Nuôi cấy meristem, tạo cây sạch bệnh virus

ĐẶT VẤN ĐỀ Sự phát triển của công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã mở ra rất nhiều hướng ứng dụng khác nhau: sản xuất sinh khối các chất có hoạt tính sinh học ở quy mô lớn, nhân nha

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TIỂU LUẬN Chuyên đề:

“Nuôi cấy meristem, tạo cây sạch bệnh virus”

Giáo viên hướng dẫn: PGS TS Vũ Đình Hoà Học viên: Chu Thuỳ Dương

Lớp: K20CNSHA

HÀ NỘI, 3/2012

I ĐẶT VẤN ĐỀ

Sự phát triển của công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã mở ra rất nhiều hướng ứng dụng khác nhau: sản xuất sinh khối các chất có hoạt tính sinh học ở quy

mô lớn, nhân nhanh các giống cây trồng bằng phương pháp invitro, bảo tồn nguồn gen in vitro…

Trong lĩnh vực bệnh cây, người ta ước tính có khoảng 1000 loại virus gây bệnh thực vật (trong số hơn

4000 loài virus), gây tổn thất lớn cho thu hoạch

Tạo cây trồng sạch bệnh virus bằng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem), ngày càng phát triển

và được ứng dụng rộng rãi

Một số thành tựu của nuôi cấy mô, tế bào thực vật

II NỘI DUNG

1 Tác hại của bệnh virus

2 Cơ sở của việc nuôi cấy meristem tạo ra cây

sạch bệnh virus

3 Quy trình nuôi cấy invitro (meristem)

4 Các kỹ thuật nuôi cấy meristem

5 Nhân nhanh và duy trì tình trạng sạch bệnh

virus

1.Tác hại của bệnh virus

 Virus là một tác nhân gây bệnh không có cấu tạo tế bào, kích thước rất nhỏ (nm), cấu tạo gồm hai thành phần chính

là acid nucleic (trong đó acid nucleic chủ yếu là dạng ARN, một số ít trường hợp là ADN) và được bao bọc bởi vỏ bên ngoài là protein

 Khi xâm nhiễm vào cơ thể thực vật, ngoài việc tái bản - sử dụng các vật liệu của tế bào chủ để tăng lên về số lượng, protein của virus còn tương tác với các chất chịu trách nhiệm chức năng sinh lý của tế bào gây ra các triệu chứng biểu hiện của bệnh virus

5 Cucumber mosaic virus (CMV)

1 Potato virus Y (PVY) 2 Tobacco mosaic virus

(TMV)

3 Tomato yellow leaf

curl virus (TYLCV)

4 Rice tungro bacilliform virus (RTBV)

Virus thực vật

Bean common mosaic virus

(BCMV)

(Đậu đũa)

Turnip mosaic virus

(TuMV) (Cải củ)

• Khảm lá (chỗ xanh chỗ vàng loang lổ xen kẽ nhau)

Một vài triệu chứng của bệnh virus

Một vài triệu chứng của bệnh virus

Biến vàng

Clerodendrum golden mosaic virus

(ClGMV) (Mò)

Erectites yellow mosaic virus

(ErYMV) (Rau tàu bay)Một vài triệu chứng của bệnh virus

Biểu hiện gây bệnh của Tobacco mosaic virus (TMV)

Một vài triệu chứng của bệnh virus

Virus gây bệnh khảm thuốc lá TMV (Tobacco mosaic virus) tạo ra các vết khảm lớn trên lá gây giảm chất lượng của thuốc lá, có khi không cho thu hoạch.

Cây sạch bệnh không virus TMV Tobacco mosaic virus

Papaya ringspot virus

E

Đu đủ không có papaya ringspot virus

1 Tác hại của bệnh virus

• Virus lây lan rất nhanh, chỉ trong một khoảng thời gian ngắn có thể xâm nhiễm cả một vùng rộng lớn và có thể gây thất thu hoàn toàn

• Không có các loại thuốc hay hoá chất đặc hiệu phòng trừ các loại bệnh gây ra bởi virus.

• Virus có lây truyền qua các thế hệ thông qua các cơ quan đã nhiễm virus như củ, hạt giống, các bộ phận sinh dưỡng sử dụng làm giống….

• Virus làm giảm sức sống của cây trồng, sức sinh trưởng phát triển của cây từ đó làm giảm năng suất của cây.

Ví dụ: virus gây bệnh cuốn lá khoai tây, cà chua (Tomato yellow leaf curl virus) và virus Y có thể làm giảm 95% năng suất của cây trồng

• Chính vì thế, chọn giống sạch bệnh virus đang được nghiên cứu rộng rãi trong đó có kỹ thuật chọn giống cây trồng sạch bệnh virus nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem)

1 Tác hại của bệnh virus

Potato yellow leaf curl virus Virus Y trên khoai tây

Tomato yellow leaf curl virus

2 Nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy

đỉnh sinh trưởng (meristem)

• Virus sống ký sinh và tồn tại trong mọi tế bào sống, tuy nhiên những nghiên cứu của White (1934), Limasset và Cornuet (1950), Martin (1952) cho thấy:

 Nồng độ virus trong tế bào các cây bị bệnh phụ thuộc vào tốc

độ phân chia tế bào và khả năng sinh trưởng của tế bào Tế bào càng phân chia mạnh thì nồng độ virus càng thấp (nghĩa

là những tế bào càng gần đỉnh sinh trưởng thì càng chứa ít virus hơn).

 White đã sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo để nghiên cứu sự phân bố virus trong rễ cây cà chua bị bệnh Kết quả cho thấy 2 cm ở đầu rễ hầu như không phát hiện ra virus.

Limasset và Corneut (1950)

đã sử dụng phương pháp huyết thanh định lượng, chứng minh được sự tồn tại một gradient nồng độ virus từ các mô non đến các mô già ở cây thuốc lá

bị bệnh

Nồng độ virus bằng 0 ở mô đỉnh lá và bao lá thứ nhất sau đó tăng dần, đạt cực đại ở lá thứ năm rồi giảm dần ở các lá già phía dưới

Giả thuyết về sự không tồn tại của virus

ở meristem

Giả thuyết về sự không

tồn tại của virus ở

meristem như sau:

Virus vận chuyển trong

cây nhờ hệ thống dẫn,

tuy nhiên hệ thống này

không có trong mô

phân sinh đỉnh

 Trong sự phân chia, các tế bào phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các thông tin di truyền của virus

 Hệ thống vô hiệu hoá ở vùng meristem mạnh hơn các vùng khác trong cây

 Nồng độ auxin, cytokinin cao ở đỉnh sinh trưởng có thể ngăn cản quá trình sao chép thông tin của virus

Giả thuyết về sự không tồn tại của virus

ở meristem

Mô phân sinh đỉnh chồi,

mô phân sinh đỉnh rễ (meristem)

Các bước trong quá trình nuôi cấy meristem

3 Quy trình nuôi cấy mô tế bào thực vật

Bước 0: Chuẩn bị và chọn lọc cây mẹ

 Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy)

 Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy sẽ giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro.

Bước 1: Nuôi cấy khởi động

• Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy invitro Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.

• Xác định chế độ khử trùng thích hợp: thường dùng các chất: HgCl2 0,1% Xử lý trong 5 - 10 phút, NaOCl, Ca(OCl)2 5 - 7% xử lý trong 15 -

20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br2…

Bước 2: Nhân nhanh

• Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng

• Vấn đề là phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả

là cao nhất

• Theo nguyên tắc chung môi trường có nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi, chế độ nuôi cấy thường là: 25 - 27o C, 16h chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000 - 4000lux

Bước 3: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

• Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin Một số chồi có thể phát sinh

rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng

Bước 4: Thích ứng cây in vitro ngoài

điều kiện tự nhiên.

• Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ

sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:

Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định( số lá, số rễ chiều cao cây)

Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước

Phải chủ động điều chỉnh được ẩm độ, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh dưỡng phù hợp

4 Các kỹ thuật làm sạch virus invitro

• Nuôi cấy meristem

• Nuôi cấy meristem kết

hợp với xử lý nhiệt

• Nuôi cấy meristem kết

hợp với bổ sung hóa

chất

• Vi ghép

4.1 Nuôi cấy meristem

• Tách chính xác meristem có kích thước nhỏ hơn 0,3 mm, nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng phù hợp để tái sinh thành cây nguyên vẹn Sau đó kiểm tra độ sạch virus ở cây tái sinh bằng các phương pháp khác nhau

để thu nhận được cây sạch bệnh virus

Sơ đồ tạo cây bằng nuôi cấy meristem

Tách meristem

4.2 Nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý nhiệt

• Ở nhiệt độ cao 36 – 370C thì một số loài virus không

có khả năng nhân lên Lợi dụng đặc tính này có thể kết hợp phương pháp nuôi cấy meristem với xử lý nhiệt để tẩy sạch virus khỏi mẫu

• Biện pháp này cho phép có thể tách meristem ở kích thước lớn hơn (0,5 – 1mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lợi hơn so với phương pháp tách ở kích thước 0,3 – 0,5mm

Cụ thể:

 Xử lý nhiệt độ cao 36 - 370C một thời gian dài khoảng 4 - 6 tuần cho cây mẹ, sau đó tách meristem

có kích thước 0,5 – 1,00mm để nuôi cấy invitro

 Tách meristem có kích thước 0,5 – 1,00mm đưa vào nuôi cấy invitro, sau đó xử lý ở nhiệt độ 39 – 400C trong thời gian 1 – 2 tuần Ở nhiệt độ này, thường các mARN thông tin của virus sẽ bị phân giải và cây tái sinh sẽ có độ sạch virus cao

4.3 Nuôi cấy meristem kết hợp với

xử lý hóa chất

 Nuôi cấy meristem với kích thước lớn (0,5 – 1 mm) kết hợp với việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất kháng virus để tạo môi trường sạch bệnh

 Chất kháng virus như: 2-thiouracil, ribavirin, vidarabin làm tăng khả năng kháng của tế bào, mô thực vật và ức chế sự nhân bản của virus

 Phương pháp này có hiệu quả cao trong việc tạo cây sạch bệnh ở thuốc lá, khoai tây, loa kèn

Sơ đồ làm sạch bệnh virus cho cây khoai tây bằng

nuôi cấy meristem kết hợp với xử lý nhiệt

4.4 Vi ghép

 Là kỹ thuật ghép các mô phân sinh đỉnh lên cây gốc sạch và kháng bệnh trong điều kiện invitro để sản xuất cây sạch virus

 Kỹ thuật này thường sử dụng với các cây thân gỗ, đặc biệt là họ cam, chanh vì meristem của chúng không thể sinh trưởng và tái sinh chồi khi nuôi cấy trực tiếp trên môi trường nhân tạo

5 Nhân nhanh và duy trì tình trạng sạch bệnh

 Sau khi đã tẩy sạch virus khỏi các mẫu nhiễm virus thì

việc nhân nhanh và duy trì độ sạch virus của giống có ý nghĩa quan trọng quyết định.

 Để ngăn chặn quá trình tái lây nhiễm có thể áp dụng các

bước sau đây:

1 Cây trồng nên được trồng trong nhà cách ly (nhà màn,

nhà kính) không chứa các nguồn bệnh và các vector truyền bệnh hay ở tự nhiên không có các mang virus.

2 Cần loại trừ thường xuyên các nguồn lây nhiễm, cần

phòng trừ các vật mang bệnh (côn trùng, tuyến trùng…).

3 Phòng tránh sự lây nhiễm cơ giới trong quá trình

Quy trình sản xuất khoai lang sạch bệnh virus

Một số giống khoai lang bị

nhiễm bệnh virus trồng ở

miền Bắc Việt Nam

 Giống Hoàng Long: 27.5%

 Khoai lang Lim: 25%

 Giống Chiêm Dâu: 30.4%

 Khoai lang Nghệ: 10%

(Điều tra tại Gia Lâm - Hà

Nội và Dâu Keo - Bắc

Ninh vụ hè thu 2002)

Virus gây bệnh khảm khoai lang

Năng suất khoai lang giảm từ 40-65% đối với cây bị nhiễm virus chân chim (Sweet potato feather virus)

Cây khoẻ sau khi lây nhiễm virus

Kỹ thuật tách meristem và chuẩn bị mẫu cấy

Kỹ thuật tách meristem khử trùng mẫu cấy

Kỹ thuật tách meristem - tách mẫu cấy

Kỹ thuật tách meristem - cấy mẫu

Sự hình thành chồi từ meristem

Ảnh hưởng của tổ hợp cytokinin và auxin đối với

sự hình thành chồi từ meristem

Kiểm tra bằng test ELISA

Ghép trên cây chỉ thị Lây nhiễm nhân tạo trên cây chỉ thị

Cây sạch bệnh virus được trồng trong

nhà lưới và củ sạch bệnh.

 Cùng với công nghệ gen, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những hướng đầy triển vọng trong việc chọn tạo giống cây trồng đặc biệt là các giống cây trồng sạch bệnh