Kỹ thuật tạo cây đơn bội invitro

Nguyên lí tạo cây đơn bộiDựa trên cơ sở của sự sinh sản đơn tính đực androgensis, người ta nuôi cấy các hạt phấn đơn nhân tiểu bào tử tách rời hay các bao phấn có chứa các hạt phấn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD: TS Nguyễn Thị Lâm Hải SVTH: Nhóm 6

Kĩ thuật tạo cây đơn bội invitro

1

Nhóm sinh viên thực hiện:

NỘI DUNG

Thành tựu và hiện trạng Phương pháp tạo cây đơn bội

Nguyên lý tạo cây đơn bội

Cây đơn bội và ứng dụng

Kết luận chung

3

1 Khái niệm cây đơn bội

 Cây đơn bội thường là những cá thểể

củ ểa những loài nhị bội hay đa bội khác ngủồồ n mà trong tểế bào soma củ ểa chúng sồế lượng nhiểễ m sắế c thểể bằng nưể a sồế lượng NST củ ểa loài khơ ểi đầồ ủ, trong mồễ i cặp NST tương đồồ ng nó chỉ ể có một NST.

4

Datura stramonium

5

Datura inoxia

6

2

Tạo đột biến ở mức độ đơn bội.

3

Tạo dòng đồng hợp tử tuyệt đối, phục vụ cho công tác chọn tạo giống cây trồng.

Sơ đồ các hướng ứng dụng của cây đơn bội

9

Nguyên lí tạo cây đơn bội

Dựa trên cơ sở của sự sinh

sản đơn tính đực

(androgensis), người ta nuôi

cấy các hạt phấn đơn nhân

(tiểu bào tử) tách rời hay

các bao phấn có chứa các

hạt phấn đơn nhân trên môi

trường dinh dưỡng nhân tạo

Nguyên lí tạo cây đơn bội

Dựa trên cơ sở của sự sinh sản đơn

tính cái, người ta kích thích tế bào

trứng hay các tế bào cực, tế bào đối

cực, tế bào kèm trong noãn phát

triển và tái sinh tạo thể đơn bội

11

Phương pháp trinh sinh cái trong ống nghiệm (invitro gynogenesis)

Các phương pháp tạo cây đơn bội invitro

Trinh sinh đực (Invitro androgenosis)

Nuôi cấy bao phấn

Nuôi cấy bao phấn

Nuôi cấy hạt phấn

Nuôi cấy hạt phấn

Trinh sinh cái (Invitro gynogensis)

Trinh sinh cái (Invitro gynogensis) Nuôi cấy noãn Nuôi cấy noãn chưa thụ tinhchưa thụ tinh

12

Phương pháp nuôi cấy bao phấn và hạt

phấn

Nuôi cấy bao phấn trên môi trường đặc: callus

và cây đơn bội xuất hiện trên bề mặt bao phấn

Nuôi cấy bao phấn trên môi trường lỏng và lắc: hạt phấn giải phóng vào môi trường, callus và cây đơn bội xuất hiện từ hạt phấn

Nuôi cấy hạt phấn tách rời trong môi trường lỏng và lắc đều hoặc môi trường bán lỏng: callus và cây đơn bội xuất hiện từ hạt phấn

13

Sơ đồ tạo cây đơn bội từ nuôi cấy hạt phấn in vitro

mt lỏng Phát triển phôi

Nuôi cấy bao phấn

1.Chọn bao phấn: chọn bao phấn chứa hạt phấn ở giai đoạn sắp phân bào nguyên nhiễm lần I Bao phấn của những hoa đầu tiên của cây cho kết quả cao hơn hoa muộn.

2.Xử lí nụ hoa: xử lí lạnh sẽ kích thích nhân dinh dưỡng phân chia Chế độ xử lí nhiệt độ phụ thuộc vào loại cây.

3.Chọn môi trường nuôi cấy thích hợp: tùy theo đối tượng nuôi cấy khác nhau mà chọn môi trường tương ứng.

15

4 Chọn lọc cây đơn bội.

Có thể xác định cây đơn bội bằng

phương pháp:

Kiểm tra số lượng NST của tế bào

Đo hàm lượng DNA trong tế bào

So sánh cây tái sinh từ bao phấn với cây mẹ về khả năng sinh trưởng, hình thái, kích thước…

16

5 Lưỡng bội hoá

Các cây đơn bội thu được sau nuôi cấy bao phấn, để có thể sử dụng được trong chọn giống thì cần lưỡng bội hoá tạo cây lưỡng bội Có 2 cách:

 Tái sinh qua phương pháp nuôi cấy mô: thường sử dụng mô lá của cây đơn bội.

 Cảm ứng nhị bội hóa bằng cochicine: sử dụng ở nồng độ 0.05-0.5% tùy theo từng loại thực vật và đối tượng mô cần xử lí.

17

Nuôi cấy hạt phấn

Năm 1934, Stow phát hiện

cấu trúc giống túi phôi của

hạt phấn ở một số loài thực

vật thuộc Hyacinthus

18

Kĩ thuật tách rời hạt phấn

 Các bao phấn vô trùng được nghiền hoặc ép trong môi trường lỏng để giải phóng hạt phấn ra ngoài bao phấn Tách hạt phấn ra khỏi bã túi phấn bằng cách rót dung dịch trên qua lưới lọc có kích thước phù hợp.

19

 Dung dịch sau lọc được li tâm

800-1000rpm trong 3-5 phút để tách và

làm sạch hạt phấn Thành phần nhẹ

nổi trên được gạn đi trong khi hạt

phấn lắng dưới đáy được rửa sạch

bằng môi trường mới và được li

tâm thêm 2 lần nữa để loại bỏ các

chất ức chế trong túi phấn.

 Tạo huyền phù hạt phấnvới mật độ

10 4 -10 5 tế bào/ml.

Một số chú ý khi nuôi cấy hạt phấn

• Các hạt phấn nuôi cấy tách rời thường phát sinh phôi trực tiếp

• Để kích thích sự phát sinh phôi thường sử dụng phương pháp nuôi trợ dưỡng: nuôi kèm với bao phấn hay loại mô khác của cây mẹ

• Môi trường nuôi cấy hạt phấn cần bổ sung các axit amin (glutamin, serin…) với nồng độ cao và

có trường hợp không cần bổ sung chất điều tiết sinh trưởng (thuốc lá, cải dầu…)

20

Ưu điểm

 Nuôi cấy bao phấn

 Vì bao phấn có kích thước lớn nên thao

tác dễ dàng.

 Môi trường nuôi cấy đơn giản

 Nuôi cấy hat phấn

 Tạo ra giống cây trồng sạch bệnh.

 Giống tạo ra co phẩm chất di truyền

đồng đều.

 Phát sinh phôi dễ dàng trong quá

trình nuôi cấy.

 Tạo cây đơn bội thuận lợi cho việc

nghiên cứu di truyền.

21

Nuôi cấy bao phấn, hạt phấn ra đời đã làm rút ngắn

thời gian, đồng thời giúp tăng vọt số lượng cá thể đơn bội thu được.

Nhược điểm

 Nuôi cấy bao phấn :

 Khó sàng lọc cây đơn bội.

 Khi nuôi cấy bao phấn

thường gặp hiện tượng

Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy bao phấn, hạt

phấn in vitro

 Tuổi hạt phấn

Cây đơn bội chỉ thu được khi cấy bao phấn chứa hạt phấn ở giai đoạn phát triển thích hợp, bắt đầu từ thể 4 nhân cho đến ngay sau lần nguyên phân đầu tiên

Trạng thái sinh lý của cây cho bao phấn và hạt phấn

 Kết quả tạo cây đơn bội phụ thuộc nhiều vào trạng thái sinh lý của cây bố, mẹ cho bao phấn, hạt phấn

 Khả năng thành công cao nhất với những bao phấn thu được trong lần trổ hoa đầu tiên và giảm dần trong những lần trổ hoa tiếp theo

 Sử dụng bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường

độ ánh sáng cao, ngày ngắn sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao

 Bao phấn từ những cây sinh trưởng dưới cường độ ánh sáng cao, trong điều kiện ngắn ngày sẽ cho hiệu quả tạo phôi cao hơn.

Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh

 Những năm 70, các nhà

nghiên cứu đã tập trung

giải quyết vấn đề cây đơn

bội bằng nuôi cấy noãn

chưa thụ tinh và thu

được một số thành tựu

trên các đối tượng hành,

hướng dương, củ cải

đường, ngô

25

Sơ đồ đường hướng trinh nữ sinh invito ở cây

hạt kín

26

Hai phương pháp nuôi cấy noãn đã được áp dụng:

1 Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh tách rời: cho hệ số

tái sinh trực tiếp thấp Đại đa số noãn hình thành mô sẹo, tỷ lệ tái sinh cây và tỷ lệ sống sót khi đưa ra ngoài thấp

2 Nuôi cấy cùng lúc nhiều noãn : Các nghiên cứu

tiến hành với mô nuôi là một phần của lõi bắp ngô và noãn chưa thụ tinh đã khẳng định ưu thế vượt trội so với nuôi cấy noãn tách rời

27

Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy noãn

chưa thụ tinh

 Kiểu gen cây mẹ

Là nhân tố quan trọng nhất đối với sự cảm ứng tạo cây đơn bội từ noãn chưa thụ tinh

Đối với mỗi kiểu gen có phản ứng khác nhau trong sinh sản đơn tính cái in vitro nên cần phải xác định quy trình tối ưu cho từng kiểu gen

30

 Các giai đoạn phát triển của noãn

Giai đoạn phát triển của noãn khi đưa vào nuôi cấy có ý nghĩa đặc biệt đối với việc tạo thể đơn bội

Giai đoạn túi phôi thành thục là giai đoạn phù hợp và cho hiệu quả cao trong nuôi cấy noãn

Việc xác định giai đoạn phát triển cá thể của

giao tử cái rất phức tạp do tùi phôi nằm sâu

trong bầu quả→ cần phải sử dụng các kĩ thuật: tách túi phôi, nhuộm màu lát cắt mỏng

31

 Môi trường nuôi cấy

Môi trường thường được sử dụng là: MS, B5, MF,… có bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng

Nồng độ đường của môi trường là yếu tố cần phải quan tâm Nồng độ đường giao động tùy thuộc vào đối tượng nuôi cấy, ví dụ:lúa là 3-

6%, hành là 10%

Môi trường dùng chủ yếu là môi trường đặc

32

 Điều kiện nuôi cấy

Nuôi cấy noãn chưa thụ tinh

Lúa là cây lương thực giữ vai

trò quan trọng hàng đầu, là

nguồn lương thực chính của

½ dân số trên thế giới

NUÔI CẤY HẠT PHẤN CỦA CÂY LÚA

36

Sơ đồ nuôi cấy bao phấn, hạt phấn lúa

37

- Mỗi dòng cần 1-2 tép có mang được hoa thụ phấn ở giai đoạn chín

38

Quy trình nuôi cấy

• Xử lý vật liệu:

- Cây lúa lấy ở giai đoạn phân tử có nhân phân chia đồng nhất trước khi hạt phấn đi vào quá trình phân chia giảm nhiễm

- Mẫu được lấy khi khoảng cách giữa tai lá đòng

và lá thứ 2 khoảng 2-3cm Đoạn thân được đặt trong bao nylon phủ giấy nhôm

- Xử lý lạnh túi phấn trước khi đưa vào nuôi cấy

ở 8-100C trong tối 48-72h

39

Dung dịch Natrihypoclorit

2.5%

Tách hoa ra khỏi thân

Tách hoa ra khỏi thân

42

Khi cây cao 8-10 cm, cấy sang môi trường White

là bước trung gian khi chuyển ra đất

43

• Các môi trường sử dụng trong nuôi cấy túi phấn

– Môi trường nhân nhanh: MS + 30g/l sucrose.

– Môi trường tạo rễ: MS + 1mg/l NAA + 30g/l sucrose.

– Môi trường thích nghi: dung dịch Yoshida.

44

Nhị bội hóa cây đơn bội

Có 3 phương pháp sử dụng cùng nồng độ colchicine và thời gian 24-48h.

 PP1: nhổ, rửa và ngâm rễ lúa trong dung dịch colchicine khi cây bắt đầu đẻ nhánh mạnh, sau đó rửa sạch và cấy lại.

 PP2: cắt bỏ phần trên cây lúa và bao chỗ cắt của phần dưới bằng bông tẩm dung dịch colchicine

 PP3: dùng dao rạch nhẹ từ trên xuống một đoạn dọc thân khoảng 2cm ngay trên ngọn bông lúa chưa trổ thành một khe nhỏ và đặt vào đó 1 miếng bông tẩm colchicine.

 Ở phương pháp 2 và 3 có thể pha colchicine trong dung dịch glycerin 2% để tránh bay hơi.

46

Thành tựu và hiện trạng

Thành tựu:

 Các cây đơn bội có nguồn gốc hạt phấn đã được tạo ra ở 216

loài thuộc 78 giống, 31 họ và nhiều loài khác cũng được nghiên cứu thành công.

 Thông qua nuôi bao phấn đã tạo các giống lúa thuần như Khao

85, Khao 1105, VH2…

 Trong lĩnh vực nông nghiệp, kỹ thuật đơn bội nuôi cấy bao phấn và nuôi cấy noãn đã tạo ra hàng loạt dòng thuần ở lúa (DDV2, MT4, DT26…) Đặc biệt chúng ta đã sản xuất được dòng lúa thuần mang gen quý như gen bất dục đực tế bào chất, bất dục đực nhân (gen TGMS, PGMS) Đối với ngô, đã tạo được 5 dòng ngô thuần và 2 tổ hợp ngô lai có triển vọng.

47

 Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào phát triển nhanh và ngày càng hiện đại mở tiềm năng to lớn cho nuôi cấy bao phấn và hạt phấn tạo cây đơn bội từ đó tạo dòng thuần, đáng chú ý là ở các đối tượng có tầm quan trọng như: lúa gạo,lúa mạch, đại mạch, thuốc lá, ngô, khoai tây…

48

Hiện trạng

 Hiện tại,người ta mới nuôi cấy hạt phấn trưởng thành để tạo cây đơn bội thành công qua con đường phôi hóa hoặc tạo thành mô sẹo.

 Còn nuôi cấy hạt phấn non chưa đạt được nhiều hiệu quả Hiện tại, chỉ có một số kết quả về nuôi cấy hạt phấn non thành công như: nuôi cấy hạt phấn non cây Trillium erectum, cây hành Allium cepa, cây Atropa belladonna.

49

Nuôi cấy bao phấn các cây ngũ cốc và cây họ Đậu rất khó thành công hoặc tỉ lệ ra cây thấp, tỉ

lệ cây bạch tạng cao

Nhiều gen có khả năng thành cây thấp thường không được ứng dụng trong nuôi cấy bao phấn nhưng có khi gen lại có giá trị kinh tế cao

Ví dụ: cấy bao phấn giống lúa Japonica dễ thành công hơn giống Indica, tuy nhiên giống lúa Indica lại có vai trò quan trọng hơn nhiều giống Japonica

50

KẾT LUẬN

• Ở cơ thể thực vật, chỉ có thể giao tử (hạt phấn, noãn) là những tế bào đơn bội Nếu chúng phát triển thành cây thì những cây đó có mức bội thể đơn bội Do đó phương pháp tạo cây đơn bội từ các thể giao tử sau đó nhị bội hóa

đã trở thành phương pháp lí tưởng để nghiên cứu các tính trạng và cũng là nguyên liệu quý cho công tác chọn tạo giống.

• Đặc biệt khi nói đến Công nghệ nuôi bao phấn và hạt phấn, mặc dù hiện tại chưa thực sự được quan tâm nhưng trong tương lai thì chúng thực sự có tiềm năng rất lớn Vấn đề chỉ còn ở chúng ta,những nhà Công nghệ sinh học tương lai!

51

Tài liệu tham khảo

• Giáo trình Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật

huc-vat-ai-cuong-hoa.html

-tao-vat-lieu-khoi-dau-phuc-vu-chon-tao-giong-bang-ky-thuat-nuoi-cay-bao-phan-o-cay-lua-28302/

52

Thanks for your listening!

53