Nghiên cứu làm sạch bệnh virus cho cây tỏi (allium sativum l) bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem

Sự nhiễm do virus đã làm giảm đáng kể về năng suất cũng như chất lượng củ tỏi, do vậy bên cạnh những biện pháp truyền thống như chọn lựa hạt giống và cây con khoẻ khi đưa ra ngoài sản xu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

NGUYỄN THI THANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU LÀM SẠCH BỆNH VIRUS

CHO CÂY TỎI (ALLIUM SATIVUM L) BẰNG KỸ THUẬT

NUÔI CẤY MERISTEM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

NGUYỄN THI THANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU LÀM SẠCH BỆNH VIRUS

CHO CÂY TỎI (ALLIUM SATIVUM L) BẰNG KỸ THUẬT

NUÔI CẤY MERISTEM

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Kết quả nghiên cứu trong luận văn

là kết quả lao động của chính tác giả Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và ch-a từng đ-ợc ai công bố trong bất cứ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đ-ợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đ-ợc chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Thanh Ph-ơng

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự

cố gắng của bản thân tôi đã nhận đ-ợc rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và ng-ời thân

Tr-ớc tiên, tôi xin đ-ợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo, nhà giáo -u tú PGS.TS Nguyễn Thị

Lý Anh – Viện Tr-ởng Viện Sinh học Nông nghiệp – Tr-ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tận tình h-ớng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này

Tôi xin đ-ợc gửi lời chân thành cảm ơn tới tập thể các thầy cô giáo trong Viện Sinh học Nông nghiệp – Tr-ờng Đại học Nông nghiệp Hà Nội và tập thể các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học và thực phẩm, Viện Đào tạo Sau đại học – Tr-ờng Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới chồng tôi, anh Đinh Tr-ờng Sơn ng-ời đã luôn ở bên

và động viên tôi trong những lúc khó khăn nhất

Đông thời, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp và những ng-ời đã ủng hộ và giúp

đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày 26 tháng 9 năm 2011

Tác giả luận văn

NguyÔn ThÞ Thanh

Ph-¬ng

MỤC LỤC Trang phụ bìa i

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục các chữ viết tắt vii

Danh mục các bảng viii

Danh mục các hình vẽ, đồ thị ix

CHƯƠNG I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích, yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây tỏi (Allium sativum L) 3

2.6 Những thiệt hại do virus gây ra trên cây tỏi 4

2.2 Tình hình nghiên cứu về bệnh virus trên cây tỏi ở Việt Nam và thế giới 7

2.2.1 Tình hình nghiên cứu về bênh virus của cây tỏi ở Việt Nam 7

2.2.2 Tình hình nghiên cứu về bệnh virus của cây tỏi trên thế giới 8

2.3 Truyền lan của virus họ hành tỏi 10

2.4 Phòng trừ bệnh virus hại hành tỏi 11

2.4.1 Các biện pháp nhằm ngăn chặn khả năng lây lan của vectơ truyền bệnh 11

2.4.2 Hạn chế sự truyền lan của các virus qua vectơ truyền bệnh 11

2.4.3 Các biện pháp tạo giống sạch bệnh 12

2.5 Các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus 16

2.5.1 Phương pháp lây nhiễm cơ giới: 16

2.5.2 Phương pháp ELISA (Enzym linked immunosorbent assay): 16

2.5.3 Phương pháp RT – PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain): 17

2.6 Những nghiên cứu về nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem) trên cây tỏi (Allium sativum L.) 18

CHƯƠNG III ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 21

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 21

3.1.2 Vật liệu thí nghiệm 21

3.1.3 Địa điểm nghiên cứu 21

3.1.4 Thời gian nghiên cứu 21

3.2 Nội dung nghiên cứu 21

3.2.1 Các nghiên cứu tiền đề là cơ sở cho nghiên cứu làm sạch bệnh virus trên cây tỏi (Allium sativum L) 21

3.2.2 Thu thập mẫu bệnh và xác định mẫu bị nhiễm bệnh virus từ các cây tỏi thu thập ngoài đồng ruộng 23

3.2.3 Nghiên cứu làm sạch bệnh virus cho cây tỏi ta (Allium sativum L) 23

3.2.4 Nghiên cứu nhân nhanh cây tỏi sạch virus 24

3.2.5 Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh 25

3.3 Phương pháp nghiên cứu 26

3.3.1 Phương pháp thu thập mẫu 26

3.3.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào 26

3.3.3 Quy trình tách đỉnh sinh trưởng 27

3.3.4 Phương pháp đánh giá độ sạch virus của cây tỏi bằng phương pháp lây nhiễm cơ giới 28

3.3.5 Phương pháp đánh giá độ sạch virus của cây tỏi bằng phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase-polymerase chain reaction) 28

3.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 30

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Các nghiên cứu tiền đề là cơ sở cho nghiên cứu làm sạch bệnh virus trên cây tỏi (Allium sativum L) 31

4.1.1 Nghiên cứu chế độ khử trùng tạo vật liệu khởi đầu 31

4.1.2 Nghiên cứu xác định môi trường nuôi cấy tái sinh chồi từ meristem 33

4.2 Thu thập mẫu bệnh và xác định mẫu bị nhiễm bệnh virus từ các cây tỏi thu thập ngoài đồng ruộng 42

4.3 Nghiên cứu làm sạch virus cho cây tỏi ta (Allium sativum L) 46

4.4 Nghiên cứu nhân nhanh cây tỏi sạch virus 52

4.3.1 Nhân nhanh cây tỏi sạch virus bằng chồi đơn 53

4.3.2 Nhân nhanh cây tỏi sạch virus bằng tái sinh chồi từ callus 57

4.4 Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh 61

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65

5.1 Kết luận 65

5.2 Đề nghị 67

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

PHỤ LỤC 73

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ĐTST Chất điều tiết sinh trưởng

Ki Kinetin

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% đến khả năng sống và sạch của mẫu

cấy meristem (sau 6 tuần) 31

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của Sodium Dichloroisocyanurate (NaDCC) đến khả

năng sống và sạch của mẫu cấy meristem (sau 6 tuần) 32

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng phát sinh hình thái của

meristem (sau 6 tuần) 36

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của 2,4D đến khả năng phát sinh hình thái của

meristem (sau 6 tuần) 38

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của tổ hợp BA + 2,4D đến khả năng tái sinh của

meristem (sau 6 tuần) 40

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của tổ hợp BA αNAA đến sự phát sinh hình thái của

meristem (sau 6 tuần) 41

Bảng 4.8 Chuẩn đoán, phát hiện cây bị nhiễm bệnh virus của các mẫu tỏi thu thập

ngoài đồng ruộng bằng phương pháp sử dụng cây chỉ thị 43 Bảng 4.9: Ảnh hưởng của kích thước đến khả năng tái sinh và làm sạch virus

của meristem (sau 6 tuần) 46

Bảng 4.10: Kết quả kiểm tra độ sạch bệnh của cây tái sinh từ các kích thước

meristem khác nhau 47 Bảng 4.11: Ảnh hưởng của việc kết hợp tách meristem và xử lý ribavinin đến

khả năng tái sinh và sạch virus của meristem (sau 6 tuần) 50 Bảng 4.12: Ảnh hưởng của BA đến sự nhân nhanh chồi tỏi (sau 6 tuần) 53 Bảng 4.13: Ảnh hưởng của αNAA đến sự nhân nhanh chồi tỏi (sau 6 tuần) 55

Bảng 4.14: Ảnh hưởng của tổ hợp αNAA và BA đến sự nhân nhanh chồi tỏi

(sau 6 tuần) 56

Bảng 4.15: Nhân nhanh cây tỏi sạch virus bằng tái sinh chồi từ callus 58 Bảng 4.16 Ảnh hưởng của IBA đến sự ra rễ của chồi tỏi sạch virus 61 Bảng 4.17 Ảnh hưởng của than hoạt tính (THT) đến sự ra rễ của cây tỏi sạch

virus (sau 4 tuần nuôi cấy) 62

Bảng 4.18 Ảnh hưởng của tổ hợp than hoạt tính (THT) với IBA hoặc αNAA

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Biểu đồ 4.1: Ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh hình thái meristem 35

Biểu đồ 4.2: Ảnh hưởng của Ki đến sự phát sinh hỉnh thái meristem 37

Biểu đồ 4.3: Ảnh hưởng của kích thước đến khả năng tái sinh và làm sạch virus 47

Biểu đồ 4.4: Ảnh hưởng của việc kết hợp tách meristem và xử lý hóa chất ribavinin đến khả năng tái sinh và sạch virus 51

Biểu đồ 4.5: Nhân nhanh cây tỏi sạch bệnh virus bằng tái sinh chồi từ callus 59

Hình 4.1 Ảnh hưởng của BA khả năng phát sinh hình thái meristem 36

Hình 4.2 Ảnh hưởng của 2,4D và BA đến khả năng phát sinh hình thái meristem 39

Hình 4.3: Ảnh hưởng của BA và 2,4D đến khả năng phát sinh hình thái của meristem 41

Hình 4.4: Mẫu tỏi biểu hiện triệu chứng bệnh virus ngoài đồng ruộng 43

Hình 4.5: Biểu hiện bệnh sọc vàng trên cây chỉ thị rau muối 44

Hình 4.6: Kết quả kiểm tra RT – PCR 45

Hình 4.7: Kết quả kiểm tra RT – PCR độ sạch bệnh virus của các mẫu tái sinh từ meristem ở các kích thước khác nhau 49

Hình 4.8: Kết quả kiểm tra RT – PCR độ sạch bệnh virus của các mẫu tái sinh từ meristem trong môi trường có bổ sung ribavirin 52

Hình 4.9: Ảnh hưởng của BA đến sự nhân nhanh chồi tỏi 54

Hình 4.10: Ảnh hưởng của αNAA đến sự nhân nhanh chồi 56

Hình 4.11: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và NAA đến sự nhân nhanh chồi 57

Hình 4.12: Tái sinh tạo chồi tỏi sạch virus từ callus 60

Hình 4.13 : Cây tỏi hoàn chỉnh 64

CHƯƠNG I MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Cây tỏi (còn gọi là tỏi ta, đại toán, hom kía ) có tên khoa học là Allium

sativum L thuộc họ hành tỏi Alliaceae, là một trong những cây trồng cổ xưa nhất

còn tồn tại đến ngày nay (trên 5000 năm) Đây vừa là cây thuốc vừa là cây rau gia

vị quan trọng, được trồng rộng rãi trên 175 quốc gia (theo FAO, 2001), đem lại nguồn thu nhập đáng kể cho người dân Trung Quốc, Hàn Quốc, Ấn Độ, Tây Ban Nha, Mỹ, Argentina và Thái Lan là những nước sản xuất nhiều tỏi nhất trên thế giới [1]

Việt Nam có các điều kiện thuận lợi cho việc trồng tỏi và đã hình thành nhiều vùng chuyên canh có tiếng như Tiên Sơn (Bắc Ninh), Mê Linh (Vĩnh Phúc), Hà Nội, Hưng Yên, Hải Phòng, Quảng Ngãi, Phú Yên, Khánh Hòa, Ninh Thuận và Đà Lạt (Tạ Thu Cúc và cộng sự, 2000) [1]

Tỏi là cây vụ đông quan trọng của vùng đồng bằng sông Hồng, có hiệu quả kinh tế hơn so với các cây trồng khác như lúa, bí xanh, dưa lê Trong dân gian, tỏi thường được giữ giống và nhân giống vô tính bằng các nhánh tỏi (ánh tỏi, tép tỏi, căn tỏi) từ năm này qua năm khác Mặc dù các phương pháp giữ giống truyền thống

có ưu điểm là giống có khả năng thích ứng rộng, dễ bảo quản và vận chuyển, nhưng nhược điểm là các bệnh virus nguy hiểm trên tỏi thường gặp như vàng lùn hành tây (Onion yellow dwarf virus-OYDV), sọc vàng tỏi tây (Leek yellow stripe virus-

LYSV), Tomato black ring virus (TBRV), Shallot latent virus (SLV) thường lan

truyền từ vụ này qua vụ khác gây nhiều thiệt hại, có khi gây mất mùa cục bộ Ở nước ta, hai loại bệnh OYDV và LYSV gây thiệt hại mạnh nhất, tỉ lệ thiệt hại lên tới 20 - 30% cây giống, có ruộng nhiễm nặng tới 80%, ngoài ra, số cây giống có thể

ẩn triệu chứng chiếm 10 - 20%, (Vũ Triệu Mân và cộng sự, 2001) [3]

Sự nhiễm do virus đã làm giảm đáng kể về năng suất cũng như chất lượng củ tỏi, do vậy bên cạnh những biện pháp truyền thống như chọn lựa hạt giống và cây con khoẻ khi đưa ra ngoài sản xuất thì việc xây dựng quy trình tạo giống tỏi sạch bệnh là yêu cầu cấp bách đặt ra trong thực tiễn sản xuất

Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu

làm sạch bệnh virus cho cây tỏi (Allium sativum L) bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem”

1.2 Mục đích, yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Sử dụng kỹ thuật tách và nuôi cấy tái sinh đỉnh sinh trưởng (meristem) nhằm tạo ra cây tỏi sạch bệnh virus cung cấp nguồn nguyên liệu phục vụ cho sản xuất giống tỏi sạch bệnh, chất lượng cao

1.2.2 Yêu cầu

- Thu thập các mẫu cây tỏi bị bệnh virus làm nguyên liệu nghiên cứu

- Xác định được chế độ khử trùng tạo vật liệu khởi đầu thích hợp

- Xác định được môi trường thích hợp cho tái sinh đỉnh sinh trưởng

- Xác định được kích thước meristem thích hợp cho nuôi cấy tái sinh cây và làm sạch bệnh virus

- Xác định được ảnh hưởng của ribavirin đến khả năng tái sinh và làm sạch bệnh virus

- Xác định được môi trường nhân nhanh thích hợp cho cây tỏi sạch bệnh virus

- Xác định được môi trường tạo cây hoàn chỉnh thích hợp cho cây tỏi sạch bệnh virus

CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây tỏi (Allium sativum L)

Tỏi là loại cây trồng cổ xưa có nguồn gốc ở vùng Trung Á, hiện vẫn tìm thấy loài tỏi đặc hữu mọc hoang dại ở Kyrgyzstan, Tajikistan, Turkmenistan và Uzbekistan Từ 3000 năm trước công nguyên, tỏi đã được biết đến ở Hy Lạp Ở Ấn

Độ và Trung Quốc, tỏi cũng là cây trồng từ thời cổ đại Người Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha và Pháp đã đưa cây tỏi từ châu Âu sang châu Mỹ Ngày nay, có khoảng

300 giống cây tỏi được trồng rộng rãi trên khắp thế giới, từ vùng có khí hậu nhiệt đới xích đạo đến vĩ tuyến ở cả hai bán cầu

Trước đây, trong một thời gian dài, cây tỏi được xếp vào họ Liliaceae (họ

hoa Lily) do hoa của chúng thuộc loại bầu thượng Nhưng sau đó một số nhà thực

vật học đã đổi thành họ Amarylliadaceae (họ thủy tiên) do hoa được sinh ra ở lá

bắc, hình tán, nằm trên ngọn của cán hoa Gần đây để tránh sự xáo trộn, J.G.Agard

đã phân loại tỏi vào chi Allium thuộc họ Alliaceae (họ Hành tỏi) Đây là một họ

thực vật lớn có khoảng 30 chi với hơn 600 loài (Tạ Thu Cúc và cộng sự, 2000 [1])

Các giống tỏi trồng phổ biến hiện nay đều có số nhiếm sắc thể 2n = 16 Ở vùng Campania, Italia người ta đã tìm thấy dạng tỏi tứ bội có bộ nhiễm sắc thể 4n = 32

Theo H Stavělíková, 2008 [26] diện tích canh tác tỏi trên thế giới năm 2006 vào khoảng 1.166.000 ha cho sản lượng hơn 15 triệu tấn Tỏi đã trở thành cây rau gia vị quan trọng, được trồng nhiều ở các nước Trung Quốc, Hoa Kỳ, Ấn Độ và các nước Châu Âu, Châu Á, Châu Phi Trong đó, Châu Á là khu vực có diện tích trồng tỏi lớn nhất khoảng 956.000 ha, đạt sản lượng 13.396.000 tấn, tiếp đó là Trung Quốc, với diện tích 657.250 ha, sản lượng đạt 11.587.000 tấn

Không chỉ được sử dụng làm nguồn thực phẩm, tỏi còn là một loại dược liệu

quý được biết đến từ lâu do khả năng diệt khuẩn, tỏi được cho là là “chất Penicillin

của thiên nhiên” Tỏi có tác dụng làm tăng nhiệt cơ thể nhanh vì trong 100g tỏi ăn được có tới 121 calo (khoai tây chỉ có 94 calo), làm giảm lượng cholesterol trong máu, ngăn ngừa bệnh tim mạch Theo nhiều tài liệu phân tích thức ăn của Việt

Nam, cứ trong 100g tỏi tươi có 62,8% là nước; 6,3% protein; 29% hydratcacbon; 0,1% chất béo; 24mg Ca; 31mg P; 1,3mg Fe; 0,24mg Vitamin B1; 0,03mg Vitamin B2; 0,9mg Vitamin PP; 3mg Vitamin C

Ở nước ta, hiện nay hành tỏi là cây trồng vụ đông quan trọng của nhiều vùng như Vĩnh Phúc, Bắc Ninh, Hưng Yên, Hải Dương, Hải Phòng, Quảng Ngãi, Phú Yên và là một trong 3 loại sản phẩm giữ vai trò chính trong mặt hàng gia vị xuất khẩu của Việt Nam với sản lượng lên tới 2.000 tấn/năm Năm 2010, Hải Dương là vùng trồng hành, tỏi lớn nhất vùng đồng bằng sông Hồng, với diện tích hơn 5.100

ha, tổng sản lượng hơn 51.000 tấn/năm Ngoài ra, phải kể đến vùng trồng tỏi nổi tiếng Lý Sơn, tỉnh Quảng Ngãi, toàn huyện hiện có 310ha trồng tỏi Vụ đông xuân

2009 - 2010, Lý Sơn được mùa tỏi với sản lượng trên 2.200 tấn, đã thu về khoảng

150 tỉ đồng cho người nông dân [49], [50]

Những giống tỏi chủ yếu đang trồng phổ biến ở nước ta có hai nhóm là: tỏi

trắng và tỏi tía Nhóm tỏi trắng (Allium sativum sativum) có củ to (4 - 4.5cm), lá

lớn, cổ tỏi và vỏ củ có màu trắng sữa đến trắng, thời gian sinh trưởng dài, năng suất

cao, đều là các giống nhập nội Nhóm tỏi tía (Allium sativum ophioscorodon) có kích

thước củ nhỏ (3 – 4cm); lá xanh đậm, thơm, nhiều tinh dầu, củ non có màu tím tía

Hệ rễ tỏi thuộc rễ chùm, phát triển kém, rễ tập trung ở lớp đất mặt, khả năng chống chịu khô hạn, ngập úng kém Vì thế đất trồng thích hợp là dạng cát pha, thịt nhẹ, khi trồng phải lên luống để tránh úng ngập nhưng cũng cần tưới ẩm thường xuyên Là cây sống hàng năm, tỏi là dạng cây thảo nhỏ, cao khoảng 30 – 40cm, thân hành ngắn, hình tháp gồm nhiều hành con gọi là nhánh tỏi (ánh tỏi, tép tỏi, căn tỏi) Khác với dạng ống của là hành, lá tỏi là một bản hẹp, dài, mềm, có lớp sáp rất mỏng che phủ để chống mất nước và bảo vệ lá

Ở nước ta, tỏi trồng bằng các nhánh tách từ củ, thời vụ thích hợp từ 25/9 tới 5/10 hàng năm Củ tỏi thương phẩm được thu hoạch sau khi trồng 125 – 130 ngày Mỗi ha trung bình đạt 5-8 tấn củ khô

2.6 Những thiệt hại do virus gây ra trên cây tỏi

Các cây họ hành tỏi bị tấn công bởi khoảng 50 bệnh trong đó 34 bệnh gây ra bởi nấm, 7 bệnh vi khuẩn và nấm men, 5 bệnh tuyến trùng, 3 bệnh virus và một bởi

Mycoplasma (Schwartz và Mohan, 1995 [35]) Các bệnh do nấm, vi khuẩn, tuyến trùng như: thối ướt, thối khô, mốc đen, khô, xanh, mốc lớn… hầu hết đều có thể phòng trừ được thông qua các biện pháp phun thuốc hóa học, kỹ thuật canh tác, phơi khô củ bảo quản… Với các bệnh do virus gây ra rất khó phòng tránh do virus

ký sinh hoàn toàn trong tế bào ký chủ sử dụng chính quá trình trao đổi chất của tế bào ký chủ để nhân lên Do được nhân giống vô tính nên tỷ lệ cây giống nhiễm bệnh ngày càng tăng sau mỗi vụ Ngoài ra, virus dễ dàng lây lan qua các vết thương

cơ giới và các vectơ truyền bệnh như rệp, nhện,… do đó không thể sử dụng biện pháp thông thường để phòng tránh bệnh và ngăn chặn sự phát triển bệnh Vì vậy bệnh virus dễ phát triển trên diện tích rộng, từ năm này qua năm khác, bệnh không chỉ ảnh hưởng nghiêm trọng tới năng suất mà còn tới chất lượng sản phẩm

Tại Mỹ tháng 6 năm 2005, S.L.Gieek đã công bố có tới 50% diện tích trồng tỏi bị nhiễm các virus gây khảm và vàng cây như OYDV, LYSV, GCLV

Klukackova, M Navratil và M Duchoslav, 2007 [27] nghiên cứu trên tỏi đã phát hiện thấy tỷ lệ nhiễm trung bình ở Cộng hòa Séc khoảng 75,4% OYDV; 31,2% LYSV; 99,6% GarCLV và 81,1% SLV

Lot H., Chovelen V., Souche S và Delecolle, 1998 [29] đã điều tra nghiên cứu về ảnh hưởng của OYDV và LYSV trên 3 giống tỏi trồng phổ biến ở Pháp là

Gernidowr, Printanor, Messidrome Kết quả OYDV làm giảm tới 39% trọng lượng

củ ở giống thứ nhất và nên tới 60% ở hai giống còn lại Trong khi đó, LYSV làm giảm trọng lượng củ tương ứng ở 3 giống 26%, 54% và 17% Củ thường bị móp, các nhánh tép teo không đều

Ở Australia, các giống tỏi được trồng bị giảm năng suất là do virus và tác nhân gây bệnh được tìm thấy là LYSV và OYDV, trong đó LYSV có thể làm giảm tới 15 - 50% năng suất tỏi (Gisele Irvine và Samantha Sterling, 2002 [24]) Ở Argentina, LYSV được tìm thấy trên tỏi chiếm tới 80 - 98%, virus này làm giảm 44% trọng lượng và 13% đường kính củ, có khi giảm tới 60% năng suất nếu dùng

củ làm giống trong 5 năm liên tục (Vilma, Conci, Ana Canavelli, P Lunello, Di Rienco, 2003)

Tháng 6 năm 2005, S L Gieck đã cống bố có tới 50% diện tích trồng tỏi bị nhiễm các virus gây khảm và vàng cây như OYDV, LYSV, GCLV ở vùng Oregon, Mỹ

Tiềm năng năng suất mất đi của tỏi (Allium sativum) do nhiễm OYDV dao động từ 39% đến 60% phụ thuộc vào từng giống (Lot H và cộng sự, 1998 [29]) Tây Âu là vùng sản xuất tỏi tây (Allium porrum) lớn nhất thế giới Các vụ tỏi thu và

đông đều xuất hiện LYSV, đây là virus gây hại nặng ở tất cả các giống trên các vùng trồng tỏi thương mại LYSV gây giảm năng suất tới 50% (Diekmann M., FAO/IPGRI, 1995 [23])

Trung Quốc là nước trồng tỏi lớn nhất, chiếm 1/2 diện tích châu Á và 1/3 diện tích của thế giới, cũng bị tổn thất nặng nề bởi bệnh virus trên tỏi Tỏi thương phẩm có chứa ít nhất hai loài virus; các virus này làm lá cây bị bệnh có màu vàng, cây không cho hoa, chất lượng củ xấu (Xu và cộng sự, 2000 [45]; Zhao và Xue

2002 [46]) Tại Trung Quốc, nhiễm virus OYDV đã làm giảm năng suất 47,60% trong đó, chiều dài thân giả giảm 27,75%, số lượng lá giảm 14%, trọng lượng cây giảm 56,24%, số lượng củ giảm 58,78%, số lượng nhánh giảm 47,37% và trọng lượng nhánh giảm 71,92% Sự giảm ở các chỉ tiêu trên cũng sảy ra với giống tỏi địa phương Baladi- Ai Cập lần lượt là 16,79%, 20,10%, 47,12%, 46,56% 20,02%, và 44,90% (S Elnagar, MAK El - Sheikh và AS Abdel Wahab, 2009 [36]) Các kết quả trong nghiên cứu này đã chứng minh rõ ràng tác động của virus OYDV đối với sản lượng của hành tây và tỏi so với những cây không bị bệnh

Theo báo cáo của hội nghị về công nghệ trong nông nghiệp tổ chức ở Ai Cập

2009 thì cây hành bị bệnh OYDV bị giảm 27,42% chiều dài thân giả, 29,14% số

lượng lá ( 8,75 lá/cây khỏe mạnh giảm xuống còn 6,2 lá/cây bị nhiễm bệnh), 31.9%

trọng lượng cây (trọng lượng trung bình của cây khỏe là 118,1g so với cây bị bệnh

là 80,36 g) và 41,8% trọng lượng củ (trọng lượng trung bình của củ bị nhiễm bệnh 62,61 g/củ bị giảm nhiều so củ không bị bệnh 107,5 g)

Cây hành tỏi bị nhiễm virus còn bị giảm số lượng hoa, số lượng hạt giống và chất lượng hạt giống (Bos L., 1982 [14]) OYDV có thể làm giảm quá trình sản xuất hạt giống của cây hành tây giống lên đến 50% tuy nhiên không ảnh hưởng tới sức sống hạt giống Tổng thiệt hại do bệnh OYDV thay đổi theo tuổi cây tại thời điểm

nhiễm bệnh (Darin, 1997 [22]), bệnh nhiễm khi cây còn non thì năng suất thiệt hại càng lớn ( S Elnagar, MAK El - Sheikh và AS Abdel Wahab, 2009 [36]), Canavelli

và cộng sự, 1998 [17]) báo cáo rằng củ từ cây bị bệnh giữ kém trong kho dự trữ

2.2 Tình hình nghiên cứu về bệnh virus trên cây tỏi ở Việt Nam và thế giới

2.2.1 Tình hình nghiên cứu về bênh virus của cây tỏi ở Việt Nam

Bệnh virus trên cây hành tỏi ở nước ta được phát hiện lần đầu tiên năm 1993 [2] Theo Vũ Triệu Mân và Bùi Trọng Thuỷ, có hai loài là virus gây bệnh vàng lùn (OYDV) và virus gây bệnh sọc vàng (LYSV) gây hại trên cây hành tây Các tác giả

đã mô tả được triệu chứng, bước đầu điều tra đánh giá mức độ gây hại từ giai đoạn

vườn ươm đến khi thu hoạch

+ Bệnh vàng lùn hành tây (Onion yellow dwarf virus): Lá cây bị nhiễm bệnh

có hiện tượng biến thành mầu vàng và rất còi cọc Nếu bệnh nhiễm sớm, cây không phát triển được, lá màu vàng nhạt uốn cong, cây dần tàn lụi Cây con sau 15 ngày lá

có màu sẫm ống lá to và mập hơn và chớm có sắc vàng Nếu nhiễm muộn cây sinh trưởng nhiều nhánh nhỏ, lá mọc thành chùm rũ cong xuống cây khô chết dần củ không hình thành mà kéo dài thành thành một đoạn thân

Theo các tác giả trên thiệt hại của bệnh vàng lùn là làm giảm số lượng và chất lượng cây giống ở giai đoạn vườn ươm và củ trong sản xuất Vùng Võ Cường - Bắc Ninh, Tiền Phong - Mê Linh - Vĩnh Phúc tỷ lệ bệnh lên tới 20 - 30% số cây giống, 10 - 20% số cây giống có thể ẩn triệu chứng, có ruộng giống nhiễm nặng tới 80% số cây giống Ngoài hai vùng trồng hành tuyền thống trên, các vùng trồng mới như Nam Sách - Hải Dương, Thuỷ Nguyên - Hải phòng cũng thấy xuất hiện bệnh

Các giống hành Mỹ (Sunseed) nhiễm nặng hơn giống hành Nhật (Tokila) và các giống Pháp, Bungari Giai đoạn 20 - 25 ngày sau khi gieo hạt là giai đoạn mẫn cảm nhất của bệnh

+ Bệnh sọc vàng hành tây (Leek yellow stripe virus): Về triệu chứng, cây bệnh lúc đầu có lá xanh đậm, dày và thô hơn cây bình thường sau đó lá xuất hiện các sọc màu trắng nhạt theo chiều dài lá hành, sọc có viền vàng nhạt Trên một lá có thể

có một hay nhiều sọc Khi bệnh đã phát triển các sọc vàng, lá thô cứng, cây còi cọc

Trên hành tây bệnh xuất hiện nhiều nhất ở giai đoạn cây bắt đầu có củ khoảng 40 ngày sau trồng Cây hành nhiễm bệnh có 2 - 3 thân giả hầu như không cho thu hoạch

Ngoài ra, một số tác giả khác như Nguyễn Hữu Thủy, 2007 [7] đã tiến hành điều tra bệnh virus cây họ hành tỏi tại 5 điểm Gia Lâm, Từ Liêm – Hà Nội, Văn Lâm – Hưng Yên, Đại Phúc – Bắc Ninh và Mê Linh – Vĩnh Phúc thu được kết quả như sau: Tỷ lệ tỏi ta bị nhiễm bệnh sọc vàng LYSV 110 ngày sau trồng ở Đặng

Xá là 4,3 %, Đại Phúc là 14 % Đối với tỏi tây 105 ngày sau trồng tỷ lệ nhiễm LYSV ở 3 vùng Tây Tựu, Văn Lâm – Hưng Yên, và Mê Linh lần lượt là 14%, 10,9%, 10,5% Tình hình nhiễm bệnh virus trên cây hành đẻ Bắc Ninh cũng khá trầm trọng ở Đại phúc Bắc Ninh tỷ lệ bệnh là 15,6%, còn ở Tây Tựu tỷ lệ bệnh là 9,2% (Phạm Thị Thu Trang, 2007 [8])

Tóm lại nghiên cứu về bệnh virus ở nước ta trên cây họ hành tỏi còn rất ít và chỉ dừng ở mức độ điều tra, mô tả triệu chứng Từ năm 1993 đến nay chưa có thêm một nghiên cứu nào thêm về các loại virus gây hại trên hành tỏi ở Việt Nam trừ một nghiên cứu mới đây nhất của Cuong Viet Ha, 2007 [21], bằng phương pháp RT - PCR tác giả đã xác định có 3 loài virus là OYDV (Onion yellow dwarf virus), LYSV (Leek Yellow Stripe Virus), SYLV (Shallot yellow stripe virus) gây hại ở Việt Nam

2.2.2 Tình hình nghiên cứu về bệnh virus của cây tỏi trên thế giới

Van Regenmortel và cộng sự, 2000 [40] đã định danh được 23 loài virus

thuộc 5 họ virus gây bệnh trên các cây họ hành tỏi: Flexiviridae, Potyviridae

Reoviridae, Tombusviridae, Bunyaviridae trong đó có 3 loài virus gây bệnh phổ

biên nhất là: Onion yellow dwarf virus (OYDV), Leek Yellow Stripe Virus (LYSV), Shallot yellow stripe virus (SYSV)

+ OYDV (Onion yellow dwarf virus) lần đầu tiên mô tả bởi Melhus và cộng

sự, 1929 [33], Bos L., 1976 [13], OYDV có dạng sợi mềm dài không có vỏ bọc bên ngoài, kích thước 722 - 823 nm x 16 nm thuộc nhóm potyvirus Thể vùi của virus trong tế bào lá hành thường giống như 2 mảng hình bầu dục xếp sít hay hơi chồng lên nhau có màu đậm nhạt khác nhau kích thước 20 micromet

Theo Bos L., 1976 [13] và những nghiên cứu mới nhất của A.S Abdel Wahab, S Elnagar và M.A.K El-Sheikh, 2009 [36] đều mô tả triệu chứng điển hình

do potyvirus OYDV gây ra trên hành tây là khảm, sọc vàng, cây còi cọc, lùn tịt, lá quăn, biến dạng cành mang hoa, không có củ hoặc củ nhỏ

+ LYSV (Leek yellow stripe virus) và SYSV (Shallot yellow stripe virus) có dạng sợi mềm dài, không có vỏ bọc chiều dài xác định lần lượt là 820 nm và 750nm

Trên cây tỏi tây (Allium porrum) bị nhiễm LYSV trên lá xuất hiện các sọc

vàng đứt đoạn theo chiều dọc của lá

Một số loài virus gây hại cây họ hành tỏi đã được xác định

(Theo Van Regenmortel và cộng sự, 2000 [40].)

Bos et al, 1978 Van Dijk,1993

Barg et al, 1994

Sumi et al, 1993 Sumi et al, 1993 Sumi et al, 1993 Sumi et al, 1993 Song et al, 1998 Vishnichenko,1991 Barg et al, 1997 VanDijk, 1991 VanDijk, 1991

Potyviridae Potyvirus

Onion yellow dwarf virus (OYDV) Leek Yellow Stripe Virus (LYSV) Shallot yellow stripe virus (SYSV) Wakegi yellow dwarf virus (WYDV) Welsh onion yellow stripe virus

Methus et al, 1929 Bos et al , 1978 VanDijk et al, 1993 Tsuneyshi et al, 1997 VanDijk et al, 1991

Bos L và cộng sự, 1978 [15] đã mô tả triệu chứng điển hình do virus OYDV gây ra trên cây tỏi là toàn cây bệnh bị vàng lá, uốn cong, cây còi cọc, lá dày, không lớn, tạo nhiều nhánh nhỏ, không có củ hay củ nhỏ Các cây tỏi bị nhiễm virus LYSV đều xuất hiện các sọc vàng đứt đoạn chạy dọc theo chiều lá, cây có 2 - 3 thân giả và không cho thu hoạch Theo Barg E và cộng sự, 1994 [10], virus SYSV đã được ghi nhận gây bệnh trên cây tỏi giai đoạn còn non Cây non bị bệnh có các sọc màu trắng sữa dọc lá, lá cong uốn, thô cứng Đến giai đoạn thu hoạch, xuất hiện các sọc vàng rõ rệt trên lá già, cây còi cọc, thấp lùn hơn so với các cây xung quanh

2.3 Truyền lan của virus họ hành tỏi

Theo Conci và cộng sự, 2002 [18], rệp là tác nhân truyền bệnh của nhiều loại

virus như Potyvirus (OYDV, LYSV), Calarvirus (GLCV, SLV), trong khi nhện là tác nhân truyền bệnh cho các vi rirus thuộc nhóm Allexivirus (Garlic virus A, B, C

và D) Đây là những nhóm gây hại chính có mặt ở hầu hết các vùng trồng tỏi lớn trên thế giới như Mỹ, Canada, Nhật Bản, Australia, Hà Lan…

Có hơn 50 loài rệp có thể truyền được virus OYDV (Bos, 1976 [13]) Rệp

đào (Myzus persicae), rệp bông (Aphis gossypii) không chỉ truyền bệnh ngoài đồng

mà còn có thể truyền cả trong kho bảo quản từ củ hành hay mầm của cây nhiễm

bệnh qua cây khoẻ khác M ascalonicus cũng là loài rệp truyền được trong kho bảo quản Các loài khác như M certus, M humuli, A fabae, Macro sifohum,

Rhopalosiphum insertum, R maydis… cũng có khả năng truyền cả ba loài virus trên

Khi nghiên cứu về sự truyền lan của OYDV, Hardtl, 1962, 1972 cho rằng virus này

có thể nhiễm qua hạt giống hành tây với tỷ lệ từ 6 - 29% Bos và cộng sự, 1978 [15] thì cho rằng trong tự nhiên OYDV không truyền từ cây tỏi (Allium sativum) xang tỏi tây (Allium porum) và ngược lại Virus cũng không truyền qua hạt giống và qua hạt

phấn (Bos, 1976 [13]; Loui và Lorbeer, 1966 [30]) Cũng theo các tác giả trên và Van dijk, 1993 [38] thì các virus đều truyền qua xây xát cơ giới Không có tài liệu nào thông báo về các loài virus này có khả năng truyền qua tuyến trùng hay nấm

Cách thức và nguồn bệnh lây truyền virus chủ yếu là qua củ giống và các cây qua đông Theo Walkey, Atil, Ballooned và Millar, 1987, 1989 [43], [44], các virus tồn tại trong củ qua các năm và lây nhiễm cho cây con khi người dân dùng củ làm

giống Báo cáo khác của Miyuki Takaichi, Takayuchi Nagakubo, Kenji Oeda, Nhật Bản, 2001 [33] tỷ lệ cây nhiễm triệu chứng tăng theo số năm liên tục để củ giống tỏi

2.4 Phòng trừ bệnh virus hại hành tỏi

Virus là tác nhân gây bệnh kí sinh hoàn toàn bên trong tế bào ký chủ vì vậy việc phòng trừ bệnh virus hại cây trồng rất khó khăn đặc biệt với nhóm non - persistant như OYDV, LYSV, SYLV lại càng khó khăn hơn vì nhóm virus này có thời gian truyền bệnh rất ngắn, có khi chỉ cần 10 - 60 giây là vectơ truyền virus đã thực hiện xong việc truyền virus của nó Chính vì thế mà mọi nỗ lực nhằm ngăn chặn hoặc kìm hãm sự lan truyền của các virus trên trên đồng ruộng bằng phương pháp sử dụng thuốc học là không hiệu quả Để phòng trừ các virus này cần phải phối hợp nhiều biện pháp khác nhau

2.4.1 Các biện pháp nhằm ngăn chặn khả năng lây lan của vectơ truyền bệnh

+ Vệ sinh đồng ruộng, trừ bỏ các cây ký chủ dại trong ruộng (cả đường đi và trong luống) và xung quang cánh đồng trồng hành hoặc phun thuốc trừ rệp muội

Aphididae vào các cây dại trước mỗi vụ trồng hành tỏi để loại bỏ nguồn bệnh và nơi

cư trú môi giới

+ Trồng hành tỏi vào thời kì không có rệp hoặc có nhưng với mật độ thấp + Nhổ bỏ sớm các cây có biểu hiện triệu chứng để hạn chế nguồn bệnh ban đầu

là một biện pháp có hiệu quả cao trong việc ngăn chặn sự lan truyền gây hại của bệnh + Sản suất cây con sạch bệnh trong nhà lưới hoặc che chắn vườn ươm bằng các vật liệu khác để hạn chế môi giới xâm nhập vào vườn ươm Cần có biện pháp áp dụng kết hợp cả trong vườn ươm và ngoài đồng ruộng

2.4.2 Hạn chế sự truyền lan của các virus qua vectơ truyền bệnh

Sử dụng thuốc hoá học để trừ rệp muội nhằm ngăn chặn sự lan truyền của OYDV, LYSV, SYLV trên đồng ruộng là không có hiệu quả khi rệp mang virus đã xuất hiện, do vậy, việc phun định kỳ thuốc trừ sâu trong suốt thời kì vườn ươm và đồng ruộng có vai trò quan trọng nhằm hạn chế sự truyền lan của virus thông qua các vectơ truyền bệnh

2.4.3 Các biện pháp tạo giống sạch bệnh

Nguồn virus chủ yếu là từ củ giống đã nhiễm bệnh từ vụ trước vì vậy cần loại bỏ những củ bị nhiễm bệnh, lựa chọn những củ sạch bệnh để giống, không để giống củ liên tục trong nhiều năm

Bên cạnh những biện pháp truyền thống như chọn lựa hạt giống và cây con khoẻ khi đưa ra ngoài sản xuất, dùng thuốc hoá học phòng trừ môi giới truyền bệnh thì các quốc gia như Nhật Bản (Walkey, D G A., Ebb, M J W., Ballooned, 1987 [44]), Myanmar, Philippin, Braxin, Nertherland (Conci, V C., và Nome, S F., 1992 [19]; Verbeek, M., P Van Dijk và P.M.A Van Well, 1995 [41] đã tạo cây con sạch

bệnh thành công trên tỏi ta (Allium sativum), trên hành (Allium cepa var ascalonicum) bằng phương pháp nuôi cấy mô

Có một số phương pháp làm sạch virus trong nuôi cấy in vitro như sau:

2.4.3.1 Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh:

Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh là tách chính xác mô phân sinh đỉnh có kích thước nhỏ hơn 0,3mm, nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng phù hợp để tái sinh bằng các phương pháp khác nhau nhằm thu được cây sạch bệnh virus

Đỉnh sinh trưởng (meristem) có đường kính khoảng 0,1mm, dài 0,25 – 0,3mm nằm trên cùng của mô phân sinh đỉnh Nếu nuôi cấy trong môi trường thích hợp, mỗi đỉnh sinh trưởng sẽ phân hóa tạo thành một hoặc nhiều cây con hoàn chỉnh

Theo những nghiên cứu của White, 1934, Limasset và Cornuet, 1950 virus không tồn tại ở mô phân sinh đỉnh và lớp lá bao thứ nhất, lượng virus sẽ tăng dần lên ở các lớp lá nằm phía dưới Dựa vào kết quả trên, White, Limasset và Cornuet

đã đề xuất kỹ thuật nuôi cấy meristem (đỉnh sinh trưởng thuộc mô phân sinh đỉnh)

để tạo ra cây hoàn toàn sạch virus từ cây đã nhiễm bệnh Morel và Martin, 1952 là những người đầu tiên tạo ra các cây thược dược khỏe từ cây bệnh thông qua kĩ thuật này Từ đó đến nay, nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đã được áp dụng rộng rãi để nhân vô tính sạch virus ở rất nhiều loại cây trồng

Các giả thuyết giải thích hiện tượng mô phân sinh đỉnh không có virus do: + Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ mô dẫn, hệ thống này không có ở mô phân sinh đỉnh

+ Trong khi phân chia, các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các thông tin di truyền của virus

+ Sự phân chia rất nhanh của các tế bào mô phân sinh dẫn tới virus không thể lan truyền qua plasmodesmata

+ Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng meristem mạnh hơn các vùng khác trong cây

+ Nồng độ auxin cao ở đỉnh sinh trưởng có thể ngăn cản quá trình sao chép virus (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2004 [6])

Hiệu quả nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được đánh giá bằng tỉ lệ hình thành cây con và độ sạch virus Điều này tùy thuộc rất lớn vào loại cây trồng, loại virus và kich thước đỉnh sinh trưởng khi nuôi cấy Một số virus có thể bị loại trừ dễ dàng, số khác thì khó hơn Nhìn chung mẫu đỉnh sinh trưởng lấy càng to thì tỉ lệ tái sinh càng cao, nhưng số cây sạch bệnh virus lại càng giảm Số mầm ở đỉnh sinh trưởng có vai trò quan trọng trong việc làm sạch virus, nếu đỉnh sinh trưởng có 1 – 2 mầm sẽ loại trừ virus tốt hơn (Phan Hữu Tôn, 2005 [5])

Sau khi tái sinh được cây sạch virus từ các cây bị nhiễm bệnh thì việc nhân nhanh và duy trì độ sạch bệnh của chúng có ý nghĩa quan trọng quyết định Các cây,

củ sạch bệnh tạo ra từ cây, củ cấy mô phải được trồng trong điều kiện cách ly với

các nguồn gây bệnh và vectơ truyền bệnh Sau giai đoạn nhà màn, nhà lưới là giai đoạn nhân nhanh giống ở vùng cách ly (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2004 [6])

Cho đến nay, kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng đã được ứng dụng rất hiệu quả trong việc làm sạch virus cho nhiều loại cây trồng, tạo ngân hàng cây giống sạch bệnh, phục vụ cho sản xuất Tại trung tâm nghiên cứu Nông Nghiệp Cent – Nhật Bản, 20 loại virus đã được loại bỏ nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và 12 chi với khoảng 50 giống cây trồng đã trở nên sạch bệnh virus Người ta đã dùng phương pháp này để làm sạch virus khảm cây sắn, mía, súp lơ, tỏi; virus khảm dưa chuột, chuối; virus X, Y, S, A, M Hiện nay, trên 10% diện tích khoai tây ở Trung Quốc đang trồng giống sạch virus thông qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Các trung tâm nghiên cứu quốc tế như CIAT ở Colombia, IITA ở Nigeria đang phổ biến nuôi cấy sinh trưởng làm sạch virus trên đối tượng cây sắn, khoai tây và khoai lang cung cấp cho nhiều quốc gia (Phan Hữu Tôn, 2005 [5])

Theo Mai Thị Tân, 1998 [4]), phương pháp làm sạch virus này đã được áp dụng trên nhiều đối tượng như cây lương thực (khoai tây, khoai lang, khoai mỡ, khoai sọ, củ từ, ngô, sắn ), cây ăn quả (nho, táo tây, mâm xôi, dâu tây ), hoa cây cảnh (cúc, loa kèn, lay ơn, phong lan ), cây rau gia vị (hành lá, tỏi ta, ớt ngọt, củ cải, cà chua ), cây dược liệu (địa hoàng )

Như vậy, bằng việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, chúng ta có thể chủ động tạo ra những cây, củ giống sạch bệnh làm trẻ hóa cây trồng, cải thiện chất lượng cây giống, nâng cao năng suất hoặc dùng làm vật liệu ban đầu sạch bệnh cung cấp cho việc lai tạo giống mới

2.4.3.2 Vi ghép:

Vi ghép là kỹ thuật ghép các mô phân sinh đỉnh lên gốc cây sạch và kháng bệnh trong điều kiện invitro để sản xuất cây sạch bệnh virus Kỹ thuật này thường

sử dụng cây thân gỗ đặc biệt họ cam chanh

2.4.3.3 Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý nhiệt độ cao:

Ở nhiệt độ 36 - 37oC thì một số loài virus không có khả năng nhân bản hoặc khả năng nhân bản giảm đi Cơ chế ảnh hưởng của nhiệt độ lên virus thực vật vẫn chưa được làm sáng tỏ Tuy nhiên, nghiên cứu của Mink và cộng sự năm 1998 cho

thấy: quá trình sinh tổng hợp protein di chuyển và protein vỏ của virus khá mẫn cảm với nhiệt độ Hai protein trên liên quan đến sự lây lan của virus giữa các tế bào (cell-to-cell movement) cũng như sự vận chuyển của virus trong hệ thống mạch dẫn

Lợi dụng đặc tính trên có thể kết hợp phương pháp nuôi cấy mô phân sinh đỉnh với xử lý nhiệt độ để tẩy sạch virus khỏi mẫu cấy Biện pháp này cho phép có thể tách meristem ở kích thước lớn hơn (0,5 - 1mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lợi hơn so với phương pháp tách ở các kích thước 0,1 - 0,2mm

Có thể xử lý nhiệt 36 - 37oC một thời gian cho cây mẹ trước khi tách mô phân sinh đỉnh Chúng ta có thể xử lý mẫu sau khi nuôi cấy in vitro ở nhiệt độ 39 -

40oC trong 1 - 2 tuần Ở nhiệt độ này, các RNA thông tin của virus sẽ bị phân giải

và cây tái sinh có độ sạch bệnh virus cao

2.4.3.4 Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp với xử lý hóa chất kháng virus:

Bên cạnh việc xử lý nhiệt độ cao, còn có thể nuôi cấy mô phân sinh đỉnh với kích thước lớn 0,5 - 1mm kết hợp với việc bổ sung vào môi trường nuôi cấy các chất kháng virus để tạo cây sạch bệnh Một số các chất có tác dụng chống virus được sử dụng trên thực vật là các chất tổng hợp có cấu trúc tương tự các nucleotide như 2-thiouracil, ribavirin, vidarabin Các chất này có tác dụng ức chế sự nhân bản của virus

Trong các kỹ thuật làm sạch virus thông qua nuôi cấy in vitro thì kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp với xử lý hóa chất có tính khả thi hơn vì có thể xác định được chính xác nồng độ của chất ức chế bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy Hóa chất thường được sử

dụng là ribavirin

Ribavirin có công thức hóa học

là C8H12N4O5 với tên hóa học là

1-β-

D-ribofuranosyl-1H-1,2,4-triazole-3-carboxamide, dạng bột màu trắng, hòa

tan tự do trong nước và hòa tan ít

trong rượu khan

Cơ chế hoạt động của ribavirin: Công thức hóa học của Ribavirin

Đối với virus có bộ máy di truyền là RNA: Nhóm carboxamide của ribavirin giống với adenosine hoặc guanosine do đó nó sẽ bắt cặp với uracil hoặc cytosine trong quá trình nhân bản của virus gây nên đột biến RNA trong quá trình sao chép RNA Các đột biến lớn có thể gây chết các virus RNA Ngoài ra ribavirin 5' mono- di- và tri-phosphates đều là chất ức chế RNA-dependent RNA polymerases của một số virus, đây chính là tính chất đặc trưng của anti-sense RNA viruses chống sự xâm nhập của virus trong tế bào

Mặc dù vậy, cơ chế mà ribavirin ảnh hưởng tới sự sao chép của virus cho đến nay vẫn chưa được chứng minh rõ ràng (Theo Wikipedia, 2010 [47])

2.5 Các phương pháp chuẩn đoán bệnh virus

2.5.1 Phương pháp lây nhiễm cơ giới:

Phương pháp lây nhiễm cơ giới là phương pháp chuẩn đoán bệnh virus thông qua quan sát triệu chứng bệnh trên cây chỉ thị

Hành tỏi bị nhiễm bởi một hỗn hợp nhiều loại virus Allexivirus, Carlavirus,

Potyvirus, do đó việc chẩn đoán dựa vào triệu chứng trên cây bệnh là rất khó khăn

và chỉ áp dụng cho một số trường hợp Chẳng hạn Mavric và Ravnikar, Slovenia,

1999 [31] đã dùng các cây Allium cepa Belocranjka, A porrum cv Crentan,

Chenopodium amaranticolor, C quinoa, C murale, Nicotiana clevelandii, N occidentalis, Celosia argentea để lây nhiễm cơ giới nhằm phát hiện các virus dựa

vào thời gian biểu hiện và triệu chứng trên các cây

2.5.2 Phương pháp ELISA (Enzym linked immunosorbent assay):

ELISA ( Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay_ Xét nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết với enzyme) dựa trên sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể đặc hiệu, phản ứng tạo sản phẩm có màu hay phát sáng Trong đó tính chất hoạt hóa của enzyme và độ đặc hiệu của kháng thể là không đổi

Nguyên tắc:

Sử dụng kháng thể đơn dòng (Mabs) phủ bề mặt những đĩa giếng Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên trong mẫu, kháng thể sẽ tạo phức hợp với kháng nguyên cố định trên giếng và kháng thể tự do có gắn enzyme tạo thành một phức

hợp kép (sandwich) Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng, enzyme

xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng

Sử dụng test ELISA là một trong những phương pháp quan trọng trong chẩn đoán virus họ hành tỏi Martin Verbeek, Paul van Dijk và Peter M A van Well là những người đầu tiên sử dụng ELISA trong chẩn đoán virus trên hành tỏi Martin Verbeek, Paul van Dijk và Peter M A van Well, 1944 Double antibody sandwich (DAS) ELISA (Clark & Adams, 1977 [20]) dùng để xác định, phân lập

OYDV và LYSV (Van Dijk, 1993) cũng như các virus khác (Barg và cộng sự,

1994, 1997 [10, 11]) Các kháng huyết thanh của các virus đã được các nhà nghiên cứu dùng lần lượt là Onion yellow dwarf virus (OYDV; As 8639), Leek yellow stripe virus (LYSV; As 8262), SLV (As 7482), CLV (As 7665) được thiết kế bởi D.Z Maat (Plant Research International, Research Institute Plant Protection, Wageningen), GCLV (As 892), SLV (As 944), LYSV (As 1035) được cung cấp bởi

D E Lesemann (Institute Pflanzenvirologie, Mikrobiologie Biologische Sicherheit, BBA, Braunschweig, Germany) Kháng huyết thanh khác của CLV là (A 178) do E Luisoni (Istituto di Fitovirologia Applicata, CNR, Torino, Italia) tạo ra Với các kháng huyết thanh này Irena Mavric và Maja Ravnikar đã xác định sự có mặt của

các nhóm Potivirus, Carlavirus trong mẫu tỏi ở Slovenia, 2005

2.5.3 Phương pháp RT – PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain):

Mặc dù mới được phát minh năm 1983 bởi Kary Mullis phương pháp PCR

đã có ứng dụng trong mọi lĩnh vực khoa học và cuộc sống đặc biệt trong chẩn đoán bệnh virus đặc biệt là chẩn đoán virus hại cây trồng Nhiều virus gây hại họ hành tỏi

đã được giám định chính xác bằng phương pháp này

Bằng RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain) Miyuki Takaichi, Mika Yamamoto, Takayuki Nagakubo và Kenji Oeda, 2001 [33] đã nhận diện được

4 loài virus OYDV, GV1, GV2 và Mite-born mosaic virus trên tỏi Cũng với RT - PCR các tác giả đã xác định gen mã hoá vỏ Protein (CPs) của LYSV, OYDV 1,

OYDV - O, OYDV - G, GV1 - Carlvirus

Klukackova, M Navratil và M Duchoslav, 2005 [27] sử dụng DAS-ELISA và RT-PCR cũng đã xác định được 5 loại virus OYDV, LYSV, GarCLV và SLV từ các giống tỏi được trồng ở Cộng hòa Séc và các giống nhập từ Trung Quốc, Tây Ban Nha

Cuong Viet Ha và cộng sự, 2008 [48], đã thiết kế bộ mồi chung CIFor, mồi

này được thiết kế trên vùng bảo thủ của gen CI của các potyvirus, có trình tự là: 5’-GGiVViGTiGGiWSiGGiAARTCiAC-3’ Mồi CIFor có khả năng phát hiện hầu

hết các virus thuộc chi Potyvirus

Mới đây, Leona Leisova-Svobodova và cộng sự, 2011 [25] cũng đã sử dụng

phương pháp RT - PCR để xác định các loại virus OYDV, LYSV, GCLV, SLV, MbFV của 50 kiểu gen tỏi ta từ các quốc gia khác nhau Kết quả cho thấy tỷ lệ nhiễm là 97, 93, 99, 98 và 87% tương ứng với các loại virus OYDV, LYSV, SLV, GCLV và MbFV

2.6 Những nghiên cứu về nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem) trên cây tỏi

(Allium sativum L.)

Khi tổng kết về kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trên họ Alliaceae (họ

hành tỏi), Haim D Rabinowitch và James L Brewster, 1990 [25] cho rằng: nuôi cấy đỉnh sinh trưởng là một kỹ thuật thường được sử dụng đối với các cây nhân

giống vô tính và để trừ tận gốc virus ở các giống thuộc chi Allium Kỹ thuật này cho

phép duy trì được một lượng lớn các kiểu gen ổn định, từ đó những đỉnh sinh

trưởng phân lập sẽ được sử dụng để bảo tồn nguồn gen Cây tỏi (Allium sativum L) thuộc chi Allium (chi hành) là một cây nhân giống vô tính điển hình, bị nhiễm nhiều

loại bệnh virus trở thành một đối tượng nghiên cứu được nhiều người quan tâm Nhiều kết quả về nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây tỏi đã được công bố và đều có tính ứng dụng cao trong thực tiễn

Để nuôi cấy, đỉnh sinh trưởng của tỏi được tách ra với ít nhất một lá nguyên thủy với kích thước nhỏ hơn 0,5mm và nuôi trên môi trường thích hợp Khi kích thước của mẫu tách vượt quá 0,5mm thì tỉ lệ cây sạch bệnh giảm mạnh

3’ UTR 5’ UTR

poly A

CIFor

Trong quá trình nuôi cấy, những chồi đơn phát triển từ đỉnh chồi tỏi phân lập

có thể xuất hiện trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng Tuy nhiên, một lượng auxin nhất định sẽ làm tăng tỷ lệ chồi tái sinh từ đỉnh sinh trưởng ngắn (0,1 – 0,5mm), quá trình phân chồi cần cả cytokinin (Kinetin hoặc BAP) và auxin (α NAA hoặc IAA) Bhojwani, 1980 [12] cho biết, việc nhân chồi khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tỏi có thể bị ảnh hưởng không chỉ bởi chất điều tiết sinh trưởng mà còn do các thành phần của môi trường cơ bản Ông đã tạo được tỷ lệ nhân gấp đôi trên môi trường B5 cũng như trên môi trường MS Cây tỏi tái sinh có bộ nhiễm sắc thể lưỡng bội (2n = 16)

Vì có tính ổn định di truyền cao, đỉnh sinh trưởng có thể bảo tồn kiểu gen trong suốt quá trình nuôi cấy Tuy nhiên, vấn đề bảo quản lạnh meristem của chi

Allium vẫn chưa được nghiên cứu

Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được sử dụng nhằm tạo ra những cây đồng nhất (vi nhân giống) hoặc cảm ứng biến dị di truyền (chọn giống đột biến)

Vấn đề làm sạch virus có thể được giải quyết bằng cách xử lý nhiệt độ mẫu cấy vì ở nhiệt cao 36 - 370C một số loài virus không có khả năng nhân lên Biện pháp này cho phép tách đỉnh sinh trưởng ở kích thước lớn hơn và làm tăng tỉ lệ cây tái sinh Bằng cách này, Ayuso và Pena-Iglesias, 1981 [9] đã đạt được tỉ lệ 85% cây tỏi sạch virus khi sử dụng mẫu có kích thước 1 - 2mm

Theo Bruna và cộng sự, 1992, nhiệt độ cũng có ảnh hưởng đến tỷ lệ sạch bệnh khi nuôi cấy đỉnh đỉnh sinh trưởng tỏi ở Chilê Trong nghiên cứu này, cây bệnh trước khi đem vào nuôi cấy sẽ được xử lý ở các ngưỡng nhiệt độ trong các khoảng thời gian khác nhau Sau đó đỉnh sinh trưởng được tách ở kích thước 0,5 - 0,8mm, nuôi cấy trong môi trường chứa đa lượng của B5 (Gamborg và cộng sự, 1968), vi lượng và vitamin của MS (Murashige và cộng sự, 1962) Ba tháng sau, cây nuôi cấy sẽ được chuyển sang trồng trong nhà kính và kiểm tra bằng ELISA Khi so sánh các ngưỡng nhiệt độ và thời gian xử lý khác nhau, A Bruna thấy rằng:

tỷ lệ phần trăm số cây tỏi sạch bệnh sau nuôi cấy tăng đến 100% khi xử lý ở nhiệt

độ 380C trong 75 ngày và tỷ lệ cây sống giảm từ 95% khi xử lý ở 480C xuống 62%

Cũng trên đối tượng là tỏi, Muhammad S H và cộng sự, 2003 [34] đã

nghiên cứu môi trường thích hợp cho sự tái sinh và hình thành cây hoàn chỉnh trên giống tỏi địa phương của Bangladesh, từ mô phân sinh đầu rễ và đỉnh chồi Chồi được tách và cắt đỉnh sinh trưởng ở kích thước 0,5mm, rễ được tách ở kích thước 2

- 3mm Môi trường tái sinh chồi thích hợp nhất là MS cho tỷ lệ 95,55% và môi trường tái sinh rễ thích hợp nhất là MS có bổ xung 0,5ppm BA Các mẫu được nuôi cấy ở pH 5,8, nhiệt độ 280C, chiếu sáng 15h/ngày

Ở Việt Nam nuôi cấy meristem trên các cây họ hành tỏi vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu, hiện nay mới chỉ có tác giả Nguyễn Thị Lý Anh – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đang tiến hành thực hiện đề tài nghiên cứu cấp trường làm sạch bệnh virus cho các cây họ hành tỏi ở miền Bắc nước ta Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu cũng chưa được công bố chính thức

Như vậy, cho tới nay việc nuôi cấy meristem tạo giống hành tỏi sạch bệnh đã được rất nhiều tác giả nghiên cứu và công bố Điều đó khẳng định đây là phương pháp hữu hiệu và có tính ứng dụng khá cao trong thực tiễn

Cây tỏi với vai trò là cây rau gia vị có giá trị kinh tế cao, vừa được sử dụng làm thực phẩm vừa là một vị thuốc dân gian rất hiệu quả Trên thế giới, tỏi được quan tâm nghiên cứu khá nhiều và đã có những ứng dụng hiệu quả trong thực tế Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay do hạn chế về nhiều mặt, cây tỏi vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu nhiều, đặc biệt là những nghiên cứu tạo cây giống sạch bệnh

Chính vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu làm sạch bệnh virus cho cây

tỏi (Allium sativum L) bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem” Qua nghiên cứu này,

chúng tôi mong muốn xây dựng được quy trình tạo cây tỏi sạch bệnh bằng kỹ thuật

nuôi cấy mô tế bào nhằm cung cấp cây giống sạch virus cho sản xuất

CHƯƠNG III ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Cây tỏi ta có tên khoa học là Allium sativum L

3.1.2 Vật liệu thí nghiệm

Củ cây tỏi ta (Allium sativum L) giống và củ cây bị bệnh virus được thu thập

ngoài đồng ruộng ở Cổ Bi và Đặng Xá - Gia Lâm - Hà Nội

3.1.3 Địa điểm nghiên cứu

Viện Sinh Học Nông Nghiệp, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội

3.1.4 Thời gian nghiên cứu

Đề tài được tiến hành từ 15/03/2010 đến 15/07/2011

3.2 Nội dung nghiên cứu

3.2.1 Các nghiên cứu tiền đề là cơ sở cho nghiên cứu làm sạch bệnh virus trên cây tỏi (Allium sativum L)

Ở tất cả các thí nghiệm nghiên cứu tiền đề là cơ sở cho nghiên cứu làm sạch

bệnh virus trên cây tỏi (Allium sativum L) chúng tôi sử dụng kích thước tách

meristem từ 0,5 – 0,7mm, nguồn mẫu sử dụng là tỏi củ làm giống.

3.2.1.1 Nghiên cứu chế độ khử trùng tạo vật liệu khởi đầu:

Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của HgCl2 0,1% đến khả năng sống và sạch của mẫu cấy meristem

Công thức Thời gian xử lý cồn 70

0(phút)

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu anh hưởng Sodium Dichloroisocyanurate (NaDCC) 5g/lít

đến khả năng sống và sạch của mẫu cấy meristem

Công thức Thời gian xử lý cồn 70

0(phút)

Thời gian xử lý NaDCC 5g/lít

Môi trường nền: MS 0 = MS + 30g saccarose + 6g agarose, pH 5,8;

3.2.1.2 Nghiên cứu xác định môi trường nuôi cấy tái sinh chồi từ meristem:

3.2.1.2.1 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin đến sự tái sinh chồi từ đỉnh sinh trưởng

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của BA đến sự phát sinh hình thái của meristem

CT1(đ/c): MS0 (MS + 30g saccarose + 6g agarose), pH 5,8

CT2: MS0 + 0,5mg BA/l

CT3: MS0 + 1,0 mg BA/l

CT4: MS0 + 1,5 mg BA/l CT5: MS0 + 2,0mg BA/l CT6: MS0 + 2,5mg BA/l CT7: MS0 + 3,0mg BA/l

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của kinetin (Ki) đến phát sinh hình thái của meristem:

CT2: MS0 + 0,25mg Ki/l CT3: MS0 + 0,5mg Ki/l CT4: MS0 + 1,0mg Ki/l CT5: MS0 + 2,0mg Ki/l CT6: MS0 + 2,5mg Ki/l CT7: MS0 + 3,0mg Ki/l

3.2.1.2.2 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm auxin đến sự tái sinh chồi từ đỉnh sinh trưởng

Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của 2,4D đến sự phát sinh hình thái của meristem

CT1 (Đ/C): MS0 CT2: MS0 + 0,25mg 2,4D/l

CT3: MS0 + 0,5 mg 2,4D/l

CT4: MS0 + 1,0mg 2,4D/l CT5: MS0 + 2,0mg 2,4D/l

3.2.1.2.3 Ảnh hưởng của tổ hợp chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin và auxin đến sự tái sinh chồi từ đỉnh sinh trưởng

Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4D đến sự phát sinh hình thái của

meristem

CT1 (Đ/C): MS0CT2: MS0 + 1,0mg BA/lCT3: MS0 + 1,0mg BA/l + 0,25mg 2,4D/l CT4: MS0 + 1,0mg BA/l + 0,5mg 2,4D/l CT5: MS0 + 1,0mg BA/l + 1,0mg 2,4D/l

Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và αNAA đến sự phát sinh hình thái của

meristem

CT3: MS0 + 1,0mg BA/l + 0,10mg αNAA /l CT4: MS0 + 1,0mg BA/l + 0,25mg αNAA /l CT5: MS0 + 1,0mg BA/l + 0,50mg αNAA /l

3.2.2 Thu thập mẫu bệnh và xác định mẫu bị nhiễm bệnh virus từ các cây tỏi thu thập ngoài đồng ruộng

Thí nghiệm 8: Thu thập mẫu bệnh và xác định mẫu bị nhiễm bệnh virus từ các cây

tỏi thu thập ngoài đồng ruộng

3.2.3 Nghiên cứu làm sạch bệnh virus cho cây tỏi ta (Allium sativum L)

Thí nghiệm 9: Xác định kích thước meristem phù hợp để làm sạch bệnh virus cho

cây tỏi

Đỉnh sinh trưởng được tách dưới kính hiển vi soi nổi ở các kích thước như sau:

CT1: 0,1mm CT2: 0,3mm CT3: 0,5mm

CT4: 0,7mm CT5: 1,0mm CT6: 1,5mm Sau đó được cấy vào môi trường tái sinh chồi tốt nhất từ thí nghiệm tái sinh meristem (MS2)

Thí nghiệm 10: Kết hợp tách meristem và xử lý hóa chất ribavinin để làm sạch bệnh

virus cho cây tỏi

CT1: MS2 (môi trường tái sinh meristem tốt nhất)

3.2.4 Nghiên cứu nhân nhanh cây tỏi sạch virus

3.2.4.1 Nhân nhanh cây tỏi sạch virus bằng chồi đơn

Chồi sử dụng trong nhân nhanh là những chồi được xác định sạch virus bằng phương pháp RT – PCR

Thí nghiệm 11: Ảnh hưởng của BA đến sự nhân nhanh chồi tỏi

3.2.4.2 Nhân nhanh cây tỏi sạch bệnh virus bằng tái sinh chồi từ callus

Thí nghiệm 14: Nghiên cứu ảnh hưởng của nền môi trường và chất điều tiết sinh

trưởng tới khả năng tái sinh tạo chồi từ callus

3.2.5 Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh

Thí nghiệm 15: Ảnh hưởng của IBA đến sự ra rễ của cây tỏi sạch bệnh virus

Thí nghiệm 17: Ảnh hưởng của tổ hợp THT với IBA hoặc αNAA đến sự ra rễ của

cây tỏi sạch bệnh virus

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp thu thập mẫu

Các mẫu bệnh được thu thập dựa trên triệu chứng bệnh điển hình do potyvirus OYDV gây ra trên cây tỏi theo miêu tả của Bos L.và cộng sự, 1976, 1978

[13],[15]; Barg E và cộng sự, 1994 [10]; S Elnagar, A.S Abdel Wahab và M.A.K

El-Sheikh, 2009 [36]

3.3.2 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào

Áp dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào hiện hành

Điều kiện thí nghiệm

Nhiệt độ nuôi cấy: 25 ± 20C, 16h chiếu sáng/8 giờ tối, cường độ ánh sáng

2000 - 2500lux Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường MS bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng tùy yêu cầu từng thí nghiệm

Phương pháp bố trí thí nghiệm

Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại

5 - 8 mẫu đối với thí nghiệm tách meristem; 25 – 30 mẫu đối với thí nghiệm nhân nhanh, tái sinh callus và tạo cây hoàn chỉnh

Phương pháp theo dõi

Theo dõi thí nghiệm định kỳ 7 – 15 ngày/lần (tùy theo yêu cầu của thí nghiệm)

Chỉ tiêu theo dõi:

- Quan sát sự biến đổi hình thái màu sắc của mô nuôi cấy

- Hình thái callus (nhỏ, to, xốp, mọng nước, vàng, nâu….)

- Tỷ lệ mẫu sống (%)

- Tỷ lệ mẫu tái sinh tạo chồi (%)

- Tỷ lệ mẫu tái sinh tạo rễ (%)

- Tỷ lệ tạo callus (%)

- Chiều cao chồi tái sinh (cm/chồi)

- Số lá trên cây (lá/cây)

- Hệ số nhân chồi (chồi/mẫu/lần cấy chuyển)

3.3.3 Quy trình tách đỉnh sinh trưởng

Bước 1: Chuẩn bị mẫu

Cắt bỏ phần thân và phần thân đế củ, tách bỏ vỏ bao ở ngoài rồi tách rời thành từng tép tỏi

Bước 2: Rửa mẫu

Rửa mẫu nhiều lần dưới vòi nước chảy

Bước 3: Khử trùng mẫu

- Khử trùng bằng NaDCC 5g/l : Mẫu trước khi tách đỉnh sinh trưởng được khử trùng 1 lần bằng cồn 70% trong 1 phút, rồi tráng lại bằng nước cất vô trùng 1 - 2 lần, tiếp đó sử dụng Sodium Dichloroisocyanurate (NaDCC) (C3Cl2N3NaO3) pha trong nước cất vô trùng với nồng độ 5g/lít trong 5 - 20 phút rồi chắt bỏ nước, để khô mẫu

- Khử trùng bằng HgCl2 0,1%: Mẫu trước khi tách đỉnh sinh trưởng được khử trùng 1 lần bằng bằng cồn 70% trong 1 phút, rồi tráng lại bằng nước cất vô trùng 1 - 2 lần, sau đó xử lý tiếp bằng HgCl2 0,1% trong 5 - 15 phút Sau đó, tiến hành rửa mẫu 3 lần bằng nước cất vô trùng

Các thao tác khử trùng được thực hiện trong box cấy vô trùng

Bước 4: Tách đỉnh sinh trưởng

Đặt các tép tỏi đã khử trùng vào đĩa petri vô trùng trong box cấy Dùng dao mũi mác và panh (đã khử trùng) tách bỏ phần thịt củ bao bên ngoài, chỉ để lại từ 1 –

3 lá bao nguyên thủy, sau đó chuyển mẫu lên kính hiển vi

Kính hiển vi có độ phóng đại 30 lần, được lau sạch bằng cồn 700 Đặt mẫu dưới kính, sử dụng một dao phẫu thuật và một dao mũi mác thực hiện thao tác sau:

+ Dùng dao mũi mác tách bỏ các lá bao còn lại, đỉnh sinh trưởng lộ ra là

+ Dùng dao phẫu thuật để cắt phần hình cầu này, tính từ trên xuống dưới với kích thước 0,1 - 1,5mm và đưa vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo đã chuẩn bị sẵn

3.3.4 Phương pháp đánh giá độ sạch virus của cây tỏi bằng phương pháp lây nhiễm cơ giới

- Cây chỉ thị là cây rau muối đỏ (Chenopodium amaranticolor)

- Nguồn lây nhiễm: mẫu tỏi thu thập ngoài đồng ruộng và mẫu tỏi tái sinh từ đỉnh sinh trưởng

- Cách lây nhiễm: Theo phương pháp của Hill (1984) và Kado (1972)

Bước 1: Nghiền cây bệnh bằng cối, chày sứ sạch trong khay đá lạnh với tỷ lệ 1g lá

2-5ml đệm phosphate (KH2PO4, K2H PO4, hoặc NaH2 PO4, Na2H PO4) 0,01M, pH = 7,0

Bước 2: Vớt bỏ phần xơ lá và tạp bẩn, cho bột cacboradum bằng hạt đậu vào cối

dịch chiết vừa nghiền và khuấy đều

Bước 3: Dùng bông sạch nhúng dịch cây có chứa bột cacborandum rồi chà lên mặt

lá của cây chỉ thị theo chiều từ bẹ lá tới đầu mút toàn bộ thao tác được tiến hành trong 15 phút

Bước 4: Để cây trong điều kiện cách ly và quan sát triệu chứng hình thành

• Lưu ý: Cây thí nghiệm được để trong bóng tối 2 ngày trước khi lây nhiễm

3.3.5 Phương pháp đánh giá độ sạch virus của cây tỏi bằng phương pháp RT-PCR (Reverse Transcriptase-polymerase chain reaction)

Phân tử RNA được chuyển mã ngược thành cDNA nhờ enzym reverse transcriptase sau đó cDNA này sẽ được nhân lên trong phản ứng PCR

a Quy trình tách chiết RNA tổng số

Trước khi chiết ủ đệm chiết CTAB chứa 2% CTAB, 2M NaCl, 0.025M EDTA, 0.1 Tris pH=8 và 2% PVP đã bổ sung Betamecraptalthanol trong bể ủ nhiệt

độ 60oC trong 30 phút (Tỷ lệ 1ml đệm CTAB:10 µl Beta-ME)

Bước 1: Lấy 0.1g mô lá bệnh nghiền với 1µl đệm CTAB bằng chày cối sứ Hút

600µl dịch chiết vào tube 1.5ml

Bước 2: Ly tâm nhanh 10000v/1phút trong 5 phút thu dịch

Bước 3: Thêm Chloroform: Isoamyl (24:1) vào ống với thể tích tương đương, đảo

đều ống để lạnh -20oC trong 10 phút

Bước 4: Ly tâm bằng máy ly tâm để bàn 12000v/1phút trong 5 phút, thu dịch nổi Bước 5: Chiết lại lần hai bằng Chloroform:Isoamyl (24:1) lượng tương đương như

bước 3 và bước 4 thu dịch nổi

Bước 6: Kết tủa RNA với LiCl 10M (bổ xung LiCl với thể tích bằng ¼ thể tích dịch

nổi), đảo đều, ly tâm bằng trong 10 phút loại bỏ dịch nổi

Bước 7: Thu lấy cặn RNA tổng số

Bước 8: Rửa cặn bằng ethanol 70% 3 lần

Bước 9: Để cặn RNA khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút

Bước 10: Hòa tan cặn bằng 50 ul đệm TE, bảo quản ở -80oC

b Phương pháp RT - PCR

- Sử dụng kit one step RT-PCR của Qiagen Kit này cho phép sinh tổng hợp cDNA từ RNA nhờ hai enzyme Omniscript and Sensiscript Reverse Transcriptases cDNA sau đó được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR sử dụng HotStarTaq DNA Polymerase và các cặp mồi tương ứng (QIAGEN® OneStep RT-PCR Kit Handbook)

- Cặp mồi sử dụng cho Potyviridae là CIfor/ CIRev (Cuong Viet Ha et al, 2008)

CIFor 5’-GGiVViGTiGGiWSiGGiAARTCiAC-3’

Mồi này là mồi chung cho phép xác định các virus thuộc họ potryviruses

Do mồi chung là một mồi được thiết kế trên vùng bảo thủ Nếu vùng bảo thủ

là đồng nhất thì mồi chung sẽ chỉ là một chuỗi mồi duy nhất Nếu vùng bảo thủ chứa các vị trí sai khác thì mồi chung thực chất là một hỗn hợp các mồi, mỗi mồi tương ứng với một sai khác nucleotide

Ký hiệu: i, R, S, V, W, Y là các mã suy biến Các mã này được sử dụng tại các vị trí sai khác Ứng với mỗi mã suy biến là các số suy biến (số sai khác nucleotide tại mỗi vị trí của mồi)

i: Inosine - một nucleotide đặc biệt có thể ghép cặp với bất kỳ nucleotide nào trong số 4 nucleotide A, T, G, C; ứng với số suy biến là 4 Do vậy, sử dụng

R: có nucleotide tương ứng là A hoặc G, ứng với số suy biến là 2

S: có nucleotide tương ứng là C hoặc G, ứng với số suy biến là 2

V: có nucleotide tương ứng là A hoặc C hoặc G, ứng với số suy biến là 3

W: có nucleotide tương ứng là A hoặc T, ứng với số suy biến là 2

Y: có nucleotide tương ứng là C hoặc T, ứng với số suy biến là 2

Chu trình RT-PCR Các bước Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ