 Mùa vụ 15

2.3.4 Khả năng lây lan 16

2.3.5 Tỷ lệ ốm và chết 16

2.3.6 ðường truyền bệnh 16

2.4 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH BỆNH LMLM 17

2.4.1 Triệu chứng lâm sàng 17

2.4.2 Bệnh tích 18

2.5 CHẨN ðỐN BỆNH LMLM 19

2.5.1 Chẩn đốn lâm sàng 19

2.5.2 Chẩn đốn phịng thí nghiệm 20

2.6 PHỊNG BỆNH 22

2.6.1 Khi chưa cĩ dịch xảy ra 22

2.6.2 Khi dịch xảy ra 24

2.7 TÌNH HÌNH VÀ NGHIÊN CỨU BỆNH LMLM Ở VIỆT NAM 24

2.7.1 Tình hình bệnh LMLM ở Việt Nam 24

2.7.2 Những nghiên cứu về bệnh LMLM ở Việt Nam 26

PHẦN III ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, ðỊA ðIỂM, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ ðỊA ðIỂM NGHIÊN CỨU 27

3.1.1 ðối tượng nghiên cứu 27

3.1.2 Nội dung nghiên cứu 27

3.1.3 ðịa điểm nghiên cứu 27

3.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 28

3.2.1 Máy mĩc 28

3.2.2 Dụng cụ 28

3.2.3 Hố chất 29

3.2.4 Nguyên liệu 29

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

3.3.1 Phương pháp lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển bệnh phẩm phát hiện virus LMLM 30

3.3.2 Phương pháp nuơi cấy virus LMLM trên mơi trường tế bào BHK21 31

3.3.3 Phương pháp ELISA xác định type virus LMLM 33

3.3.4 Phương pháp Real-time PCR 36

3.3.4.2 Tiến hành 37

3.3.5 Xử lý số liệu 39

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

4.1 CHẤT LƯỢNG MẪU BỆNH PHẨM NHẬN VÀ MẪU BỆNH PHẨM ðI LẤY TẠI TRUNG TÂM CHẨN ðỐN THÚ Y TƯ 40

4.2 KẾT QUẢ CHẨN ðỐN PHÁT HIỆN VIRUS LMLM 43

4.2.1 Kết quả chẩn đốn bằng phương pháp ELISA 43

4.2.2 Kết quả chẩn đốn bằng phương pháp Real-time PCR 46

4.2.3 Kết quả chẩn đốn bằng phương pháp phân lập trên mơi trường tế bào BHK21 48

4.3 SO SÁNH THỜI GIAN CHẨN ðỐN CỦA CÁC PHƯƠNG PHÁP 51

4.3.1 Thời gian chẩn đốn bằng phương pháp ELISA 52

4.3.2 Thời gian chẩn đốn bằng phương pháp Real-time PCR 54

4.3.3 Thời gian chẩn đốn bằng phương pháp phân lập trên mơi trường tế bào BHK21 55

4.3.4 So sánh thời gian chẩn đốn của các phương pháp 57

4.4 SO SÁNH ðỘ NHẠY TƯƠNG ðỐI GIỮA CÁC PHƯƠNG PHÁP 58

4.5 SO SÁNH VỀ HIỆU QUẢ KINH TẾ GIỮA CÁC PHƯƠNG PHÁP 60

4.5.1 Chi phí xét nghiệm cho một mẫu bệnh phầm LMLM bằng phương pháp ELISA 60

4.5.2 Chi phí xét nghiệm cho một mẫu bệnh phầm LMLM bằng phương pháp Real-time PCR 62

4.5.3 Chi phí xét nghiệm cho một mẫu bệnh phầm LMLM bằng phương pháp phân lập trên tế bào BHK21 63

4.5.4 So sánh chi phí giữa các phương pháp cho một mẫu xét nghiệm 65

4.6 NĂNG LỰC THỰC HIỆN CÁC PHƯƠNG PHÁP 66

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 68

5.1 KẾT LUẬN 68

5.2 ðỀ NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

PHỤ LỤC 78

PHẦN I

MỞ ðẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ðỀ TÀI

Nông nghiệp chiếm trên 60% tỷ trọng nền kinh tế nước ta Chăn nuôi, ñặc biệt là chăn nuôi gia súc ñóng góp lượng thực phẩm lớn cho nhu cầu thịt của toàn dân Theo Tổng Cục Thống kê (GSO) năm 2007 [62], tổng ñàn trâu 2,99 triệu con, ñàn bò 6,72 triệu con, ñàn lợn 26,56 triệu con, ñàn gia cầm 226 triệu con, và dê cừu 1,77 triệu con Trong những năm gần ñây, ñược sự quan tâm và chỉ ñạo sát sao của ðảng và Nhà nước, ngành Nông nghiệp nói chung

và ngành Chăn nuôi Thú y nói riêng ñã có những bước chuyển biến rõ rệt Tuy nhiên tình hình dịch bệnh vẫn diễn biến hết sức phức tạp, bệnh Lở Mồm Long Móng (LMLM) vẫn liên tiếp xảy ra ở trong nước cũng như trong khu vực Bệnh ñược tổ chức Thú y Thế giới (OIE) ñưa vào vị trí ñầu tiên trong danh mục các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của gia súc Bệnh do virus FMDV (Foot and Mouth Disease Virus) gây ra, thường ở thể cấp tính; lây lan nhanh, mạnh; còn ñược gọi là dịch LMLM Các loài ñộng vật guốc chẵn như trâu, bò, lợn, dê và cừu ñều mắc Bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế và ảnh hưởng ñến thương mại, ñặc biệt là việc buôn bán gia súc và sản phẩm gia súc Ngoài những thiệt hại do việc triển khai chống dịch, bệnh LMLM trực tiếp gây sảy thai khoảng 25% cái chửa, làm giảm 25% sản phẩm thịt, 50% sản lượng sữa và 25% sản lượng lông cừu [19], [1] Phòng chống dịch bệnh

LMLM luôn là chính sách của mỗi Quốc gia trên Thế giới

Virus gây bệnh LMLM thuộc loại RNA virus, họ Picornaviridae, có hướng thượng bì Virus ñược chia thành 7 serotype: O; A; C; SAT 1; SAT 2; SAT 3 và Asia 1, trong ñó có hơn 70 subtype khác nhau [22], [31] Trong những năm gần ñây ở Việt Nam, ngoài type O, các type A, Asia 1 cũng lần lượt

xuất hiện tại các ổ dịch LMLM [23] Các type O, A, Asia1 ựã có mặt tại Khánh Hoà [10] Các type O, Asia1 ựồng thời xuật hiện ở Lào Cai năm 2005 [23] Thêm vào ựó là hiện tượng virus biến chủng và xuất hiện topotype khác như phát hiện topotype O khác biệt từ bò lai F1 ở đồng Tháp [21] Các serotype này gậy bệnh có triệu chứng lâm sàng giống nhau nhưng lại không tạo ựáp ứng miễn dịch chéo cho nhau Chắnh vì vậy chương trình phòng bệnh bằng vacxin gặp nhiều khó khăn do cấu trúc kháng nguyên khác nhau Xác ựịnh chắnh xác type virus gây bệnh cho gia súc là ựiều kiện tiên quyết trong chương trình phòng chống dịch bệnh [7]

đặc biệt, khi Việt Nam ựã chắnh thức là thành viên của Tổ chức Thương mại Thế giới (WTO), ựã và ựang hội nhập sâu, rộng vào nền kinh tế quốc tế Áp lực chúng ta phải có những phương pháp chẩn ựoán bệnh nhanh, chắnh xác, phù hợp với tiêu chuẩn quốc tế ựáp ứng với tình hình dịch bệnh trong và ngoài nước

Từ những lý do cấp thiết ựó, chúng tôi tiến hành thực hiện ựề tài:

ỘSo sánh một số phương pháp phòng thắ nghiệm chẩn ựoán virus

Lở Mồm Long Móng tại Việt NamỢ

1.2 MỤC TIÊU CỦA đỀ TÀI

đánh giá, so sánh ựộ nhạy tương ựối, thời gian xét nghiệm, chi phắ giữa các phương pháp dựa trên kết quả ựạt ựược Kiến nghị phương pháp chẩn ựoán phát hiện virus LMLM tối ưu

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Bệnh LMLM là một trong những bệnh truyền nhiễm cấp tính lây truyền nhanh, diện gây bệnh rộng, tạo thành ñại dịch [6] của các loài ñộng vật móng guốc chẵn, chẽ ñôi như: Trâu, bò, lợn, dê, cừu bệnh gây ra do một loài virus LMLM hướng thượng bì, có ñặc ñiểm là sốt cao và hình thành những mụn nước ở niêm mạc miệng, móng, vú của gia súc cảm thụ Bệnh LMLM gây bệnh nhẹ ở ñộng vật trưởng thành nhưng gây bệnh nặng ở ñộng vật non (tỷ lệ chết 90 %) [57]

Do tính chất nguy hiểm, bệnh LMLM ñược tổ chức Thú y Thế giới (OIE) xếp là một bệnh ñứng ñầu bảng A (bảng những bệnh truyền nhiễm ñặc biệt nguy hiểm ở ñộng vật) và bắt buộc các nước thành viên khai báo khi có dịch xảy ra [33]

2.1 CĂN BỆNH

Virus LMLM, là một loại Aphthovirus LMLM (Aphthovirus xuất phát từ chữ Hy Lạp, “Alpha” có nghĩa là mụn nước), thuộc họ Picornaviridae (Pico-nhỏ, rna- ribonucleic acid) [33], [6] Bệnh ñược Fracastorius mô tả lần ñầu tiên ở Venice (Ý) vào năm 1514 ðến năm 1897 Loeffler và Frosh mới chứng minh ñược tính qua lọc của nhân tố gây bệnh [33], [61]

Bệnh ghi nhận ở châu Âu (Pháp,Ý, ðức…) từ thế kỷ XVII - XVIII, sau

ñó bệnh phát hiện ở khắp toàn cầu [6]

2.1.1 Phân bố serotype virus LMLM trên thế giới

Nhìn chung, sự phân bố của các type virus LMLM thường có tính ñặc trưng vùng lãnh thổ: Virus LMLM type O, A, C có mặt trên khắp thế giới; type Asia 1 có nguồn gốc châu Á Các type SAT 1, SAT 2, SAT 3 chỉ có ở

châu Phi, hiếm khi thoát ra ngoài (ngoại trừ trường hợp dịch do SAT1 ở Trung đông năm 1962)

Diễn biến của type O cũng trở nên phức tạp trong những năm gần ựây: Type O có mặt ở nhiều quốc gia ở khắp 4 châu lục: châu Phi (Sudan, Mali và Togo), châu Á (Iran, Pakistan, Arập Xê Út, Nepan, Bhutan, Philippin, Việt Nam, Myanmar và Thái Lan), Nam Mỹ (Brazil, Southern Cone, Ecuador và Venezuela)Ầ[17]

Phân bố serotype virus LMLM trên thế giới

(Nguồn FAO:

http://www.fao.org/corp/google_result/en/?cx=018170620143701104933%3Aqq82j sfba7w&q=FMD+stituation+map+2008&cof=FORID%3A9&x=12&y=7#1247)

Virus LMLM type O xuất hiện nhiều nhất ở khu vực đông Nam Á: Malaysia, Lào, Việt Nam, Philippin, Hồng Kông, Myanmar và Thái Lan Ổ dịch do virus LMLM type Asia1 cũng ựược báo cáo ở Iran, Afganistan, Georgia, Azerbezan, Mông Cổ [17]

Chưa có những hiểu biết rõ ràng về dịch tễ học type C virus LMLM Virus LMLM type C xảy ra ắt nhất so với các type khác trong khu vực trên thế giới, virus LMLM type này là nguyên nhân gây 8% các vụ dịch xảy ra vào năm 1977-1990 và 1,6% các vụ dịch trong năm 1991-1994 [51]

Từ năm 1995 có ắt nhất là 10 vụ dịch nghi ngờ do virus LMLM type C gây ra trên thế giới; châu Á (1967-2004) tiêu biểu ở Angola, 1973 châu Âu (1953-1989), Bắc Mỹ (1944 và 1996, 1971-1993), Trung đông (1967-1970) [52]

2.1.2 Hình thái, cấu trúc của virus LMLM

Virus LMLM là loại virus thuộc nhóm Picornavirus Kắch thước 20-30

nm, hình ựa diện có 30 mặt ựều Hạt virus chứa 30% acid nucleic, khoảng

8000 nucleotit, ựó là một ựoạn RNA chuỗi ựơn có khối lượng phân tử là 8.6 KiloDalton Vỏ capsid có 60 ựơn vị gọi là capsome, mỗi capsome có 4 loại protein (VP1, VP2, VP3 và VP4) trong ựó VP1 có vai trò quan trọng nhất trong việc gây bệnh, cũng như là loại kháng nguyên chắnh tạo ra kháng thể chống lại bệnh LMLM [9] Vì thế, người ta ựã tiến hành giải mã nucleotit của

1 phần hoặc toàn bộ gen mã hoá VP1 ựể phân chia chúng ra thành các serotype và các subtype [33]

Hằng số lắng (S) của hạt virus như sau: Hạt virus hoàn chỉnh (virion)

có hằng số lắng 140S; phần vỏ capsid không có RNA là 75S; mảnh protein của capsid bao quanh RNA (dài 8 kilobases) là 12S khi bị tác ựộng bởi nhiệt

ựộ, môi trường acid hoặc nồng ựộ ion thấp

Virus LMLM là loại không có vỏ bọc - vỏ bọc của virus thường ựược cấu tạo bằng một lớp lipid [41]

Sự sai khác về bộ gen là nguyên nhân tạo ra các biến type, ựặc biệt thông qua

sự ựa dạng của phân tử VP1

Hạt Virion của virus LMLM

2.1.3 Phân loại và biến type của virus

Virus LMLM thuộc nhóm picornavirus có kích thước rất nhỏ Virus LMLM có 2 ñặc tính ñặc biệt liên quan ñến dịch tễ học, ñó là tính có ña type

và tính dễ biến ñổi kháng nguyên, các type tuy gây ra những triệu chứng, bệnh tích giống nhau, nhưng lại không gây miễn dịch chéo [12]

Vào năm 1922, hai nhà khoa học Pháp là Vallée và Carré lần ñầu tiên phát hiện ra sự tồn tại của hai type virus gây bệnh LMLM ở bò Năm 1926, hai nhà khoa học ðức là Waldman và Traut - Wein nêu thêm một type virus gây bệnh LMLM thứ 3 Hiện nay, các type virus LMLM do hai nhà khoa học Pháp phát hiện ñược gọi là type A và O; còn virus mà hai nhà khoa học ðức phát hiện ñược gọi là type C Ba type O, A, C ñược gọi là các type châu Âu Vài năm sau, 3 type virus LMLM khác ñược phát hiện ở miền Nam châu Phi

và ñược ñặt tên là SAT1, SAT2, SAT3 Tiếp theo, các phòng thí nghiệm virus LMLM của Anh phân lập ñược type virus thứ 7 ở tại nhiều nước châu Á và ñặt tên là type Asia1 Ngoài 7 type cơ bản, người ta thừa nhận có hơn 70

subtype của virus LMLM Hiện nay, các subtype của virus ñược ký hiệu thống nhất ví dụ A22 và O1 Tính ña loại của virus ñược thể hiện khi gia súc ñã khỏi bệnh, tính miễn dịch thu ñược không ñều, có khi lại không còn nữa Virus LMLM biến dị mạnh, một số subtype về mặt miễn dịch học hoàn toàn khác với type “bố mẹ”, thường xuất hiện cuối một ổ dịch [24]

2.1.4 ðặc tính nuôi cấy của virus LMLM

LMLM là loại virus hướng thượng bì do ñó ta có thể nuôi cấy virus:

- Trên tổ chức da sống (thượng bì) như tổ chức da của thai lợn, thai bò còn sống, chuột non [21]

- Nếu nuôi cấy virus LMLM trên ñộng vật thí nghiệm như thỏ, chuột lang, chuột nhắt trưởng thành thì virus hay bị biến ñổi và thường mất tính gây bệnh [12]

- Virus thích ứng trên chuột chưa cai sữa, trên phôi gà hoặc gà con 1 ngày tuổi [8]

- Phương pháp tốt nhất là nuôi cấy virus trên tổ chức thượng bì lưỡi bò trưởng thành, phương pháp này cho kết quả tốt sau nhiều lần tiếp ñời, ñộc lực của virus vẫn giữ ñược ñối với bò và ñộng vật thí nghiệm

- Ngoài ra có thể nuôi cấy virus LMLM trên môi trường tế bào, tốt nhất là tế bào lấy từ tuyến yên của bò hoặc của lợn, tế bào thận bê hoặc thận cừu non hoặc các dòng tế bào có ñộ nhạy tương ñương, như tế bào thận của chuột Hamster non gọi tắt là tế bào BHK (Baby Hamster Kidney) Sau khi cấy virus LMLM vào các môi trường tế bào này ñể tủ ấm 370C trong 24, 48, 72 giờ trong ñiều kiện có 5% CO2, virus sẽ làm huỷ hoại tế bào nuôi [28]

* Khả năng ñột biến của virus LMLM

Virus LMLM có khả năng ñột biến cao Qua theo dõi nhiều năm người ta quan sát ñược mức ñộ ñột biến của virus LMLM là 7x10-2 năm [38] ðây là

một trong những yếu tố chính dẫn ñến tính ña type và nhiều biến chủng qua hàng nghìn năm tiến hoá

Lịch sử ñã ghi nhận trong các ổ dịch kéo dài ở châu Âu thường xuất hiện những biến chủng mới vào thời kỳ cuối Thực ra những biến chủng này có nguồn gốc ngay trong ổ dịch chứ không phải ñưa từ ổ dịch khác vào

Nghiên cứu về ñột biến và chọn lọc ñột biến dẫn ñến giả thuyết về sự xuất hiện các biến chủng là hậu quả của việc sử dụng vacxin (do áp lực miễn dịch, hiện tượng tái tổ hợp giữa các topotype tạo chủng mới cũng là một phương thức dẫn ñến sự ña dạng sinh học của virus LMLM) [22]

2.1.5 Sức ñề kháng

ñề kháng cao ñối với các dung môi hữu cơ như cồn, ê-te v.v…tuy nhiên, virus LMLM mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, axít, formol v.v…

- pH: Virus LMLM có thể tồn tại ở pH từ 6,7- 9,5 nhưng bền vững nhất ở

pH 7,2- 7,6, virus LMLM bị vô hoạt rất nhanh ở pH <5 và pH >11 [8], [9]

- Với sức nóng: Virus LMLM dễ bị tiêu diệt, ở 30- 370C virus LMLM sống ñược 4- 9 ngày, ở 500C virus LMLM nhanh chóng bị bất hoạt, ở 700C virus LMLM chết sau 5-10 phút Nhìn chung, virus LMLM mẫn cảm với nhiệt ñộ nhưng không nhạy cảm với ñộ lạnh [13], [28]

2.1.6 ðộc lực của virus LMLM

ðộc lực là khả năng gây bệnh lâm sàng hay mức ñộ gây bệnh của virus LMLM Mọi chủng virus LMLM ñều ñược coi là cường ñộc, mà không có chủng nhược ñộc Về mặt lâm sàng, gia súc nhiễm virus LMLM có thể biểu hiện dưới nhiều mức ñộ khác nhau, từ bệnh rất nghiêm trọng ñến dạng lâm sàng thể ẩn [9]

Sau khi vào máu, virus LMLM ñược ñưa ñến các vị trí thứ cấp gồm các

cơ quan tuyến, hạch lympho khác và biểu mô quanh mồm, chân, nơi phát sinh các mụn nước [8] Mụn nước dày ñặc sẽ xuất hiện ở viền móng, vòm khẩu cái, mõm, lưỡi, ñầu vú [38]

Virus LMLM có thể qua ñường sinh dục, qua các niêm mạc khác, qua da của vành móng [14]

2.1.8 Sự mang trùng của ñộng vật mẫn cảm

Nét ñặc trưng của bệnh LMLM là hiện tượng mang trùng virus LMLM Hiện nay, ñộng vật mang trùng ñược ñịnh nghĩa là những ñộng vật có thể phân lập virus LMLM sau 28 ngày hoặc muộn hơn nữa sau khi chúng nhiễm bệnh [36]

Số lượng ñộng vật vật mang trùng cao như vậy có thể do sự tiếp xúc giữa ñộng vật cảm nhiễm cao, trong khi ñó phạm vi ñộng vật mẫn cảm với bệnh lại khá lớn [36]

Số lượng ñộng vật mang trùng trong một quần thể phụ thuộc vào loài ñộng vật ñó, khả năng chống chịu với sự nhiễm bệnh (sự mẫm cảm), trạng

thái miễn dịch của ñàn (tiêm hoặc chưa tiêm vacxin), trâu bò mang trùng có thể kéo dài 3- 5 năm ñiều này cũng thấy ở cừu và dê nhưng không thấy ở lợn, trâu châu Phi mang trùng tới 5 năm, bò châu Phi có thể mang virus LMLM hơn 3 năm [11] Một ñiều ñặc biệt ở bệnh LMLM là lợn không mang trùng [2], [33]

Bằng phương pháp nested - PCR tác giả Aliasghar Bahari và cộng sự ñã xác ñịnh tỷ lệ mang trùng tại Iran, ñộng vật mang trùng là 43,59% [36]

Cơ chế của sự hình thành và duy trì trạng thái mang trùng vẫn chưa ñược biết rõ, Alexandersen và cộng sự ñã giả thuyết hai cơ chế cho sự phát triển của virus LMLM trong hầu họng Một giả thuyết rằng virus LMLM có thể nhiễm vào tế bào của hệ thống miễn dịch ví dụ như ñại thực bào hoặc các tế bào ở các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch làm cho chúng có thể tránh ñược

sự ñáp ứng miễn dịch Baxt và Mason ñã xem xét sự nhân lên của virus LMLM trong bạch cầu ñơn nhân lớn ngoại vi trên bò và ñã chỉ ra rằng virus LMLM có thể nhiễm … [33]

Hơn nữa, có ý kiến cho rằng virus LMLM ñược vận chuyển trong cơ thể nhờ hệ thống tế bào langerhans (tế bào trình diện kháng nguyên có dấu ấn bề mặt MHC-II) Khi những tế bào này tiếp xúc với những tế bào bị nhiễm [37]

Cơ chế thứ hai cho rằng virus LMLM có thể xâm nhập vào tế bào vật chủ

ñể cung cấp ñiều kiện nội bào cho sự tồn tại lâu dài [33]

2.2 TÌNH HÌNH BỆNH LMLM TRÊN THẾ GIỚI

Bệnh LMLM ñã xảy ra ở hầu hết ở các nước trên thế giới, ở nhiều nước thuộc châu Á, châu Âu, châu Mỹ La Tinh và châu Phi [31] Thế giới ñã ghi nhận một ñợt dịch lớn kéo dài từ năm 1981-1985, xảy ra trên phạm vi 80 nước, gây tổn hại kinh tế lớn cho các nước này [28]

Bản ñồ dịch tễ thế giới bệnh LMLM năm 2009

(Nguồn FAO:

http://www.fao.org/corp/google_result/en/?cx=018170620143701104933%3Aqq82j sfba7w&q=FMD+stituation+map+2008&cof=FORID%3A9&x=12&y=7#1247)

Châu Âu

Vào năm 1544, căn bệnh sốt Aphovirus LMLM ñã hoành hành tại Pháp, Anh và miền Nam Italia Kể từ ñó ñến nay, gần như toàn bộ lục ñịa châu Âu

liên tục bị nhiễm bệnh [61]

Bệnh LMLM ñược ghi nhận ở châu Âu (Pháp, Ý, ðức…) từ thế kỷ 17,

18, sau ñó bệnh phát hiện ở hầu khắp toàn cầu Riêng nước Anh, mãi tới năm

1939 mới ghi nhận có dịch [6] Cuối thế kỷ XIX, ở châu Âu trong vài tháng bệnh ñã lây nhanh chóng từ Nga sang ðức, Hà Lan, Thụy Sĩ, Bỉ, Hungary,

Áo, ðan Mạch, Pháp, Italia Có ñến hàng chục triệu con bò mắc bệnh, kéo dài ñến hàng chục năm không tắt [19]

Từ khi ngừng việc dùng vacxin ở các nước thuộc Liên minh châu Âu (EU) vào năm 1991, dịch LMLM lại xảy ra ở Italia (1993), Hy Lạp (1994, 1996), Bungari (1991, 1993, 1996), Nga (1995), Anbani và Cộng hoà Macedonia (Liên bang Nam Tư cũ), Kosovo (1996) Bởi vì phần lãnh thổ phía Bắc của Bosphorrus (thuộc Thổ Nhĩ Kì) là một phần của châu Âu, nên có thể nói rằng châu Âu chưa bao giờ hoàn toàn không có bệnh LMLM [12]

Gần ñây, vào năm 2001 một ñợt dịch khác ñã khởi phát từ Anh với 2030 trang trại nhiễm bệnh (chi phí cho các ổ dịch năm 2001 ñối với nền kinh tế nước Anh vượt quá 8 tỉ USD) [11], sau ñó bệnh lan sang Pháp, Hà Lan, Ireland mặc dù số lượng ổ dịch ñã ñược giới hạn ở các nước này [33]

Vào tháng 12/2005 và 1/2007 xảy ra các vụ dịch do type O gây ra ở Israel; Năm 2006 xảy các ra vụ dịch do type A ở Ai Cập, type O ở Hebron, Gaza…

Châu Mỹ

Bệnh xuất hiện lần cuối cùng ở Canada vào năm 1952, Mexico năm 1954 Tại nước Mỹ ñã xảy ra 9 vụ dịch từ 1870 ñến 1929 Nước này ñã công bố hoàn toàn hết dịch vào năm 1929 Một số nước thuộc Trung Mỹ, Newzealand, Panama ñược xem là chưa từng có dịch bệnh LMLM [45]

Argentina xảy ra 3 ổ dịch từ năm 2000- 2001 do type O và type A gây ra ðến tháng 4 năm 2001 virus LMLM type A ở Argentina lan sang Uruguay, sau ñó dịch LMLM xuất hiện ở Brazil và một số nước Nam Mỹ khác [17] Trong năm 2005- 2006 xảy ra các vụ dịch ở Argentina, (type O), Brazil (type O)

Châu Phi

Tình trạng bệnh LMLM ở các nước Châu Phi là không rõ ràng do không tiến hành ựiều tra hoặc ựiều tra rất ắt Hầu hết các quốc gia ở Tây, Trung và đông Phi có khả năng xuất hiện dịch [17]

Năm 1989, virus LMLM serotype O ựã thâm nhập vào Tuynidi do cừu và

dê mắc bệnh nhập khẩu từ vùng Trung đông, sau ựó bệnh lây lan sang bò và

ựã ựược phát hiện Tuy nhiên, lúc này bệnh ựã có thời gian lây lan và trước khi các biện pháp phòng chống ựược triển khai, bệnh ựã lan toả ở Ai Cập, Libia và liên tục có sự xâm nhập của virus LMLM, có lẽ là từ Libi vào Tuynidi vào những năm 1990 Ở hầu hết vùng hạ Sahara của Châu Phi, Phắa nam Tandania, Malauy, Zaia và Angola ựều có dịch LMLM Cộng hoà Nam Phi nhưng bệnh lại sảy ra chủ yếu ở trâu của các nước này, tập trung chủ yếu

ở các vườn thú Các ổ dịch LMLM do virus LMLM thuộc serotype SAT2 tái xuất hiện ở Zimbabue trong những năm 1980, thường ựược coi là lây lan từ trâu Ổ dịch cuối cùng trong số các ổ dịch này là vào năm 1991, ổ dịch cuối cùng ở Bôtxoana là vào năm 1980 Ở Namibia có một ổ dịch do virus LMLM thuộc serotype SAT3 vào năm 1994 và Ở cộng hoà Nam Phi, ổ dịch cuối cùng ựược thông báo là do serotype SAT2, ở loài linh dương tại vườn thú quốc gia Kruger vào năm 1993 [12]

Tây Bắc Phi có thể thỉnh thoảng xuất hiện dịch bệnh nhưng không có báo cáo từ năm 1999 Virus LMLM type O gây nên dịch ựịa phương ở Ai Cập và

có thể cả Libia Trong năm 2001, Uganda báo cáo có hàng loạt ca bệnh do type O gây nên trên bò ở một ựồng cỏ lớn gần với vùng Kiboga Malauy báo cáo có một ở dịch xuất hiện vào tháng 4-5/2000 Trong tháng 1/2001 tại Swziland xuất hiện một ổ dịch do virus LMLM type SAT1 gây ra trên bò ở miền bắc vùng Hhohho theo dọc biên giới Nam Phi, trong một vùng an toàn dịch LMLM từ lâu Swaziland Trong tháng 2/2001, xuất hiện một ổ dịch do

virus LMLM type SAT2 gây ra trên bò ở một quận của tỉnh Mhana-phắa Bắc của Nam Phi Zimbabue thống kê có 18 ổ dịch do virus LMLM type SAT2 gây ra từ 17/8 ựến 22/10/2001 tại các tỉnh Metabeland và Masvingo [17] Trong năm 2005-2006 xảy ra các vụ dịch ở Namwala, Itezhi, Mumbwa, Chibombo, Monzo, Zimbabwe, Công GôẦ

Châu Á

Theo OIE, từ năm 1995 ựến nay, bệnh LMLM ựã ựược thông báo tại đài Loan (1997), gây thiệt hại vô cùng lớn cho ựất nước này làm ngừng ngay xuất khẩu vào thị trường Nhật Bản và Hàn Quốc (gây thiệt hại trên 4 tỉ USD, 90% trong số này bị mất từ lợi nhuận xuất khẩu) [11] Năm 2000, dịch lây lan ựến các nước đông Bắc Á (Nhật Bản và Hàn Quốc), ựến năm 2000 châu Á có 22 quốc gia chắnh thức công bố dịch LMLM [16]

Năm 2004, các nước thuộc khu vực đông Á là Mông Cổ và Trung Quốc báo cáo có dịch

Từ năm 2005, tại Trung Quốc, Myanmar ựã xuất hiện type virus LMLM Asia1 làm cho diễn biến dịch LMLM trong khu vực ựã phức tạp lại càng phức tạp hơn Tình hình dịch LMLM tại khu vực đông Nam Á diễn ra theo chiều hướng gia tăng và phức tạp Các nước có dịch là Thái Lan, Myanmar, Lào, Campuchia, Malaysia, Philippin và Việt Nam

Giữa năm 2006 xảy ra các vụ dịch ở Campuchia do type O gây ra (Cathay

và topotype Southeast Asia), Việt Nam, Lào nguyên nhân do type A

2.3 DỊCH TỄ HỌC BỆNH LMLM

2.3.1 Loài vật mắc bệnh

Trong tự nhiên: Trâu, bò, dê, lợn, lạc ựà, hươu, bò rừng Bò là ựộng vật cảm nhiễm nhất Bò là một thành phần ựóng vai trò quan trọng trong dịch tễ

bệnh LMLM bởi sự cảm nhiễm cao và khả năng bài thải virus LMLM ít nhất

4 ngày trước khi xuất hiện những triệu chứng lâm sàng ñầu tiên Mặc dù vậy cừu và dê cũng nhiễm bệnh LMLM nhưng triệu chứng của nó không biểu hiện hoặc có biểu hiện không rõ dưới dạng tiền lâm sàng Lợn là nguồn tàng trữ mầm bệnh LMLM quan trọng của sự gieo rắc virus LMLM trong không khí Do vậy lợn ñược coi là vật chủ cho virus LMLM nhân lên và bò là sự chỉ ñiểm cho sự có mặt của virus LMLM Cừu có thể là vật dự trữ bởi vì chúng thường mắc ở thể nhẹ hoặc không xuất hiện triệu chứng lâm sàng, không những thế virus LMLM còn có khả năng gây nhiễm ở ñộng một số loại ñộng vật khác trong cùng một vùng nhiễm bệnh [56]

Trong phòng thí nghiệm: Các loài ñộng vật thí nghiệm ñều mẫn cảm với virus LMLM Tuy nhiên, người ta thường gây bệnh cho bê, chuột lang [28], [9]

Virus LMLM có thể phân lập trên phôi gà và trên môi trường nuôi cấy tế bào tuyến giáp trạng bò sơ cấp, tế bào thận cừu, thận bê hoặc thận lợn sơ cấp Các tế bào dòng, ví dụ như tế bào thận chuột Hamter một ngày tuổi (BHK 21) [22], [9]

2.3.4 Khả năng lây lan

Bệnh LMLM là bệnh lây lan rất mạnh rất nhanh, rất rộng trong một thời gian ngắn Sự di chuyển virus LMLM trong ñiều kiện thích hợp có thể là 250

km trong không khí [46]

2.3.5 Tỷ lệ ốm và chết

Tỷ lệ tử vong ở ñộng vật trưởng thành thấp nhưng tỷ lệ tử vong ở ñộng vật non có thể lên tới 100%, ñộng vật non chết chủ yếu do viêm cơ tim nặng dẫn ñến suy tim và chết [34], nguyên nhân khác là do gia súc non, sức ñề kháng kém nên dễ bị nhiễm kế phát các bệnh khác khi mắc bệnh LMLM

2.3.6 ðường truyền bệnh

Có nhiều nhân tố ảnh hưởng ñến sự phát tán mầm bệnh Yếu tố quan trọng nhất là ñộng vật cảm nhiễm, sự tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp giữa các ñộng vật với nhau (sự di chuyển của ñộng vật và con người) mật ñộ của ñộng vật trong một vùng, phương thức chăn nuôi, ñiều kiện môi trường và các biện pháp kiểm soát sự nhân lên của bệnh

Sự lây truyền chính của virus LMLM thông qua ñường không khí, sự tiếp xúc trực tiếp và thông qua ñường thức ăn nước uống Nhìn chung virus LMLM xâm nhập thông qua ñường hô hấp

Cơ chế của sự lây truyền virus LMLM, sự di chuyển của ñộng vật cảm nhiễm ñóng vai trò quan trọng nhất tiếp theo sự trao ñổi sản phẩm ñộng vật Một hoặc hơn một ñộng vật trong ñàn nhiễm bệnh số virus LMLM thải ra môi trường là rất lớn virus LMLM có thể phát tán rất xa bởi các ñộng vật mang trùng hoặc ủ bệnh, các phương tiện vận chuyển như xe tải vận chuyển thức

ăn, chim, chó hoang, các ñộng vật nuôi như chó và mèo, loài gặm nhấm và các ñộng vật có xương sống khác, vecter cơ học Rác bao gồm các mảnh thức

ăn chưa ñược nấu chín và xương từ những ñộng vật nhiễm bệnh là nguồn gây

nhiễm ở lợn Con người có thể hít hoặc là nơi ẩn náu của virus LMLM trong thời gian 24 giờ và cũng là nguồn lây nhiễm cho ñộng vật

Nét ñặc trưng của bệnh LMLM là sự bài thải virus LMLM trước khi ñộng vật bị nhiễm có những dấu hiệu lâm sàng, giai ñoạn ủ bệnh dài phụ thuộc từng chủng virus LMLM, sự phơi nhiễm và con ñường lây nhiễm Virus LMLM lây nhiễm qua ñường không khí sẽ phát bệnh từ 4-5 ngày ở ñộng vật

bị bệnh LMLM và bài thải virus LMLM lên ñến 4 ngày trước khi có những dấu hiệu lâm sàng ñầu tiên

Virus LMLM lây theo ñường không khí phát tán trên khoảng cách 60 km

ở ñất liền và 200 km ở biển so với nơi xảy ra Nhân tố ñóng vai trò quan trọng nhất trong việc phát tán virus LMLM là gió, ñộ ẩm cao, ñiều kiện thích hợp nhất cho virus LMLM là ñộ ẩm trên 60%, không khí ổn ñịnh… [57]

2.4 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH BỆNH LMLM

2.4.1 Triệu chứng lâm sàng

Triệu chứng ñặc trưng của bệnh LMLM là: “lở mồm” và “long móng” ñúng như tên gọi của bệnh Ở lợn, thời gian ủ bệnh nhiều hơn Các triệu chứng của bệnh bao gồm:

Tăng thân nhiệt: Sốt thành 2 ñợt, ñợt một do virus LMLM, ñợt hai do nhiễm trùng thứ cấp

- Ngày thứ nhất ñến ngày thứ hai: gia súc nhai nhóp nhép, chảy nước dãi, bắt ñầu xuất hiện mụn nước ở miệng, lợi, kẽ móng, núm vú

- Ngày thứ ba ñến ngày thứ năm: mụn nước vỡ ra

- Ngày thứ sáu ñến ngày thứ mười: hình thành các vết sẹo tại nơi có mụn nước vỡ

Gia súc ñi khập khiễng do xuất hiện các mụn nước và vết lở loét ở xung quanh gờ vành móng, khe ngón và ñế guốc Nếu nặng thì què do long móng Con vật ăn kém hoặc không ăn do ñau khi nhai [9]

Các loài ñộng vật guốc chẵn có mức ñộ mẫn cảm ngang nhau ñối với virus LMLM nhưng mức ñộ phát bệnh lâm sàng khác nhau Bệnh thường biểu hiện rõ nhất và nặng ở trâu bò, sau ñó ñến lợn và sau cùng là dê cừu [9]

Triệu chứng ở trâu bò

Trâu bò mắc bệnh thường sốt cao (40-410C), bỏ ăn, run rẩy, giảm sản lượng sữa trong 2-3 ngày, miệng chảy nhiều nước dãi, ñi khập khiễng Mụn nước (hoặc vết loét khi mụn nước ñã vỡ) xuất hiện ở niêm mạc miệng, má, lưỡi, bờ lợi, phía trong mũi, núm vú, kẽ và viền móng

Triệu chứng ở dê, cừu

Triệu chứng bệnh LMLM ở dê và cừu là không ñiển hình, tổn thương nhẹ thường chỉ thấy các vết loét ở vùng lợi Những tổn thương ở chân không rõ ràng Mất sữa là triệu chứng ñặc trưng nhất của bệnh LMLM ở cừu và dê cho sữa Dê và cừu non cũng dễ bị chết khi nhiễm virus LMLM

Triệu chứng ở lợn

Tổn thương ở miệng của lợn nhẹ hơn của trâu bò Biểu hiện rõ nhất ở lợn

là ñi lại khập khiễng do tổn thương nghiêm trọng ở các móng, ñặc biệt là lợn nuôi trên nền chuồng bê tông, bệnh gây chết với tỷ lệ cao ở lợn con

2.4.2 Bệnh tích

Bệnh tích ñại thể

Bệnh tích chủ yếu của bệnh LMLM là mụn nước, vết loét, sẹo ở xoang miệng, gờ vành móng, kẽ ngón, da vú v.v…và hiện tượng lở mồm, long móng [9] Khi mổ ñộng vật, ta có thể gặp các bệnh tích sau:

Mặt ngồi của tim cĩ vết xuất huyết thành vệt như da hổ, gọi là “tim hổ” [9] Nếu con vật sống sĩt thì thấy tim bị co giãn, to và mềm nhũn Trên vết cắt

cơ tim xuất hiện vết sọc với những nốt vàng rải rác nổi rõ trên phần cơ tim bình thường [4]

Ngồi biến đổi ở tim, con vật cịn cĩ những biến đổi sau [15] Viêm khí quản và viêm phổi, lách sưng to và cĩ đốm sẫm, cĩ mụn nước kèm theo tụ huyết, xuất huyết ở niêm mạc đường tiêu hố như lợi, mép chân răng, thực quản, dạ múi khế, ruột non v.v Hạn hữu cĩ những trường hợp xuất hiện mụn nước ở những vùng da đáy chậu, vùng da ở bên ngồi bộ phận sinh dục con đực cũng như con cái và ở mí mắt của chúng [43]

Bệnh tích vi thể

Bệnh tích vi thể cĩ thể quan sát thấy ở bề mặt biểu mơ, cơ tim và cơ bắp ðặc biệt là ở cơ tim của động vật non cĩ thể bị hoại tử kéo dài, kèm theo sự xâm nhiễm mạnh của các tế bào lympho ðây là nguyên nhân phổ biến dẫn đến tử vong ở gia súc non [43]

Bệnh tích ở lớp thượng bì: Tổn thương ở các tế bào biểu bì, thối hố ở các tế bào ở giữa lớp biểu bì Bên trong tế bào bị thối hố, nhân tế bào co lại

và thẫm màu Dịch thuỷ thũng cĩ thể cĩ sợi fibrin Lớp tế bào bì cĩ sự thâm nhiễm bạch cầu đơn nhân lớn Cĩ hiện tượng hoại tử tan và thấm nước phù Bệnh tích ở cơ vân: Hoại tử các sợi cơ tạo thành những nốt kết hợp với sự thâm nhiễm các tế bào viêm

2.5 CHẨN ðỐN BỆNH LMLM

2.5.1 Chẩn đốn lâm sàng

Chẩn đốn lâm sàng bệnh LMLM cĩ thể thực hiện trong trường hợp bệnh xảy ra trong khu vực đã được xác định là cĩ dịch LMLM Triệu chứng chính

của bệnh là sốt, chảy nước dãi, xuất hiện những mụn nước trong xoang miệng, quanh mũi, vành tiếp giáp da mĩng chân, kẽ chân và đầu vú Kèm theo các triệu chứng trên là hiện tượng con vật bị què do bị đau chân, gây ra khĩ khăn trong khi đi lại, gây ra khĩ khăn trong khi di chuyển [9]

2.5.2 Chẩn đốn phịng thí nghiệm

2.5.2.1 Chẩn đốn bằng phương pháp virus học

Huyễn dịch nghi là cĩ virus LMLM cần phải ly tâm trước khi cấy vào tế bào nuơi hoặc tiêm cho chuột nhắt trắng chưa cai sữa

gan bàn chân chuột, bơi huyễn dịch bệnh phẩm lên vùng da bị khía Nếu bệnh phẩm cĩ chứa virus LMLM, sau 12 giờ sẽ nổi vết đỏ, cĩ thuỷ thũng và đau ở vết khía [22]

bào tuyến giáp trạng bị sơ cấp, tế bào thận cừu, thận bê hoặc thận lợn sơ cấp Các tế bào dịng, ví dụ như tế bào thận chuột Hamster một ngày tuổi (BHK21), sau 24 giờ nếu bệnh phẩm cĩ virus LMLM thì sẽ thấy bệnh tích tế bào [22]

Tiêm động vật cảm thụ: Tiêm vào nội bì lưỡi bị (bị khơng nằm trong

phạm vi ổ dịch, chưa được tiêm phịng vacxin), sau 24 giờ nếu xuất hiện mụn nước ở chỗ tiêm, khi mụn nước tạo ra các vết loét thì kết luận gia súc bị bệnh

2.5.2.2 Chẩn đốn bằng các phương pháp huyết thanh học

* Phản ứng miễn dịch gắn với enzyme (ELISA)

Theo quy định của phịng thí nghiệm tham chiếu về LMLM của OIE, FAO, biện pháp thích hợp nhất để phát hiện kháng nguyên của virus LMLM

và giám định các serotype của virus LMLM là phương pháp ELISA Hiện nay

ELISA là một phản ứng chẩn đốn nhanh dùng cho bệnh LMLM cũng như giám định serotype của virus LMLM

cĩ chứa kháng thể

- Kháng nguyên là máu gia súc nghi mắc bệnh LMLM hoặc bệnh phẩm cấy vào trong mơi trường tổ chức lấy từ tuyến yên của bị hoặc của lợn, tế bào thận bê hoặc thận cừu non hoặc các dịng tế bào cĩ độ nhạy tương đương, khi

tế bào xuất hiện nhưng dấu hiệu bệnh tích tế bào thì lấy dịch làm phản ứng kết hợp bổ thể [28]

* Phản ứng trung hồ virus LMLM (Virus neutralization test- VNT)

Nguyên lý: Virus LMLM khi xâm nhập vào cơ thể kích thích cơ thể sản sinh kháng thể dịch thể đặc hiệu Sự kết hợp giữa kháng thể dịch thể đặc hiệu

và virus LMLM làm cho virus LMLM bị trung hồ, mất khả năng lây nhiễm

2.5.2.3 Phân lập và giám định virus LMLM

* Giám định bằng cách phân tích protein

Virus LMLM là virus cĩ mức độ đột biến cao nhưng mỗi biến chủng cĩ dấu ấn riêng Bằng phương pháp sinh hố học cĩ thể đưa ra những kết luận về đặc tính của chủng, tính đặc hiệu của chủng cũng như tiến hố của các biến chủng ðiện di polyacrylamid gel cho phép so sánh điểm đẳng điện của các

protein, phát hiện dấu vết sai khác giữa các biến chủng của virus LMLM và quan hệ họ hàng giữa các biến chủng [22], [30]

* Chẩn đốn phát hiện RNA virus

Các phương pháp phát hiện virus LMLM trong bệnh phẩm bằng RT-PCR

và real-time PCR hiện đang được áp dụng rộng rãi trong các phịng thí

nghiệm trên thế giới

2.6 PHỊNG BỆNH

2.6.1 Khi chưa cĩ dịch xảy ra

Chăm sĩc và vệ sinh phịng bệnh

- Cho gia súc ăn uống đầy đủ về chất lượng và số lượng

- ðịnh kỳ tẩy uế chuồng trại, bãi chăn thu gom phân rác đốt hay ủ phân theo phương pháp sinh vật học

- Khi nhập gia súc từ nơi này sang nơi khác phải thực hiện kiểm dịch chặt chẽ, nhất là qua biên giới [22]

Phịng bệnh bằng vacxin

- ðối với bệnh LMLM đến nay người ta chỉ sử dụng vacxin vơ hoạt [28]

- Virus LMLM cĩ nhiều type và subtype, cĩ khả năng đột biến mạnh và khơng gây miễn dịch chéo nên chủng virus dùng sản xuất vacxin phải phù hợp với chủng virus gây bệnh trên thực địa thì việc tiêm phịng mới cĩ hiệu quả Sau khi tiêm vacxin mức độ bảo hộ tốt nhất thường được ghi nhận ở bị là

từ 21-28 ngày sau khi tiêm, nhưng cĩ một số trường hợp đỉnh cao này lại quan sát thấy ở ngày 14 sau khi tiêm [40], [42], [41]

Mỗi lần tiêm bảo hộ được 3 tháng do vậy chúng ta cần phải tiêm nhắc lại

- Các loại vacxin đang dùng hiện nay:

+ Vacxin formol keo phèn

Vacxin formol keo phèn sản xuất theo phương pháp của Valê (Pháp 1925), Smits (ðan Mạch 1938) và Vanman (ðức 1938) 1954 [23]

Vacxin này ñược chế tạo bằng cách gây bệnh cho bò bằng cách khía da trên lưỡi hoặc tiêm vào cơ lưỡi virus LMLM thuộc các type gây bệnh Mụn nước hình thành trên lưỡi sau 24h, mụn nước ñược lấy ra cẩn thận, và bảo quản lạnh sau ñó vô hoạt bằmg formalin nồng ñộ 1% [28]

+ Vacxin vô hoạt nuôi cấy trên môi trường tế bào

Vacxin này ñược chế từ virus nuôi cấy trên mô bào; biểu mô lưỡi bò trưởng thành tế bào nguyên sinh thận bê hoặc các dòng tế bào mẫn cảm như: BHK 21, sau ñó vô hoạt bằng formalin, acetylethyleneimine, binary, Ethyleneimine sau ñó vô hoạt các chất trên, người ta nhũ hoá với chất bổ trợ dầu sẽ ñược vacxin virus hữu hiệu, hơn vacxin formalin bởi vì ñộ dài miễn dịch ở bò và lợn dài hơn [28]

Các loại vacxin LMLM hiện dùng ở Việt Nam

Tại Việt Nam hiện ñang sử dụng 2 loại vacxin ñơn giá và ña giá nhập từ các nước là Merial (Pháp) và Intervet (Hà Lan), Trung Quốc (vacxin vô hoạt type O), Nga, Ấn ðộ (Posi-FMD)

Intervet giới thiệu ở Việt Nam hai loại vacxin LMLM có tên thương mại

là DECIVAC- FMD- ALSA (dùng cho thú nhai lại) và DECIVAC- FMD- DOE (dùng chung cho lợn và thú nhai lại)

Merial có vacxin Aftovax (dùng cho thú nhai lại) và Aftopor (dùng cho lợn và thú nhai lại) [37]

Viện Thú y Lan Châu, Trung Quốc có vaxin nhị giá Foot and Mouth Disease (type O, Asia1) Bivalent Vaccine, Inactivated cũng ñang ñược sử dụng ở nước ta

Vacxin ña giá ở Việt Nam chứa các type O, A và Asia1 [37]

26 tỉnh làm nhiều trâu, bò, lợn bị chết Diễn biến bệnh LMLM ngày càng trở nên phức tạp, hàng năm bệnh xảy ra ở diện rộng với số lượng lớn gia súc bệnh [4] Theo số liệu của Cục Thú y [5], năm 1999, trong khi vẫn chưa chấm dứt các ñợt dịch từ các tỉnh miền Trung và miền Nam thì ở miền Bắc, ñợt dịch mới từ Trung Quốc tràn sang tấn công hàng loạt các tỉnh giáp biên Cao Bằng

là ñiểm dịch ñầu tiên, từ ñó dịch lan sang các tỉnh khác ðến 10/3/2000 ñã có

58 tỉnh bị dịch, 297.808 trâu, bò và 36.530 lợn mắc bệnh

Năm 2001, bệnh xảy ra ở 16 tỉnh thành với 3.976 trâu, bò mắc bệnh Năm 2002, bệnh xảy ra ở 26 tỉnh thành với 10.287 trâu, bò mắc bệnh Năm 2003, 38 tỉnh thành có dịch, trong ñó 28 tỉnh thành có dịch ở trâu, bò

và 28 tỉnh có dịch ở lợn, với tổng số 20.303 trâu, bò; 1.178 dê và 3.533 lợn mắc bệnh, chủ yếu ở các tỉnh: Quảng Trị, Phú Yên, Khánh Hoà, Gia Lai, Hà Giang Theo Tô Long Thành và cộng sự, tình hình dịch bệnh LMLM trong mấy năm gần ñây diễn biến hết sức phức tạp và có chiều hướng gia tăng

Năm 2004, số tỉnh có dịch LMLM là 24 tỉnh, trong ñó có 9 tỉnh do virus LMLM serotype A (phát hiện lần ñầu tiên tại Ninh Thuận và Bình ðịnh vào 8/2004), 12 tỉnh do virus LMLM serotype O và 3 tỉnh do cả 2 virus LMLM serotype O và A Nguyên nhân của việc xuất hiện virus LMLM type A có thể

là do việc nhập lậu bò từ Camphuchia

Năm 2005, số tỉnh có dịch LMLM là 37 tỉnh với 28.241 trâu, bò, 3.976 lợn mắc bệnh, trong ñó có 3 tỉnh do virus LMLM serotype A, 13 tỉnh do virus LMLM serotype O, 3 tỉnh do cả 2 virus LMLM serotype O và A, 2 tỉnh do virus LMLM serotype Asia 1 (Lào Cai và Khánh Hoà vào tháng 10/2005) Năm 2006, số tỉnh có dịch LMLM là 27, trong ñó 26 tỉnh là type O và Hà Giang là type Asia 1 (phát hiện tháng 5/2006 bằng kít 3ABC và giám ñịnh bằng phương pháp RT-PCR) với tổng số 9.271 trâu bò và 12.461 lợn bị bệnh Năm 2007 có 37 tỉnh có dịch, chủ yếu xảy ra ở trâu bò, với tổng số 11.355 trâu bò ốm và phải xử lý, chết là 3.765 con trong 225 huyện, 294 xã có dịch LMLM Có 172 xã thuộc 71 huyện có dịch LMLM trên lợn với tổng số con ốm là 12.386 con và phải xử lý là 11.122 con Các type virus lưu hành là type O, A và Asia1

Tình hình dịch bệnh LMLM trong năm 2008 có giảm so với các năm trước, 43 huyện có dịch trên trâu bò, 2.408 trâu bò mắc bệnh, số trâu bò chết, tiêu hủy là 218 con Type O vẫn là type virus xuất hiện nhiều nhất trong các ổ dịch bên cạnh type A và Asia1

ðến ngày 15 tháng 9 năm 2009 ñã có 21 tỉnh có dịch LMLM trên trâu, bò

và lợn, số mắc ở trâu là 1.439 con, bò là 1.768 con và lợn là 238 con Những tỉnh có số trâu bò lợn mắc và tiêu hủy nhiều là Kon Tum, Quảng Bình, Quảng Ngãi, Sơn La…

2.7.2 Những nghiên cứu về bệnh LMLM ở Việt Nam

Năm 2003, Hồ đình Chúc và Ngô Thanh Long ựã sử dụng kit ELISA CHECKIT - FMD- 3ABC ựể phát hiện trâu bò nhiễm virus LMLM [3]

Năm 2004, Tô Long Thành và cộng sự ựã phân lập thành công virus LMLM trên tế bào BHK21 Sử dụng kỹ thuật RT- PCR với cặp mồi chung 1F/1R ựặc hiệu cho 7 type của virus LMLM gây bệnh LMLM và cặp mồi P33/P38 ựặc hiệu cho type O ựã ựược xác ựịnh virus LMLM phân lập ựược là virus LMLM type O [27]

Năm 2005, Lê Văn Phan và cộng sự ựã tách dòng và giải mã thành công ựoạn mã hoá cho serotype O của virus LMLM gây bệnh LMLM thu thập tại Quảng Trị [18]

Tháng 10/2005, Nguyễn Viết Không và cộng sự ựã phát hiện type Asia1 của virus LMLM tại Khánh Hòa Như vậy, ở Nha Trang ựược ghi nhận có 3 type virus LMLM là O, A và Asia1 [10]

Năm 2006, Thái Thuỷ Phượng và Lê Thanh Hoà ựã tách dòng, giải trình

tự và phân tắch chuỗi gene từ các mẫu bệnh phẩm từ bò lai và lợn đồng Tháp

ựã phát hiện ra topotype khác biệt của virus LMLM [20]

Năm 2007, Thái Thủy Phượng, Lê Thanh Hoà ựã ựịnh type virus LMLM trên heo, bò tại Tiền Giang và đồng Tháp qua sử dụng chỉ thị phân tử gene kháng nguyên 1D- 2A- 2B (VP1-2A-2B) [21]

Như vậy ở nước ta hiện nay có 3 serotype virus LMLM gây bệnh LMLM

O, A, Asia1 Virus LMLM serotype O có 3 topotype: Topotype SAE (South- EAST), topotype Cathay, topotype ME-SA (Trong ựó topotype Cathay và topotype ME-SA là phổ biến nhất trong các ổ dịch)

PHẦN III ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, ðỊA ðIỂM, VẬT LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ ðỊA ðIỂM NGHIÊN CỨU

3.1.1 ðối tượng nghiên cứu

Gia súc nghi mắc bệnh LMLM, mẫu bệnh phẩm nghi cĩ virus LMLM

3.1.2 Nội dung nghiên cứu

- Nhận xét, đánh giá chất lượng mẫu bệnh phẩm được gửi đến Trung tâm Chẩn đốn Thú y TƯ và mẫu bệnh phẩm do cán bộ Trung tâm đi lấy

- Chẩn đốn phát hiện virus LMLM bằng phương pháp ELISA

- Chẩn đốn phát hiện virus LMLM bằng phương pháp Real-time PCR

- Chẩn đốn phát hiện virus LMLM bằng phương pháp phân lập virus trên tế bào BHK21

- Thu thập kết quả, đánh giá, so sánh độ nhạy tương đối, thời gian chẩn đốn, chi phí giữa các phương pháp dựa trên kết quả đạt được Kiến nghị phương pháp chẩn đốn phát hiện virus tối ưu

- Khảo sát năng lực thực hiện ba phương pháp chẩn đốn trên tại một số đơn

vị

3.1.3 ðịa điểm nghiên cứu

- Một số tỉnh cĩ dịch

- Trung tâm Chẩn đốn Thú y TƯ

- Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y TƯ1

3.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.2.1 Máy móc

- Tủ lạnh âm

- Tủ lạnh thường

- Tủ ấm 37oC

- Máy lắc ñĩa (orbital shaker)

- Máy lắc trộn (vortex mixer)

- Nồi ñun cách thuỷ (water bath)

- Máy ñọc ELISA với kính lọc 492 nm

- Máy rửa ñĩa ELISA

- Buồng cấy vô trùng (BSC-Biosafety cabinet)

- Máy ly tâm, máy ly tâm lạnh

- Máy real-time PCR Smart Cycler

3.2.3 Hố chất

- Nước cất hoặc nước khử ion

- Water free RNA

3.2.4.3 Nguyên liệu cho phân lập tế bào

- Giống tế bào BHK21: do Bộ mơn Virus, TT Chẩn đốn Thú y TƯ cung cấp

- Môi trường cơ bản RPMI 1640, MEM (Minimum Essential Medium), MEM non essential amino acid solution 100x, MEM amino acid solution 50x, Foetal Bovine (Cafl) Serum, Dimethylsulfoxide (DMSO), L - Glutamine, Sodium pyruvate, Penicilline - Streptomycine, Amphotericin, Trypsin, Trypan blue, Hepes free acid, NaHCO3, PBS Ca2+, Mg2+ free, HCl 1N, NaOH 1N…

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Phương pháp lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển bệnh phẩm phát hiện virus LMLM

Mẫu bệnh phẩm ñể phát hiện bệnh và ñịnh type virus là các mẫu biểu

mô, nơi có bệnh tích ở lợi, lưỡi, mép, chân, vú … ; dịch mụn nước lấy từ các mụn nước chưa vỡ ở các tổ chức trên

Bảo quản:

- Mẫu tổ chức biểu mô sau khi lấy ñựng trong lọ thuỷ tinh dày, có nút vặn kín với dung dịch bảo quản ít nhất là 20 ml Phía ngoài lọ ñựng bệnh phẩm phải ghi nhãn về chủ gia súc, loại gia súc, loại bệnh phẩm, nơi lấy mẫu

- Bên ngoài lọ ñựng bệnh phẩm phải khử trùng

- Lọ mẫu bệnh phẩm sau khi lấy nếu chưa kịp gửi ñến phòng xét nghiệm cần bảo quản ngay trong ngăn ñá tủ lạnh hoặc tủ lạnh âm

Vận chuyển:

Khi gửi mẫu cần quấn bơng thấm nước quanh lọ để chống vỡ và cho vào 2 lượt túi nilon bên trong cĩ phiếu gửi bệnh phẩm, buộc kín Mẫu bệnh phẩm được để vào hộp giữ lạnh cĩ đủ đá trong quá trình vận chuyển, đậy nắp, gắn nhãn bên ngồi, ghi rõ tên và địa chỉ nơi gửi và gửi nhanh đến phịng chẩn đốn xét nghiệm

Ghi phiếu gửi bệnh phẩm (cần cĩ những thơng tin sau):

- Tên và địa chỉ nơi gửi

- Tên và địa chỉ chủ gia súc

- Số lượng, lồi, và giống gia súc mắc bệnh trên tổng số

- Bệnh phẩm: loại bệnh phẩm, ngày lấy mẫu, ngày gửi mẫu

- Tuổi của đàn mắc bệnh

- Ngày mắc bệnh, mức độ lây lan

- Lịch sử bệnh: đã từng mắc bệnh hay đã tiêm phịng, loại vacxin…

3.3.2 Phương pháp nuơi cấy virus LMLM trên mơi trường tế bào BHK21

3.3.2.1 Hồi phục tế bào BHK21 từ nguồn giống bảo quản ở tủ âm sâu

- Giống tế bào BHK21 được giữ tại Bộ mơn Virus, Trung tâm Chẩn đốn Thú

y TƯ

- Các bước tiến hành hồi phục tế bào BHK21:

+ Bước 1: Giải đơng: Lấy 1 ống tế bào ra khỏi tủ âm sâu (-800C), cho vào cốc nước sạch và để ở nhiệt độ phịng, quan sát đến khi ống tế bào chuyển màu và tan đơng