Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào Kỹ thuật nhân giống vô tính Invitro

Khái niệmNhân giống vô tính In vitro vi nhân giống cây trồng là quá trình sản xuất một lượng lớn cây hoàn chỉnh, từ các bộ phận, cơ quan như chồi, mắt ngủ, vảy củ, đoạn thân, lá… củ

Công nghệ nuôi cấy mô, tế bào thực vật

Chuyên đề: Kỹ thuật nhân giống vô tính In vitro

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD : Ts Nguyễn Thị Lâm Hải

Nhóm 2

Danh sách sinh viên nhóm 2

Khái niệm

Tính cấp thiết của nhân giống vô tính In vitro

Các bước tiến hành nhân giống

Các phương thức nhân giống vô tính In vitro

Các tồn tại của nhân giống vô tính In vitro

Ứng dụng

Quy trình nhân giống vô tính cây chuối

Nội dung

3

Tách cây để trồng Các loại cây sau khi tách cây

Phương pháp tách cây Các phương pháp nhân giống vô tính

4

5

Phương pháp giâm hom

6

1 Khái niệm

Nhân giống vô tính In vitro ( vi nhân giống

cây trồng) là quá trình sản xuất một lượng

lớn cây hoàn chỉnh, từ các bộ phận, cơ

quan như chồi, mắt ngủ, vảy củ, đoạn

thân, lá… của cây mẹ ban đầu thông qua

kỹ thuật nuôi cấy in vitro.

8

Tại sao phải dùng kỹ thuật này???

9

- Cây con không đảm bảo sạch bệnh virus

- Phụ thuộc vào mùa vụ

- Tốn công lao động, đất đai và thời gian

- Một số cây trồng không áp dụng được

- Cây giống dễ bị thoái hoá qua một số thế hệ

2 Tính cấp thiết của kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro

Các phương pháp nhân giống vô tính thông thường

10

Ưu điểm

 Hệ số nhân rất cao và cho ra các cá thể tương đối đồng nhất về mặt di truyền

 Có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối tượng khó nhân

bằng phương pháp thông thường)

 Dễ dàng tạo được cây sạch virus

 Các cây sau nhân In vitro có xu hướng được trẻ hóa-> nâng cao hiệu quả nhân bằng các

phương pháp thông thường sau đó

Kỹ thuật nhân giống vô tính In vitro

11

Hạn chế

 Chi phí cao so với các phương pháp nhân giống vô tính khác

 Không phải bất cứ loài cây nào cũng có thể vi nhân giống

 Một số loài cây trồng rất dễ bị biến dị khi nhân giống In vitro.

Kỹ thuật nhân giống vô tính In vitro

12

Phòng thí nghiệm đòi hỏi trang thiết bị, hóa chất với chi phí cao

3 Các bước tiến hành nhân giống

Bước 2: Nuôi cấy khởi động

Bước 3: Nhân nhanh

Bước 4: Tạo cây In vitro hoàn chỉnh

Bước 5: Thích ứng cây In vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Bước 1: Chọn lọc cây mẹ  Lấy mẫu

Khử trùng vào mẫu

Mt tạo rễ

14

b5

b3 b2

b4

Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

 Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ ( cây cho nguồn

mẫu nuôi cấy)

 Cây mẹ phải sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh

 Các cây mẹ được trồng trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng

trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu cấy

16

Bước 2: Nuôi cấy khởi động

Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu

cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt

 Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non, ít

chuyên hóa ( đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ…)

 Xác định chế độ khử trùng mẫu cấy thích hợp: HgCl2 0,1% xử lý trong 5-10 phút,

NaOCl, Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br2…

17

Bước 3: Nhân nhanh

Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con

đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính

=>Phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả là cao nhất

Nguyên tắc chung: môi trường có nhiều xytokinin sẽ kích thích tạo chồi

Chế độ nuôi cấy: 25-27oC, 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh sáng 2000-4000 lux.

Mục tiêu quan trọng nhất của giai đoạn này là xác định được phương thức nhân nhanh bằng môi

trường dinh dưỡng và điều kiện khí hậu tối thích

20

A As tự nhiên & tinh bột

B AS tự nhiên & đường

C As đèn & tinh bột

D As đèn & đường

Cây lan Dendrboium trên các nguồn carbohydrat và chế độ chiếu sáng khác nhau

21

Chồi Thủy tùng trong phòng thí nghiệm (Loài cổ thực vật được xem như hóa thạch sống của ngành

hạt trần)

22

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

 Môi trường tạo rễ thường được bổ sung một lượng nhỏ auxin Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng

 Đối với các phôi vô tính thường chỉ cần gieo chúng trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa nồng độ thấp của xytokinin để phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh

23

Ra rễ cho chồi Cây In vitro hoàn chỉnh

24

Lan Mokara nuôi phát triển thành cây hoàn chỉnh Tạo rễ của cây sâm ngọc linh

25

Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số

yêu cầu:

 Cây trong ống nghiệm đã đạt được những tiêu chuẩn hình thái nhất định ( số lá, số rễ, chiều cao

cây)

 Có giá thể tiếp nhận cây In vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước.

 Phải chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như có chế độ dinh

dưỡng thích hợp

26

Cây đạt tiêu chuẩn ra vườn ươm

Giá thể trồng mẫu

Vườn ươm

27

4 Các phương thức nhân giống vô tính in vitro

Sự phát triển của chồi nách được kích thích bằng cách loại bỏ ưu thế ngọn khi nuôi cấy các đỉnh

chồi và đoạn thân mang mắt ngủ Theo phương thức này sự phát triển chồi diễn ra theo 2 cách:

 Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách Trường hợp này thường xảy ra khi nuôi

cấy cây 2 lá mầm như thuốc lá, khoai tây, hoa cúc…

 Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách Trường hợp này hay gặp với cây 1 lá mầm như

mía, lúa…

a Hoạt hóa chồi nách

28

 Cần phải thực hiện quá trình phản phân hóa và tái phân hóa tế bào để bắt các tế bào

soma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát trển mô sẹo

 Ở các đối tượng 1 lá mầm như lan, dứa, chuối, hoa loa kèn… thường gặp sự phát triển

cây qua giai đoạn dẻ hành (protocorm), cùng một lúc mẫu cấy tạo thành hàng loạt

protocorm, các thể này hoặc tiếp tục sản sinh protocorm mới hoặc phát triển thành cây

b Tạo chồi bất định

31

 Cần phải thực hiện quá trình phản phân hóa và tái phân hóa tế bào để bắt các tế bào soma

hình thành phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát triển mô sẹo Nhưng phôi

vô tính có cấu trúc lưỡng cực bao gồm cả chồi mầm và rễ mầm

 Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh hoặc sử dụng làm nguyên liệu sản xuất

hạt giống nhân tạo

c Tạo phôi vô tính

33

Sự hình thành phôi có 2 bước:

 Sự phân hóa các tế bào có khả năng phát sinh phôi: cần môi trường giàu auxin

Các tế bào có khả năng phát sinh phôi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không

có không bào, tế bào chất đậm đặc, giàu protein và mRNA

 Sự phát triển của những tế bào phôi mới hình thành: cần môi trường nghèo hoặc không

có auxin

Nồng độ cao của auxin kích thích sự hình thành phôi vô tính nhưng ức chế quá trình phân

hóa và phát triển tiếp theo của các phôi này

34

5 Các tồn tại của nhân giống vô tính in vitro

Những nhân tố gây ra biến dị tế bào soma có thể là:

 Kiểu di truyền: tần số biến dị ảnh hưởng bởi kiểu gen của các loài cây trồng khác nhau Nói chung cây càng có

mức bội thể cao thì càng dễ biến dị.

 Số lần cấy chuyển: càng nhiều thì độ biến dị càng cao Theo Amstrong và Phillips (1988): khi nuôi cấy lâu dài

thường gây ra biến dị NST.

 Loại mô: nói chung nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh In vitro ít bị biến dị hơn so với nuôi cấy các cơ

quan khác.

a Tính bất định về mặt di truyền

35

Một số loại VK như: Agrobacterium, Bacillus, Corylabacterium, Erwinnia và Pseudomonas có thể xâm nhiễm vào

mô dẫn, tồn tại trong mô và bắt đầu gây tác hại khi tế bào bắt đầu phân chia (sau 1-2 tuần nuôi cấy)

Biện pháp khắc phục:

 Phải lựa chọn cây mẹ đúng tiêu chuẩn.

 Sử dụng 1 số chất kháng sinh để chống hiện tượng nhiễm khuẩn và nấm Nhưng mô TV rất mẫn cảm với

kháng sinh và có phản ứng đến kiểu di truyền do đó cần thận trọng khi dùng kháng sinh Chất kháng sinh

thường gây ra những hủy hoại ở ty thể và lạp thể nên có ảnh hưởng đến di truyền tế bào chất.

b Sự nhiễm mẫu

37

Hiện tượng hóa nâu này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tanin hoặc hydroxyphenol

Các phương pháp loại trừ sự hóa nâu:

 Bổ sung than hoạt tính vào môi trường nuôi cấy (0,1-0,3%): đặc biệt hiệu quả trên các loài phong lan Phalenopsis,

Cattleya và Aerides

Tuy nhiên than hoạt tính có thể làm chậm quá trình nhân nhanh cây do hấp phụ một số chất điều tiết sinh trưởng và dinh dưỡng cần thiết khác.

 Bổ sung polyvinyl pyrolidone (PVP) có tác dụng khử nâu hóa tốt ở mẫu một số cây ăn quả (táo , hồng).

 Sử dụng mô non, gây vết thương nhỏ nhất khi khử trùng.

 Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và xytric vài giờ trước khi cấy.

 Nuôi cấy trong môi trường lỏng, O2 thấp, không có ánh sáng(1-2 tuần).

 Cấy chuyển mẫu liên tục (1-2 ngày/lần) sang môi trường tươi trong 1-2 tuần.

c Việc sản sinh các chất độc từ mô nuôi cấy

39

Lớp đen do mẫu cấy tiết ra nhiều phenol

40

Cây bị “thủy tinh hóa”- thân lá cây mọng nước, trong suốt, cây rất khó sống khi đưa ra ngoài môi trường do bị

mất nước rất mạnh.

Thường xảy ra khi nuôi cấy trong môi trường lỏng hay môi trường ít agar, sự trao đổi khí thấp Đặc biệt thường

xảy ra khi nuôi cấy táo, mận, hoa cẩm chướng, hoa đồng tiền và hoa cúc.

Cây bị thủy tinh hóa thường có hàm lượng lớp sáp bao vệ thấp, cấu tạo có nhiều phân tử phân cực nên dễ hấp

thụ nước Cây in vitro thường có mật độ khí khổng cao, khí khổng có dạng tròn chứ không elip, khí khổng mở liên

tục trong quá trình nuôi cấy.

d Hiện tượng thủy tinh hóa

41

Một số giải pháp tránh hiện tượng thủy tinh hóa:

 Giảm sự hút nước của cây bằng cách tăng nồng độ đường hoặc các chất gây áp suất thẩm

thấu cao.

 Giảm nồng độ các chất chứa nito trong môi trường.

 Giảm sự sản sinh ethylen trong bình nuôi cấy.

 Xử lý acid absixic hoặc một số chất ức chế sinh trưởng.

42

6 Ứng dụng

 Sản xuất nhanh chóng các giống cây trồng đáp ứng được nhu cầu về cây giống cao

trong trồng trọt

 Công tác giống: các khâu thu nhập nguồn gen, bảo quản quỹ gen, lai tạo, tuyển chọn,

thử nghiệm giống và nhân giống được thực hiện một cách khá thuận lợi và nhanh

chóng

VD: chuối, khoai tây

Trong nông nghiệp

43

 Nhân giống ổn định chất lượng, năng suất cao

phẩm chất lượng tốt

VD: các cây trồng chuyển gen, con lai F1…

 Tạo giống sạch bệnh chống chịu với môi trường

VD khoai tây sạch virus, hoa lily sạch bệnh…

44

 Dây chuyền sản xuất nhân nhanh các giống hoa cây cảnh phục vụ cho thị trường.

VD: nhờ nuôi cấy mô vào sản xuất các giống hoa như: tulip, đồng tiền, hoa ly ở Hà Lan, hoa

lan ở Trung Quốc, đồng tiền ở Việt Nam, cẩm chướng…

 Dây chuyền sản xuất giống cây con cung cấp cho thị trường, giảm giá thành sản phẩm

VD: sản xuất cây giống lâm nghiệp theo quy mô công nghiệp: bạch đàn , keo…

Trong công nghiệp

45

Hoa Cẩm chướng

Hoa Cát tường

Hoa Torenia

46

Sản xuất nhanh sinh khối các cây dược liệu

bằng thu sinh khối callus hoặc thể huyền phù

VD: nhân nhanh sâm Triều Tiên, sâm Ngọc

Linh…

Trong y học

Sâm Ngọc Linh

47

 Phục tráng các giống cây quý hiếm nằm trong sách đỏ

 Mở ra một chân trời mới trong nghiên cứu di truyền TV, các cơ chế sinh tổng hợp ở TV, sinh lý phát triển, vai trò của phytohormone trong đời sống TV và nhiều vấn đề sinh học cơ bản khác.

 Khắc phục hiện tưởng bất thụ trong lai xa.

 Bảo quản nguồn gen bằng nuôi cấy trong ống nghiệm.

 Tồn trữ các tế bào TV sống trong thời gian dài ở nhiệt độ thấp mà không mất tính toàn thể của tế bào.

 Làm cơ sở cho các kỹ thuật di truyền khác là khâu cuối cùng cho các công tác đánh giá giống.

Trong nghiên cứu khoa học

48

Cây sưa-Dallbergai

tokinensis

49

7 Quy trình nhân giống vô tính in vitro cây chuối

50

Nguồn:Nhân giống in vitro chuối LaBa – Đại học Đà Lạt – Khoa Sinh học

http://www.youtube.com/watch?v=uZQdF6-3810 http://www.youtube.com/watch?v=Zgxbar-Ll_s

Bước 1: Chọn lọc cây mẹ và giám định bệnh

Chọn lọc cây mẹ đầu dòng ưu tú bao gồm chọn các đặc tính tốt của cây như: sinh trưởng

khoẻ mạnh, năng suất cao, chất lượng quả ngon và phải đúng giống Cây sau đó được giám

định kiểm tra các loại bệnh do virus như BBTV, BSV bằng kỹ thuật PCR Các cây được

chọn lọc phải hoàn toàn sạch các bệnh nêu trên, sau đó, được trồng trong nhà lưới để thu

chồi nhân giống

51

Bước 2: Tạo chồi ban đầu và nhân chồi in vitro.

 Chuối con có chiều cao từ 0,5-1,0 m lấy từ cây mẹ đầu dòng, tách bỏ những lớp thân giả và phần rễ củ bên ngoài, khử trùng bằng dung dịch cồn 70%

 Mẫu cấy có kích thước 1,5 x 1,5 x 1,0 cm được đưa vào môi trường tái sinh chồi (MS + 4 mg/l BA + 0,5 mg/l IAA + 30g/l sucrose +0,9 % agar)

 Sau 4-5 tuần, khoảng 10-12 chồi/ mẫu cấy sẽ được tái sinh

 Tách mẫu cấy đã tái sinh ra từng cụm nhỏ mang 3-4 chồi, cấy sang môi trường nhân nhanh cụm chồi (MS +5mg/l BA +0,1 mg/l IAA + Ademin 80 mg/ l+ 30g/l sucrose + 0,9 % agar), cấy chuyền sau 4-5 tuần/ lần Số lần cấy chuyền không vượt quá 6 lần

52

Chồi ban đầu

Chuyển sang MT nhân nhanh cụm chồi

Cấy chuyển lần 1

Cấy chuyển lần 2

54

Bước 3: Tái sinh cây hoàn chỉnh

Môi trường tái sinh (MS BAP 2 mg/l +

20g/l sucrose + than hoạt tính

0,1-0,15%) sẽ được bổ sung vào bình nuôi

cấy nhằm giúp chồi vươn dài và ra rễ

sau 3-4 tuần nuôi cấy

55

Bước 4: Chuyển cây ra vườn ươm

Cây tái sinh trong bình cấy sẽ được chuyển ra vườn ươm giữ trong điều kiện mát sau 2-3 tuần

trước khi ra ngôi Cây ra ngôi cao trên 5 cm sẽ được trồng trực tiếp trong bầu đất phân bò + tro

+ trấu + xơ dừa (1:1:1:1) còn những cây nhỏ hơn sẽ được chăm sóc tập trung trong khay nhựa

khoảng 2-3 tuần rồi mới chuyển ra bầu đất Cây con trước khi trồng ở đồng ruộng phải đạt tiêu

chuẩn cao từ 20-30 cm và mang 6-7 lá

56

Cây được lấy ra và rửa sạch agar bám trên bộ rễ

57

Giá thể xơ dừa Giá thể: xơ dừa+ đất đen

Giá thể tro, trấu+ phân bò

(Tỷ lệ sống 100%)

58

Cây được chăm sóc trong khay nhựa

Sự phát triển của mẫu cây trên 3 giá thể sau 30 ngày

60

Cây được chuyển sang bầu đất với giá thể là tro, trấu, phân bò, xơ dừa (1:1:1:1)

Cây trước khi xuất vườn

62

Một số quy trình nhân giống vô tính in vitro

Nhân giống cây Xoan

chịu hạn

66

Nhân giống

In vitro cây

Dứa

67

Nhân giống

In vitro cây

Thanh long

68

Nhân giống In

vitro cây Trinh

nữ hoàng cung

69

Nhân giống

In vitro cây

Tre

70

Kết luận

 Với lợi thế tạo ra số lượng cây giống lớn,đồng đều sạch bệnh…, nhân giống cây trồng

ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô thực vật đã mở ra hướng đi mới cho phát triển nền

nông nghiệp bền vững và hiện đại hiện nay

 Nhân giống In vitro là một hướng phát triển mới cần được quan tâm, đầu tư, phát triển

thêm

 Nhiệm vụ của các nhà nuôi cấy mô tế bào thực vật là tiếp tục xây dựng và hoàn thiện

quy trình nhân giống In vitro với các cây trồng mang lại hiệu quả kinh tế cao,đáp ứng

nhu cầu thị trường

71

Cảm ơn cô giáo và các bạn đã lắng nghe