Khóa luận tốt nghiệp Nghiên cứu định danh Potyvirus hại cây hoa loa kèn

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPĐỀ TÀI:Nghiên cứu định danh Potyvirus hại cây hoa loa kènMỤC LỤCLời cảm ơniMục lụciiDanh mục chữ viết tắtvDanh mục bảngviDanh mục hìnhviiTóm tắtixPHẦN I: MỞ ĐẦU11.1Đặt vấn đề11.2Mục đích và yêu cầu của đề tài21.2.1Mục đích21.2.2Yêu cầu2PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU32.1Sơ lược về hoa loa kèn32.2Sơ lược về họ Potyviridae32.2.1Giới thiệu32.2.2Cấu trúc32.3Sơ lược về chi Potyvirus42.3.1Giới thiệu42.3.2Cấu trúc phân tử42.3.3Genome52.3.4Chức năng các protein62.3.5Sự tái bản62.3.6Phương thức lan truyền62.4Sơ lược về bệnh virus trên họ loa kèn62.5Chẩn đoán virus bằng kỹ thuật RTPCR62.6Kỹ thuật xác định trình tự6PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU163.1Đối tượng nghiên cứu163.2Địa điểm và thời gian nghiên cứu163.2.1Địa điểm nghiên cứu163.2.2Thời gian nghiên cứu 163.3Vật liệu nghiên cứu163.4Phương pháp nghiên cứu173.4.1Điều tra bệnh173.4.2Thu mẫu và xử lý mẫu173.4.3Tách chiết RNA tổng số từ mẫu bệnh183.4.4Các mồi sử dụng trong nghiên cứu183.4.5Phân lập gen bằng kỹ thuật RTPCR183.4.6Điện di sản phẩm RTPCR trên agarose gel 1% 183.4.7Giải trình tự gen virus183.4.8Phân tích trình tự gen virus193.4.9Xác định bệnh bằng lây nhiễm nhân tạo.193.4.10Kỹ thuật nuôi cấy meristem19PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN214.1Bệnh virus trên cây hoa loa kèn214.1.1Mô tả triệu chứng214.1.2Điều tra tình hình bệnh virus trên hoa loa kèn năm 2015224.1.3Điều tra mức độ ảnh hưởng của bệnh virus đến khả năng sinh trưởng của cây hoa loa kèn224.1.4Khả năng lan truyền bệnh virus qua củ giống 224.2Xác định virus bằng RTPCR 244.2.1Xác định virus hại hoa loa kèn trắng224.2.2Xác định virus hại hoa loa kèn đỏ224.3Kết quả giải trình tự gen Potyvirus gây bệnh khảm lá hoa loa kèn đỏ254.4Kết quả xác định phổ ký chủ của virus284.4.1Xác định phổ ký chủ của LMoV224.4.2Xác định phổ ký chủ của virus mới hại cây hoa loa kèn đỏ224.5Kết quả nuôi cấy meristem314.6Xác định virus hại cây hoa lay ơn22PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ525.1Kết luận525.2Kiến nghị53TÀI LIỆU THAM KHẢO54PHỤ LỤC58

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- 

 -KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu định danh Potyvirus hại cây hoa loa kèn

Sinh viên thực hiện : Hoàng Ngọc Anh

Giáo viên hướng dẫn : TS Hà Viết Cường

“ Khóa luận đệ trình khoa CNSH, Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội là một phần yêu cầu

của trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học”, năm học 2014-2015

HÀ NỘI - 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện đề tài thực tập tốt nghiệp, tôi đã nhận được rấtnhiều sự giúp đỡ và động viên từ các thầy cô, gia đình và bạn bè

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Hà Viết Cường - ngườiđã trực tiếp hướng dẫn và đóng góp những ý kiến quan trong cho tôi trong toàn bộquá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn đến tập thể các anh chị cán bộ Trung tâmnghiên cứu bệnh cây nhiệt đới, các thầy cô giáo trong bộ môn Công Nghệ Sinh Họcđã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp củamình

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã giúp tôirất nhiều về mặt kinh tế cũng như tinh thần giúp tôi duy trì được trạng thái tốt nhấttrong suốt quá trình thực hiện đề tài

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 5 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Hoàng Ngọc Anh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

TÓM TẮT viii

PHẦN I: MỞ ĐẦU 9

1.1 Đặt vấn đê 9

1.2 Mục đích và yêu cầu của đê tài 10

1.2.1 Mục đích 10

1.2.2 Yêu cầu 10

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

2.1 Sơ lược vê hoa loa kèn 11

2.2 Sơ lược vê họ Potyviridae 11

2.2.1 Giới thiệu 11

2.2.2 Cấu trúc 12

2.3 Sơ lược vê chi Potyvirus 12

2.3.1 Giới thiệu 12

2.3.2 Cấu trúc phân tử 12

2.3.3 Genome 13

2.3.4 Chức năng các protein 13

2.3.5 Sự tái bản 16

2.3.6 Phương thức lan truyền 17

2.4 Sơ lược vê bệnh virus trên họ loa kèn 17

2.4.1 Hippeastrum mosaic virus (HiMV) 17

2.4.2 Vallota speciosa virus 18

2.4.3 Lily mottle virus (LMoV) 18

2.4.4 Lily symptomless virus (LSV) 19

2.4.5 Tulip breaking virus (TBV) 19

2.4.6 Lily virus X (LVX) 20

2.4.7 Narcissus mosaic virus (NMV) 20

2.5 Chẩn đoán virus bằng kỹ thuật RT-PCR 20

Các bước trong chẩn đoán bệnh cây bằng RT-PCR: 20

1.Thiết kế mồi: tự thiết kế hoặc lựa chọn mồi từ các nghiên cứu đã được công bố 20 2.Tách chiết RNA tổng số từ mô cây 20

3.Tiến hành phản ứng RT-PCR 20

4.Kiểm tra, đánh giá kết quả bằng điện di 20

Có 2 loại mồi được sử dụng cho chẩn đoán bệnh cây: 20

Mồi chung (degenerate primers): được thiết kế trên các vùng bảo thủ cao, có khả năng phát hiện các đối tượng khác hẳn nhau (thường là các đối tượng trong 1 họ, 1 chi) 20 Mồi đặc hiệu (specific primers): được thiết kế trên các vùng có thể phân biệt được loài, thậm chí dưới loài như chủng, nòi… 20

2.6 Kỹ thuật xác định trình tự 21

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Đối tượng nghiên cứu 22

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 22

3.2.2 Thời gian nghiên cứu: 22

Từ 01/2015 đến 06/2015 22

3.3 Vật liệu nghiên cứu 22

Bảng 3.2 Thành phần môi trường MS 24

3.4 Phương pháp nghiên cứu 24

3.4.1 Điều tra bệnh 24

3.4.2 Thu mẫu và xử lý mẫu 25

3.4.3 Tách chiết RNA tổng số từ mẫu bệnh 25

3.4.4 Các mồi sử dụng trong nghiên cứu 25

3.4.5 Phân lập gen bằng kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction) 26

3.4.6 Điện di sản phẩm RT-PCR trên Agarose gel 1 % 27

3.4.7 Giải trình tự gen virus 27

3.4.8 Phân tích trình tự gen virus 28

3.4.9 Xác định bệnh bằng nhiễm nhân tạo 28

3.4.10 Kỹ thuật nuôi cấy Meristem 29

3.4.10.1 Cách pha chế 29

3.4.10.2 Nuôi cấy meristem 29

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1 Bệnh virus trên cây hoa loa kèn 30

4.1.1 Mô tả triệu chứng 30

4.1.2 Điều tra tình hình bệnh virus trên cây hoa loa kèn năm 2015 31

4.2 Xác định virus bằng RT-PCR 33

4.2.1 Xác định virus gây bệnh khảm lá cây hoa loa kèn trắng 34

36 37 4.2.2 Xác định virus gây bệnh khảm lá cây hoa loa kèn đỏ 37

4.3 Kết quả giải trình tự gen Potyvirus gây bệnh khảm lá hoa loa kèn đỏ 39

4.4 Kết quả xác định phổ ký chủ của virus 1

4.4.1 Xác định phổ ký chủ của LMoV 1

Cây lây 1

Lần 1 1

Lần 2 1

Triệu chứng 1

2 tuần 1

18 ngày 1

4.4.2 Xác định phổ ký chủ của virus mới hại cây hoa loa kèn đỏ 2

Cây lây 3

Lần 1 3

Lần 2 3

Triệu chứng 3

2 tuần 3

18 ngày 3

TÀI LIỆU THAM KHẢO 7

Bảng 3.2 Thành phần môi trường MS 10

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

NCBI National Center for Biotechnology Information

PCR Polymerase Chain Reaction

RT-PCR Reverse transcription - Polymerase Chain Reaction

TTBCNĐ Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới

TS

Tiến sĩ

β- ME Beta- Mercaptoethanol

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.3 Các mồi dùng trong nghiên cứu 26

Bảng 4.1 Triệu chứng chính của 2 bệnh giống bị nhiễm virus trên hai loại hoa loa kèn 30

Bảng 4.2 Tỷ lệ bệnh virus trên cây hoa loa kèn 31

Chúng tôi tiến hành kiểm tra Potyvirus bằng phản ứng RT-PCR sử dụng cặp mồi chung cho Potyvirus là CIFor và CIRev trên 3 mẫu LKT: 2 mẫu LKT (LKT-35 và LKT-39) biểu hiện triệu chứng khảm lá điển hình và 1 mẫu LKT đối chứng (LKT-ĐC9) không xuất hiện triệu chứng (Hình 4.7 và Bảng ) Các mẫu được chiết bằng phương pháp CTAB/LiCl Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR cho thấy cả 2 mẫu LKT mang triệu chứng khảm lá đều cho phản ứng dương tính với băng sản phẩm ~ 0.7kb còn mẫu đối chứng thì cho kết quả âm tính (Bảng 4.4 và Hình 4.8) Kết quả này chứng tỏ rằng, bệnh khảm lá trên cây hoa loa kèn trắng là do Potyvirus gây ra 34

35

Hình 4.7 Các mẫu lá: LKT-35 (1), LKT-39 (2), LKT-ĐC9 (3) 35

Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra RT-PCR trên các mẫu cây hoa loa kèn trắng 35

Để xác định virus gây bệnh khảm lá trên cây hoa loa kèn đỏ, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm với 3 mẫu cây LKĐ chính là LKĐ-ĐC5, LKĐ-17, LKĐ-18 (Bảng 3.1 và Hình 4.10) 37

38

Hình 4.10 Các mẫu lá: LKĐ-ĐC5 (1), LKĐ-17 (2), LKĐ-18 (3) 38

Giống như thí nghiệm với LKT, đầu tiên, chúng tôi cũng kiểm tra xem các mẫu LKĐ có nhiễm Potyvirus hay không bằng kỹ thuật RT-PCR sử dụng cặp mồi chung CIFor/CIRev Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR (Hình 4.11) cho thấy, 2 mẫu LKĐ-17 và LKĐ-18 đều xuất hiện băng sản phẩm ~ 0.7kb còn mẫu LKĐ-ĐC5 thì không Kết quả này cho ta thấy, triệu chứng khảm lá trên cây hoa LKĐ cũng do Potyvirus gây ra Trường hợp mẫu lá LKĐ-18 không có triệu chứng khảm lá nhưng vẫn cho băng sản phẩm ~ 0.7kb chứng tỏ rằng, mẫu lá cây LKĐ thu từ phương pháp tách vảy củ này có mang Potyvirus nhưng chưa biểu hiện thành triệu chứng khảm 38

Sau khi khẳng định bệnh khảm lá trên cây loa kèn đỏ là do Potyvirus gây ra, chúng tôi tiếp tục kiểm tra RT-PCR sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/LMoV-CP3-R với các mẫu cho kết quả dương tính với Potyvirus: LKĐ-17 và LKĐ-18 Tuy nhiên, cả 2 mẫu đều cho kết quả âm tính (Bảng 4.5 và Hình 4.11) 38

Từ các kết quả trên, chúng tôi kết luận rằng, các mẫu cây loa kèn đỏ đã nhiễm một loại Potyvirus khác mà không phải là virus LMoV như ở cây hoa loa kèn trắng 38

Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra RT-PCR trên các mẫu cây hoa loa kèn đỏ 38

Bảng 4.: Kết quả lây nhiễm nhân tạo virus LMoV 1

Bảng 4.13: Kết quả lây nhiễm nhân tạo bệnh virus trên hoa loa kèn đỏ 3

6

Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra RT-PCR rên các mẫu cây hoa Lay ơn 6

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Mô hình cấu trúc phân tử của các potyvirus 13

Hình 2.2 Sơ đồ tổ chức bộ genome của potyvirus 13

Hình 4.1 Bệnh khảm lá hoa loa kèn trắng (1, 2), khảm lá hoa loa kèn đỏ (3) (nguồn Hoàng Ngọc Anh, 2015) 31

Hình 4.5 Sơ đồ bộ gen potyvirus và vị trí tương đối 34

của cặp mồi CIFor và CIRev 34

Hình 4.6 Vị trí cặp mồi đặc hiệu LMoV trên bộ gen potyvirus 34

Hình 4.8 Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát hiện potyvirrus trên loa kèn trắng dùng cặp mồi chung CIFor/CIRev M: thang DNA 1 kb (hãng Fermentas) 1,2,3: sản phẩm RT-PCR của các mẫu LKT-35, LKT-39, 36

LKT-ĐC9 36

Hình 4.9 Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát hiện LMoV trên các mẫu loa kèn trắng bị bệnh khảm lá sử dụng cặp mồi CP3-F/ LMoV-CP3-R M: thang DNA 1 kb (hãng Fermentas) 1,2: sản phẩm RT-PCR 37

của các mẫu LKT-35, LKT-39 37

Hình 4.11 Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát hiện Potyvirus và LMoV trên các mẫu loa kèn đỏ M: thang DNA 1 kb (hãng Fermentas) 39

1,2,4: sản phẩm RT-PCR của các mẫu LKĐ-ĐC5, LKĐ-17, LKĐ-18 sử dụng cặp mồi CIFor/CIRev 3, 5: sản phẩm RT-PCR của các mẫu LKĐ-17, LKĐ-18 sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R 39

Hình 4 : Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát hiện LMoV sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R trên các mẫu loa kèn trắng M: thang DNA 1 kb (hãng Fermentas) 1,2: sản phẩm RT-PCR của các mẫu LKĐ-ĐC5, LKĐ-17, LKĐ-18 sử dụng cặp mồi CIFor/CIRev 3, 5: sản phẩm RT-PCR của các mẫu LKĐ-17, LKĐ-18 sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R 5

Hình 4.6 Kết quả chạy điện di sản phẩm RT-PCR phát hiện Potyvirus và LMoV trên các mẫu cây hoa lay ỏn M là thang DNA 1 kb (Fermentas) Các giếng 1,2,4 tương ứng với các mẫu L1, L2, L3 sử dụng cặp mồi chung CIFor/CIRev Các giếng 3, 5 tương ứng với các mẫu L2, L3 sử dụng cặp mồi LMoV-CP3-F/ LMoV-CP3-R 7

TÓM TẮT

Vụ mùa 2009, sự xuất hiện của bệnh lùn sọc đen do SRBSDV gây ra ở nhiềutỉnh thành miền bắc Việt Nam đã gây ra hậu quả nghiêm trọng, cây lúa bị lùn, láxoắn vặn và xanh thẫm, cây lúa không trỗ hoặc trỗ không thoát gây mất sản lượng

và phải tiêu hủy Hậu quả này đã dẫn đến thiệt hại hàng nghìn tỉ đồng cho sản xuấtnông nghiệp nước ta Nguyên nhân chính gây bệnh đã được xác định bằng sinh họcphân tử Chúng tôi đã thiết kế một cặp mồi đặc hiệu để nhân dòng gen S10 củaSRBSDV từ đó tiến hành tạo plasmid tái tổ hợp và giải trình tự toàn bộ ORF genS10 trên clone Kết quả giải trình tự và phân tích các chuỗi tương đồng tìm kiếmtrên ngân hàng gen đã cho thấy quan hệ giữa bốn chuỗi của Việt Nam với các chuỗi

cùng chi Fijivirus và cùng họ Reoviridae Chúng tôi đã xây dựng thành công cấu

trúc biểu hiện của gen S10 trên vector biểu hiện pET-28a (+) Việc biểu hiện proteintái tổ hợp cũng đã được tiến hành tuy nhiên vẫn chưa thu được kết quả khả quan

PHẦN I: MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đê

Trong những năm gần đây, do nền kinh tế phát triển mạnh mẽ, con ngườikhông chỉ quan tâm về đời sống vật chất mà còn quan tâm rất nhiều đến đời sốngtinh thần Trong đời sống tinh thần đó, người ta không thể không kể đến giá trị củacác loài hoa

Nước ta có khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm tạo nên các vùng sinh thái đa dạngthích hợp cho việc trồng trọt nhiều chủng hoa đẹp của Việt Nam và thế giới Hiệntại, nước ta có khoảng 5000 ha sản xuất hoa, cây cảnh với tổng sản lượng ước tínhkhoảng 4 tỷ cành hoa Năm 2001, cả nước có hơn 8000 ha đất trồng hoa, chủ yếutập trung ở các tỉnh thành như Lâm Đồng (1254 ha), Hà Nội (867 ha), Hưng Yên(867 ha)…, với doanh thu là 291 tỷ đồng, trong đó giá trị xuất khẩu đạt 7 tỷ đồng.Về mặt kinh tế, nghề trồng hoa đem lại lợi nhuận cao hơn trồng lúa Chính vì vậy,nghề trồng hoa ngày càng được phát triển với quy mô, diện tích và chủng loại hoangày một tăng lên

Cùng với các loài hoa như: lan, hồng, lay ơn, cúc…, hoa loa kèn cũng là loàihoa rất được ưa chuộng vì chúng có màu sắc đẹp, tươi lâu, chủng loại thì vô cùng đadạng Hiện nay ở nước ta, hoa loa kèn đang được trồng khá phổ biến Tuy nhiên,trong quá trình gieo trồng, sản xuất hoa loa kèn thấy xuất hiện nhiều triệu chứng do

virus gây ra Hầu hết là các virus gây bệnh thuộc chi Potyvirus – chi lớn nhất trong tám chi của họ Potyviridae Bệnh do Potyvirus gây ra những ảnh hưởng không nhỏ

đến giá trị thẩm mỹ của cây hoa Chi virus này xuất hiện phổ biến ở các nước nhiệtđới và cận nhiệt đới như Việt Nam Virus có thể gây ra nhiều triệu chứng khác nhau

ở cây ký chủ như khảm, đốm, sáng gân, lùn cây, héo, còi cọc… Trong đó, ở cây hoaloa kèn thì triệu chứng khảm lá là chủ yếu

Tại Việt Nam, chưa có nhiều công trình nghiên cứu về Potyvirus trên cây hoa

loa kèn Vì vậy, để có thể góp phần cung cấp thêm thông tin về loài virus này, từ đóđề ra các biện pháp phòng trừ hợp lý, đạt hiệu quả cao, dưới sự hướng dẫn của TS

Hà Viết Cường, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu định danh

Potyvirus hại cây hoa loa kèn”.

1.2 Mục đích và yêu cầu của đê tài

• Kiểm tra RT-PCR một số mẫu cây hoa loa kèn trắng và loa kèn đỏ bị bệnh

• Giải trình tự gen Potyvirus hại cây loa kèn đỏ

• Phân tích trình tự

• Đánh giá khả năng lây nhiễm Potyvirus trên một số cây kí chủ

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược vê hoa loa kèn

Cây hoa loa kèn là loài thực vật có hoa hình dạng như cái kèn Tuy nhiên, 2loại hoa loa kèn chính là loa kèn trắng và loa kèn đỏ lại thuộc hai họ thực vật khác

nhau Loa kèn trắng ( Lilium longiflorum) là một loài thực vật một lá mầm với các lá

thẳng và gân song song, thuộc chi Lilium, họ loa kèn (Liliaceae). Còn loa kèn đỏ làloại cây thân thảo, sống lâu năm, mọc ra từ thân hành, thường có hoa sặc sỡ, nằm

trong chi Hippeastrum, họ loa kèn đỏ (Amaryllidaceae) Hai họ thực vật này phân biệt với nhau nhờ bầu nhụy, với bầu nhụy hạ ở Amaryllidaceae và bầu nhụy thượng

ở Liliaceae Dù có đặc điểm cấu tạo khác nhau nhưng chúng đều là những loài hoa

dễ chăm sóc, ít sâu bệnh và sinh trưởng mạnh Trái ngược với hoa loa kèn đỏthường được trồng trong chậu để làm cảnh thì loa kèn trắng lại được trồng ngoàiđồng ruộng để lấy hoa vào khoảng tháng 4 Ở Việt Nam, hoa loa kèn trắng mớiđược trồng ở một số tỉnh, thành phố có nghề trồng hoa phát triển: Đà Lạt, thành phố

Hồ Chí Minh, Hà Nội, Hải Phòng… trong đó Đà Lạt là nơi hiện đang có diện tíchtrồng loa kèn trắng nhiều nhất so với các địa phương khác trên cả nước (chiếm 8%trong tổng diện tích trồng hoa) Cây hoa loa kèn trắng là cây chịu rét khá, chịu nóngkém, ưa khí hậu mát ẩm, nhiệt độ ban ngày là 20 -25°C, ban đêm là 12°C, ưa cường

độ ánh sáng ở mức trung bình Loa kèn trắng thích không khí ẩm ướt, độ ẩm thíchhợp nhất là 80-85% Việc trồng hoa loa kèn trắng đem lại lợi nhuận kinh tế cao, ướctính, mỗi sào, trừ chi phí, hoa loa kèn trắng cho lãi từ 30 – 40 triệu đồng/năm (

2.2 Sơ lược vê họ Potyviridae

2.2.1 Giới thiệu

Potyviridae là một trong hai họ virus thực vật lớn nhất với trên 200 loài Tất

cả các thành viên trong họ đều có bộ gen RNA sợi đơn (ssRNA), cực dương

Các virus của họ Potyviridae, gọi tắt là các potyvirus, được phân loại thành 8 chi bao gồm: Brambyvirus, Bymovirus, Ipomovirus, Macluravirus, Poacevirus,

Potyvirus, Rymovirus và Tritimovirus

Tên của họ “Potyviridae” có nguồn gốc từ cụm từ Potato virus Y , vốn là

virus thực vật được nghiên cứu nhiều và đầy đủ nhất và được ghi nhận đầu tiên trên

khoai tây từ năm 1931

2.2.2 Cấu trúc

Phân tử (virion) của các potyvirus có dạng sợi mềm, không có vỏ bao bọc,đường kính khoảng 11-15 nm và dài 650-950 nm đối với các virus có bộ gen đơn và200-300 + 500-600 đối với các virus có bộ gen kép

Các virus của 7 chi Brambyvirus, Potyvirus, Macluravirus, Poacevirus,

Ipomovirus, Rymovirus và Tritimovirus là virus có bộ gen đơn, tức là có bộ gen không

phân đoạn, chỉ gồm 1 phân tử RNA duy nhất còn các virus của chi còn lại Bymovirus

thì có bộ gen kép gồm 2 phân tử RNA-1 và RNA-2 (phân tử RNA-1 tương đương với2/3 kích thước tính từ đầu 3’ còn phân tử RNA-2 tương đương phần còn lại của bộ gencủa các virus có bộ gen đơn)

2.3 Sơ lược vê chi Potyvirus

2.3.1 Giới thiệu

Chi Potyvirus là chi lớn nhất trong họ Potyviridae với khoảng gần 200 loài

và cùng với chi Begomovirus (họ Geminiviridae), Potyvirus là chi virus thực vật lớn

nhất, chiếm khoảng 20% tổng số virus thực vật

Nhiều potyvirus là các tác nhân gây bệnh cho cây có ý nghĩa kinh tế, như:

• Papaya ringspot virus (PRSV) là bệnh virus số 1 hại đu đủ và bầu bí

• Turnip mosaic virus (TuMV) hại cây rau họ thập tự và được xem là virus quantrọng thứ 2 trên cây rau

• Bean common mosaic virus (BCMV) trên cây họ đậu

• Potato virus Y (PVY) trên cây khoai tây và các cây họ cà khác

• Plum pox virus (PPV) là virus quan trọng nhất trên cây quả hạch như đào, táo,

lê, mận

Đặc trưng của các potyvirus đó là khả năng hình thành thể vùi trong tế bàocây Các loại thể vùi này có thể là thể vùi tế bào chất có hình dạng đặc trưng (hìnhvong, bánh xe, hình phiến…) cho potyvirus và do đó có giá trị chẩn đoán, chúngcũng có thể là thể vùi nhân – thể vùi vô định hình, không có hình dạng xác định

Phần lớn potyvirus có phổ ký chủ hẹp hoặc rất hẹp nhưng một số ít lại cóphổ ký chủ rất rộng, nhiễm cả trên cây 1 và 2 lá mầm

2.3.2 Cấu trúc phân tư

Các potyvirus có phân tử hình sợi mềm, không có vỏ bao bọc, đường kính11-15 nm và dài 650-950 nm Mỗi phân tử virion được cấu tạo từ 1700-2000 tiểuphần protein sắp xếp theo kiểu xoắn đối xứng xung quanh phân tử RNA genome(Hình 2.1)

Hình 2.1 Mô hình cấu trúc phân tử của các potyvirus

(http://viralzone.expasy.org/all_by_species/50.html)

2.3.3 Genome

Tất cả các potyvirus đều có bộ gen là một phân tử RNA sợi đơn, cực dương,kích thước ~ 10 kb Tổ chức bộ gen của các potyvirus tính từ trái sang phải là:

Một vùng 5’ không dịch mã (5’UTR)

Một ORF đơn, lớn gọi là ORF chính (major ORF) ORF chính mã hóa 1polyprotein, sau khi dịch mã sẽ được xử lý thành khoảng 10 protein chức năng:protein P1, protein bổ trợ (Helper component protein, HC-Pro), protein P3, protein6K1, protein thể vùi tế bào chất (CI), protein 6K2, protein VPg (viral protein

genome-linked, Hari, 1981; Siaw et al., 1985; Riechmann et al., 1989; Murphy et

al., 1990), protein NIa-pro (major protease of small nuclear inclusion protein - NIa),

protein NIb (large nuclear inclusion protein) và protein vỏ (coat protein, CP)

(Shukla et al., 1998) Protein VPg gắn vào đầu 5’ của RNA genome.

Một đầu 3’ không dịch mã (3’UTR), kết thúc bằng 1 đuôi poly-A

Hình 2.2 Sơ đồ tổ chức bộ genome của potyvirus

(http://viralzone.expasy.org/all_by_species/50.html)

2.3.4 Chức năng các protein

 P1 là 1 proteinase P1 là vùng biến động nhất của bộ gen P1 có hoạt tính

proteinase và sẽ tự cắt liên kết P1/HC-Pro sau dịch mã để giải phóng P1

 P1 tương tác với RNA P1 có khả năng liên kết với RNA của virus, do vậy

nó có vai trò trong quá trình vận chuyển virus

 P1 tham gia ức chế phản ứng phòng thủ của tế bào ký chủ (thông qua cơ

chế câm gen)

HC-Pro

 HC-Pro cần thiết cho sự lan truyền qua vector Vai trò này của protein

HC-Pro được thể hiện qua cơ chế bắc cầu HC-Pro đóng vai trò là một phân tử cầunối, trong đó phần đầu N của nó (thông qua motif bảo thủ cao KITC) sẽ liên kết vớireceptor ở bề mặt phía trong của vòi aphid, còn phần trung tâm của nó (thông quamotif PTK) sẽ liên kết với protein vỏ của virion Nhờ cầu nối này mà phân tử virusđược giữ lại ở phần vector

 HC-Pro cần cho virus di chuyển hệ thống và di chuyển giữa các tế bào.

HC-Pro là một protein vận chuyển (MP) của potyvirus HC-Pro làm tăng kích thướcgiới hạn (size exclusion limit, SEL) của sợi liên bào và do đó cho phép RNA củavirus có thể di chuyển giữa các tế bào

 HC-Pro có hoạt tính proteinase Đầu C của HC-Pro có hoạt tính

proteinase, cho phép nó tự cắt khỏi liên kết giữa HC-Pro và P3

 HC-Pro cần cho sự tái bản (thông qua motif IGN).

 HC-Pro có thể ức chế bộ máy câm gen của tế bào Đây là một chức năng

quan trọng của potyvirus chống lại phản ứng phòng thủ của cây

P3

P3 cũng là vùng biến động và ít được nghiên cứu chức năng P3 được biết làquy định tính gây bệnh của virus thông qua tương tác với các protein khác củavirus

CI

 CI là thành phần chính của phức hợp tái bản virus CI có hoạt tính

helicase, hoạt tính liên kết RNA, hoạt tính thủy phân ATP Tất cả các hoạt tính nàyđều cần thiết cho CI tháo xoắn cấu trúc trung gian sợi kép của RNA virus trong quá

trình tái bản.

 CI cần cho sự di chuyển của virus giữa các tế bào Quá trình di chuyển

giữa các tế bào yêu cầu năng lượng Do CI có hoạt tính ATPase nên nó đảm nhậnvai trò cung cấp năng lượng cho quá trình vận chuyển virus qua các tế bào Ngoài

ra, CI tương tác trực tiếp với plasmodesmata và phức hợp ribonucleoprotein củavirus để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình di chuyển

6K1 và 6K2

 6K1 tương tác với P3 để quy định tính gây bệnh của virus

 6K2 là một protein mỏ neo giúp liên kết bộ máy tái bản của virus vàomạng lưới nội chất – nơi thực hiện quá trình tái bản

VPg

 VPg chính là phần đầu N của NIa VPg cũng là một protein cấu trúc vìngoài protein CP, nó có mặt trong phân tử virus VPg liên kết vào đầu 5’ của RNAvirus và bảo vệ phân tử RNA khỏi bị phân hủy

 VPg cần cho quá trình tái bản bộ gen virus, di chuyển hệ thống của virus trong cây.

 VPg tương tác với yếu tố khởi đầu dịch mã của tế bào như eIF4E và

eIF(iso)4E, do đó cho phép ribosome có thể tiếp cận RNA virus ngay sau khi tháovỏ để thực hiện quá trình dịch mã Cần chú ý là potyvirus có bộ gen RNA sợi đơncực (+), phân tử RNA genome của virus không được mũ hóa nên quá trình dịch mãORF trên bộ gen virus là một quá trình dịch mã độc lập mũ CAP

 VPg là một protein Avr cho potyvirus Nhiều gen kháng của thực vật đối

với potyvirus đã đực chứng minh là các gen lặn, ví dụ như pvr1 (ớt), mo1 (rau diếp),

sbm1 (đậu) và rym4/5 (lúa miến) Các gen này thực chất mã hóa yếu tố khởi đầu

dịch mã eIF4E Khi các gen này (ở trạng thái đồng hợp tử), mang các đột biến phávỡ tươnng tác VPg - eIF4E đã dẫn tới kiểu hình kháng

NIa-Pro

NIa-Pro là phần đầu C của protein NIa Nó là một protease chính của virus.Đầu C của NIa-Pro có hoạt tính protease cho phép nó cắt các liên kết P3/6K1,6K1/CI, CI/6K2, 6K2/VPg, VPg/NIa-Pro, NIa-Pro/NIb và NIb/CP để giải phóng ra

các protein chức năng đơn lẻ.

Nib

NIb là một RNA dependent RNA polymerase (RdRp) Đây là một chức năng

quan trọng cho phép bộ gen virus được tái bản từ sợi (+) sang sợi (-) và ngược lại

CP

 CP của potyvirus đã được nghiên cứu rất kỹ Protein CP có thể được chialàm 3 phần (đầu N, trung tâm và đầu C) Đầu N là phần nhô lên bề mặt phân tử, khábiến động về trình tự và chứa các epitope đặc hiệu cho virus ở mức loài và mứcchủng Phần trung tâm và đầu C bảo thủ hơn và mức biến động của 2 phần này tươngđương mức biến động chung trên toàn bộ bộ gen Chính vì vậy, CP, đặc biệt phần đầu

C và trung tâm hay được sử dụng trong đánh giá đa dạng virus

 CP có vai trò quan trọng trong lan truyền qua vector Đầu N của CP chứa

1 motif bảo thủ cao (DAG) Thông qua motif này, phân tử virus sẽ liên kết với Pro theo lý thuyết bắc cầu để lan truyền qua vector rệp muội

HC- CP có vai trò quan trọng trong di chuyển hệ thống và di chuyển giữa các

tế bào CP cùng với HC-Pro là 2 protein vận chuyển (MP) của potyvirus Cả 2

protein này đều làm tăng kích thước giới hạn (SEL) của lỗ liên bào và do đó chophép virus di chuyển giữa các tế bào

 CP là một protein cấu trúc tạo virion.

 CP điều khiển quá trình tái bản RNA virus.

2.3.5 Sự tái bản

• Virus xâm nhập vào trong tế bào chất Sau đó, tiến hành tháo vỏ, giải phóng

bộ gen virus (ssRNA sợi +)

• Bộ máy dịch mã của tế bào sẽ dịch mã tạo polyprotein ngay trên khuôn RNAgenome của virus (ssRNA sợi +) Tiếp theo, polyprotein này được xử lý hậudịch mã nhờ chính các vùng có hoạt tính protease của polyprotein để tạothành các protein chức năng

• Các protein của virus và của tế bào ký chủ thực hiện quá trình tái bản (cần 2protein chủ chốt của virus là RdRp (NIb) và helicase (CI) Các protein thamgia tái bản cùng với RNA sợi (+) lắp ráp thành “phức hợp tái sinh virus”

(VRC – viral replication complex) gắn trên màng lưới nội chất Tại VRC,sợi RNA (-) sẽ được tổng hợp trên sợi RNA (+).

• Sợi (-) mới được tổng hợp ra lại được dùng làm khuôn để tổng hợp nhiều sợi(+) mới

• Lắp ráp thành virion mới từ protein CP và sợi (+) được tổng hợp mới

2.3.6 Phương thức lan truyền

• Lan truyền ngoài tự nhiên bằng rệp muội theo kiểu không bền vững

• Nhiều virus truyền qua vật liệu giống như củ giống (PVY - khoai tây;OYDV, LYSV, SYSV - hành tỏi), hạt (BCMV - đậu đỗ), qua phấn hoa(BCMV - đậu đỗ)

• Có thể truyền qua tiếp xúc cơ học

2.4 Sơ lược vê bệnh virus trên họ loa kèn

2.4.1 Hippeastrum mosaic virus (HiMV)

Hippeastrum là một chi trong họ Amaryllidaceae, có khoảng 90 loài với hơn

600 giống cây trồng và cây lai (Stevens, 2001), có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới vàcận nhiệt đới của châu Mỹ từ phía Bắc Argentina tới Mexico và vùng Caribbean.Chi này gồm các loài cây thân thảo sống lâu năm, mọc ra từ thân hành, thường cóhoa sặc sỡ và nhiều loài được trồng làm cảnh

HiMV là một potyvirus Bệnh do HiMV gây ra được mô tả lần đầu tiên bởi

Kunkel vào năm 1922 trên cây Hippeastrum hybridum (Kunkel, 1922) Dọc theo

phiến lá và cuống hoa của cây bệnh xuất hiện những vết khảm sọc, đứt quãng

(Brunt et al., 1973) Phân tử HiMV có hình sợi mềm, kích thước 782 x 12 nm Mỗi

phân tử virion được cấu tạo từ các tiểu phần protein sắp xếp theo kiểu xoắn đốixứng xung quanh 1 phân tử RNA genome (Brunt, 1973; Jayasinghe & Dijkstra,1979)

HiMV không truyền qua hạt giống, không truyền qua phấn hoa Virus đượctruyền bằng tiếp xúc cơ học nhưng đây không phải là con đường lan truyền ngoài tự

nhiên của virus Ngoài tự nhiên, virus lan truyền qua rệp như Myzus persicae, Aphis

fabae, A gossypii theo kiểu không bền vững.

Virus có thể được xác định bằng phương pháp RT-PCR sử dụng cặp mồichung cho Potyvirus Ngoài ra, có thể xác định virus bằng cách quan sát thể vùi

trong tế bào cây bệnh với hình dạng đặc trưng cho potyvirus như hình trụ, hìnhvòng bánh xe, hình phiến Hầu hết các tế bào bệnh đều có chứa 1 thể vùi, nằm gầnhoặc áp sát vào nhân tế bào và lục lạp của những tế bào này thường nhỏ hơn so vớicác tế bào bình thường

Ký chủ tự nhiên của HiMV mới chỉ tìm thấy trên các cây họ thuộc

Amaryllidaceae, nhưng thông qua phương pháp nhiễm bệnh bằng tiếp xúc cơ học

thì virus có thể gây bệnh trên một số cây thuộc các họ Amaranthaceae,

Chenopodiaceae và Solanaceae

2.4.2 Vallota speciosa virus

Cây Vallota speciosa (Scarborough Lily) thuộc chi Cyrtanthus, họ

Amaryllidaceae, là cây thân thảo sống lâu năm, mọc ra từ thân hành, có nguồn gốc

từ Nam Phi, hoa thường nở vào cuối mùa hè đầu mùa thu (Stevens, 2001) Hoa hìnhphễu, có nhiều màu sắc khác nhau như đỏ tươi, cam, vàng, hồng trắng

Vallota speciosa virus là một potyvirus mới được công bố gần đây vào năm

2006 tại New Zealand (Wei et al., 2006) Ký chủ tự nhiên của virus này mới chỉ được phát hiện trên cây hoa thủy tiên (chi Narcissus) (Wei et al., 2006; Nixon

et al., 2008; Wylie et al., 2010).

2.4.3 Lily mottle virus (LMoV)

LMoV là một potyvirus LMoV được xem là virus phổ biến và nguy hiểmnhất trên cây hoa trồng bằng củ Virus còn được gọi dưới một số tên như Lily streakmottle virus (Brierley & Smith, 1944) và cho đến năm 1990 vẫn được gọi là Tulip

breaking virus (TBV) (Dekker et al., 1993; Derks et al., 1994, dẫn theo Asjes,

và hoa bị dị hình, không đối xứng, trong khi những cây khác có thể biểu hiện cácđốm hình nhẫn chết hoại màu nâu trên các vảy của củ Cây thường thấp hơn và chết

sớm, hoa cắt nhanh tàn.

Việc phát hiện virus ở những cây bị nhiễm bệnh phụ thuộc vào virus, độ mẫncảm của cây trồng và ảnh hưởng của điều kiện trồng Mức độ đa dạng về triệuchứng của LMoV khiến cho việc loại bỏ các cây bị bệnh trên đồng ruộng không dễdàng

Trong những năm gần đây, kỹ thuật RT-PCR và ELISA đã được sử dụng đểnhận biết những chủng virus trên các cây trồng LMoV được phát hiện bằng kỹthuật RT-PCR với mồi đặc hiệu Gen quy định protein vỏ đã được giải trình tự saukhi phân lập dòng cDNA phần đầu 3’ của bộ gen virus (Brierley & Smith, 1944 dẫntheo Derks et al., 1994) So sánh phương pháp ELISA và RT-PCR, Yoshiji (2002)chỉ ra rằng RT-PCR nhạy hơn là ELISA trong việc xác định sự có mặt của virustrong các cây lily Độ tin cậy của các thử nghiệm thay đổi rất ít khi tiến hành vàogiữa tháng 11 và tháng 3 Sự khác nhau về mức độ tập trung của virus được xácđịnh ở các vảy đơn riêng rẽ của các củ (van Schadewijk, 1986)

LMoV truyền theo kiểu không bền vững bởi rệp muội Myzus persicae ,

Aphis gossypii, Macrosiphum euphorbiae Virus được truyền qua dịch cây và không

qua hạt giống của lily (Brierley và Smith, 1944 dẫn theo Derks, 1997)

2.4.4 Lily symptomless virus (LSV)

LSV là một virus thuộc chi Carlavirus, họ Flexiviridae LSV gây hại chủ yếu

trên 3 loài thực vật thuộc 2 họ khác nhau là cây Alstroemeria (họ

Alstroemeriaceae), hoa ly (Lilium spp.) và cây hoa tulip (Tulipa) (họ Liliaceae).

LSV lan truyền theo kiểu không bền vững nhờ các loài rệp như Myzus

persicae (Mowat & Stefanac, 1974), Macrosiphum euphorbiae (Derks & Abeele,

1980), Aphis gossypii, A fabae và Aulocorthum solani (Mowat & Stefanac, 1974;

Derks & Asjes, 1975) Bên cạnh đó LSV có thể lan truyền bằng con đường tiếpxúc cơ học

2.4.5 Tulip breaking virus (TBV)

TBV là một potyvirus TBV nhiễm tự nhiên trên cây các cây Tulipa spp,

Lilium spp Virus này gây hại nghiêm trọng trên cây hoa Tulip Truyền bệnh nhờ

véc tơ truyền bệnh là côn trùng: Myzus persicae, Aphis gosypii, Aphis fabae,

Macrosiphum euphorbiae, Dysaphis tulipae, Aphididae.Virus truyền không theo

một cách thức cụ thể Virus truyền bệnh qua việc ghép cành, kỹ thuật cơ học gây xátthương, không truyền bệnh bằng tiếp xúc giữa các cây với nhau, không truyền quahạt giống, không truyền qua phấn hoa

Phạm vi phân bố: Có thể Phân bố trên toàn thế giới (Brierley & Smith 1944)

2.4.7 Narcissus mosaic virus (NMV)

NMV thuộc chi Potexvirus Theo CABI, 2005, NMV chỉ gây hại trên 2 loài hoa trồng là Lilium speciosum và Narcissus (cây thuỷ tiên vàng) Tuy nhiên theo

Brunt (1966), NMV có thể lây nhiễm trên một số loài cỏ nằm trong 10 họ của cây 2lá mầm

NMV không truyền qua vector côn trùng và hạt giống mà truyền qua tiếp xúc

cơ học và qua củ giống (Mowat, 1971)

2.5 Chẩn đoán virus bằng kỹ thuật RT-PCR

Các bước trong chẩn đoán bệnh cây bằng RT-PCR:

1 Thiết kế mồi: tự thiết kế hoặc lựa chọn mồi từ các nghiên cứu đã được côngbố

2 Tách chiết RNA tổng số từ mô cây

3 Tiến hành phản ứng RT-PCR

4 Kiểm tra, đánh giá kết quả bằng điện di

Có 2 loại mồi được sử dụng cho chẩn đoán bệnh cây:

Mồi chung (degenerate primers): được thiết kế trên các vùng bảo thủ cao, cókhả năng phát hiện các đối tượng khác hẳn nhau (thường là các đối tượng trong 1

họ, 1 chi)

Mồi đặc hiệu (specific primers): được thiết kế trên các vùng có thể phân biệtđược loài, thậm chí dưới loài như chủng, nòi…

2.6 Kỹ thuật xác định trình tự

Những phương pháp xác định trình tự axit nucleic đang được sử dụng ngàynay đều dựa trên phương pháp của Frederick Sanger (1977) , có cải tiến Phươngpháp này còn được gọi là phương pháp enzyme học hay phương pháp dideoxy

Trong phương pháp này, người ta sử dụng các nhân tố kết thúc đặc hiệu quátrình kéo dài DNA khi tổng hợp Nhân tố kết thúc là các 2,3 dideoxynucleosidetriphosphat (ddNTP) Các ddNTP có thể kết hợp vào chuỗi DNA đang tổng hợp quanhóm 5 triphosphat nhưng lại không thể tiếp tục kết hợp được với phân tửdesoxynucleoside triphosphat tiếp theo Do đó khi trộn lẫn lượng nhỏdideoxynucleoside triphosphat với 4 loại desoxynucleosid triphosphat rồi tiến hànhtổng hợp DNA nhờ DNA polymerase thì sẽ thu được một loạt các đoạn DNA đượckết thúc đặc hiệu bởi gốc dideoxy nucleotit Tiến hành 4 thí nghiệm tách rời, mỗiphản ứng bổ sung 1 loại dideoxy nucleotit khác nhau sẽ thu được các đoạn DNA cókết thúc bằng các dideoxy nucleotit khác nhau và hơn kém nhau 1 nucleotit Chạyđiện di các đoạn này rồi hiện hình chúng, ta có thể xác định trình tự của chuỗi DNAquan tâm

PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Potyvirus hại cây hoa họ loa kèn

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu

Trung tâm bệnh cây nhiệt đới – Học Viện Nông nghiệp Việt Nam

3.2.2 Thời gian nghiên cứu:

Từ 01/2015 đến 06/2015

3.3 Vật liệu nghiên cứu

3.3.1 Mẫu cây thí nghiệm

Các mẫu cây sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.1

Bảng 3.1 Các mẫu cây sử dụng trong nghiên cứu

STT Ký hiệu mẫu Cây ký chủ Triệu chứng Địa điểm thu mẫu

Bộ môn Sinh học- khoa

CNSH

4 LKT-56 Loa kèn

trắng Khảm lá

Cây nuôi cấy meristem (cây nguồn: LKT1)

5 LKT-58 Loa kèn

trắng Khảm lá

Cây nuôi cấy meristem(cây nguồn: LKT2)

6 LKĐ-ĐC5 Loa kèn đỏ Không triệu

8 LKĐ-18 Loa kèn đỏ Không triệu

chứng Mẫu cây tách vảy

9 LKĐ-21 Loa kèn đỏ Không triệu

chứng

Bộ môn Thực Vật –Khoa CNSH (Nhân nhanh từ vảy củ

- Giống: Red Peacock)

10 LKĐ-22 Loa kèn đỏ Không triệu

chứng

Bộ môn Thực Vật –Khoa CNSH (Nhân nhanh từ vảy củ

- Giống: Red Peacock)

11 L-ĐC Lay ơn Không triệu

chứng Tiền Phong – Mê Linh

12 L-3 Lay ơn Khảm lá Tiền Phong – Mê Linh

13 L-11 Lay ơn Khảm lá Tiền Phong – Mê Linh

3.3.2 Cây chỉ thị

Potyvirus trên hoa loa kèn trắng: thuốc lá (Nicotiana tabacum var Xanthi), phong huệ đỏ ( Zephyranthes rosea), ly (thu từ phương pháp tách vảy củ; nguồn:

Viện nghiên cứu Rau quả), cỏ lan chi (Chlorophytum bichetii),lô hội

Potyvirus trên hoa loa kèn đỏ: thuốc lá (Nicotiana tabacum var Xanthi), hoa loa kèn đỏ (Hippeastrum sp.)(bộ môn Thực vật – khoa CNSH), phong huệ đỏ

( Zephyranthes rosea), ly (thu từ phương pháp tách vảy củ; nguồn: Viện nghiên cứu

Rau quả), cỏ lan chi (Chlorophytum bichetii).

3.3.3 Các đệm, dung dịch, kít, hóa chất và môi trường chính

• 2xGoTaq (hãng Fermentas)

• MMLUV Reverse transcriptase (hãng Fermentas)

• Đệm 0.5× TAE dùng điện di: 5mM Tris-acetate và 0.25mM EDTA (pH 7.8)

phần phụ lục.

Bảng 3.2 Thành phần môi trường MS

Ký hiệu DD mẹ Thành phần Số mg/ 1 lít MT nuôi cấy