PHÁT HIỆN VIRÚT GÂY BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG BẰNG KỸ THUẬT RTPCR

vì vậy cần chọn một phương pháp đặc hiệu và nhạy có thể phát hiện nhanh và sớm vi-rút LMLM thuộc cả 3 chủng O, A, Asia1 tồn tại trong cơ thể vật nuôi nhằm phát hiện sớm các cá thể vật nu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN VI-RÚT GÂY BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN VI-RÚT GÂY BỆNH LỞ MỒM LONG MÓNG

BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

KS VÕ KHÁNH HƯNG

Tháng 07/2012

LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn:

Các thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Nông Lâm đã chăm

lo và tạo điều kiện cho những sinh viên chúng tôi được học tập và nghiên cứu

Tất cả các thầy cô trường Đại học Nông Lâm đã truyền dạy cho tôi những kiến thức vô cùng quý giá trong lĩnh vực công nghệ sinh học

Lãnh đạo Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam và lãnh đạo Phòng Công Nghệ Sinh học đã cho phép tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện

đề tài tại cơ sở của Viện và Phòng

ThS Lê Thị Thu Hà và KS Võ Khánh Hưng, những người đã tận tình chỉ dạy

và hướng dẫn tôi thực hiện đề tài này

Anh Nguyễn Xuân Nam, chị Nguyễn Thị Bích Hiền, những người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng là cha mẹ tôi, những người đã sinh thành và nuôi dưỡng tôi, luôn chăm lo, chia sẽ, động viên tôi và là người đã dẫn dắt tôi đến lĩnh vực công nghệ sinh học này

TP Hồ Chí Minh, năm 2012

Phạm Thanh Tùng

TÓM TẮT Bệnh lở mồm long móng là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm trên gia súc Bệnh lây lan nhanh vì vậy đòi hỏi phải có một phương pháp chẩn đoán nhanh chóng

và hiệu quả để phát hiện sớm nhằm giảm thiệt hại do bệnh gây ra Kỹ thuật RT-PCR

có thể đáp ứng những yêu cầu này cho phép phát hiện nhanh chóng và hiệu quả sự hiện diện của vi-rút gây bệnh

Xây dựng quy trình phản ứng RT-PCR phát hiện vi-rút gây bệnh lở mồm long móng sử dụng cặp mồi 3DF/3DR Cặp mồi 3DF/3DR được thiết kế dựa trên trình tự gen 3D quy định một protein không cấu trúc của vi-rút lở mồm long móng, cặp mồi khuếch đại đoạn gen có kích thước 204 bp Phản ứng RT-PCR với cặp mồi 3DF/3DR phát hiện vi-rút lở mồm long móng sử dụng bộ kit one-step RT-PCR (AccessQuick™ RT-PCR System (Promega)) với chu trình nhiệt: ủ 450C trong 45 phút, 920C trong 2 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ (940C trong 30 giây, 520C trong 1 phút, 680C trong 1 phút), cuối cùng là 680C trong 7 phút Phản ứng RT-PCR được tiến hàng trên 3 mẫu dương chủng O, A, Asia1 của vi-rút lở mồm long móng và 24 mẫu thực địa được thu thập tại tỉnh Lâm Đồng

Kết quả mẫu dương chủng O, Asia1 của vi-rút lở mồm long móng cho sản phẩm PCR có kích thước 204 bp Kết quả giải trình tự và BLAST của sản phẩm PCR thuộc hai chủng O, Asia1 cho thấy chính là gen 3D của vi-rút lở mồm long móng Kết quả PCR trên 24 mẫu thực địa không cho ra sản phẩm PCR Cần xem xét việc ứng dụng quy trình phản ứng RT-PCR phát hiện vi-rút lở mồm long móng đã xây dựng trên vào thực địa

SUMMARYFoot and mouth disease is a dangerous contagious disease in cattle The disease spreads rapidly so a rapid effective and diagnostic methods is required for the early detection to reduce damage caused by the disease RT-PCR technique can meet these requirements for rapid detection the virus

RT-PCR reactions to detect the virus that causes foot and mouth with 3DF/3DR primers was developed The 3DF/3DR primers were designed based on the sequence encoding 3D structure a protein of the foot and mouth virus, primer pairs amplified fragments with the size of 204 bp RT-PCR reaction was performed using the kit one-step RT-PCR (RT-PCR AccessQuick ™ System (Promega)) with thermal cycles: 450C for 45 minutes incubation , 920C for 2 min, followed by 35 cycles (940C for 30 sec, 520C for 1 min, 680C for 1 min), and finally extention at 680C for 7 minutes RT-PCR reaction was carried on three positive samples of type O, A, Asia1

of foot and mouth disease virus and 24 field samples collected in Lam Dong province

Result positive samples type O, Asia1 of foot and mouth virus for PCR showed bands with the size of 204 bp on agarose gel The results of the sequencing and BLAST PCR products from two strains of O, Asia1 proved that thay were 3D gene of foot and mouth disease virus Amplification of 24 field samples resulted no PCR products Amplication of RT-PCR technique to detect foot and mouth virus should be put in consideration

Keyword: foot and mouth disease, RT-PCR, FMDV, 3D

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

TÓM TẮT ii

SUMMARY iii

MỤC LỤC iv

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu 2

1.3 Nội dung 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Bệnh lở mồm long móng 3

2.1.1 Biểu hiện lâm sàng của bệnh lở mồm long móng 3

2.1.2 Đường xâm nhập của bệnh lở mồm long móng 5

2.1.3 Cơ chế sinh bệnh lở mồm long móng 5

2.1.4 Tình hình dịch bệnh lở mồm long móng trên thế giới và Việt Nam 6

2.1.5 Một số nghiên cứu về bệnh lở mồm long móng 8

2.2 Vi-rút gây bệnh lở mồm long móng 9

2.2.1 Hình thái học vi-rút gây bệnh lở mồm long móng 9

2.2.2 Phân bố của chủng vi-rút lở mồm long móng 11

2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh lở mồm long móng 11

2.3.1 Chẩn đoán lâm sàng 11

2.3.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm 12

2.3.2.1 Chẩn đoán huyết thanh học 12

2.3.2.1.1 Phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT) 12

2.3.2.1.2 Phản ứng trung hòa vi-rút 13

2.3.2.1.3 Phản ứng ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 13

2.3.2.3 Chẩn đoán bằng kỹ thuật RT-PCR 14

2.4 Kỹ thuật RT-PCR (reverse transcriptase polymerase chains reaction) 15

2.4.1 Nguyên tắc của kỹ thuật RT-PCR 15

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Thời gian và địa điểm 17

3.2 Vật liệu 17

3.2.1 Bệnh phẩm 17

3.2.2 Hóa chất, vật liệu và thiết bị tiến hành phản ứng RT-PCR 17

3.3 Phương pháp nghiên cứu 18

3.3.1 Phương pháp thu thập, vận chuyển và bảo quản bệnh phẩm 18

3.3.2 Thiết kế mồi cho phản ứng RT-PCR phát hiện vi-rút lở mồm long móng 19

3.3.3 Phương pháp RT-PCR để phát hiện vi-rút lở mồm long móng 20

3.3.3.1 Ly trích RNA vi-rút từ mẫu bệnh phẩm 20

3.3.3.2 Phản ứng RT-PCRphát hiện vi-rút trong mẫu bệnh phẩm 21

3.3.3.3 kiểm tra sản phẩm PCR 21

3.3.4 Giải trình tự 22

Chương 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN 23

4.1 Thiết kế primer cho phản ứng RT-PCR phát hiện vi-rút gây bệnh lở mồm long móng 23

4.2 Đánh giá khả năng phát hiện vi-rút lở mồm long móng bằng kỹ thuật RT-PCR của cặp primer 3DF và 3DR 25

4.3 Kết quả giải trình tự 27

4.4 Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi 3DF và 3DR để phát hiện vi-rút gây bệnh lở mồm long móng trên mẫu thực địa 29

Chương 5 KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ 33

5.1 Kết luận 33

5.2 Đề nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

dATP : Deoxyriboadenosine triphosphate

dUTP : Deoxyribouridine Triphosphate

ELISA : Enzyme-linked immunosorbent assay

FAO : Food and Agriciltural Organization

NCBI : National Center for Biotechnology Information

OIE : World Organisation for Animal Health

RT-PCR : Reverse transcription polymerase chain reaction

TCID50 : 50% Tissue Culture Infectious Dose

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1 Danh sách mẫu thực địa và ký hiệu 18

Bảng 3.2 Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase 21

Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR 21

Bảng 4.1 Trình tự primer (3DR, 3DR) 23

Bảng 4.2 Kết quả PCR trên mẫu thực địa 31

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Một số biểu hiện lâm sàn của gia súc bị bệnh LMLM 4

Hình 2.2 Cấu trúc hình thái vi-rút LMLM 9

Hình 2.3 Sơ đồ bộ gen vi-rút LMLM 10

Hình 2.4 Các quốc gia có dịch LMLM đã được báo cáo cho OIE những năm 1990 – 2002 11

Hình 3.1 Bản đồ khu vực lấy mẫu 18

Hình 4.1 Vị trí primer 3DF trên đoạn gen 3D 23

Hình 4.2 Vị trí Primer 3DR trên đoạn gen 3D 24

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid vi-rút chủng O, A, Asia với primer (3DF, 3DR) 26

Hình 4.4a Kết quả Blast mẫu dương chủng O 27

Hình 4.4b Kết quả Blast của mẫu chủng O với 1 trình tự gen đã biết 27

Hình 4.5a Kết quả Blast mẫu dương chủng Asia1 28

Hình 4.5b Kết quả Blast của mẫu chủng Asia1 với 1 trình tự gen đã biết 29

Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên 12 mẫu thực địa với cặp mồi (3DF và 3DR) 30

Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên 12 mẫu thực địa với cặp mồi (3DF và 3DR)( tt) 30

Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cùng với sự phát triển của đất nước trong những năm qua, ngành chăn nuôi nước ta đã có những bước phát triển nhanh chóng, đạt được nhiều thành tựu, ngành chăn nuôi chiếm khoảng 1/4 tỉ trọng trong sản suất nông nghiệp Tổng đàn gia súc của Việt Nam đạt khoảng 36 triệu con, trong đó gần 3 triệu con trâu, gần 7 triệu con bò, hơn 26 triệu con heo Về sản lượng thịt, sữa: đạt khoảng 2.5 triệu tấn thịt heo, 200 nghìn tấn thịt bò và hơn 200 nghìn tấn sữa (Báo cáo bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2007) Cùng với sự phát triển của chăn nuôi là sự bùng phát của các dịch bệnh, dịch bệnh ngày càng nguy hiểm và phức tạp, đã ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và sản lượng ngành chăn nuôi của Việt Nam cũng như trên thế giới Trong số các bệnh có thể kể tới các bệnh như: bệnh tụ huyết trùng trâu bò, bệnh dịch tả heo, bệnh

lở mồm long móng, bệnh heo tai xanh Trong đó bệnh lở mồm long móng (LMLM) Tuy không làm chết gia súc trừ gia súc nhỏ, nhưng bệnh LMLM lại gây những thiệt hại gián tiếp to lớn ảnh hưởng đến năng suất, chất lượng, phân phối, lưu thông và suất khẩu sản phẩm của ngành chăn nuôi (Sổ tay phòng chống dịch bệnh, 2002)

Bệnh LMLM là bệnh truyền nhiễm trên gia súc có khả năng lây nhiễm nhanh Nên khi dịch bệnh xảy ra có thể trở thành đại dịch gây thiệt hại lớn đối với ngành chăn nuôi của Việt Nam cũng như trên thế giới Việc dịch bệnh lây lan sẽ gây khó khăn trong việc phòng chống dịch và cản trở việc buôn bán động vật và các sản phẩm

từ động vật làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến kinh tế xã hội của vùng dịch đó Vì vậy,

tổ chức thú y thế giới (OIE; World Organisation for Animal Health) xếp bệnh này đứng đầu bảng trong danh mục các bệnh nguy hiểm trên vật nuôi Bệnh LMLM là bệnh truyền nhiễm của động vật guốc chẵn như: trâu, bò, heo, dê, hươu, nai… Sự nguy hiểm của bệnh là khả năng lây lan rất nhanh, rất mạnh Sự lây lan không chỉ do tiếp xúc giữa động vật khỏe và động vật mắc bệnh mà còn qua nhiều đường kể cả qua không khí Vì vậy bệnh thường bùng phát thành đại dịch gây thiệt hại về chăn nuôi, ảnh hưởng lâu dài đến năng suất vật nuôi và kinh tế xã hội của nhiều nước thuộc nhiều châu lục trên thế giới (Knowles và Sanuel, 2003)

Ở Việt Nam dịch LMLM xảy ra chủ yếu trên trâu, bò , heo với các chủng O, A, Asia1 (Knowles và ctv, 2005) vì vậy cần chọn một phương pháp đặc hiệu và nhạy có thể phát hiện nhanh và sớm vi-rút LMLM thuộc cả 3 chủng O, A, Asia1 tồn tại trong

cơ thể vật nuôi nhằm phát hiện sớm các cá thể vật nuôi nhiễm bệnh để hỗ trợ công tác phòng và trị bệnh do vi-rút LMLM gây ra Một trong những phương pháp thường được sử dụng là kỹ thuật RT-PCR, đây là phương pháp chẩn đoán phát hiện sự có mặt

bộ gene của vi-rút Vì thế thực hiện đề tài phát hiện vi-rút gây bệnh LMLM bằng kỹ thuật RT-PCR

1.2 Yêu cầu

Xây dựng được quy trình chẩn đoán bệnh lở mồm long móng bằng kỹ thuật

RT-PCR trên các chủng O, A và Asia1

1.3 Nội dung

Thu thập mẫu bệnh phẩm tại một số huyện thuộc địa bàn tỉnh Lâm Đồng

Thiết kế primer cho phản ứng RT-PCR phát hiện vi-rút LMLM

Đánh giá cho phản ứng RT-PCR để phát hiện vi-rút gây bệnh LMLM trên mẫu

thực địa với primer được thiết kế

Ứng dụng phản ứng RT-PCR được phát triển để phát hiện vi-rút gây bệnh

LMLM trên các mẫu thực địa thuộc địa bàn tỉnh Lâm Đồng

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

tế rất lớn, do tính lây lan quá mạnh (Bùi Quang Anh và Hoàng Văn Nam, 2000)

Hiện nay những nước đã khống chế được bệnh rất ngại nhập khẩu gia súc, hoặc các sản phẩm động vật từ các nước chưa khống chế được bệnh LMLM, đây chính là mối nguy hại cho đầu ra của ngành chăn nuôi, cũng như sự phát triển của nó Vì thế việc chẩn đoán sớm bệnh này là rất cần thiết trong thực tiễn (Sổ tay dịch bệnh động

vật, 2002)

2.1.1 Biểu hiện lâm sàng của bệnh lở mồm long móng

Ở trâu bò và heo hoặc các loài vật khác, bệnh có chung đặc điểm là sốt đột ngột 2 – 3 ngày, viêm dạng mụn nước rồi lở loét ở miệng, vú, vùng móng chân, nước bọt chảy nhiều như bọt bia Niêm mạc miệng, môi, lợi, chân răng đỏ ửng, khô, nóng Mụn nước bắt đầu mọc ở bên trong má, mép, chân răng, môi, lợi, và bề mặt lưỡi Kích thước của mụn nước bằng hạt gạo, hạt ngô hoặc to hơn, mụn nước phồng lên, có màng bọc mỏng, bên trong chứa nước trong, sau đục dần Sau 1 – 2 ngày, mụn nước bị vỡ, lớp niêm mạc tróc ra để lộ mặt dưới đỏ, chạm nhẹ vào dễ chảy máu mụn nước thường không có mủ Do viêm vùng miệng, con vật khó chịu, luôn lúc lắc đầu, nhai tóp tép, nước bọt sùi ra đầy mõm miệng (Sổ tay dịch bệnh

động vật, 2002)

Do có viêm mụn nước ở vùng vành móng, kẽ móng chân làm con vật khó chịu, tỏ ra đau đớn, bồn chồn, luôn nhấc chân lên Dễ thấy nhất là hiện tượng què, không đi cày kéo được trong khoảng 1 – 2 tuần Có trường hợp móng chân bị long hẳn ra, phổ biến nhất là ở heo Triệu chứng què ở cả đàn trâu bò gây ảnh hưởng xấu đối với vùng dựa vào sức kéo của chúng, làm lỡ thời vụ gieo trồng, có nơi xảy ra dịch bệnh, năng lúa bị giảm 20% (Nguyễn Tiến Dũng, 2000)

Hình 2.1 Một số biểu hiện lâm sàn của gia súc bị bệnh LMLM A: lở loét ở miệng trên bò; B:mụn nước ở chân heo; C: long móng ở heo; D: mụn nước ở vú (bò) (vietbao.vn)

Ở con cái đang nuôi con, triệu chứng và bệnh tích ở bầu vú, núm vú cũng tương tự như ở miệng và chân làm con vật giảm tiết sữa, sữa bị giảm phẩm chất Con mẹ thường không cho con bú vì đau, làm con non thiếu sữa Hơn nữa chính con non cũng bị viêm lở mồm như mẹ nên không bú được Hậu quả có tới 50 –

80% gia súc non bị chết Súc vật cái mang thai nhiễm vi-rút LMLM sẽ sẩy thai

Biến chứng: Viêm cơ tim ở súc vật non và viêm ruột (bê non, heo < 2 tháng) Từ miệng tới thực quản, dạ dày, ruột đều có mụn loét với từng mảng suất huyết hoặc tụ máu Bộ máy hô hấp cũng bị viêm Ở trâu bò hay gặp hiện tượng mặt ngoài cơ tim

có những vệt hoại tử màu trắng xen kẽ trông giống như da hổ nên gọi là “tim vằn

hổ” (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978)

Bệnh lở mồm long móng ở người: lây nhiễm bệnh LMLM ở người khá hiếm

và nhẹ Đôi khi gặp ở người hay tiếp xúc với gia súc có bệnh hoặc với vi-rút trong phòng thí nghiệm như người chăn nuôi, chăm sóc gia súc, cán bộ thú y, công nhân

lò mổ, nhân viên phòng thí nghiệm Đôi khi do uống sữa nhiễm mầm bệnh không

tiệt trùng kỹ, hoặc qua vết trầy xước trên da Biểu hiện là có mụn nước nổi trên da

ở tay, chân và lưỡi, lợi, có cảm giác ngứa ngáy và hơi nóng rát Mụn nước có thể tự

vỡ ra hoặc xẹp đi sau vài ngày, không để lại vết sẹo hay di chứng, có thể sốt nhẹ, mệt mỏi (www.anova.com.vn/contents/article.asp?id=265&detail=16&ucat=42)

2.1.2 Đường xâm nhập của bệnh lở mồm long móng

Đường xâm nhập chính là tiêu hoá, vi-rút có thể vào cơ thể qua niêm mạc miệng, và niêm mạc ống tiêu hoá Ngoài ra, các vết trầy ở da, đầu vú cũng là nơi vi-rút xâm nhập vào cơ thể Đường sinh dục và hô hấp được coi là đường xâm nhập

phụ (Sổ tay dịch bệnh đông vật, 2002)

Quá trình lây lan bệnh diễn ra theo các cách thức sau:

- Lây trực tiếp qua nước bọt hoặc các chất bài tiết do nhốt chung hoặc chăn

thả chung gia súc bệnh với gia súc khoẻ mạnh

- Lây gián tiếp qua thức ăn, nước uống, các dụng cụ chăn nuôi, chân tay, giầy dép của người chăn nuôi, người tham gia điều trị bệnh hoặc lây lan do việc bán chạy các gia súc mắc bệnh, mổ lậu gia súc mắc bệnh, không xử lý đúng mức

thịt gia súc mắc bệnh hoặc vận chuyển gia súc mắc bệnh

- Vi-rút có thể theo gió phát tán ra không khí trong cự ly 10 km

2.1.3 Cơ chế sinh bệnh lở mồm long móng

Thời gian ủ bệnh LMLM: sau khi vius LMLM nhiễm vào động vật mẫn cảm qua đường hô hấp trên hoặc phổi, vi-rút LMLM tuần hoàn qua máu đến các tổ chức biểu mô và nhân lên rất nhanh theo cấp số nhân Thời gian từ khi vi-rút xâm nhập vào cơ thể động vật mẫn cảm cho đến khi gây các bệnh tích lâm sàng là các mụn nước ở móng chân mồm thường là khoảng 2 – 14 ngày tùy thuộc vào độc lực của chủng vi-rút Vì vậy cần chọn phương pháp thích hợp để chẩn đoán và phát hiện sớm vi-rút LMLM trên trâu, bò, heo (Garland và Donaldson, 1990)

Đầu tiên vi-rút xâm nhập vào cơ thể qua niêm mạc miệng, niêm mạc ống tiêu hoá, qua thức ăn, nước uống… hoặc các vết trầy ở bên ngoài cơ thể Vi-rút sẽ nhân lên tại các vị trí xâm nhập ở lớp thượng bì của miệng, niêm mạc ống tiêu hoá,

da, tạo nên mụn nước sơ cấp, thường các mụn nước này ít và ở giai đoạn đó thú vẫn sinh hoạt bình thường, do đó dễ dàng bị bỏ qua không phát hiện được Sau 1 – 2

ngày vi-rút từ mụn nước sơ phát xâm nhập vào máu và phủ tạng, tạo nên triệu chứng sốt cao Tuy nhiên, máu và phủ tạng không phải là nơi thích hợp cho sự phát triển, do đó vi-rút quay ngược trở về các vị trí trên cơ thể có vùng thượng bì non như môi, nướu răng, lưỡi, gờ móng, đầu vú để phát triển, tạo các mụn nước thứ cấp Đặc điểm mụn nước chỉ mọc ở phần thượng bì, không ăn sâu vào lớp trung bì

và hạ bì, do đó sau khi mụn nước vỡ sẽ rất mau lành lại, và ít gây nhiễm trùng

thành mụn mủ nếu được chăm sóc tốt

Mụn mọc ở miệng, lưỡi gây cảm giác đau nhức làm thú không nuốt được, nước bọt bị kích thích chảy ra đầy ở miệng Heo con, bê, nghé bỏ bú do đó sẽ chết

sau vài ngày mắc bệnh Mụn nước ở móng chân thường bị nhiễm trùng do thú đi

đứng trong phân, đất, vi trùng phụ nhiễm sẽ tấn công sâu vào các lớp bên dưới gây

hư hại nặng tổ chức da ở gờ móng, làm móng dễ bị bong tróc Vi-rút có thể tạo các

mụn nước ở khí quản, phế quản hoặc tấn công vào cơ tim kéo theo sự phụ nhiễm

của vi khuẩn Staphylococcus, tạo nên các thể viêm cơ tim, thoái hoá cơ tim làm gia

súc chết ngộp (Nguyễn Tiến Dũng, 2000)

2.1.4 Tình hình dịch bệnh lở mồm long móng trên thế giới và Việt Nam

Từ thế kỷ XVII, XVIII bệnh LMLM đã bắt đầu suất hiện ở châu Âu và sau

đó bệnh được phát hiện trên toàn thế giới Năm 1987, Loeffler và Frosch mới phân lập được vi-rút gây bệnh (Nguyễn Vĩnh Phước, 1978) Tình hình dịch bệnh LMLM trong những năm 60 xảy ra rất trầm trọng, trung bình mỗi năm có khoảng 4.000 ổ dịch Đến những năm 70, bệnh có xu hướng giảm ở các nước châu Âu, nhưng ở các nước châu Phi và châu Á vẫn tăng

Vào những năm 1980, dịch LMLM xảy ra ở nhiều nước trên toàn thế giới châu Âu có 804 ổ dịch tại 12 nước do các chủng O, A, và C gây ra Tại châu Á đã

có quốc gia được thông báo có dịch LMLM do chủng Asia1 gây ra Các nước châu Phi có dịch LMLM do chủng C và SAT1, SAT2, SAT3 gây ra

Tháng 3/1997 dịch tái phát tại Đài Loan, tiêu diệt khoảng 4 triệu heo gây thiệt hại gần 2 tỉ USD Năm 2000, bệnh LMLM tiếp tục xảy ra trên dê bởi chủng tương tự chủng O năm 1999; dịch xảy ra trên bò ở các nước Nhật Bản, Hàn Quốc, Mông Cổ, Liên Bang Nga (Hoàng Văn Nam, Văn Đăng Kỳ, 2000) Năm 2001 dịch bùng phát lại gây thiệt hại nặng nề cho nền kinh tế nước Anh, đến tháng 7/2001 có

20 nước ở châu Phi, châu Mỹ, châu Á cũng xảy ra bệnh do vi-rút LMLM chủng O, chủ yếu trên heo (Knowles và ctv, 2005) Năm 2004 có 48 nước thông báo có dịch LMLM, chủng O là chủ yếu, riêng chủng A, SAT1 và SAT2 có sự biến đổi gen Riêng các nước Đông Nam Á và vùng Viễn Đông, trừ Indonesia không có dịch LMLM, chủng A được tìm thấy ở Malaysia, Thái Lan, Việt Nam Năm 2005, FAO/WRL đã nhận được 266 mẫu bệnh từ 21 nước thuộc châu Âu, châu Á, châu Phi, kết quả chủng O vẫn chiếm tỉ lệ cao (OIE/FAO, 2005) Trước tình hình dịch bệnh xảy ra nghiêm trọng , nhiều viện nghiên cứu ở các nước, Anh, Hòa Kỳ, Đức, Pháp, Brazil, Thái Lan ra đời Năm 1958, Pirbright của Anh trở thành phòng thí nghiệm tiêu chuẩn thế giới về LMLM Nhờ vào sự phát triển của khoa học công nghệ hiện đại, việc chẩn đoán và phát hiện bệnh nhanh chóng cũng như việc sản suất các loại vắc xin chất lượng cao cùng các biện pháp phòng chống dịch hiệu quả, nhiều quốc gia đã thanh toán thành công dịch LMLM (59 quốc gia được công nhận

là quốc gia an toàn dịch bệnh LMLM (OIE, 2005)

Ở Việt Nam: vi-rút LMLM được phát hiện lầm đầu tiên năm 1898 tại Nha Trang sau đó dịch đã xảy ra liên tiếp vào các năm 1937, 1940, 1948 tại các tỉnh miền Trung và Nam bộ Theo tổ chức quốc tế bệnh truyền nhiễm, bệnh LMLM có

xu hướng định vị tại Việt Nam và Campuchia Bệnh cũng xảy ra và gây nhiều thiệt hại trên trâu, bò, heo ở các tỉnh miền Bắc, Bắc Trung bộ (1952 – 1953) và các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long (1995) Theo số liệu nghiên cứu trước đây cho thấy dịch LMLM xảy ra liên tục trên trâu bò suốt từ năm 1975 – 2005, gây thiệt hại nặng nề nhất vào các năm 1993, 1995, 1999 và 2000 Vi-rút chủng O lưu hành nhiều năm cùng với chủng A (2005) trên trâu bò và chủng Asia1 được tìm thấy ở heo (2005) (Thái Thị Thủy Phượng, 2008)

Trong năm 2008, tổng số 153 ổ dịch LMLM xuất hiện ở 128 xã thuộc 47 huyện trong cả nước, trong đó xảy ra trên 1775 trâu, 886 bò, 67 heo Trong 2 tháng đầu năm 2009, có tổng số 38 ổ dịch LMLM xảy ra ở 36 xã của 11 huyện thuộc 5 tỉnh, tổng số ảnh hưởng dến 106 trâu, 394 bò Trong các ổ dịch trên, chủng O và A

là nguyên nhân chính gây bệnh (Hoàng và ctv, 2009) Năm 2010, số trâu bò bị mắc bệnh LMLM là 12.826 con so với năm 2009 tăng 5.595 con Tuy nhiên số bị chết,

xử lý là 225 con, giảm 183 con so với năm ngoái: số heo bị chết, xử lý là 818 con,

tăng 389 con (Báo cáo Bộ NN và PT Nông thôn, 2010) Báo cáo 6 tháng đầu năm

2011, dịch LMLM đã xảy ra hơn 30 tỉnh thành với tổng số gia súc là 140.897 con, trong đó trâu bị nhiễm nhiều nhất 78.277con, tiếp đến là heo 42.897, bò 17.373 con

và dê 1.624 con Tổng số gia súc bị tiêu hủy trên cả nước là 38.744 con (Báo cáo

Bộ NN và PT Nông thôn, 2011)

2.1.5 Một số nghiên cứu về bệnh lở mồm long móng

Vi-rút gây bệnh LMLM thuộc họ Picornavirus (giống Aphthovirus, họ

Picornaviridae), tồn tại với 7 kiểu huyết thanh miễn dịch khác nhau: O, A , C, Asia1, SAT1, SAT2, SAT3 (South Afican Territories), với rất nhiều kiểu huyết thanh phụ khác nhau phản ánh biến đổi di truyền ở các mức độ (Carrillo và ctv, 2005) Ba chủng A, O, C phổ biến trên thế giới, chủng Asia1 được tìm thấy ở Pakistan, chủng này thường gây bệnh ở châu Á Các chủng SAT1, SAT2, SAT3 tìm thấy ở Nam Phi, chủng này thường gây bệnh cho gia súc ở các nước châu Phi Trong số đó, chủng A có kháng nguyên đa dạng nhất và vì thế việc tạo vắc xin là khó khăn hơn cả (Kiching, 2005) Vi-rút gây bệnh LMLM biến đổi liện tục nên gây

đe dọa lớn đến ngành chăn nuôi trên toàn thế giới (Mohapatra và ctv, 2009b)

Theo Lê Văn Phan và ctv (2010) đã tiến hành phân tích trình tự một số đoạn gen mã hóa vi-rút LMLM chủng A trên các mẫu thu từ vùng dich thuộc các tỉnh Bắc Cạn, Phú Thọ, Quảng Bình Và Thừa Thiên Huế trong năm 2009 Kết quả phân tích trình tự nucleotid và acid amin vùng gen mã hóa protein capsid VP1 cho thấy 6 chủng vi-rút LMLM phân lập tại Việt Nam Thuộc kiểu gen IX trong tổng số 10 kiểu gen chính tồn tại trên thế giới, với mức tương đồng acid amin 98,1 – 100% Các chủng vi-rút LMLM trên có quan hệ gần gũi với chủng A thuộc các nước châu

Á lân cận như Lào, Thái Lan và Malaysia, với mức tương đồng acid amin 88,3 – 95,5% Phan và ctv (2010a, b) phân tích trình tự một số gen mã hóa vi-rút LMLM chủng A, O và Asia1 cho thấy cả 3 chủng trên có mặt ở các vùng dịch từ nhiều tỉnh thành khác nhau Dịch LMLM đã có mặt ở hầu hết các quốc gia châu Á, châu Phi

và Nam Mỹ Hiệu quả việc kiểm soát dịch LMLM phụ thuộc rất nhiều vào việc chẩn đoán sớm động vật nhiễm dựa trên phương pháp chẩn đoán đặc hiệu và nhạy (Hoffmann và ctv, 2009)

2.2 Vi-rút gây bệnh lở mồm long móng

2.2.1 Hình thái học vi-rút gây bệnh lở mồm long móng

Hình 2.2 Cấu trúc hình thái vi-rút LMLM (Grubman, 2004)

Là vi-rút nhỏ nhất trong các hạt vi-rút qua lọc, thuộc họ picornaviridae, chi

aphthovirus, có kích thước từ 20nm – 30nm, hình đa diện có 30 mặt đều, qua được

các máy lọc bekefeld, chamberland và qua mang lọc seitz Hạt vi-rút chứa 30% là acid nucleic, đó là 1 đoạn RNA chuỗi đơn Vỏ capsid có 60 đơn vị gọi là capsome, mỗi capsome có 4 loại protein (VP1, VP2, VP3, VP4) trong đó VP1 đóng vai trò quan trọng nhất trong viêc gây bệnh, đồng thời là loại kháng nguyên chính tạo ra kháng thể bảo hộ chống lại bệnh LMLM (Nguyễn Tiến Dũng, 2000)

Cấu trúc gen: bộ gen vi-rút có chiều dài khoảng 8.500 base, bao gồm phần giải mã đầu 5’ và đầu 3’, phần giải mã protein cấu trúc (1ABCD) và phần giải mã protein không cấu trúc (2ABC và 3ABCD) (Clavijo và ctv, 2004) Trong số 7 chủng LMLM, chủng A là chủng có tính biến đổi kháng nguyên lớn nhất

Hình 2.3 Sơ đồ bộ gen vi-rút LMLM (Grubman, 2004)

Dựa vào phân tích cây sinh dòng trên cơ sở trình tự gen VP1, chủng A được chia thành 10 kiểu gen chính (I – X) (Kitching, 2005) Tương tự chủng O được chia làm 10 kiểu gen, ký hiệu Europe-South America (Euro-SA), MiddleEast-South Asia (ME-SA), Cathay (CHY), West Africa (WA), East Africa 1 (EA-1), East Africa 2 (EA-2), East Africa 3 (EA-3), Indonesia – 1 (ISA-1), và Indonesia – 2 (ISA – 2) (Knowles và ctv, 2005) Chủng Asia1 được chia làm 6 chủng (I – VI) (Valarcher và ctv, 2009) Ở khu vực Đông Nam Á, những năm gần đây vi-rút LMLM gây ra những trận đại dịch ở Campuchia, Lào, Myanma, Philippin, Thái Lan và Việt Nam được xác định là do sự suất hiện đồng thời các chủng O, A, và Asia1 (Knowles và ctv, 2005) Chính sự đa dạng này mà khả năng lây lan nhanh, mạnh nên rất khó khăn trong việc phòng chống bệnh (Kitching, 2005) Dịch LMLM vẫn tiếp tục tồn tại và phát triển, điều đó đặt ra mối đe dọa nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi trên toàn thế giới (Mohapatra và ctv, 2009) Vi-rút LMLM không có vỏ bọc ngoài do vậy chúng có sức đề kháng với các dung môi hưu cơ (cồn, ete…) nhưng lại mẫn cảm với ánh sáng mặt trời, acid, formol…

2.2.2 Phân bố của chủng vi-rút lở mồm long móng

Các chủng huyết thanh có sự phân bố khác nhau trên thế giới Chủng huyết thanh O, A được nhận biết ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới Trái lại các chủng huyết thanh SAT1, SAT2, SAT3 được giới hạn ở một số nước thuộc châu Phi Chủng huyết thanh Asia1 được tìm thấy ở nhiều nước thuộc châu Á Riêng chủng huyết thanh C chỉ còn tồn tại một vài nước như Philippines (OIE/FAO, 2005) Theo tài liệu của Cục Thú y, dòng vi-rút gây bệnh lở mồm long móng trên gia súc ở Việt Nam thuộc chủng O, gần đây có suất vi-rút chủng A ở miền Trung và vi-rút chủng Asia1 ở các tỉnh miền núi phía bắc

cho OIE giữa năm 1990 và 2002 (Grubman, 2004)

2.3 Các phương pháp chẩn đoán bệnh lở mồm long móng

2.3.1 Chẩn đoán lâm sàng

Việt chẩn đoán lâm sàng bệnh LMLM có thể được thực hiện trong trường hợp bệnh xảy ra tại khu vực đã được xác định là có dịch LMLM Các triệu chứng chính của bệnh là sự suất hiện các mụn nước trong khoang miệng (lưỡi, lợi), quanh mũi, vành tiếp giáp da với móng chân, kẽ chân và các đầu vú (đối với bò sữa) Kèm theo các triệu chứng trên là hiện tượng con vật bị què do bị đau chân gây khó khăn

trong di chuyển Các mụn nước này tiến triển tạo thành các vết loét có thể có vi trùng thứ phát Tuy nhiên việc chẩn đoán lâm sàng thường dễ nhầm với các bệnh khác như: viêm miệng mụn nước, bệnh mụn nước ở heo, bệnh ngoại ban mụn nước heo, bệnh dịch tả trâu bò, bệnh tiêu chảy siêu trùng ở bò… Mặt khác cần phải chú ý rằng không phải tất cả số gia súc mắc bệnh đều có biểu hiện lâm sàng rõ rệt Do

vậy cần kết hợp với số liệu dịch tể để chẩn đoán (Tô Long Thành, 2004)

2.3.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm

Tại các nơi chưa bao giờ xảy ra dịch LMLM, các triệu chứng lâm sàng chỉ

có tính chất định hướng trong chẩn đoán và nhất thiết phải dùng biện pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm để khẳng định bệnh Biện pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm thường dùng là phương pháp huyết thanh học Trước đây, ta thường dùng phản ứng kết hợp bổ thể phát hiện huyết thanh cho cả 7 chủng khẳng định là

LMLM Hiện nay ta có thể dùng các phương pháp khác như ELISA

2.3.2.1 Chẩn đoán huyết thanh học

2.3.2.1.1 Phản ứng kết hợp bổ thể (KHBT)

Phản ứng KHBT được thực hiện nhờ hai hệ thống: hệ thống dung khuẩn và

hệ thống dung huyết với sự tham gia của bổ thể

Huyết thanh miễn dịch của từng chủng trên chuột lang: bằng phương pháp gây tối miễn dịch, tiêm vắc xin LMLM của các chủng khác nhau vào trong da dưới bàn chân chuột lang hai lần, mỗi lần cách nhau một tháng, sau đó lấy máu, chắt

huyết thanh có chứa kháng thể

Kháng nguyên là máu gia súc nghi mắc bệnh LMLM hoặc dùng bệnh phẩm cấy vào môi trường tế bào tổ chức lấy từ tuyến yên của bò hoặc của heo, tế bào thận bê hoặc cừu non hoặc các dòng tế bào có độ nhạy tương đương, khi tế bào

nuôi suất hiện các biến đổi tế bào thì lấy dịch làm phản ứng KHBT

Phản ứng KHBT cũng đã được hoàn thiện rất kỹ và khi sử dụng thành thục

sẽ là một phương tiện hữu hiệu để chẩn đoán phân biệt giữa vi-rút LMLM và các

vi-rút gây viêm mụn nước khác